Cuid 2: Rannchuidíonn Rialáil Eigénéiteach na Géine Circadian Per1 le hAthruithe a Bhaineann le hAois ar Chuimhne Hippocampal

Déan teagmháil le: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Pls cliceáil anseo chun Cuid 1

Cuireann Cnoc an Dúin Per1 isteach go fadtéarmachcuimhnei lucha óga.Ansin, chun tástáil a dhéanamh an bhfuil gá le hathrialú Per1 sa dobhareach droma san fhadtéarmacuimhneLe foirmiú, d'insileadh muid siRNA a dhírigh Per1 isteach i hippocampus droma lucha óga 48 h roimh 10-nóiméad oiliúna OLM. Tháirg insileadh de siRNA Per1 laghdú suntasach ar phróitéin PER1 sa hippocampus droma, mar a thomhaistear 2 h tar éis an tseisiúin thástála deiridh (Fíor 4d, Fíor Fhorlíontach Fig. 5). Tháinig lagú mór ar an laghdú beag seo de phróitéin PER1 (~30 faoin gcéad).cuimhnefoirmiú le haghaidh OLM; Níor léirigh lucha a insileadh le Per1 siRNA aon mhéadú suntasach ar DI idir oiliúint agus tástáil agus taispeánadh i bhfad níos lú tosaíochta don réad a bhí ag gluaiseacht le linn tástála ná lucha rialaithe (Fíor 4e) gan aon éifeacht ar thaiscéalaíocht réad iomlán le linn tástála (Fíor 4f) agus gan aon difríocht i ngluaiseacht le linn na seisiún gnáthaimh réamhoiliúna (Fíor Forlíontach 8c). Léiríonn sé seo, don chéad uair, go bhféadfadh cur isteach áitiúil ar chroíghéine cloig circadian go roghnach laistigh den hippocampus lagú.cuimhnefoirmiú.

Feabhsaítear ró-eisiúint per1cuimhnei lucha ag dul in aois. Ar deireadh,a chinneadh cé acu is leor an ró-léiriú Per1 sa dobhareach droma chun coibhneas le haois a fheabhsúcuimhnelagú, rinneamar uasrialú Per1 go háitiúil ag baint úsáide as dhá mhodh chomhlántacha. Ar dtús, d'úsáideamar lentivirus a léirigh cineál fiáin Per1 le clib epitope v5 (pLVX-v5Per1) (Fíor 5a, Fíor Forlíontach 6a). Chun a dheimhniú go sáraíonn an plasmid seo Per1, d'aistrigh muid cealla HT22 le pLVX-v5Per1 nó pLVX-EV agus thomhaiseamar Per1 mRNA abairt. Ag an dá 24 agus 48 u tar éis transfection, Per1 mRNA Bhí méadú suntasach i gcealla transfected le pLVX-v5Per1 i gcoibhneas le cealla transfected leis an rialú plasmid (Fig. 5 b). Mar thoradh ar aistriú pLVX-v5Per1 freisin tháinig méadú suntasach ar mRNA do Per2 (ball teaghlaigh clog Tréimhse a idirghníomhaíonn le Per1) ag 24 h (Fíor Forlíontach 6b), cé go raibh an méadú seo i bhfad níos lú ná an méadú a breathnaíodh ar Per1 (ag. 24 h, Per1: 466-méadú huaire thar EV, Per2: 1.6-méadú faoi fhilleadh thar EV). Ní raibh tionchar ag ró-ráiteas Per1 ar thrascríobh na géine iartheachtach is gaire Hes7, áfach (Fíor Forlíontach 6c).

Chun a chinneadh an dtagann feabhas ar ró-eisiúint Per1cuimhnefeidhmíocht i lucha aosaithe, pLVX-v5Per1 a insileadh isteach sa hippocampus droma 18-mo lucha 2 sheachtain roimh an iompar. Léirigh lucha pLVX-v5Per1 feabhas suntasachcuimhnele haghaidh OLM ag an tástáil i gcoibhneas le rialtáin pLVX-EV (veicteoir folamh) (Fíor 5c). Níor léirigh ach lucha pLVX-v5Per1 méadú suntasach ar rogha an réad a bhí ag gluaiseacht ar fos i gcomparáid le hoiliúint gan aon difríochtaí grúpa breathnaithe i dtaiscéalaíocht iomlán ag an tástáil (Fíor 5d) nó i gluaiseacht le linn habituation (Fíor Forlíontach. 8d).

Tar éis iompair, próiseáladh fíochán hippocampal ó fho-thacar ainmhithe le haghaidh seicheamhú RNA chun láithreacht na tras-scríbhinní pLVX-EV agus pLVX-v5Per1 a dheimhniú sna grúpaí cuí in vivo (Fíor Forlíontach 7a, b, f, g).

Chun an cur chuige seo a chomhlánú, d'úsáideamar an córas CRISPR/dCas9 Idirghabhálaí Gníomhachtaithe Sineirgisteach (SAM)33 chun gníomhachtú trascríobh Per1 a thiomáint sa hippocampus droma. Tá an córas seo comhdhéanta de thrí chomhpháirt lentiviral: a catalaíochneamhghníomhach Cas9 (dCas9) comhleádh le fearann ​​gníomhachtaithe trascríobh VP64 le clib GFP (dCas9-VP64-GFP), RNA aontreorach mionathraithe (sgRNA) a dhíríonn ar Per1 le dhá fheisteán RNA MS2 is féidir earcaigh an tríú comhpháirt, próitéin chomhleá MS2- gníomhachtaithe tras-aistrithe dúbailte (MS2-p65-HSF1)(Fíor 5e). Fuair ​​ainmhithe rialaithe sgRNA rialaithe nach raibh an seicheamh 20 núicléitíd ag teastáil uathu chun an córas SAM a dhíriú ar Per1 (dá dtagraítear mar ctrl sgRNA). Ligeann comhthionól na gcomhpháirteanna seo ag tionscnóir Per1 do na trí fhearann ​​éifeachtóra (VP64, p65, agus HSF1) trascríobh Per1 a thiomáint. Lena dheimhniú, feabhsaítear laguithe aois-choibhneasa i suíomh réada le héifeachtacht Fíor 5 Ró-léiriú Per1 sa hippocampus droma.cuimhne. Scéimreach de thógáil lentivirus a úsáidtear chun ró-shníomh a dhéanamh ar v{{{{0}}Per1 (pLVX-v5Per1) i gcomparáid leis an rialú veicteoir folamh (pLVX-EV). b Méadaíodh per1 mRNA go suntasach 24 agus 48 h tar éis pLVX-v5Per1 a aistriú i gcealla HT22 i gcomparáid le cealla a aistríodh le EV (ANOVA Dhá-bhealach: idirghníomhaíocht Grúpa x Timepoint (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" tástálacha="" post="" hoc="" sidak,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-thaispeáin="" lucha="" a="" tugadh="" insiltí="" hippocampal="" de="" plvx-v5per1="" cuimhne="" i="" bhfad="" níos="" fearr="" do="" olm="" ná="" lucha="" ar="" tugadh="" víreas="" rialaithe="" plvx-ev="" dóibh="" (anova="" dhá-bhealach:="" víreas="" x="" idirghníomhú="" seisiúin,="" (f(1,29)="" {{34)="" }}.15,="" p="">< 0.05),="" tástálacha="" post="" hoc="" sidak,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" n="16," 15,="" gach="" fireannach).="" d="" bhí="" an="" taiscéalaíocht="" iomlán="" cosúil="" leis="" an="" dá="" ghrúpa="" ag="" an="" tástáil="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" scéimre="" de="" chóras="" crispr/dcas9="" idirghabhálaí="" gníomhachtaithe="" sineirgisteach="" (sam)="" a="" úsáidtear="" chun="" trascríobh="" per1="" a="" thiomáint.="" barr:="" comhpháirteanna="" aonair="" de="" sam.="" bun:="" comhpháirteanna="" curtha="" le="" chéile="" ag="" an="" tionscnóir="" per1,="" ag="" tiomáint="" trascríobh="" per1.="" f="" méadaíodh="" per1="" mrna="" go="" suntasach="" 48="" h="" tar="" éis="" comhpháirteanna="" crispr-sam="" a="" aistriú="" i="" gcealla="" ht22="" i="" gcomparáid="" le="" cealla="" a="" aistríodh="" leis="" an="" scrna="" rialaithe="" (anova="" dhá-bhealach:="" grúpa="" x="" idirghníomhú="" timepoint="" (f(1,8)="14.77)" ,="" p="">< 0.01),="" tástálacha="" post="" hoc="" sidak,="" **p="">< 0.001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" lucha="" a="" tugadh="" insiltí="" hippocampal="" den="" chóras="" crispr-sam="" le="" sgrna="" dírithe="" ar="" per1="" i="" bhfad="" níos="">cuimhnele haghaidh OLM i gcomparáid le lucha rialaithe EV le scRNA rialaithe (ANOVA Dhá-bhealach: Víreas x Idirghníomhú Seisiún (F(1,30)=5.83, p < 0.05)="" ,="" tástálacha="" post="" hoc="" sidak,="" ***p="">< 0.001,="" n="17," 15,="" gach="" fireannach).="" h="" bhí="" an="" taiscéalaíocht="" iomlán="" cosúil="" leis="" an="" dá="" ghrúpa="" ag="" an="" tástáil="" (t(30)="0.41," p="0.68)." cuirtear="" sonraí="" i="" láthair="" mar="" mheán="" ±="" sem="" sa="" chóras="" crispr-sam,="" d'aistrigh="" muid="" cealla="" ht22="" leis="" na="" trí="" plasmid="" go="" léir,="" bhaineamar="" na="" cealla="" 24="" nó="" 48="" h="" níos="" déanaí,="" agus="" tomhaiseadh="" per1="" mrna="" abairt.="" faoi="" 48="" h="" tar="" éis="" aistrithe,="" méadaíodh="" per1="" mrna="" go="" suntasach="" sa="" ghrúpa="" a="" tugadh="" per1="" sgrna="" i="" gcomparáid="" le="" rialuithe="" (fíor="" 5f),="" ag="" deimhniú="" go="" dtiomáineann="" an="" córas="" crispr-sam="" slonn="" per1="" mrna="" go="" héifeachtach.="" níor="" thugamar="" faoi="" deara="" aon="" athrú="" slonn="" do="" cheachtar="" per2="" mrna="" (fíor="" forlíontach="" 6e)="" nó="" hes7="" mrna="" (fíor="" forlíontach="" 6f),="" rud="" a="" thugann="" le="" fios="" go="" dtiomáineann="" an="" córas="" crispr-sam="" ró-léiriú="" roghnach="" ar="" an="" spriocghéine,="">

