Cuid 1: Glicóisídí Feinileatánóideach Cistanche Tubulosa a Spreagann Apoptosis de Chealla Carcanóma Hepatocellular agus Feabhsaigh Éifeacht Antitumor
Mar 25, 2022
Teagmháil: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, agus Jinyao Li, PhD1
Teibí
Feadáin chistíníIs cineál de leigheas luibhe Síneach é agus feidhmíonn sé feidhmeanna bitheolaíocha éagsúla. Tá sé léirithe ag staidéir roimhe seo go bhfuilGlicóisídí feinileatánóideach cistanche tubulosa(CTPG) éifeachtaí antitumor ar éagsúlacht de chealla meall. Mar sin féin, tá iarmhairtí frith-tumóra CTPG ar chealla carcanóma hepatocellular HepG2 agus BEL-7404 doiléir fós. Léirigh ár staidéar gur chuir CTPG bac suntasach ar fhás cealla HepG2 agus BEL-7404 trí ghabháil timthriall cille agus apoptosis a ionduchtú, a bhain le gníomhachtú conairí MAPK arb iad is sainairíonna iad fosfarylation uasrialaithe p38, JNK, agus ERK1/2 agus cosán cleithiúnach miteachondrial arb iad is sainairíonna é an laghdú ar an bpoitéinseal membrane miteachondrial. Méadaíodh scaoileadh cíteochrome c agus scoilteacht caspase-3, -7, -9, agus PARP ina dhiaidh sin trí chóireáil CTPG. Ina theannta sin, chuir CTPG go mór faoi chois imirce HepG2 trí leibhéil maitrís metalloproteinase-2 agus fachtóirí fáis endothelial soithíoch a laghdú. Is díol suntais é, ní hamháin gur chuir CTPG feabhas ar iomadú splenocytes ach laghdaigh sé freisin apoptosis splenocytes de bharr cisplatin. Sa mhúnla luch meall H22, chuir CTPG in éineacht le cisplatin bac breise ar fhás cealla H22 agus laghdaigh sé fo-iarsmaí cisplatin. Le chéile, chuir CTPG bac ar fhás HCC trí éifeacht dhíreach antitumor agus éifeacht feabhsaithe imdhíonachta indíreach, agus d'fheabhsaigh sé éifeachtúlacht antitumor cisplatin.
Eochairfhocail Cistanche tubulosa gliocóisídí feinileatánóideach, apoptosis, conair MAPK, cosán cleithiúnach mitochondria, cisplatin, feabhsú imdhíonachta
Tá an éifeacht frith-meall ag Cistanche.
Cliceáil chun táirgí Cistanche agus Cistanches
Réamhrá
Réamh-mheasadh gurb é ailse ae an séú ailse is coitianta a diagnóisíodh agus an ceathrú príomhchúis le bás ailse ar fud an domhain in 2018, le thart ar 841 000 cás nua agus 782000 bás gach bliain in Oirdheisceart na hÁise (Mhongóil, an Chambóid, agus Vítneam). .1 Sa tSín, ba í ailse ae an tríú príomhchúis le bás a bhain le hailse in 2015.2 Carcanóma heipiteacheallach (HCC) ar fud an domhain is ea níos mó ná 90 faoin gcéad d’ailsí ae príomhúla. Faoi láthair, is iad heipitíteas, trasphlandú ae, agus ablation tréchraicneach na príomh-mhodhanna chun HCC a chóireáil. Ar an drochuair, tá na cóireálacha seo éifeachtach do 30 faoin gcéad de na hothair a diagnóisíodh le hailse luath ae, agus caithfidh othair a diagnóisíodh le hailse ae chun cinn (arb ionann é agus 40 faoin gcéad) brath ar chóireáil mhaolaitheach chun a gcuid ama marthanais a leathnú.3,4 Sorafenib i gcomhar le hepatic. Is teiripe mhaolaitheach tábhachtach agus coitianta é an cheimileabólacht artaireach don chuid is mó d’othair le HCC chun cinn sa réigiún Áise-Aigéan Ciúin.5 Sorafenib, arna fhormheas ag FDA i 2006 le haghaidh cóireáil ailse ae chun cinn, is inhibitor kinase iolrach a chuireann bac ar iomadú cille meall agus soithíoch. táirgeadh agus cuireann sé apoptosis cille meall chun cinn. Síneann Sorafenib go suntasach am marthanais an othair faoi 3 go 5months ach tá fo-iarsmaí tromchúiseacha aige agus tá dlúthbhaint aige le tarlú frithsheasmhacht in aghaidh drugaí.6 Dá bhrí sin, tá sé práinneach drugaí nó straitéisí nua a fhorbairt do HCC.
