Modhnaíonn NGF Meitibileacht Cholesterol Agus Spreagann sé Rún ApoE i gCealla Glial Ag Bronnadh Néarchosaint ar Strus Ocsaídeach Cuid 2

2.6. Cosnaíonn Rúnú ApoE trí mheán NGF le U373 Cealla Néarónacha ó Insult Ocsaídeach

Léiríonn fianaise carntha go n-ardaíonn ApoE athléimneacht néarónach i leith insiltí ocsaídiúcháin, rud a chuireann cosc ​​​​ar apoptosis agus neurodegeneration [17,18,37]. Sa chomhthéacs seo, rinneamar measúnú ar cibé an bhféadfadh secretion ApoE arna spreagadh ag NGF ag cealla U373 néaróin N1E a chosaint ó strus ocsaídiúcháin. Rinneadh réamhchóireáil N1E-115 atá difreáilte go hiomlán le rotenone, rud a chothaíonn strus ocsaídiúcháin trí chosc a chur ar choimpléasc miteachondrial I.

Is próiseas féin-scriosadh é apoptosis, agus is bealach tábhachtach é do chealla homeostasis an chomhlachta a chothabháil trí fhéin-scriosadh cláraithe faoi imthosca áirithe. Imríonn apoptosis róil éagsúla i gcéimeanna éagsúla den saol.

Léirigh staidéir le déanaí go bhfuil gaol áirithe idir apoptosis agus cuimhne. Tá a fhios againn cheana féin gur próiseas casta néarúil é cuimhne san inchinn, ina bhfuil naisc agus comhordú idir réigiúin iolracha inchinne. Féadfaidh ról a bheith ag apoptosis sa phróiseas néaraíoch seo.

Ar thaobh amháin, is féidir le apoptosis struchtúr líonra na néaróin a chobhsú trí néaróin agus synapses nach bhfuil gá leo a ghlanadh, naisc néaróin a dhéanamh níos scagtha, agus ar an gcaoi sin feabhas a chur ar cháilíocht agus ar éifeachtúlacht na cuimhne. Ar an láimh eile, d'fhéadfadh laghdú ar líon na gcealla inchinn a bheith mar thoradh ar apoptosis iomarcach freisin, rud a d'fhéadfadh tionchar diúltach a bheith aige ar stóráil agus ar ghabháil cuimhní cinn.

Dá bhrí sin, agus leibhéil chuí apoptosis á gcothabháil againn, is féidir linn cuimhne a fheabhsú trí shraith iompraíochtaí agus scileanna, mar shampla léamh, foghlaim, cleachtadh, agus ár meon a choigeartú. Is féidir leis na hiompraíochtaí agus na scileanna seo fás agus nasc cealla inchinn a chur chun cinn agus cáilíocht agus éifeachtúlacht na cuimhne a fheabhsú trí naisc agus comhordú idir néaróin inchinn a spreagadh.

Mar fhocal scoir, tá an gaol idir apoptosis agus cuimhne casta. Ní féidir linn ár n-inchinn a spreagadh agus ár gcuimhne a fheabhsú trí raon iompraíochtaí agus scileanna ach amháin agus apoptosis ceart á chothabháil againn. Ón taobh sin de, ní mór dúinn ár gcuimhne a fheabhsú. Is féidir le Cistanche deserticola cabhrú go mór linn ár gcuimhne a fheabhsú, mar is féidir le Cistanche deserticola cothromaíocht neurotransmitters a rialáil freisin, mar shampla leibhéil acetylcholine agus fachtóirí fáis a mhéadú. Tá na substaintí seo tábhachtach don chuimhne. Tá sé an-tábhachtach don fhoghlaim agus don fhoghlaim. Ina theannta sin, is féidir le feoil ó fheoil feabhas a chur ar leacht fola agus iompar ocsaigine a chur chun cinn, rud a d'fhéadfadh a chinntiú go bhfaigheann an inchinn go leor cothaithigh agus fuinnimh, rud a fheabhsóidh beogacht agus seasmhacht na hinchinne.

Cliceáil fios forlíontaí chun cuimhne a fheabhsú

Tar éis 16 h de nochtadh rotenone, saothraíodh néaróin N1E-115 i meán úr (Ctrl), meán coinníollaithe ó chealla U373 (U373-Ctrl), meán coinníollaithe ó U373 réamhchóireála le NGF ar feadh 48 h. (U373-NGF), nó meán coinníollaithe ó U373 atá tosta ó ApoE réamhchóireáilte le NGF ar feadh 48 uair (U373-NGF ApoE siRNA). Laghdaigh réamhchóireáil Rotenone go mór líon na N1E{-115 saothraithe sa mheán rialaithe, rud a thugann le fios go mbíonn tionchar mór ag riaradh an lotnaidicíde seo ar mharthanas N1E{-115.