Ansin, 18-tugadh insiltí laistigh den hippocampal de lentiviruses CRISPR-SAM (Fíor Forlíontach 6d) do lucha agus cuireadh oiliúint orthu in OLM dhá sheachtain ina dhiaidh sin. Mar a breathnaíodh lenár ró-eisiúint pLVX- v5Per1, tháinig feabhas suntasach ar ró-eisiúint Per1 trí mheán CRISPR-SAMcuimhnefeidhmíocht i lucha insileadh Per1 sgRNA i gcoibhneas le hainmhithe rialaithe (Fíor 5g) gan cur isteach ar thaiscéalaíocht iomlán (Fíor 5h) nó ar ghluaiseacht le linn habituation (Fíor Fhorlíontach Fíor. 8e). Níor léirigh ach lucha ar tugadh an sgRNA Per1 dóibh méadú suntasach ar an rogha a bhí ann don réad a bhí ag gluaiseacht ar fos i gcomparáid leis an oiliúint, rud a léiríonn sláncuimhnedo na suíomhanna réad (Fig. 5g). Tar éis iompair, próiseáladh fíocháin hippocampal ó fho-thacar ainmhithe le haghaidh seicheamhú RNA chun láithreacht na tras-scríbhinní CRISPR a dheimhniú sna grúpaí cuí in vivo (Fíor Forlíontach 7c-g). I dteannta a chéile, léiríonn na torthaí seo gur leor an ró-léiriú Per1 sa dobhareach droma chun laguithe a bhaineann le haois a fheabhsú i gcuimhne fadtéarmach suímh réad. Mar sin, is géine ríthábhachtach é Per1 atá ríthábhachtach le haghaidh foirmiú cuimhne fadtéarmach, atá rialaithe ag HDAC3, agus lagaithe san inchinn atá ag dul in aois.

Plé

Léiríonn ár dtorthaí go bhféadann scriosadh nó cur isteach ar an histone deacetylase faoi chois HDAC3 laigí a bhaineann le haois a fheabhsú sa dá fhadtéarma.cuimhneagus plaisteacht shionaptach. Ina theannta sin, trí HDAC3 a scriosadh, athchóirítear léiriú taithí-spreagtha den ghéin circadian Per1 sa hippocampus droma. Toisc go bhfuil léiriú hippocampal PER1 ríthábhachtach le haghaidh foirmiú cuimhne fadtéarmach (Fíor 4) agus maíonn overexpression Per1 sa hippocampus laigí cuimhne a bhaineann le haois (Fíor 5), is meicníocht fhéideartha é PER1 trína bhfeabhsaíonn scriosadh HDAC3.cuimhneagus plaisteacht shionaptach i lucha aosaithe. Ar bhonn níos leithne, d’fhéadfadh cur isteach ar Per1 a bhaineann le haois ceangal a dhéanamh ar laigí a bhaineann le haois sa chuimhne fhadtéarmach agus i rithimeacht circadian, ag brath ar an struchtúr.

Príomhthoradh amháin ón staidéar reatha ná go bhféadfaí laigí a bhaineann le haois sa LTP hippocampal a fheabhsú trí scriosadh nó cur isteach HDAC3. Tá sé seo ag teacht le hobair le déanaí ó shaotharlann Sajikumar a léirigh gur féidir le himshuí cógaseolaíochta HDAC3 laguithe a bhaineann le haois a fheabhsú i LTP hippocampal comhthiomsaitheach34. Rud suimiúil, fuaireamar amach gur theip ar slisní ó shean-ainmhithe HDAC3flox/flox agus HDAC3(Y298H) an leibhéal potentiation céanna a bhaint amach le slisní ó ainmhithe óga HDAC3flox/flox nó HDAC3(Y298H) (Fíor 2c, f), ag moladh é sin d'fhéadfadh go mbeadh uasteorainn plaistigh níos ísle ag brains atá ag dul in aois ná brains óga. Míniú amháin a d’fhéadfadh a bheith ar an difríocht seo ó thaobh potentiation is ea go bhféadfadh caillteanas teagmhálacha synaptic a bhaineann le haois in CA122 an uasteorainn plasticity a ísliú sa hippocampus atá ag dul in aois, toisc go n-éireodh níos lú synapses atá ar fáil sáithithe níos tapúla ná na synapses sách flúirseach sa DH óg. Más é seo an cás, níor cheart go gcuirfí tuilleadh le LTP sa hippocampus atá ag dul in aois trí an prótacal spreagtha a neartú nó babhtaí spreagtha spásúla35 a sholáthar, toisc nach bhfuil aon synapses breise ar fáil. Beidh gá le tuilleadh oibre chun an mheicníocht is bun leis an difríocht seo a chinneadh.

Léirigh ár dtorthaí seicheamhaithe RNA nach raibh ach fo-thacar beag géinte ag teacht leis na critéir maidir le hathshlánú san inchinn aosaithe trí scriosadh HDAC3 (Fíor 3e). Mar sin, seachas próifíl slonn géine na hinchinne óg a athchaipitliú, trí HDAC3 a scriosadh san inchinn atá ag dul in aois, d’athchóirigh léiriú taithí-spreagtha ar roinnt príomhghéin atá ríthábhachtach maidir le foirmiú cuimhne fadtéarmach, lena n-áirítear Per1. Is cosúil go bhfuil Per1 á rialú go díreach ag HDAC3, toisc go ndéantar scriosadh fócasach ar léiriú Per1 arna spreagadh ag taithí HDAC3 agus HDAC3 a bhaint go fisiciúil ón tionscnóir Per1 mar fhreagra ar oiliúint OLM. Ina theannta sin, tá gá le léiriú Per1 le haghaidhcuimhne, mar a dhéanann siRNA-idirghabhála cnag síos ar phróitéin PER1 sa DH lagaithe fadtéarmachcuimhnefoirmiú i lucha óga, agus overexpression feabhsaithecuimhnele haghaidh OLM i lucha ag dul in aois. Go sonrach, níor aistrigh an dá chóras lentiviral a úsáidtear chun ró-express Per1 ach líon beag cealla i limistéar CA1b den hippocampus droma (Fíor Forlíontach 6a, d), rud a chiallaíonn gur gá láithreacht na dtógálacha seo a dhearbhú le seicheamhú RNA (féach modhanna ). Mar a léirigh obair roimhe seo go bhfuil an réigiún beacht seo den hippocampus droma ríthábhachtach do OLM36, léiríonn sé seo go bhféadfadh fiú athrú beag fócasach ar Per1 laistigh de struchtúr cuimhne-ábhartha tionchar a imirt ar fhoirmiú cuimhne fadtéarmach. Síneann sé seo le taighde a rinneadh roimhe seo a thaispeánann gur féidir le scriosadh neamhshonrach Per1 ar fud na hinchinne bac a chur ar fhoirmiú cuimhne i lucha óga6,28,29. Mar sin is príomhimeacht é an cosc ​​ar Per1 trí mheán HDAC neamhghnácha san inchinn atá ag dul in aois a d’fhéadfadh laigí a bhaineann le haois a bheith mar thoradh ar fhoirmiú cuimhne fadtéarmach agus rithimeach circadian araon. Cé go léiríonn an staidéar seo go soiléir gur géine tábhachtach é Per1 trína rialaíonn HDAC3 cuimhne fhadtéarmach san inchinn atá ag dul in aois, is dóichí go gcuireann géinte eile le héifeachtaí feabhsaithe cuimhne scriosadh HDAC3. I measc na ngéinte eile atá beartaithe chun éifeacht HDAC3 a idirghabháil ar phlaisteacht agus cuimhne synaptic tá NF-κB34, FMRP37, agus Nr4a226. Sa staidéar reatha, d'aithin muid trí ghéinte breise (Fíor 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) a léiríonn, cosúil le Per1, léiriú lagaithe san inchinn atá ag dul in aois a fheabhsaítear trí scriosadh HDAC3. Níl sé soiléir faoi láthair conas a chuireann na géinte éagsúla seo le héifeachtaí feabhsaithe cuimhne scriosadh HDAC3. Go háirithe, comhéadann na géinte seo go léir leis an gcosán CBP/CREB, rud atá ríthábhachtach le haghaidh foirmiú cuimhne fadtéarmach38,39 agus atá suas agus iartheachtacha ó PER16,28. Toisc go bhfuil PER1 in aghaidh an tsrutha ó fhosfarylation CREB6, d’fhéadfadh go laghdaítear fosfarylation CREB faoi chois trí mheán HDAC de Per1, rud a chuireann isteach ar thrascríobh ghéinte CREB-idirghabhála amhail Fmrp40,41, agus baill teaghlaigh ghéine Nr4a Nr4a1 agus Nr4a226. Beidh tuiscint ar an dinimic chasta idir HDAC3, PER1, agus na himreoirí móilíneacha eile seo ina sprioc thábhachtach de thaighde amach anseo.