Baineadh úsáid as leigheas traidisiúnta Síneach (TCM) ina n-aonar nó i gcomhcheangal le straitéisí eile chun HCC a chóireáil agus léirigh sé buntáistí cliniciúla lena n-áirítear am marthanais leathnaithe, cáilíocht beatha feabhsaithe, frithghníomhartha díobhálacha laghdaithe, agus mar sin de.7,8Cistancheis TCM é ina bhfuil gliocóisídí feinileatánóideach (PhGs), iridoids, lignin, agus polaisiúicrídí a bhfuil feidhmeanna bitheolaíocha éagsúla aige, mar shampla feidhmeanna frith-ocsaídiúcháin, frith-athlasadh, frith-aosaithe, feabhsaithe cuimhne, agus feabhsaithe imdhíonachta.9 Rinneadh breithniú ar PhGanna mar na comhpháirteanna gníomhacha móra de Cistanche, agus tá feidhmeanna iolracha acu lena n-áirítear frith-ocsaídiúcháin, frith-athlasadh, frith-apoptosis, hepatoprotection, agus neuroprotection.10-12 Thuairiscigh ár ngrúpa goCistanchegliocóisídí feanilethanoid tubulosa(CTPG) d’fhéadfadh bac a chur ar fhás cealla melanoma B16-F10, cealla carcinoma esophageal Eca{-109, agus cealla HCC H22 trí chonairí comharthaíochta eistreach nó intreacha in vitro nó in vivo; ina theannta sin, bhí éifeacht imdhíon-spreagthach ag CTPG.13-15
Sa staidéar seo, rinneamar imscrúdú ar éifeacht antitumor agus meicníocht CTPG ar chealla HepG2 agus BEL-7404 in vitro, rinneamar anailís ar fheidhm inmunomodulatory CTPG in vitro agus in vivo, agus rinneamar measúnú breise ar éifeacht theiripeach CTPG in éineacht leis an ceimiteiripe. cisplatin drugaí ar lucha meall HCC H22 in vivo. Fuaireamar amach go bhféadfadh CTPG bac a chur ar fhás cealla HepG2 agus BEL-7404 trí apoptosis atá ag brath ar mhiotochondria agus an chonair chomharthaíochta MAPK. Chuir CTPG bac suntasach ar imirce cealla HepG2 trí leibhéil maitrís metalloproteinase-2 (MMP-2) agus fachtóir fáis endothelial soithíoch (VEGF) a laghdú. Ina theannta sin, chuir CTPG iomadú agus gníomhachtú cealla imdhíonachta chun cinn agus d'fheabhsaigh sé díolúine lucha. Rud atá tábhachtach, is féidir le CTPG in éineacht le cisplatin bac breise a chur ar fhás cealla H22 in vivo agus laghdaítear fo-iarmhairtí cisplatin.
Feabhsaíonn Cistanche díolúine.
Abhair agus modhanna
Ainmhithe
Ceannaíodh tuairim is 6 go 8 seachtaine d’aois BALB/c fireann, lucha Kunming, agus lucha baineann C57BL/6 ó Ionad na Saotharlainne Ainmhithe, Ollscoil Leighis Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, an tSín) agus iad lonnaithe i saoráid ainmhithe de chuid Ollscoil Xinjiang le teocht an tseomra. (RT) 25±3 céim , agus tréimhse éadrom-dhorcha 12/12 uair an chloig.