Chinn cíteatocsaineacht Rotenone freisin tarraingt siar neurite dian, mar a breathnaíodh le fad na néaróinítí. Ba léir go háirithe damáiste neurite mar thoradh ar chóireáil rotenóin nuair a rinneadh measúnú ar chealla a bhfuil néarít orthu, de réir mar a tháinig laghdú go 50% ar líon na N1E-115 le neurites. Fuarthas torthaí comhchosúla nuair a saothraíodh cealla N1E i meán coinníollaithe U373-Ctrl, rud a thugann le tuiscint nach leor láithreacht súiche a dhíorthaítear ó astrocytes neamhspreagtha chun cealla néaránach a chosaint ó thocsaineacht rotenone-mediated. Ar an ábhar contrite, chuir feidhm n de mheán coinníollaithe díorthaithe ó U373 cóireáilte NGF cosc ​​éifeachtach ar bhás néarónach, chomh maith leis an laghdú ar chealla a bhfuil néaróin orthu agus ar fhad neurite de bharr riarachán rotenone (Fíor 5).

Níos tábhachtaí fós y, chaill an meán coinníollaithe a dhíorthaítear ó chealla U373 ApoE-tosaithe go hiomlán na héifeachtaí tairbhiúla a tharlódh don mheán riochtaithe U373-NGF, rud a léiríonn go bhfuil neuroprotection á thiomáint ag scaoileadh ApoE trí mheán an NGF sa mheán cultúir. Go háirithe, choinnigh meán coinníollaithe ó U373 cóireáilte NGF a aistríodh le siRNA scrofa go hiomlán na héifeachtaí cosanta a chuireann meán coinníollaithe U373-NGF i bhfeidhm, rud a thaispeánann go bhfuil an caillteanas neuroprotection a breathnaíodh i meán coinníollaithe ó chealla tosta ApoE ag brath go héifeachtach ar ApoE. íosrialáil (Fíor S3C).

Fíor 5. Éifeachtaí meán coinníollaithe U373 ar strus ocsaídiúcháin i néaróin. Íomhánna ionadaíocha i réimse geal agus measúnú cainníochtúil ar mhoirfeolaíocht néarónach N1E-115. Cóireáladh cealla roimhe seo (+) nó nach raibh (−) le rotenone (0.1 µM) ar feadh 16 h, agus ansin saothraíodh iad i DMEM úr (Ctrl), i meán coinníollaithe díorthaithe ó rialú U373 (U{{ 9}}Chuir Ctrl), U373 (U373-NGF) réamhchóireáilte NGF), agus U373 réamhchóireáilte NGF ina thost le haghaidh apoE (U{373-NGF ApoE siRNA) ar feadh 48 h. n=5 turgnaimh dhifriúla. Ciallaíonn sonraí ± SD. Rinneadh anailís staitistiúil a mheasúnú trí úsáid a bhaint as ANOVA aontreo, agus ansin tástáil iar hoc Tukey. ** p < 0.01, *** p < 0.001.

Chun na torthaí a fuarthas ón meán coinníollaithe a neartú, rinneamar comhchultúr U373/N1E115. Chun tús a chur, rinneadh réamhchóireáil ar chealla U373 nó nach raibh le NGF ar feadh 48 h. Ina theannta sin, réamhchóireáladh cealla difreáilte N1E-115 le rotenone ar feadh 16 h. Ina dhiaidh sin, cuireadh meán úr ina raibh 0.5% FBS in ionad an mheán U373, agus aistríodh clúdaí clúdaithe le N1E-115 chuig an gciseal U373 chun comhchultúr a ullmhú (Fíor 6A).

Chuir damáiste ocsaídeach a eascraíonn as cóireáil rotenóin isteach go mór ar chealla imthacaí viabilineurite cille agus ar fhad rialaithe néaraíoch N1E-115 agus N1E-115 comhshaothraithe le astrocytes U373-Ctrl (Fíor 6B). I gcomhréir le meánturgnaimh choinníollaithe, rinneadh cealla N1E a chomhshaothraíodh le cealla U373-NGF a chosaint ó dhamáiste ocsaídiúcháin, ach chuir tosta ApoE in U373 deireadh leis an néarchosaint a d’fhulaing NGF.