Sa staidéar reatha, d’úsáideamar dhá mhodh chomhlántacha chun ró-express Per1 san inchinn atá ag dul in aois: ró-léiriú ar thógáil Per1 cDNA lán-fhad ag baint úsáide as pLVX-v5Per1 agus gníomhachtú trascríobh Per1 endogenous ag baint úsáide as an gcóras CRISPR-SAM. Cé gur thiomáin ró-léiriú pLVX-idirghabhála méadú mór ar Per1 mRNA (Fíor 5b), bhí méadú ar Per2, ball eile den teaghlach Tréimhse (Fíor Forlíontach 6b) ag gabháil leis seo. Níor tháinig aon athrú ar léiriú na géine le sruth Hes7, áfach, le pLVX-v5Per1 (Fíor Forlíontach 6c). Ar an láimh eile, tháinig méadú níos caolchúisí ar an gcóras CRISPR-SAM ar Per1 mRNA a sheachain feabhsuithe seach-sprioc ar shloinneadh Per2 nó Hes7 (Fíor Forlíontach 6e-f). Mar an dá chur chuige mar an gcéanna feabhsaithe go fadtéarmachcuimhnei lucha aosaithe, ní dócha gurb é an méadú as an sprioc i Per2 a breathnaíodh le pLVX-v5Per1 ba chúis leis an bhfeabhsú a breathnaíodh ar chuimhne fadtéarmach.

Éifeachtaí circadian ar fhadtéarmachcuimhneCreidtear go traidisiúnta go n-eascraíonn siad as dírialú laistigh den SCN, rud a spreagann athruithe ar struchtúir imeallacha a bhaineann le foirmiú cuimhne, cosúil leis an hippocampus droma. Is beag atá ar eolas faoi ról na ngéinte cloig circadian aonair sa DH, in ainneoin nasc soiléir idir rithimiúlacht circadian agus foirmiú cuimhne fadtéarmach. Tá dlúthbhaint ag cuimhne le ham an lae, mar go léiríonn cascáidí géine a bhaineann le plasticity ascaluithe circadian3,6 aguscuimhneIs féidir é a fháil níos éasca ag tréimhsí áirithe den timthriall circadian. Mar shampla, faightear riochtú eagla comhthéacs níos láidre i rith an lae, nuair a bhíonn leibhéil fosfarylation MAPK buaicphointe3. Ina theannta sin, tá sé dea-dhoiciméadaithe go bhfuil miondealú ar rithimí circadian ag gabháil leis an dul in aois, is dócha mar gheall ar athruithe sa chlog circadian lárnach, an núicléas suprachiasmatic (SCN) (le hathbhreithniú1). Conas a bhaineann an cur isteach seo sa chlog circadian leis na laguithe a bhaineann le haois icuimhneis ceist oscailte í. Tugann ár dtorthaí le fios go gcuireann HDAC3 teorainn le Per1 de bharr taithí sa hippocampus atá ag dul in aois, rud a d’fhéadfadh cur leis na laguithe a breathnaíodh sa chuimhne fhadtéarmach. Mar sin, d’fhéadfadh go mbeadh cosúlacht eipigineach ar Per1 ina chomhéadan tábhachtach idir laigí a bhaineann le haois i rithimeacht circadian agus i bhfoirmiú cuimhne fadtéarmach.

De na príomhghéinte cloig circadian canónacha, tá Per1 ar tí dul i bhfeidhm go mór ar hippocampal fadtéarmach.cuimhne. Is cosúil go bhfuil baint ag Per1 go príomha le conairí aschuir SCN agus tá ról lárnach aige sna cloig fhorimeallacha le sruth ón SCN, amhail an hippocampus42. Ina theannta sin, tugann obair a rinneadh le déanaí le fios go bhféadfadh Per1 foirmiú cuimhne spásúlachta a “gheata” i rith an timthriall lae/oíche trí fhosfarylation CREB6,28,29 a rialú. Go deimhin, breathnaíodh upregulation hippocampal Per1 mRNA tar éis foghlama comhthéacs nó spásúlachta i dtrí staidéar RNA-seq eile ar a laghad, lena n-áirítear obair i bhfrancaigh, rud a thugann le fios go ndéantar Per1 a uasrialú go hiondúil tar éis foghlama thar speicis20,43,44. Mar aon le torthaí an staidéir reatha, léiríonn an obair seo go bhfuil léiriú PER1 ríthábhachtach maidir le foirmiú cuimhne fadtéarmach hippocampal; d'fhéadfadh laghduithe i PER1 a tharlaíonn san oíche29 nó le dul in aois dochar a dhéanamh do hippocampalcuimhne. Go dtí seo,

taighde ag baint le Per1 incuimhneBhí foirmiú ag brath go heisiach ar knockouts domhanda a chuireann isteach ar léiriú Per1 sa chroí-chlog circadian agus i réigiúin eile chomh maith le struchtúir a bhaineann le cuimhne mar an hippocampus6,28,29,45,46, rud a fhágann nach féidir a chinneadh an bhfuil gá go sonrach le hippocampal PER1 le haghaidh foirmiú cuimhne. Go deimhin, bíonn tionchar ag scriosadh domhanda Per1 ar rithimeacht circadian i roinnt tuarascálacha42. Anseo, léirímid don chéad uair gur féidir lagú a dhéanamh ar slonn PER1 go díreach sa hippocampus dromacuimhnei lucha óga ach is féidir le ró-léiriú áitiúil Per1 sa dobhareach droma feabhas a chur ar chuimhne i lucha atá ag dul in aois. Toisc nach raibh aon éifeacht ag scriosadh roghnach HDAC3 (a rialaíonn Per1) sa dobhareach droma ar phatrúin ghníomhaíochta circadian sa staidéar reatha (Fíor Fhorlíontach 4), agus fiú nach leor loit leictrealaíoch den hippocampus droma chun cur isteach ar rithimeacht circadian47, ní dócha go bhfuil cuireann ionramháil Per1 laistigh den hippocampus droma isteach ar fheidhm an chlog circadian lárnach. Mar sin féin, d’fhéadfadh méaduithe taithí-spreagtha i Per1 nó ró-abairt víreas-idirghabhála de Per1 dul i bhfeidhm ar ascalach circadian imreoirí móilíneacha eile, ar nós géinte cloig eile, laistigh de néaróin hippocampal, fiú gan cur isteach ar phatrúin ghníomhaíochta circadian. Beidh tuiscint ar an gcaoi a bhfeidhmíonn Per1 chun foirmiú cuimhne a athrú, lena n-áirítear na comhpháirtithe féideartha idirghníomhaithe seo a aithint, mar sprioc don obair amach anseo.

Le chéile, léiríonn na torthaí seo go bhfuil príomhról ag an ngéine cloig circadian lárnach Per1 laistigh de áitiúilcuimhnestruchtúir chun foirmiú cuimhne a athrú, ról atá neamhspleách ar a fheidhm sa SCN. Níos ginearálta, tugann sé seo dúshlán don hipitéis thraidisiúnta a athraíonn circadiancuimhneTá foirmiú á dtiomáint ag athruithe sa chroí-chloig circadian agus ina ionad sin tacaíonn sé leis an hipitéis go n-imríonn géinte cloig circadian ról níos uathrialaí i gcealla hippocampal, b'fhéidir ag geataí foirmiú cuimhne bunaithe ar am an lae6.