Línte Cille agus Cultúr Cille
Ceannaíodh na cealla murine H22 ó Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, an tSín) agus fuarthas cealla daonna HCC HepG2 agus BEL-7404 ó Phríomhshaotharlann Acmhainní Bitheolaíochta Xinjiang agus Innealtóireacht Ghéiniteach, Ollscoil Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, an tSín) agus saothraithe i meán RPMI 1640 (Gibco, SAM) nó meán Eagle modhnaithe Dulbecco (DMEM) (Gibco) ina bhfuil 10 faoin gcéad de serum bó féatais féatais neamhghníomhaithe teasa (MRC, an tSín), 1 faoin gcéad L-. glutamine (100mM), peinicillin 100U/mL, agus streiptimícin 100ug/mL ag 37 céim in atmaisféar tais de 5 faoin gcéad CO2.
Crómatagrafaíocht Leachtach Ardfheidhmíochta (HPLC)
Rinne HPLC na príomh-chomhdhúile CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, an tSín) a cháiliú agus a chainníochtú mar a tuairiscíodh roimhe seo.13 Baineadh úsáid as Colún ZORBAX SB-C18 (250 × 4.6mm; 5μm) agus is éard a bhí sa chéim shoghluaiste ná 0.2 faoin gcéad de thuaslagán aigéad formach agus meatánól le grádán ó 23 faoin gcéad go 31 faoin gcéad. Instealladh agus aimsíodh sampla 10μL san iomlán ag 330 nm. Baineadh úsáid as na caighdeáin echinacoside agus acteoside (Yuanye, Shanghai, an tSín) chun anailís a dhéanamh ar chomhpháirteanna CTPG.
echinacoside
Anailís ar Inmharthanacht na gCeall
Rinneadh measúnú ar éifeachtaí antitumor CTPG ar chealla HepG2 agus BEL-7404 trí úsáid a bhaint as MTT (3-(4, 5-démheitil-2-thiazolyl)-2, {{7 }}défheinile-2-bróimíd H-tetrazolium). Plátáladh cealla HepG2 agus BEL-7404 isteach i 96-plátaí tobair (5 × 1{04 chealla/tobar) agus déileáladh leo le 0, 2{{{{5-0, 400, agus 600 ug/mL CTPG ar feadh 24 agus 48 uair an chloig, faoi seach, tar éis 24 uair an chloig goir ag 37 céim . Baineadh úsáid as thart ar 35 ug/mL cisplatin (Yuanye) mar rialú dearfach. Ansin cuireadh 100 μL MTT (0.5mg/mL, caolaithe trí mheán gan mheán FBS) le gach tobar agus saothraíodh é ar feadh 3 huaire ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO2. Tar éis goir, lártheifneoiríodh na plátaí ag 1200 rpm ar feadh 7 nóiméad, baineadh an meán agus cuireadh 200 ug/ml DMSO le gach tobar chun na criostail formazan foirmithe a thuaslagadh. Rinneadh na luachanna OD490 a thomhas ag 96-léitheoir micreaphláta tobair (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Chun éifeachtaí CTPG ar splenocytes a mheas, rinneadh na cealla a leithlisiú ó C57BL/6 lucha agus plátáilte i 96-plátaí tobair ag dlús 1 × 105 cill/tobar. Cóireáladh splenocytes le 0, 200, 400, agus 600 ug/mL ar feadh 24, 48, agus 72 uair, faoi seach. Ríomhadh inmharthanacht na gceall mar an fhoirmle a leanas: Inmharthanacht cille ( faoin gcéad )=(ODtreated/ODuntreated) × 100 faoin gcéad .