Fíor 6. Soláthraíonn secretion ApoE ag cealla U373 cóireáilte NGF neuroprotection ó strus ocsaídiúcháin. (A) Scéim ionadaíoch de chomhchultúr astrocyte-néaróin arna cur ar bun mar a thuairiscítear i Roinn na nÁbhar agus na Modhanna. Rinneadh measúnú ar chealla a iompraíonn neurite, fad neurite, agus líon cille uaireanta tar éis bunú an chomhchultúir. (B) Íomhánna ionadaíocha i réimse geal agus measúnú cainníochtúil ar mhoirfeolaíocht néarónach de chealla N1E-115, cóireáilte roimhe seo (+) nó nach bhfuil (−) le rotenone (0.1 µM) ar feadh 16 h.

Coinníodh N1E-115 ansin i DMEM úr (Ctrl), nó rinneadh é a chomhshaothrú le rialú U373 (U373-Ctrl), U373 (U373-NGF) réamhchóireáilte NGF, agus Cuireadh U373 réamhchóireáilte NGF ina thost le haghaidh ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) ar feadh 48 h. n=5 turgnaimh dhifriúla. Ciallaíonn sonraí ± SD. Rinneadh anailís staitistiúil trí úsáid a bhaint as ANOVA aontreo, agus ansin tástáil iar hoc Tukey. *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

3. Plé

Tá baint láidir ag míchothromaíochtaí i gconairí comharthaíochta neurotrophin, chomh maith le hathruithe ar mheitibileacht colaistéaról na hinchinne, le galair néareolaíocha agus neurodegenerative, mar shampla siondróm Rett, HD, galar Alzheimer (AD), agus galar Parkinson (PD) [2,38,39] . Sa chomhthéacs seo, tá taighde bunúsach ar ghníomhaíocht bhitheolaíoch néareatrófáin ríthábhachtach chun na meicníochtaí móilíneacha a nascann meitibileacht colaistéaróil agus fisiapaiteolaíocht na hinchinne a scaradh. Le cúpla bliain anuas, thuairiscigh staidéar suimiúil ról do BDNF i rialáil meitibileacht colaistéaróil in astrocytes [38].

In ainneoin an nóisin seo, níl aon fhaisnéis ar fáil faoi rannpháirtíocht toimhdiúil NGF i rialáil colaistéaról astrocytic. Dá bhrí sin, san obair seo, dhíríomar ar an ról ionchasach a fheidhmíonn NGF i rialáil meitibileacht colaistéaróil, le tagairt ar leith do thionchar secretion ApoE ar dhifreáil néarónach agus ar mharthanas. Coinníonn U373, an líne cille astrocytoma a úsáidtear mar mhúnla turgnamhach de astrocytes daonna, an cumas chun freagairt go hiomlán do NGF, toisc go léiríonn sé leibhéil shuntasacha TrkA agus p75NTR araon.

Léirigh na príomhthorthaí go rialaíonn NGF leibhéil na bpríomhphróitéiní a bhaineann le bithsintéis colaistéaról (HMGCR), gáinneáil intracellular (NPC1), agus secretion (ABCA1). Tá méadú comhthráthach de ApoE agus colaistéaról lein ag gabháil leis na himeachtaí seo isteach sa mheán cultúir, rud a thugann le tuiscint go n-ardóidh NGF bithsintéis colaistéaról agus easbhrúite ó chealla glial. Tuairiscíodh go spreagann NGF léiriú próitéine ApoE trína thrascríobh a mhéadú [40]. Mar sin féin, níor thugamar faoi deara aon athrú suntasach i slonn ApoE intracellular. Is féidir an neamhréireacht dealraitheach seo a mhíniú ós rud é nach féidir tuiscint a fháil ar thógáil ApoE mar gheall ar an méadú atá air ó UI a chóireáiltear le NGF
In iarracht chun na meicníochtaí móilíneacha a dhíscriosadh níos fearr, chaitheamar U373 leis an LM11A-31 agus fuaireamar amach nach raibh an modhnóir p75NTR in ann ach aithris a dhéanamh ar an ardú i slonn HMGCR arna idirghabháil ag NGF. Tá rannpháirtíocht p75NTR i modhnú leibhéil HMGCR comhsheasmhach le sonraí roimhe seo a fuarthas i gcineálacha cille eile, rud a léiríonn go rialaíonn an receptor seo trascríobh einsímí cholaistéarigineacha [41]. Mar sin féin, níor spreag LM11A-31 aon athruithe ar na próitéiní eile a ndearnadh anailís orthu sa staidéar seo, lena n-áirítear ABCA1, nó ar leibhéil cholesterol agus ApoE isteach sa mheán cultúir, rud a thugann le fios nach leor modhnú roghnach p75NTR chun colaistéaról a chur chun cinn. easbhrúite trí cháithníní saibhir ApoE a breathnaíodh i gcealla cóireáilte NGF. Tugann na torthaí seo dúinn hipitéis a thabhairt go rialaíonn NGF meitibileacht colaistéaróil i gcealla glial trí rannpháirtíocht gabhdóirí p75NTR agus TrkA araon.