Modhanna

lucha. Bhí lucha óga fásta idir 2 agus 4 mhí d’aois tráth na tástála agus bhí lucha aosaithe idir 18 agus 20 mí d’aois. Bhí na lucha go léir C57BL/6J nó coinnithe ar chúlra C57BL/6 (HDAC3 móide / móide agus lucha HDAC3flox/flox). Bhí rochtain saor in aisce ag lucha ar bhia agus ar uisce agus coinníodh soilse ar thimthriall 12 uair an chloig éadrom/dorcha. Rinneadh gach tástáil iompraíochta le linn an timthriall solais. Rinneadh na turgnaimh go léir de réir threoirlínte na nInstitiúidí Náisiúnta Sláinte SAM maidir le cúram agus úsáid ainmhithe agus d'fhormheas Coiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Ollscoil California, Irvine, iad.

Máinliacht. Rinneadh ainéistéitic ar lucha le isifliún (spreagtha, 4 faoin gcéad; coinnithe 1.5–2.0 faoin gcéad ) agus cuireadh sa steiréatacsach iad. Íslíodh snáthaidí insteallta go dtí an hippocampus droma ag ráta 0.2 mm/15 s (AP, −2.0 mm; ML, ± 1.5 mm, DV, − 1.5 mm i gcoibhneas le Bregma ). Dhá nóiméad tar éis an doimhneacht sprice a bhaint amach, insileadh 1.0 ul den víreas nó siRNA go déthaobhach isteach sa RS ag ráta 6 ul/u. I gcás na n-insileadh lentiviral CRISPR-SAM, insileadh manglam de na trí víreas go dtí toirt deiridh de 1.5 μL in aghaidh an leathsféar ag an ráta céanna. D'fhan snáthaidí insteallta in áit ar feadh dhá nóiméad tar éis an insteallta chun ligean don víreas idirleathadh. Ardaíodh na hinsteallairí ansin 0.1 mm agus ligeadh dóibh suí ar feadh nóiméid eile sula mbaintear iad ag ráta 0.1 mm in aghaidh 15 s. Rinneadh insiltí víreasacha 2 sheachtain roimh anailís iompraíochta ach rinneadh briseadh siRNA 2d roimh an oiliúint13. I gcás gach turgnaimh insteallta, sannadh ainmhithe go randamach do na coinníollacha insteallta éagsúla (cé is moite de lucha HDAC3 móide / móide agus HDAC3flox / ox, a bhí instealladh go léir le AAV-CaMKII-Cre). I gcás gach turgnaimh iompraíochta, rinneadh ainmhithe laistigh de gach riocht víreasach a shannadh go randamach do cháis bhaile/grúpaí oilte agus rinneadh na coinníollacha uile (rudaí, boscaí, etc.) a fhrithchothromú idir grúpaí.

Táirgeadh AAV. AAV2.1-Ceannaíodh CaMKII-Cre ó Penn Vector Core (teideal: 1.81 × 1013 GC/ml). Le haghaidh AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5, mhéadaíomar cineál fiáin HDAC3 ó hippocampal cDNA agus clónálamar an táirge isteach i pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) mionathraithe faoi rialú an tionscnóra CMV agus intron -globin. Baineadh an chlib 3×-FLAG, eilimint IRES, agus hrGFP den veicteoir agus cuireadh clib V5 ina n-ionad, rud a cheadaíonn comhleá C-críochfort go HDAC3 (plasmid MW91). Chun an pointe sóchán a chruthú, d'athraigh muid na núicléatídí go cód le haghaidh iarmhar histidine in ionad tyrosine ag aimínaigéad 298 (plasmid MW92). Maidir leis an rialú veicteoir folamh, ní raibh an seicheamh códaithe HDAC3 i láthair, ach tá gach eilimint eile fós (plasmid MW87). Is é an Penn Vector Core a rinne an AAV agus cinntigh qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6.48 × 1012 GC/ ml; AAV-EV: 1.35 × 1013 GC/ml) na teidil deiridh.

Táirgeadh lentivirus. Don chóras CRISPR/dCas9 Idirghabhálaí Gníomhachtaithe Sineirgisteach (SAM), ceannaíodh plasmidí lentiviral ó Addgene don dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) agus MS2- P{5}}HSF1_Tógálacha Hygro (#61426-LVC) (teidil Níos mó ná nó cothrom le 8×106 TU/ml). Maidir leis an sgRNA Per1, rinneamar clónáil agus chuireamar isteach seicheamh treorach antisense a fhreagraíonn don eilimint CRE sa tionscnóir Per1 (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) isteach i gcnámh droma clónála Addgene sgRNA(MS2) (#61427). Bhí an sgRNA rialaithe comhionann, ach amháin nár clónáladh aon seicheamh treorach isteach sa phlasmid. Tháirg Saotharlann Lentiviral Scoil na Cógaisíochta lentivirus le haghaidh an sgRNA Per1 (títer: 6.8 × 107 IFU/ml) agus an sgRNA rialaithe (3.5 × 107 IFU/ml).

Maidir leis an tógáil ró-eisbhrú pLVX-V5Per1, mhéadaíomar cineál fiáin fad iomlán Per1 ón Addgene pCMV-Sport2-mPer1 plasmid (#16203) agus rinneamar an táirge a chlónáil isteach i pLVX-EF1 -IRES-mCherry modhnaithe cnámh droma (Takara, #631987). Baineadh na heilimintí IRES agus mCherry agus cuireadh clib V5 ina n-áit, rud a cheadaigh comhleá N-críochfort go PER1 (plasmid MW206). Maidir le rialú veicteoir folamh (EV), ní raibh an seicheamh códaithe PER1 i láthair ach d'fhan na heilimintí eile go léir (Plasmid MW93). Tháirg Saotharlann Lentiviral Scoil na Cógaisíochta lentivirus le haghaidh pLVX-v5Per1 (títer: 1.3 × 108 IFU/ml) agus pLVX-EV (títer: 1.5 × 108 IFU/ml). Cuireadh gach tógáil lentiviral in iúl faoin tionscnóir EF1.

Cultúr na gCeall Fíorú pLVX-v5Per1 agus CRISPR-SAM. Chun a fhíorú go dtáirgeann pLVX-v5Per1 overexpression Per1 mRNA, aistríodh cealla luch HT22 (Institiúid Salk, La Jolla, CA, #T09031) le pLVX-v5Per1 nó pLVX-EV (Fig. 5a) ag baint úsáide as Lipofectaine LTX (Invitrogen). Mar an gcéanna, chun a fhíorú gur féidir leis an gcóras CRISPR-SAM trascríobh Per1 a thiomáint go héifeachtach, aistríodh cealla HT22 le dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast bronntanas ó Feng Zhang Addgene plasmid #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Ba bhronntanas ó Feng Zhang, Addgene plasmid #61426) é Blast, agus ach an oiread Ba bhronntanas ó Feng Zhang, Addgene plasmid #61427) é Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) nó an scRNA rialaithe neamhspriocdhírithe (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2)_zeo cnámh droma ó Feng Zhang, Addgene plasmid #61427) ag baint úsáide as Lipofectamine LTX (Invitrogen). Baineadh cealla tar éis 24 nó 48 h, lysed, agus scoiteadh mRNA mar a thuairiscítear thuas. Rinneadh qRT-PCR mar a thuairiscítear thuas ag baint úsáide as na primers Per1, Per2, agus Hes7 agus an taiscéalaí atá liostaithe i dTábla S4.

siRNA. Don turgnamh leagain Per1, caolaíodh RNAanna beaga isteach Accell SMARTpool (siRNAs; Dharmacon, GE) a dhírigh Per1 go tiúchan iomlán deiridh de 10 μM i ddH20 agus insileadh isteach sa DH (1.0 ul/taobh). Baineadh úsáid as siRNA linn snámha neamhdhírithe Accell mar an rialú (tiúchan iomlán, 10 μM) agus insileadh é ar an mbealach céanna. I gcás turgnaimh siRNA, láimhseáladh agus gnáthaíodh lucha mar a thuairiscítear thuas agus rinneadh máinliacht an lá tar éis lá deiridh an ghnáthaimh. Tugadh lá iomlán téarnaimh do lucha tar éis máinliachta agus cuireadh oiliúint orthu an lá dár gcionn (~48 h tar éis máinliachta) chun an sprioc uasta a bhaint anuas a chinntiú. Chun a chinntiú go leagfaí síos, íobraíodh lucha ~1 h tar éis tástála agus próiseáladh punches ón hippocampus droma le blotaí thiar chun a chinntiú go leagfaí síos próitéin PER1.