Ki-67 a bhrath
Braitheadh Ki{{{0}} de réir ár staidéar roimhe seo.16 Go hachomair, déileáladh le cealla BEL{-7404 le tiúchain éagsúla (0, 200, 400, agus 600ug/mL) de CTPG nó cisplatin (35ug/mL). Tar éis 24 uair an chloig, baineadh cealla agus nite le PBS, ansin seasta agus tréscaoilteach le Foxp3 Staing Maolán Set (eBioscience, USA) de réir threoracha an mhonaróra. Rinneadh staining intracellular ag baint úsáide as antashubstaint comhchuingeach Ki{-67 FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, SAM) ar feadh 15 nóiméad ag RT. Rinneadh anailís ar na samplaí de réir cíteiméadracht sreafa (BD FACSCalibur, CA, SAM).
Anailís ar Apoptosis Cille agus Timthriall Cille
Síolaíodh cealla HepG2 agus BEL-7404 ag dlús 2.5 × 105 cill/mhias agus goraíodh iad ag 37 céim thar oíche. Trypsinized agus bainte cealla trí lártheifneoiriú tar éis cóireála le tiúchain éagsúla CTPG nó réamhchóireáilte le coscaire caspase (Z-VAD-FMK) nó caspase-3 inhibitor (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, An tSín) ar feadh 2 uair roimhe sin. Cóireáil CTPG. Tar éis 24 uair an chloig, aimsíodh apoptosis ag cítoiméadracht sreafa. Go hachomair, nite na cealla a bailíodh le fuar PBS (Gibco) agus athfhionraíodh i maolán ceangailteach iarscríbhinn le 2.5μL Annexin V-FITC agus 5μL PI-PE Réiteach Staining (Solarbio, Beijing, an tSín), agus ansin bhí gor cealla ag RT. sa dorchadas ar feadh 15 nóiméad. Chun anailís a dhéanamh ar an dáileadh timthriall cille, baineadh cealla tar éis cóireála CTPG agus socraíodh iad i eatánól fuar 70 faoin gcéad ag 4 céim ar feadh 30 nóiméad. Dathaíodh cealla le PI (BD Biosciences) sa dorchadas ar feadh 30 nóiméad. Rinneadh anailís ar shamplaí de réir cíteaiméadar sreafa (BD FACSCalibur). Braitheadh blot an Iarthair leibhéil léirithe apoptosis cille agus próitéiní a bhaineann le timthriall.
Blot an Iarthair
Rinneadh blot an Iarthair de réir ár staidéar roimhe seo. Cuireadh cóireáil ar 17HCC le CTPG ar feadh 24 uair an chloig. Tar éis dúinn a bheith níocháin le PBS fuar oighir faoi dhó, bailíodh na cealla greamaitheacha agus snámhacha go léir agus cuireadh iad i RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) ar feadh 20nóiméad ar an oighear. Tar éis lártheifneoiriú ag 12000rpm 4 céim ar feadh 10 nóiméad, socraíodh tiúchan próitéine ag baint úsáide as Kit Measúnachta Aigéad Bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, USA) de réir threoracha an mhonaróra. Bhí an tiúchan céanna próitéiní scartha ag 12 faoin gcéad SDS-PAGE agus aistríodh chuig seicní PVDF. Tar éis níocháin le maolán PBST (PBS le 0.05 faoin gcéad Tween-20), cuireadh bac ar na seicní le 5 faoin gcéad bainne neamh-saille ag 37 céim ar feadh 1 uair an chloig agus ansin goraíodh iad leis na príomh-antasubstaintí (Cell Signaling Technology, MA, SAM) ag caoluithe cuí thar oíche ag 4 céim. Tar éis níocháin 3 huaire le PBST, goraíodh an scannán leis na antasubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha HRP (eBitheolaíocht) ar feadh 2 uair an chloig ag 37 céim . Braitheadh na spriocphróitéiní trí úsáid a bhaint as trealamh measúnaithe ECL (Beyotime). Fuair Image J sonraí scanadh liathscála.