Tá sé ar eolas go maith go ngníomhaíonn ceangal neurotrophin le gabhdóirí Trk ERK1/2, rud a rialaíonn roinnt bealaí a bhaineann le difreáil cille, iomadú agus maireachtáil [2,38]. Go suimiúil, tugadh faoi deara go rialaíonn gníomhachtú ERK1 / 2 freisin abairt ABCA1 agus ApoE i gcineálacha éagsúla cille [38,42,43]. Tugann na torthaí seo, mar aon leis an bhfianaise go gcuireann an ais BDNF/TrkB/ERK easbhrú ApoE agus slonn ABCA1 chun cinn i gcealla glial [38], le fios go bhféadfadh conair aistrithe comhartha a bhaineann leis an ais TrkA/ERK cuid de na héifeachtaí a dhéanann NGF a mhíniú. inár staidéar.

Cé nár breathnaíodh aon athruithe ar eisfhás neurite, léirigh fostaíocht mheán coinníollaithe U373- agus bunú turgnaimh chomhchultúr go bhfuil an secretion ApoE méadaithe ó chealla glial idirghabhála ag NGF cinntitheach chun cosc ​​a chur ar thorthaí díobhálacha a tharlódh de bharr ocsaídiúcháin. strus i gcealla néaróin. Chun cíteatocsaineacht a spreagadh, d'fhostaigh muid rotenone, lotnaidicíd a úsáidtear go coitianta i dtaighde réamhchliniciúil chun speicis ocsaigine imoibríocha díorthaithe mitochondria (ROS) agus apoptosis ina dhiaidh sin a spreagadh [44].

Léiríonn ár dtorthaí go spreagann NGF secretion ApoE ag cealla glial, rud atá riachtanach chun na héifeachtaí neuroprotective i gcoinne riarachán rotenone i gcealla difreáilte N1E-115 a ráthú. Tá ról ApoE maidir le strus ocsaídiúcháin a chosc dea-dhoiciméadaithe. Mar shampla, méadaíonn ídiú ApoE i múnlaí luiche gortú ocsaídiúcháin i bhfíochán inchinne [45,46]. Dá réir sin, cosnaíonn riarachán ApoE exogenous i gcoinne damáiste ocsaídiúcháin do-aisiompaithe ó chóireáil sárocsaíd hidrigine trí dhul i ngleic le tocsaineacht tánaisteach glutamáit [18]. Ina theannta sin, tá lipoproteiní ina bhfuil ApoE éifeachtach chun apoptosis a mhaolú de bharr tacaíocht thrófach a tharraingt siar i néaróin ganglion reitineach [47].

Inár staidéar, tugann fostaíocht rotenone le fios go bhféadfadh neuroprotection trí mheán ApoE, arna chur chun cinn ag cealla glial spreagtha ag NGF, a bheith ábhartha i gcomhthéacs coinníollacha neurodegenerative cosúil le PD. Go háirithe, atáirgeann rotenone díghiniúint néarónach dopaminergic cosúil leis an gceann a breathnaíodh i PD, i múnlaí ainmhithe agus i gcultúir chealla, lena n-áirítear néaróin díorthaithe N1E-115- [48-50]. Go comhleanúnach, tacaíonn ár dtorthaí le fianaise roimhe seo a léiríonn go bhfaigheann ApoE neuroprotection ar riaradh 6-hydroxydopamine (6-OHDA), neurotoxin eile atá in ann feinitíopa cosúil le PD a spreagadh [51]. Le chéile, léiríonn ár staidéar go bhfuil NGF ina mhodhnóir ríthábhachtach ar mheitibileacht colaistéaról agus easbhrúite ApoE ó chealla glial. Níos tábhachtaí fós, tá gá leis an bhfeabhsú i secretion ApoE arna chur chun cinn ag an néarotróifín seo chun neuroprotection a chinntiú i gcoinne cíteatocsaineacht rotenone.

Is é BDNF an neurotrophin is flúirseach san inchinn fásta. In ainneoin na fianaise seo, tá sé léirithe go bhféadfadh ról ríthábhachtach a bheith ag NGF, ní hamháin le linn na forbartha ach freisin sa lárchóras néaróg fásta. Mar shampla, bíonn tionchar ag NGF ar ghníomhaíocht hippocampal agus, mar thoradh air sin, ar chuimhne spásúlachta agus ar fhoghlaim [52]. Tugann torthaí eile le fios go dtaispeánann NGF éifeacht neuroprotective ar néaróin dopaminergic nigrostriatal agus go bhféadfadh an ghníomhaíocht seo bunús a leagan síos do chur chuige teiripeacha nua-bhunaithe NGF do PD [53].