Suíomh réad agus aithint oibiachtacuimhnetascanna. Le haghaidh suíomh réad agus tascanna cuimhne aitheantais réad, láimhseáladh lucha ar feadh 2 nóiméad / lá ar feadh 4 lá agus ansin habituated chuig an gcomhthéacs ar feadh 5 nóiméad / lá ar feadh sé lá as a chéile in éagmais oibiachtaí. Le linn na hoiliúna, nochtadh lucha do dhá rud chomhionanna (eascraí 100 ml, stáin spíosraí, nó sealbhóirí coinneal gloine) agus ceadaíodh iad a iniúchadh ar feadh 10 nóiméad. Le linn na tástála coinneála (24 h níos déanaí le haghaidh fadtéarmachcuimhnenó 60 m níos déanaí le haghaidh cuimhne gearrthéarmach), ceadaíodh lucha a iniúchadh ar feadh 5 nóiméad. Le haghaidh suíomh réadcuimhne, aistríodh ceann amháin den dá réad coitianta go dtí suíomh nua. Le haghaidh aitheantais réadcuimhne, d'fhan láithreacha na n-oibiachtaí seasta ach cuireadh mír nua in ionad ceann amháin de na réada. Cuireadh tús le gnáthóga do chuimhne aitheantais oibiachta seachtain amháin ar a laghad tar éis críochnú na tástála OLM agus baineadh úsáid as comhthéacs nua agus réada neamhaithnidiúla48. Scóráladh taiscéalaíocht nuair a dhírigh ceann na luiche i dtreo an réad agus tháinig sé laistigh de 1 cm nó nuair a bhain an tsrón leis an réad. Taifeadadh an t-am taiscéalaíochta iomlán (t) agus tugadh tosaíocht don mhír núíosach mar innéacs idirdhealaithe (DI=(snovel -tfamiliar) / (snovel plus tfamiliar) x 100 faoin gcéad). Le haghaidh seisiúin oiliúna, baineadh úsáid as an réad a bhí ainmnithe le bogadh ag an tástáil mar réad nua chun go bhféadfaí comparáid dhíreach a dhéanamh idir an oiliúint agus an tástáil DI. Baineadh tuilleadh anailíse ar lucha a rinne iniúchadh ar an dá réad ar feadh níos lú ná 2 s le linn tástála nó 3 s le linn oiliúna. Baineadh lucha freisin a léirigh gurbh fhearr leo rud amháin le linn na hoiliúna (DI > ±20). Rinneadh anailís ar sheisiúin chónaithe (chun an fad a taistealaíodh agus an luas a chinneadh) ag baint úsáide as bogearraí anailíse iompraíochta AON Maze (Stoelting Co). Rinne turgnamhoirí dall ar na grúpaí turgnamhacha an nós, an oiliúint, an tástáil agus an scóráil go léir.

Comhthéacs eagla go riocht. Chun eagla comhthéacsúil a riochtú, láimhseáladh lucha ar feadh 5 lá ar dtús. Le linn na héadála, nochtadh lucha don chomhthéacs ar feadh 2 nóiméad agus 28 s agus turraing 2 s (0.75 mA) ina dhiaidh sin, prótacal a tháirgeann cuimhne láidir fadtéarmach12,20 de ghnáth. D’fhan lucha sa chomhthéacs ar feadh 30 s breise sular baineadh iad. Rinneadh lucha a íobairt 60 m tar éis na hoiliúna mar aon le rialtáin cáiste baile a láimhseáladh ach nár cuireadh oiliúint orthu. Tomhaiseadh iompar reo ag baint úsáide as bogearraí Ethovision 11 (Noldus)12.

Lúbra móide ardaithe. Turgnamh a bhí dall ar na grúpaí turgnamhacha a rinne an lúbra móide. Seachtain amháin tar éis críochnú ORM, rinneadh tástáil ar fho-thacar de lucha ar an lúbra móide. Bhí dhá arm an gcathair ghríobháin oscailte (30 × 5 cm) agus bhí dhá arm faoi iamh (30 × 5 × 15 cm), ceangailte ag ardán lárnach (5 × 5 cm). Ardaíodh an lúbra 40 cm os cionn an urláir. Rinneadh tástáil ar lucha ar feadh 5 nóiméad ar an ngaireas, rud a bhí comhdhéanta de gach luch a chur ar an ardán lárnach os comhair ceann de na géaga oscailte. Idir ábhair, glanadh an gcathair ghríobháin le 70 faoin gcéad eatánól. Scóráladh céatadán an ama a chaitear sna hairm dúnta agus oscailte trí úsáid a bhaint as bogearraí AON gcathair ghríobháin.

Anailís rithim circadian. Póraíodh lucha óga ({{0}}mo) agus ag dul in aois (18-mo) HDAC3 móide / móide agus HDAC3flox/flox agus cuireadh faoi thimthriall 12 h éadrom/dorcha (LD). Dhá sheachtain tar éis insileadh AAV-CaMKII-Cre (a thuairiscítear thuas), aistríodh lucha chuig seomra imghabhála scoite 12 h LD ar feadh 7 lá. Aistríodh lucha ansin isteach i seomra anailíse gníomhaíochta solaschosanta, áit a ndearnadh anailís ar ghníomhaíocht inneall gluaiste ag baint úsáide as brathadóirí gluaisne léasa optúla (Philips Respironics). Rinneadh monatóireacht ar an ngníomhaíocht le linn 2 sheachtain de threalmhú timthriall LD sa seomra solas-chosanta sular aistríodh lucha go dorchadas leanúnach (DD) ar feadh 3 seachtaine breise. Leanadh le monatóireacht ghníomhaíochta ar feadh na céime DD chun a fháil amach an raibh tionchar ag scriosadh HDAC3 sa RS ar rithimí circadian ingenous. Bailíodh sonraí trí úsáid a bhaint as Minimitter VitalView 5.0 agus úsáideadh bogearraí Clocklab (Actimetrics) chun tosú na gníomhaíochta in aisce a chinneadh. Ríomhadh luachanna Tau trí fhána an thosaigh seo a fháil agus na cearnóga is lú a d'oirfeadh le bogearraí Clocklab49,50 a ríomh.

Imdhíon-cheimic. Tar éis an t-iompar a chríochnú, rinneadh lucha a eothánú trí dhíláithriú ceirbheacsach agus baineadh a n-inchinn agus cuireadh flash-reoite in iseipitín fuar oighir. Bailíodh slisne fiche micriméadair ar fud an champais droma droma, iad suite ar shleamhnáin leáite agus stóráilte ag −80 céim . Socraíodh na sleamhnáin le 4 faoin gcéad paraformaildéad (10-nóiméad), tréscaoilteach i 0.01 faoin gcéad Triton X-100 i 0.1 M PBS (5-nóiméad) , agus bac ar feadh 1 h le 8 faoin gcéad serum gabhar gnáth (Jackson). Goradh sleamhnáin thar oíche (4 céim) in antashubstaint coinín go HDAC3 (1:250, Abcam, clón Y415, ab32369) nó V5 (1:1000, Abcam, ab9116), nó antasubstaint sicín go GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). An lá dár gcionn, nite agus gor na sleamhnáin ar feadh 1 h ag teocht an tseomra le frith-choinín gabhar Alexa 488 (HDAC3 agus V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) nó frith-sicín gabhar Alexa 488 (GFP ;1:1000, ThermoFisher, #A-11039) sa dorchadas. Ansin nite na sleamhnáin le PBST agus goraíodh iad ar feadh 50 m in NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), stainnín fluaraiseach nissl. Chun uathfhluaraiseacht neamhshonrach a scor51, nite slisní ansin i PBS le 0.01 faoin gcéad Triton, rinsed in uisce, agus gor ar feadh 10-nóiméad i 10 mM CuSO4 i maolán aicéatáit amóiniam 50 mM. Rinneadh slisní a rinsiú arís in uisce, nite i PBS, agus clúdaíodh iad le meán gléasta VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Fuarthas na híomhánna go léir le Scanóir Olympus VS110 le cuspóir apacrómatach 20x (cró uimhriúil 0.75) le bogearraí scanóir VS110. Rinneadh ionadaíocht ar gach grúpa cóireála ar gach sleamhnán agus gabhadh gach íomhá ar shleamhnán leis an am nochta céanna faoi choinníollacha neamhsháithithe. Rinneadh déine lipéadaithe imdhíonachta a chainníochtú le ImageJ trí dhlús optúil na ciseal cille a shampláil in CA1 agus trí shampla de fhluaraiseacht chúlra san íomhá chéanna a dhealú. I gcás gach turgnaimh AAV, rinneadh ainmhithe nár léirigh an víreas i limistéar CA1 den hippocampus droma a eisiamh ó anailísí. Rinne turgnamhoirí a bhí dall ar na coinníollacha turgnamhacha íomháú agus cainníochtú.