Anailís ar Phoitéinseal Membrane Mitochondrial (Δψm)
Rinneadh Δψm a chinneadh le dath JC-1 membrane-thréscaoilteach (Beyotime). Go hachomair, déileáladh le cealla HepG2 agus BEL-7404 le tiúchain éagsúla CTPG (0, 200, 400, agus 600ug/mL) ar feadh 24 huaire. Bailíodh na cealla go léir agus nigh iad le maolán níocháin JC-1. Rinneadh na cealla a dhathú leis an taiscéalaí fluaraiseacha JC-1 de réir threoir an déantóra ar feadh 20 nóiméad ag RT. Tar éis níocháin le PBS faoi dhó, rinneadh anailís ar na samplaí go léir de réir cíteiméadracht sreafa (BD FACSCalibur).
Hoechst 33342 Staining
Rinneadh staining Hoechst 33342 de réir ár staidéar roimhe seo.16 Scrúdaíodh athruithe moirfeolaíocha na núicléis ag baint úsáide as dath ceangailteach DNA membrane-thréscaoilteach Hoechst 33342 (Beyotime). Go hachomair, rinneadh na cealla a ionaclú i 6-phláta tobair ag tiúchan 1 × 105 ceall/tobar i meán 2mL. Nuair a shroich siad cumar 70 faoin gcéad go 80 faoin gcéad, déileáladh leis na cealla le 200, 400, agus 600ug / ml de CTPG nó cisplatin ar feadh 24 uair an chloig. Níodh na cealla le PBS agus socraíodh iad le paraformaildéad 4 faoin gcéad fuar-oighear ag 4 céim ar feadh 10 nóiméad. Tar éis níocháin le PBS, bhí na cealla dhaite le Hoechst 33342 ag 4 céim ar feadh 10 nóiméad. Breathnaíodh samplaí trí mhicreascóp inbhéartaithe fluaraiseachta (Nikon Eclipse Ti-E, an tSeapáin).
sliocht cisteanche
Measúnacht Imirce
Braitheadh imirce cille HCC tríd an measúnú cneasaithe créachta. Go hachomair, síolaíodh cealla HepG2 (2×104/tobar) i 24-phláta tobair. Tar éis cumar 80 a bhaint amach, scríobadh lár gach tobair uair amháin le barr pípéad 20μL. Tar éis níocháin le PBS, déileáladh le cealla le cisplatin (35ug/mL) nó tiúchain éagsúla (0, 200, 400, agus 600ug/mL) de CTPG ag 37 céim . Tar éis 24 uair an chloig, tógadh íomhánna de gach sampla faoi mhicreascóp (Nikon Eclipse Ti-E). Rinne Íomhá J anailís ar na meánachar d'imirce cille. Ríomhadh céatadán an leighis chréachta ag an gcothromóid: leigheas créachta ( faoin gcéad ) { { 14 }} ( 1 - limistéar scread ag an bpointe ama sonraithe / limistéar screadaí ag 0 uair) × 100 faoin gcéad . Braitheadh leibhéil slonn de phróitéiní MMP-2 a bhaineann le himirce cille agus VEGF le blot an Iarthair.
Iomadú agus Apoptosis Splenocytes
Chun anailís a dhéanamh ar iomadú, rinneadh splenocytes a leithlisiú ó 3 lucha C57BL/6 agus a dhaite le CFSE (eBioscience). Rinneadh cealla lipéadaithe CFSE a ionaclú i 24-plátaí tobair ag dlús 2 × 106 cill i meán 1 mL in aghaidh an tobair agus déileáladh leo le tiúchain éagsúla CTPG (200, 400, agus 600 ug/mL) nó comhcheangailte le 35 ug / mL cisplatin ar feadh 72 uair an chloig. Rinneadh anailís cíteaiméadrachta sreafa tar éis é a dhathú le CD3-APC agus CD19-PE (BD Biosciences). Le haghaidh anailíse apoptóis, rinneadh splenocytes a ionaclú i 24-plátaí tobair ag dlús 2 × 106 cealla i meán 1 mL in aghaidh an tobair agus déileáladh leo le tiúchain éagsúla CTPG (200, 400, agus 600 ug/mL) nó in éineacht le cisplatin ar feadh 24 uair an chloig. Rinneadh anailís cítiméadrachta sreafa tar éis staining le 2.5 μL Annexin V-FITC agus 5 μL PI-PE Réiteach.