De réir an nóisin seo, tá sé léirithe go bhfuil táirgeadh NGF rialaithe go domhain i astrocytes le linn aosach agus go ndéanann sé gníomhartha modhnúcháin ar néar-athlasadh, gortú inchinne, agus néar-mhíothlú [54-56]. Sa chomhthéacs seo, bheadh ​​sé suimiúil a mheas, i staidéir amach anseo, an bhféadfaí na héifeachtaí sin a idirghabháil, go páirteach ar a laghad, trí mhodhnú colaistéaról glial arna chur chun cinn ag NGF. Léiríonn an saothar reatha roinnt srianta ar cheart iad a shárú sna chéad imscrúduithe turgnamhacha eile; mar shampla, bheadh ​​sé tábhachtach na meicníochtaí móilíneacha a nascann cóireáil NGF agus meitibileacht colaistéaróil i gcealla glial a dháileadh níos fearr.

Tá tuiscint leathan úsáideach chun sainspriocanna móilíneacha a aithint a d’fhéadfaí a úsáid i gcomhthéacsanna néarath-athlúcháin. Ina theannta sin, cé go n-úsáidtear cealla U373 agus N1E go forleathan mar línte cille inláimhsithe chun gnéithe astrocytic agus néarónacha a atáirgeadh faoi seach [27-29,57], ba cheart na torthaí seo a dhearbhú tuilleadh i gcultúir cille príomhúla. Cé gur cheart iarrachtaí breise a dhéanamh chun rannpháirtíocht chomharthaíochta néarotróifín in hoiméastáis colaistéaról inchinne a neartú, léiríonn an obair seo den chéad uair go bhféadfadh NGF neuroprotection a chur i bhfeidhm go hindíreach trí thionchar a imirt ar mheitibileacht colaistéaról glial.

4. Ábhar agus Modhanna

4.1. Cultúr na Cille

Saothraíodh cealla neuroblastoma N1E-115 agus cealla U373 ag 5% CO2 i DMEM ag ard-ghlúcós (Merck Life Science, Milano, an Iodáil), le 10% (v/v) séiream bó féatais (FBS) (Merck Life Science , Milano, an Iodáil), agus curtha leis le tuaslagán peinicillin/streptomycin.

Chun difreáil néarónach a spreagadh, síolaíodh cealla N1E-115 ag comhlí 30% agus aistríodh iad go DMEM le 0.5% FBS ar feadh 96 h.

Chun difreáil néarónach a spreagadh, síolaíodh cealla N1E-115 ag comhlí 30% agus aistríodh iad go DMEM le 0.5% FBS ar feadh 96 h.

Bunaíodh comhchultúr astrocyte-néaróin de réir an phrótacail a ndearna Ioannou agus a chomhghleacaithe cur síos air, le modhnuithe [59]. Brúdh spásairí pairifín ar dhuillíní clúdaigh lena chinntiú go gcloítear leo; d'úsáideamar spásairí ar chlúdaigh néarónacha chun damáiste meicniúil a chosc go héifeachtach nuair a cuireadh na cealla os comhair a chéile. Steiriliú ansin duillín clúdaigh in eatánól agus brataíodh iad le il-lísín-D (Merck Life Science, Milano, an Iodáil). Síolaíodh N1E-115 ar na clúdaigh chlúdaigh brataithe ag an dlús inmhianaithe agus, nuair a bhí siad réidh don chomhchultúr, úsáideadh fórsaí steiriúla chun na clúdaigh chlúdaigh a ardú le néaróin N1E-115 agus iad a chur aghaidh síos i -115 {10}}toibreacha atá síolaithe le astrocytes U373.

Rinneadh réamhchóireáil ar chealla N1E-115 trí 0.1 µM de rotenone (Sigma-Aldrich, Milan, an Iodáil, R8875) a thabhairt ar feadh 16 h. Fuair ​​​​cealla rialaithe DMSO (caolú 1:1000 i meán saothraithe cille) mar fheithicil. Cóireáladh cealla U373 le NGF (Almona Labs, Iarúsailéim, Iosrael, N-245) ag dáileog 100 ng/mL ar feadh 48 h sna turgnaimh go léir.