blot an iarthair. Chun cniogadh PER1 a fhíorú, íobraíodh lucha siRNA Per1 agus siRNA rialaithe 2 h tar éis tástála agus rinneadh na hinchinn a reo ar bhonn flash. Gearradh corónach ar an inchinn agus bailíodh punches 1 mm DH as slisne 500 μm. Rinneadh punches a homogenized i maolán T-PER (Thermo Fisher) le Halt protease agus inhibitor phosphatase (Thermo Fisher) ag baint úsáide as homogenizer Dounce. Rinneadh lísáití próitéine a chainníochtú trí úsáid a bhaint as measúnacht Bradford mionathraithe (BioRad) agus lódáladh 50 lysate próitéin iomlán isteach i ngach lána de ghlóthach NuPAGE Bis-Tris (Thermo Fisher) 7.5 faoin gcéad. Rith glóthacha ar feadh 50 nóiméad ag 200 volta agus aistríodh blotaí thar oíche ag 15 V ag 4 chéim go seicní nítrigeallalóis (Novexi, LC2001). An lá dár gcionn, goraíodh seicní i maolán blocála ar feadh 1 h (5 faoin gcéad bainne neamhshaille i saline maolánach Tris le 0.01 faoin gcéad Tween 20), nite (0.1 faoin gcéad Tween 20 in TBS) agus ansin gortha in antashubstaint phríomhúil (1:500, coinín frith-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) i maolán antashubstainte bunscoile (3 faoin gcéad BSA i TBS le 0.1 faoin gcéad Tween) thar oíche ag 4 céim . Ansin nite agus goradh na seicní in antashubstaint luiche comhchuingeach HRP go coinín (1:10,000, Jackson Laboratories, slabhra-sainiúil éadrom, #{211-032-171) ar feadh 1 h. Rinneadh scannáin a ní agus a fhorbairt ag baint úsáide as Foshraith Chemiluminescent Pierce SuperSignal West Pico (Pierce, 34077). Baineadh úsáid as il-nochtadh scannán chun líneacht a fhíorú. Rinneadh blotaí a ní agus a bhaint ar feadh 10 m le Restore Western Blot Stripping Maolán (Thermo Fisher #21059), nite arís, agus ansin athscrúdú thar oíche (4 céim ) le antasubstaint coinín chuig GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biteicneolaíocht, SC25778). ). Taispeántar blotaí fad-fhad PER1 agus GAPDH i bhFíor Forlíontach 5. Ríomhadh dlúis optúla choibhneasta ó scannán scanadh ag baint úsáide as ImageJ (Institiúidí Náisiúnta Sláinte na SA) ag turgnamhaí a bhí dall ar na coinníollacha turgnamhacha. Normalaíodh na luachanna go léir go leibhéil slonn GAPDH.

qRT-PCR. Bailíodh fíocháin ó phunches DH (a gcuirtear síos orthu thuas) agus reoite ag −80 céim go dtí go bpróiseáiltear é. Rinneadh RNA a leithlisiú ag baint úsáide as Minikit RNeasy (Qiagen, #74104) agus cruthaíodh cDNA ag baint úsáide as an trealamh Sintéise cDNA Transcriptor First Strand (Roche, 04379012001). Díorthaíodh primers agus tóireadóirí ón Roche Universal ProbeLibrary (Tábla S4) agus úsáideadh iad le haghaidh ilphléacsála sa mheaisín Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Normalaíodh na luachanna go léir go Gapdh. Rinneadh anailísí agus staitisticí ag baint úsáide as algartaim dílseánaigh Roche agus bogearraí REST 2009 bunaithe ar mhodh Pfaffl52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >Áiríodh 9 gcinn inár n-anailís. Ullmhaíodh leabharlanna cDNA do gach grúpa de réir Threoir Ullmhúcháin Samplach TruSeq RNA (Illumina). Glanadh dhá chéad caoga nanogram de RNA iomlán ó gach luch le coirníní maighnéadacha poly-T oligo-ceangailte agus ilroinnte teasa. Ansin rinneadh an cDNA an chéad agus an dara snáithe a shintéisiú agus a íonghlanadh. Tar éis na foircinn a bheith blunted, adenylated an foirceann 3′ chun cosc ​​a chur le comhcheangail an teimpléid le linn ligation cuibheora. Do gach grúpa, cuireadh tacar cuibheora uathúil le foircinn an cDNA agus mhéadaigh PCR na leabharlanna. Rinne Bioanalyzer measúnú ar cháilíocht na leabharlainne agus rinneadh é a chainníochtú ag baint úsáide as qRT-PCR le cuar caighdeánach a ullmhaíodh ó leabharlann seicheamhaithe tráchtála (Illumina). Rinneadh ilphléacs ar shamplaí, agus léiríodh gach grúpa iompraíochta i ngach sreabhchill den seicheamhóir. Comhthiomsaíodh 10 nm de gach leabharlann i gceithre leabharlann ilphléacs agus rinneadh seicheamhú orthu ar ionstraim Illumina HiSeq 2500 le linn seicheamhú aon léite 50 bp, arna reáchtáil ag an Áis Ard-Thréchur Ghéanómaíoch ag Ollscoil California, Irvine. Rinneadh na sonraí seicheamhaithe do gach leabharlann a iarphróiseáil chun comhaid FastQ a tháirgeadh. Rinneadh na sonraí a dhí-ilphléascadh agus a scagadh ansin trí úsáid a bhaint as bogearraí Illumina CASAVA 1.8.2 chomh maith le bogearraí intí. Baineadh léamha ar dhroch-chaighdeán (ar theip ar thástálacha caighdeánacha cáilíochta Illumina) agus léamha rialaithe a bhí ailínithe go rathúil le genome rialaithe PhiX as anailísí. Rinneadh measúnú breise ar cháilíocht na seichimh a bhí fágtha agus úsáid á baint as scóir cháilíochta PHRED a táirgeadh i bhfíor-am le linn na céime bonnghlao den rith seicheamhaithe (Fíor Fhorlíontach Fíor 3a).

Ailíniú leis an ngéanóm tagartha agus an tras-scríbhinn. Rinneadh léamha gach turgnaimh a ailíniú go leithleach leis an ngéanóm tagartha agus leis an tras-scríbhinne comhfhreagrach ag baint úsáide as ailínithe gearrléithe ELAND v2e (Illumina) agus Bowtie24. Áiríodh sa tras-scríbhinn léitheanna atá ailínithe go sainiúil ag an dá uirlis le hacomhail eorna nó splice aitheanta nach raibh níos mó ná dhá mhímheaitseáil ar aon phíosa 25 bp den léamh. Léamh ailínithe go uathúil, ach le níos mó ná dhá mhímheaitseáil ar aon phíosa 25 bp den léamh baineadh as anailísí. Ar an gcaoi chéanna, baineadh léamha a bhí ag teacht le roinnt suíomhanna sa ghéanóm tagartha ón anailís. Tuairiscítear céatadán na léamha a shanntar don ghéanóm tagartha agus don tras-scríbhinn ag baint úsáide as an bprótacal seo do gach grúpa macasamhla (Fíor Fhorlíontach Fíor. 3b). Mar thoradh air seo bhí thart ar 30 milliún léamh ar an meán in aghaidh an tsampla.

Chun láithreacht na plasmid pLVX agus CRISPR-SAM a fhíorú tar éis insileadh lentiviral, ritheamar seicheamhú RNA ar shamplaí hippocampal ó fho-thacar de thrí ainmhí in aghaidh an ghrúpa tar éis iompar. Toisc go raibh líon na gceall ionfhabhtaithe leis an lentiviruses in vivo ró-bheag chun láithreacht na n-athscríbhinní cuí a bhrath go hiontaofa ag baint úsáide as RT-qPCR (Fíor Forlíontach 6a, d), d'úsáideamar RNA-seq mar mhodh níos íogaire chun an láithreacht a bhrath. de na tras-scríbhinní seo. Tógadh leagan nuashonraithe de thionól géanóm agus anótáil ghéanóim trí sheichimh agus anótáil na dtógálacha plasmid a chur i gceangal le bunghéanóm na luiche mm10 agus leis an nóta géanóim luiche mm10, faoi seach. Ag baint úsáide as an uirlis ailínithe léann TopHat sa Tuxedo Suite54, rinneadh léamha a mhapáil chuig an ngéanóm agus níor measadh ach amais a bhí uathúil do na tras-scríbhinní plasmid i gcomparáid leis an ngéanóm tagartha luch ingenous mar “léamh meaitseála” do na tógálacha plasmid. Rinneadh líon na léamha comhoiriúnaithe sin a chainníochtú ansin do gach tógáil do gach sampla.

Léiriú géine agus anailís dhifreálach. Ríomhadh leibhéil slonn géine go díreach ó na torthaí ailínithe léite do gach macasamhail. Baineadh luachanna caighdeánacha RPKM55, léamha in aghaidh an chileagraim de shamhail exon in aghaidh an mhilliúin léamh léarscáilithe) do gach géine a chlúdaítear leis na sonraí seicheamhaithe agus gach macasamhail a úsáideadh sa staidéar seo.