Meastóireacht Sábháilteachta agus Gníomhaíochtaí Imdhíon-spreagthacha CTPG In Vivo
Chun gníomhaíochtaí imdhíonspreagthacha in vivo CTPG a mheas, roinneadh lucha Kunming fireann 6 go 8 seachtaine go randamach i 7 ngrúpa (5 lucha / grúpa). Cuireadh instealladh subcutaneous (sc, 200, 400 mg/kg), instealladh inperitoneal (ip, 200, 400 mg/kg), agus riarachán intragastrach (ig, 200, 400 mg/kg) i bhfeidhm gach 2 lá ar feadh 7 n-uaire san iomlán , cé nach bhfuair an grúpa rialaithe aon chóireáil. Tá na lucha tar éis a mheá gach lá eile agus breathnaíodh stádas na lucha gach lá. Tar éis cóireáil CTPG, rinneadh orgáin na lucha a scaradh agus a mheá. Ríomhadh na hinnéacsanna orgán de réir na foirmle: innéacs orgán=meáchan orgán (mg)/meáchan coirp (g). Bailíodh na splenocytes, rinneadh iad a chomhaireamh agus a dhathú le frith-CD3-APC, frith-CD19-PE, frith-CD49b FITC nó frith-CD4-APC, frith-CD{{3- 22}}PE, frith-CD8-FITC (BD Biosciences). Braitheadh samplaí trí chiteiméadracht sreafa (BD FACSCalibur).
Éifeachtúlacht Antitumor CTPG Comhcheangailte le Cisplatin i Mice Iompraíonn Meall H22 Rinneadh instealladh subcutaneously do lucha fireann BALB/c 6 go 8 seachtaine le cealla H22 (1.0 × 106 in aghaidh na luiche i 100 μL PBS). Nuair a shroich an líon siadaí thart ar 60mm3, roinneadh lucha siadaí go randamach i 4 ghrúpa (6 lucha / grúpa) agus cóireáilte le cisplatin (4mg / kg), CTPG (400mg / kg), cisplatin (4mg / kg) móide CTPG ( 400mg/kg), nó gan chóireáil (grúpa rialaithe), faoi seach. Instealladh inperitoneally do lucha meall le CTPG ar an 5ú, 7ú, 9ú, 11ú, agus 13ú lá, faoi seach. Instealladh infhéitheach Cisplatin ar an 7ú agus 11ú lá. Rinneadh toirt an meall agus meáchan coirp a thomhas gach lá eile. Ríomhadh toirt meall mar seo a leanas: Toirt meall (V)=a × b2/2, ina seasann a agus b don trastomhas is faide agus is giorra de mheall arna thomhas ag vernier caliper, faoi seach. Ar an 20ú lá, bhí orgáin agus tumaí scoite amach agus ualaithe. Bailíodh, comhaireamh agus dathaíodh na splenocytes le frith-CD3-APC agus frith-CD19-PE nó frith-CD4-FITC agus frith-CD8-APC nó frith-CD11b-PE agus frith-Gr-1-APC nó frith-CD4-FITC, frith-CD25-APC, agus frith-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Ina dhiaidh sin, rinneadh anailís ar mhinicíochtaí agus ar líon na gceall de réir cíteiméadracht sreafa (BD FACSCalibur).
Feabhsaíonn Cistanche an éifeacht frith-meall agus feabhsaíonn sé díolúine.
Le haghaidh tuilleadh eolais, cliceáil le do thoil ar an bpictiúr.
Anailís staitistiúil
Cuireadh na sonraí go léir in iúl mar mheán±earráid chaighdeánach an mheáin (SEM). Rinneadh anailís staitistiúil trí úsáid a bhaint as anailís aon-bhealaigh/dé-bhealach ar athraithis (ANOVA) ag baint úsáide as bogearraí Prism5.0. p<.05 was="" considered="" statistically="">