4.2. Ullmhúchán Lysate agus Anailís Blot an Iarthair

Rinneadh sonicated cealla U373 (timthriall dleachta 20%, aschur 3) i maolán sampla (0.1Tris-HClisHCl ina bhfuil 10% SDS, cocktail inhibitor protease, pH 6.8) le haghaidh toer chun lysate iomlán a fháil, mar a thuairiscítear roimhe seo [ 60,61]. Cuireadh maolán Laemmli leis, agus dínádúraíodh samplaí ag 95 ◦C ar feadh 5 nóiméad. Réitíodh sleachta próitéine (fiche microgram de phróitéiní) ar SDS-PAGE, agus rinneadh aistriú go membrane nitrocellulose trí úsáid a bhaint as córas aistrithe turbo tras-blot (Biorad Laboratories, Milan, an Iodáil), mar a tuairiscíodh roimhe seo [62].

Ina dhiaidh sin, goradh an scannán ag teocht an tseomra ar feadh 1 h le bainne tirim gan saill 5% i saline maolánach Tris (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0.05% Tween{ {10}}, pH 6.8) agus scrúdaíodh é thar oíche ag 4 ◦C leis na príomhantasubstaintí seo a leanas: frith-p75NTR (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, SAM, sc-271708, caolú 1:500), frith- TrkA (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, SAM, sc-118, caolú 1:500), frith-SREBP-1 (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, SAM, sc-8984 , caolú 1:1000), frith-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, UK, ab30682, caolú 1:1000), frith-HMGCR (Abcam, Cambridge, RA, ab242315, caolú 1:1000), frith-LDLr (Abcam, Cambridge, RA, ab30532, caolú 1:500), frith-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, USA, NB400-148, caolú 1:3000 ), antiABCA1 (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, SAM, sc-58219, caolú 1:400), frith-ApoE (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, SAM, sc-53570, caolú 1 :400), frith-vinculin (SigmaAldrich, Milano, an Iodáil, V9264, caolú 1:10,000), agus frith- -actin (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, SAM, sc-47778, caolú 1 :10,000).

Goradh scannáin i ndiaidh a chéile ar feadh 1 h ag teocht an tseomra le hantasubstaintí tánaisteacha frith-luiche nó frith-choinín comhchuingeach HRP (Saotharlanna Bith-Rad, Milano, an Iodáil). Léiríodh antasubstaintí próitéine-cheangailte le soiléireacht ECL Western blotting (Saotharlanna Bith-Rad, Milano, an Iodáil, #1705061), agus cláraíodh cemiluminescence trí chóras ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Milan, an Iodáil). Rinneadh anailís densitometric ansin ó bhlotaí an Iarthair trí úsáid a bhaint as bogearraí ImageJ leagan 1.52t (Institiúidí Náisiúnta Sláinte, Bethesda, MD, SAM) do Windows. Baineadh úsáid as vinculin nó -actin mar phróitéiní coimeád tí, a bhí mar rialuithe inmheánacha do luchtú próitéine. Fuarthas ríomhaireachtaí densitometric mar aonaid threallacha, díorthaithe ón gcóimheas idir déine an bhanda próitéine agus an phróitéin coimeádta tí faoi seach.

4.3. Ola Dearg O Staining

Síolaíodh cealla U373 ar chlúdaigh chlúdaigh pola-L-lísín (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) i 6-phlátaí tobair, agus rinneadh staining Ola dearg O mar a tuairiscíodh roimhe seo [60]. Go hachomair, socraíodh cealla i paraformaildéad (tuaslagán 4%) ar feadh 10 nóiméad agus rinsíodh iad go réidh trí huaire le PBS. Goradh cealla seasta le 60% isopropanol ar feadh 5 nóiméad agus ansin nite le huisce driogtha. Ina dhiaidh sin, scrúdaíodh cealla le 1 ml de thuaslagán oibre Ola Red O (Sigma-Aldrich, O{1391-250ML) ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra tríd an 6-pláta tobair a chur ar fhithiseán croithaire rothlaithe. Tar éis goir leis an réiteach staining, nite na toibreacha trí huaire le huisce driogtha chun deireadh a chur leis an stain iomarcach.