Rinneadh anailísí tras-scríobhacha difreálacha trí úsáid a bhaint as Cyber ​​T56,57 thar gach péire grúpaí (cáis baile i gcoinne 60 m tar éis oiliúna) chun géinte suas-nó síos-rialaithe a aithint i ndiaidh OLM. Chomh maith leis na lucha 18-mí d'aois HDAC3 móide / móide agus HDAC3flox/flox atá oilte don staidéar reatha, próiseáladh sonraí seicheamhaithe RNA mar an gcéanna ó {{1{0}}mí d'aois lucha cineál fiáin C57 ( cage baile agus OLM-oilte ar an mbealach céanna leis an staidéar reatha) ó staidéar roimhe seo20 le haghaidh anailísí difreálach. Ba é líon na n-ainmhithe (macasamhlacha bitheolaíocha) do gach grúpa ná: HDAC Óga móide / móide HC: 6, Óga HDAC3 móide / móide OLM: 6, Sean HDAC3 móide / móide HC: 6, Sean HDAC3 móide / móide OLM: 6, Sean HDAC3flox/flox HC: 8, Sean HDAC3flox/flox OLM: 8. Níor úsáideadh macasamhla teicniúla. Is é 0.05 an tairseach p-luach a úsáidtear chun slonn difreálach a chinneadh do gach grúpa. Baineadh úsáid as Ráta Fionnachtana Bréagach (FDR) arna thomhas ag an q-luach Benjamini & Hochberg (BH) chun a cheartú le haghaidh tástála iolrach, le tairseach FDR de 0.15. Trasnaíodh na tacair géinte arna n-uasrialú tar éis na taithí (i gcomparáid le cage baile) do na 3 ghrúpa seo (cineál fiáin óg, HDAC móide / móide ag dul in aois, nó HDAC3flox / flox ag dul in aois) chun géinte a bhí coitianta ag dhá ghrúpa nó níos mó a chinneadh. Rinneadh measúnú ar shaibhriú gach grúpa le haghaidh slonn sainiúil fíocháin, téarmaí Géine Ontology58, agus cosáin KEGG59,60 ag baint úsáide as DAVID61, bunaithe ar ghéinte sainráite go difreálach tar éis iompair. Rinneadh léirshamhlú sonraí ag baint úsáide as "matplotlib" le haghaidh python agus "ggplot" le haghaidh R.

Imdhíonadh cromatin. Rinneadh ChIP ar phunches DH bunaithe ar an bprótacal ó threalamh Millipore ChIP11,12,62. Bhí fíocháin tras-nasctha le 1 faoin gcéad formaildéad (Sigma), lysed agus sonicated, agus bhí crómatin immunoprecipitated thar oíche le 2 ul de frith-H4K8Ac (Millipore #17-10099) nó 4 ul de frith-HDAC3 (Millipore #{{ 13}}) nó méid comhionann de Shéiream Coinín Gnáth (rialú diúltach H4K8Ac, Millipore) nó IgG frith-luch (rialú diúltach HDAC3, Millipore). Tar éis níocháin, fágadh crómatin as na coirníní agus rinneadh é a thrasnascadh ar ais i láthair na bpróitéine K roimh íonú DNA an cholúin. Dhear clár Primer 3 (Tábla S4) seichimh primer do thionscnóirí gach géine. Scrúdaíodh cúig ul ionchuir, frith-H4K8Ac IgG/frith-HDAC3 IgG, nó imdhíon-réamhshamhlú IgG frith-choine/luiche ó gach ainmhí i ndúblach. Chun sonraí ChIP-qPCR a normalú, úsáideamar an modh ionchuir faoin gcéad. Coigeartaíodh an sampla ionchuir go 100 faoin gcéad agus ríomhadh na samplaí IP agus IgG araon mar faoin gcéad den ionchur seo ag baint úsáide as an bhfoirmle 100*AE^ (ionchur coigeartaithe – Ct(IP)). Rinneadh saibhriú fillte a ríomh ansin mar chóimheas idir an Sliseanna agus an meán IgG. Cinntíonn cuar caighdeánach inphláta éifeachtúlacht aimpliúcháin (AE).

Slice a ullmhú agus a thaifeadadh. Rinneadh lucha óga (thart ar 3-mo) agus lucha aosaithe (18-mo) a insileadh go steiréitíteach leis an víreas. Don chéad turgnamh, insileadh lucha HDAC3 móide/móide óg agus aosta agus lucha HDAC3flox/flox le AAV-CaMKII-Cre go déthaobhach isteach sa DH. Don dara turgnamh, rinneadh lucha fiáine C57 idir óg agus aosta a insileadh le AAV-HDAC3(Y298H) isteach i DH leathsféar amháin agus rialú AAV-EV isteach sa leathsféar eile. Dhá sheachtain tar éis an insileadh (chun an léiriú víreas is fearr is féidir a cheadú)2, cuireadh slisní trasnacha hippocampal (320 μm) i seomra taifeadta comhéadain le leacht cerebrospinal saorga réamhthéite (31 ± 1 céim) (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM KH2PO4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, agus 10 mM D-glúcóis). Bhí blúiríní perfused go leanúnach ag ráta 1.75–2 ml in aghaidh an nóiméid agus bhí dromchla na slisní nochta do 95 faoin gcéad O2/5 faoin gcéad CO2 taisithe te. Cuireadh tús leis na taifeadtaí tar éis 2 h goir ar a laghad.

Taifeadadh poitéinseal postsynaptic excitatory allamuigh (fEPSPanna) ó CA1b stratum radiatum ag baint úsáide as pípéad gloine amháin (2–3MΩ) líonadh le 2 M NaCl. Seachadadh bíoga spreagtha (0.05 Hz) do réamh-mheastacháin comhthaobhachta-coimisiúnaithe Schaffer ag baint úsáide as leictreoid spreagthach dépholach (sreang niocróim chasta, 65 μm) suite in CA1c. Coigeartaíodh an déine reatha chun 50 faoin gcéad den fhreagra fEPSP uasta a fháil. Tar éis bunlíne chobhsaí a bhunú, tionscnaíodh LTP le traein amháin de chúig phléasc téite, inar seachadadh gach pléasctha (ceithre chuisle ag 100 Hz) 200 ms óna chéile (.i. ag minicíocht téite). Níor mhéadaíodh an déine spreagtha le linn TBS. Bailíodh sonraí agus rinne siad digitiú ar an gCóras Fála Neurodata NAC 2.0 (Theta Burst).

Anailís staitistiúil. Rinneadh anailís staitistiúil mar a léiríodh sa téacs agus sa bhfíorscéal ag baint úsáide as Prism 6 (GraphPad). Tá ár gcur chuige anailíse bunaithe ar shaothar a foilsíodh roimhe seo12,20,63,64. Níor úsáideadh aon mhodhanna staitistiúla chun méideanna samplaí a réamhchinneadh, ach tá ár méideanna samplacha cosúil leis na cinn a úsáidtear go ginearálta sa réimse, lena n-áirítear iad siúd a tuairiscíodh sna foilseacháin roimhe seo12,20,64,65. Glacadh leis go raibh dáileadh sonraí gnáth, le hathraitheas comhchosúil faoi deara i measc grúpaí, ach níor tástáladh é seo go foirmiúil. Nuair a bhí dhá ghrúpa le comparáid a dhéanamh i dturgnamh, baineadh úsáid as t-tástálacha déearbaill an Mhic Léinn. Nuair a rinneadh comparáid idir dhá thoisc, (amhail aois agus géinitíopa nó seisiún agus grúpa), rinneadh anailís ar shonraí le ANOVAanna dhá bhealach agus tástálacha iar hoc comparáidí iolracha Sidak ina dhiaidh sin. Tá na hanailísí go léir dhá eireaball, agus tá luach 0.05 ag teastáil le haghaidh tábhachta. Léiríonn barraí earráide i ngach figiúir SEM. I gcás gach turgnaimh, measadh luachanna ± 2SD ó mheán an ghrúpa mar asluiteacha agus baineadh de na hanailísí iad.

Infhaighteacht sonraí. Tá na sonraí a thacaíonn le torthaí an staidéir seo ar fáil ón údar comhfhreagrach arna iarraidh sin go réasúnach. Tá sonraí seicheamhaithe RNA curtha i dtaisce in Omnibus Gene Expression NCBI agus tá siad inrochtana trí uimhir aontachais Shraith GEO GSE94832.