Ar deireadh, suiteáladh duillín clúdaigh le meán gléasta Fluoroshield (Sigma-Aldrich, F6182), agus léiríodh uathfhluaraiseacht Oil red O trí mhicreascópacht chomhfhócasach (TCS SP8; Leica, Wetzlar, an Ghearmáin). Gabhadh íomhánna ag baint úsáide as Leica TCS SP8 atá feistithe le formhéadú 63 × agus Bogearraí Leica LAS X (Milan, an Iodáil). Rinneadh an staining Ola dearg O a chainníochtú trí bhogearraí ImageJ do Windows agus ríomhadh é mar mheán-déine fhluaraiseachta in aghaidh an limistéir cille.
4.4. Staining Filipin

Rinneadh staining Filipin ag baint úsáide as Filipín casta (Sigma-Aldrich, F9765). Ullmhaíodh tuaslagán stoic Filipín (10 mg/mL i PBS) díreach roimh é a úsáid i gcónaí. Socraíodh cealla i paraformaildéad (réiteach 4%) ar feadh 10 nóiméad agus nite le PBS. Rinneadh U373 a dhaite ansin le tuaslagán oibre Filipín 1 ml (0.05 mg/mL i PBS) ar feadh 1 h sa dorchadas, ag teocht an tseomra. Ina dhiaidh sin, nite cealla trí huaire le PBS, agus gléasadh clúdaigh clúdaigh le meán gléasta Fluoroshield agus anailís láithreach trí micreascópacht comhfhócasach ag baint úsáide as tacar scagaire UV (340-380 nm excitation). Fuarthas íomhánna ag formhéadú 40X. Ríomhadh cainníochtú Filipin mar mheándéine fhluaraiseachta in aghaidh an limistéir cille trí úsáid a bhaint as bogearraí ImageJ do Windows.

4.5. Cainníochtú Cholesterol

Rinneadh cainníochtú colaistéaról trí úsáid a bhaint as measúnacht dathmhéadrach (Kiteal Quantitation Cholesterol, MAK043, Sigma-Aldrich, Milan, an Iodáil) de réir threoracha an mhonaróra.

4.6. ELISA
Rinneadh measúnú ar leibhéil ApoE i meán cultúir trí úsáid a bhaint as Kit Apolipoprotein E ELISA Daonna (Abcam, Cambridge, UK, ab108813), de réir threoracha an mhonaróra.

4.7. Imdhíonfluaraiseacht

Rinneadh immunofluorescence de chealla U373 a fhorghníomhú mar a thuairiscítear roimhe seo [60]. Socraíodh U373 i bparaformaildéad (4% i PBS) agus rinneadh iniúchadh air thar oíche le hantasubstaintí príomhúla: frith-p75NTR (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, SAM, sc-271708, caolú 1:100), agus frith-TrkA ( Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, SAM, sc-118, caolú 1:100). Ina dhiaidh sin, goraíodh cealla ar feadh 1 h le antashubstaint thánaisteach frith-luiche gabhar Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAM, A28180) agus le antashubstaint thánaisteach frith-choine gabhar Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA , A27034). Rinneadh smálú DAPI chun núicléis a shamhlú, agus ar deireadh gléasadh na clúdaigh chlúdaigh le meán gléasta Fluoroshield. Rinneadh anailís ar shamplaí trí mhicreascópacht chomhfhócasach, mar a thuairiscítear thuas.

4.8. ApoE Tost

Rinneadh tosta mRNA ApoE ar chealla U373 ag baint úsáide as ApoE siRNA (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, SAM, sc-29708) de réir threoracha an mhonaróra. Bunaíodh an t-aistriú i 6-pláta saothraithe fíocháin tobair inar síolaíodh 100,000 cill in aghaidh an tobair i meán fáis saor ó antaibheathaigh DMEM agus forlíonta le 10% de FBS ar feadh 24 h. I gcás gach tobair, cuireadh siRNA Transfection Medium (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, USA, sc-36868) ​​le réiteach Imoibriú Trasdultach siRNA, ullmhaithe ag baint úsáide as siRNA déphléacsacha agus imoibrí aistrithe siRNA (Biteicneolaíocht Santa Cruz, Dallas, TX, Stáit Aontaithe Mheiriceá, sc29528). Ansin nite cealla uair amháin le siRNA Transfection Medium agus clúdaíodh iad leis an meascán aistrithe a rinneadh roimhe seo. Ina dhiaidh sin, goraíodh an pláta cultúir ar feadh 7 h ag 37 ◦C i gorlann 5% CO2.

Cuireadh meán fáis DMEM le 20% de FBS agus antaibheathaigh (2-an gnáth-thiúchan) leis an meascán aistrithe i ngach tobar le cóimheas 1:1. Goraíodh cealla ar feadh 18 h, agus ansin scaoiltear an meán agus cuireadh meánfhás gnáth úr ina ionad; 24 h tar éis na céime deiridh seo, bhí cealla réidh le húsáid le haghaidh tuilleadh turgnaimh. Rinne RT-qPCR measúnú ar éifeachtúlacht tosta ApoE i gcealla U373 agus ag ELISA san fhostán cille; Chuir ApoE siRNA cosc ​​éifeachtach ar ionduchtú ApoE ag NGF i gcomparáid le scramble siRNA (ApoE mRNA: laghdú 83%; ApoE ELISA: laghdú 78%). Go háirithe, bhí léiriú ApoE ar siRNA tosta níos ísle ná na leibhéil slonn basal a breathnaíodh i rialú U373 (ApoE mRNA: laghdú 72%; ApoE ELISA: laghdú 58%) (Fíor S 3A, B).