Tagairtí

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Cuireann athruithe epigenetic sa núicléas suprachiasmatic agus hippocampus le meath cognaíocha a bhaineann le haois. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Rithimí circadian agus foirmiú cuimhne. Nat. An tUrr Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et al. Oscillation circadian de ghníomhaíocht hippocampal MAPK agus cAmp: impleachtaí do bhuanseasmhacht cuimhne. Nat. Neurosci. 11, 1074– 1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Modhnú foghlama agus cuimhne circadian i lucha a bhfuil eagla orthu. iompar. Brain Res. 133, 95–108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV An clog circadian agus paiteolaíocht na hinchinne atá ag dul in aois. Nat. An tUrr Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Tréimhse1 geataí an modhnú circadian comharthaí cuimhne-ábhartha i hippocampus luch trí rialú a dhéanamh ar shuttling núicléach an CREB kinase pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Hipitéis epigenetic de mhífheidhm chognaíoch a bhaineann le dul in aois. Neurosci ag dul in aois tosaigh. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et al. Tá baint ag aicéitiliú histone athraithe le lagú cuimhne aois-spleách i lucha. Eolaíocht 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. Feabhsaíonn cosc ​​H3K9me3 cuimhne, cuireann sé foirmiú spine chun cinn, agus méadaíonn sé leibhéil BDNF sa hippocampus d'aois. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Ranníocaíochtaí epigenetic le haosú cognaíocha: meon agus saolré a dhícheangal. Foghlaim Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. Cuireann coscóir roghnach HDAC le díothú iompair atá á lorg cóicín ar bhealach leanúnach. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL et al. Déantar comhthéacs agus eagla éisteachta a rialú go difreálach ag gníomhaíocht HDAC3 i bhfonúicléas cliathánach agus basal an amygdala. Neuropsychopharmacology 42, 1284-1294 (2017).

13. McQuown, SC et al. Is rialtóir diúltach ríthábhachtach é HDAC3 maidir le foirmiú cuimhne fadtéarmach. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM et al. Scaoileann cosc ​​​​deacetylase Histone trí RGFP966 na coscáin ar phlaisteacht cortical céadfach agus ar shainiúlacht foirmiú cuimhne.J. Neurosci. 35, 13124– 13132 (2015).

15. Lahm, A. et al. Ag réiteach na gníomhaíochta catalaíoch folaithe de dheacetylases histone rang IIa veirteabrach. Proc. Natl Acad. Sci. Stáit Aontaithe Mheiriceá 104, 17335 – 17340 (2007).

16. Sun, Z. et al. Éilíonn feidhm deacetylase-neamhspleách HDAC3 i trascríobh agus meitibileacht croíbhrúiteoir receptor núicléach. Mol. Cill 52, 769–782(2013).

17. Alaghband, Y. et al. Róil ar leith don fhearann ​​deacetylase de HDAC3 sa hippocampus agus cortex réamhéadanach medial i bhfoirmiú agus díothú na cuimhne. Neurobiol. Foghlaim. Mem. 145, 94–104 (2017).

18. Nott, A. et al. Comhlaigh Histone deacetylase 3 le MeCP2 chun FOXO agus iompar sóisialta a rialáil. Nat. Neurosci. 19, 1497–1505 (2016).

19. Tá Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histone deacetylase 3 riachtanach le haghaidh forbairt inchinne cuí. J. Biol. Ceimic. 289, 34569–34582(2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. Tá an fo-aonad rialála crómatin sonrach do néaróin BAF53b riachtanach le haghaidh plaistigh shionaptach agus cuimhne. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Fachtóirí trascríobh i gcuimhne fadtéarmach agus plasticity synaptic. Fisiol. Ath. 89, 121-145 (2009).

22. Barnes, CA Potentiation fadtéarmach agus an inchinn ag dul in aois. Fealsúnacht. tras. R. Soc. Londain. B 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML et al. Bunachar sonraí Brabhsálaí Genome UCSC: nuashonrú 2016. Aigéid Núicléacha Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Ultrafast agus ailíniú cuimhne-éifeachtach de sheichimh ghearra DNA leis an ngéanóm daonna. Géanóim Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Nochtann anailísí slonn hippocampal baint roghnach de bhealaí láithreach-luath, neuroenergetic, agus myelinogenic le lagú cognaíocha i bhfrancaigh aosta. J. Neurosci. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Róil difreálach do Nr4a1 agus Nr4a2 i suíomh oibiachta vs cuimhne fadtéarmach aitheanta oibiachta. Foghlaim Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Éifeachtaí díothachta codlata agus dul in aois ar chuimhne fadtéarmach agus iargúlta i lucha. Foghlaim Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. Comhordaíonn LINN1 rithimí hippocampal agus próiseáil cuimhne le linn an lae. Hippocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. et al. Tacaíonn dinimic ama na luiche cloig hippocampal slonn géine le próiseáil cuimhne. Hippocampus 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Tacaíonn ascaluithe circadian laistigh den hippocampus le foirmiú cuimhne agus le buanseasmhacht. Mol tosaigh. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Léiriú géine ag brath ar thaithí sa hippocampus francach tar éis foghlama spásúlachta: comparáid idir na géinte láithreach-luath Arc, c-fos, agus zif268. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Mionathruithe Kouzarides, T. Chromatin agus a bhfeidhm. Cill 128, 693–705(2007).

33. Konermann, S. et al. Gníomhachtú tras-scála genome-scála ag coimpléasc CRISPR-Cas9 a ndearnadh innealtóireacht air. Nádúr 517, 583–588 (2015).

34. Athbhunaíonn Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Histone deacetylase 3 clibeáil synaptic agus gabháil le linn dul in aois trí ghníomhachtú fachtóir núicléach kappa B. Sci. Ionadaí 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et al. Fianaise shionaptach d'éifeachtúlacht na foghlama spásála. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. Bíonn tionchar ag baint fócasach hippocampal CBP ar mhionathruithe histone ar leith, ar chumas fadtéarmach agus ar chuimhne fhadtéarmach. Neuropsychopharmacology 36, 1545-1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Éilíonn potentiation fadtéarmach méadaithe ag synapses cille gráinnín cosán medial-perforant-dentate a tharlódh de bharr chosc roghnaíoch histone deacetylase 3 próitéin mhoilliú meabhrach leochaileach X. Neurobiol. Foghlaim. Mem. 114, 193–197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB agus cuimhne. Annú. An tUrr Neurosci. 21, 127–148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Róil fheidhmiúla CREB mar rialtóir dearfach i bhfoirmiú agus feabhsú cuimhne. Brain Res. Tarbh. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Tá an géine a ionchódaíonn an próitéin leochaileach X RNA-ceangailteach á rialú ag fachtóir riospráide núicléach 2 agus an teaghlach CREB fachtóirí trascríobh. Aigéid Núicléacha Res. 34, 1205– 1215 (2006).

41. Wang, H. et al. Róil CREB i rialáil FMRP ag gabhdóirí glutamáit meiteabrópacha grúpa I sa cortex cingulate. Mol. Inchinn 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monacó, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. D'athraigh rithimí iompraíochta agus léiriú géine clog i lucha le sóchán spriocdhírithe sa ghéin Tréimhse1. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. et al. Tá athruithe meitilation DNA i ngéinte plaistigh ag gabháil le foirmiú agus cothabháil na cuimhne. Nat. Neurosci. 19, 102–110 (2016).

44. Diúc, CG, Ceanadach, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Atheagrú eipigineach ag brath ar thaithí sa hippocampus. Foghlaim Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Tá ról lárnach ag géine clog, tréimhse, i bhfoirmiú cuimhne fadtéarmach i Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058– 16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Tá íogrú agus luach saothair cóicín faoi thionchar ghéinte agus rithim circadian. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Braitheann ascalú laethúil MAP (próitéin gníomhachtaithe mitogen) kinase agus gníomhaíochtaí adenylyl cyclase sa hippocampus ar an núicléas suprachiasmatic. J. Neurosci. 31, 10640– 10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Scrúdú a dhéanamh ar shuíomh oibiachta agus cuimhne aitheantais réad i lucha. Curr. Prótacal. Neurosci. 69, 1–17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. Rialaíonn an clog circadian sa hypothalamus ventromedial caiteachas timthriallach fuinnimh. Metab Cille. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Feinitíopáil rithimí circadian i lucha. Curr. Prótacal. Luch Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Laghdú ar uathfhluaraiseacht cosúil le lipofuscin i bhfíocháin a bhfuil lipéadú fluaraiseacha orthu. J. Histochem. Cítochem. 47, 719–730 (1999).

52. Pfaffl, MW Samhail mhatamaiticiúil nua do chainníochtú coibhneasta i bhfíor-am RT-PCR. Aigéid Núicléacha Res. 29, e45 (2001).

53. Pfaffl, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Uirlis bhogearraí slonn choibhneasta (REST) ​​le haghaidh comparáide grúpa agus anailís staitistiúil ar thorthaí slonn coibhneasta i PCR fíor-ama. Aigéid Núicléacha Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et al. Anailís géine difreálach agus slonn tras-scríofa ar thurgnaimh RNA- seq le TopHat agus Cufflinks. Nat. Prótacal. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Tras-scríbhinní mamaigh a mhapáil agus a chainníochtú de réir RNA-Seq. Nat. Modhanna 5, 621–628 (2008).

56. Freastalaí gréasáin Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T: anailís dhifreálach ar shonraí tréchur ard. Aigéid Núicléacha Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Creat Bayesach chun anailís a dhéanamh ar shonraí slonn micrea-eagair: t-tástáil rialta agus tátail staitistiúla ar athruithe géine. Bithfhaisnéisíocht 17, 509–519 (2001).