4.9. Eastóscadh RNA agus PCR Fíor-Ama

Rinneadh anailís mRNA mar a tuairiscíodh roimhe seo [22,63]. Go hachomair, baineadh RNA iomlán ó chealla U373 le TRI Imoibrí (Merck Life Science, Milan, an Iodáil) de réir threoracha an mhonaróra. Rinneadh cóireáil DNAse (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Milan, an Iodáil), agus ansin íonaíodh RNA ag baint úsáide as Kit glantacháin RNA (Zymo, an Iodáil). Trascríobhadh RNA droim ar ais go cDNA i ndiaidh a chéile trí Kit Cille Trascríobh Droim ar ais cDNA Ard-Acmhainne (Bithchóras Feidhmeach, Foster City, CA, SAM) agus úsáideadh é le haghaidh anailíse qPCR.

Ba iad na primers a úsáideadh in qRT-PCR le haghaidh apoE: ar aghaidh 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 agus aisiompú 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0 . Ba iad na primers a úsáideadh in qRT-PCR le haghaidh gapdh (roghnaithe mar ghéin thagartha): cuir ar aghaidh 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 agus droim ar ais 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Rinneadh measúnú ar tháirgeadh an aimplicain cheart trí mheastóireacht a dhéanamh ar an gcuar leá. Ritheadh ​​gach sampla bitheolaíoch faoi thrí le himoibrí IQ glas SYBR (Saotharlanna Bith-Rad, Milano, an Iodáil) agus úsáid á baint as córas braite CFX Connect (Saotharlanna Bith-Rad, Milano, an Iodáil).

4.10. Measúnú Cainníochtúil ar Mhoirfeolaíocht Néarónach

Rinneadh moirfeolaíocht néarónach i gcealla N1E-115 a mheas trí íomhánna a ghabháil le micreascóp inbhéartaithe. Rinneadh anailís moirfiméadrach trí bhogearraí ImageJ do Windows, agus rinneadh meastachán ar líon na gcealla iomlána (arna shloinneadh mar éagsúlacht céatadáin den rialú), meánfhad neurite (arna shloinneadh mar chéatadán den rialú), agus cealla a bhfuil néaracht orthu. Maidir le cealla a bhfuil néaráit orthu, ríomhadh an céatadán trí líon na gceall difreáilte a roinnt ar líon iomlán na gceall in aghaidh an réimse. Rinneadh difreáil ar N1E-115 nuair a bhí ar a laghad néarít amháin acu a a raibh fad cothrom le nó níos mó ná trastomhas an soma. Rinneadh meastóireacht mhoirfeolaíoch ar chúig thurgnamh neamhspleácha ar a laghad, ina ndearnadh anailís ar thrí íomhá ar a laghad.

4.11. Anailís staitistiúil

Cuireadh na torthaí go léir a cuireadh i láthair sa staidéar seo in iúl mar mheán ± SD (seiceáil diall caighdeánach dáileadh gnáth na sonraí trí úsáid a bhaint as an tástáil Shapiro-Wilk. Nuair a cuireadh dhá ghrúpa thurgnamhach i gcomparáid, cuireadh Tástálacha neamhphéire i bhfeidhm. Mar sin féin, nuair a bhí trí ghrúpa nó níos mó Baineadh úsáid as anailís aontreo ar athraithis (ANOVA) agus tástáil iar hoc Tukey ina dhiaidh sin Maidir leis na turgnaimh le rotenone, áit a raibh dhá athróg i láthair, baineadh úsáid as ANOVA débhealaigh agus iar-thástáil Bonferroni ina dhiaidh sin. p < 0.05 a bheith difriúil ó thaobh staitistice de. Rinneadh anailís staitistiúil trí úsáid a bhaint as GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) do Windows.

Ranníocaíochtaí Údair:

Coincheapú, MS; modheolaíocht, BS agus MC; bailíochtú, BS agus MC; anailís fhoirmiúil, MS, MC, DP, agus MP; imscrúdú, MC, NM, LL, MP, agus DP; acmhainní, BS agus VP; coimeád sonraí, MS agus MC; scríbhneoireacht – dréacht-ullmhú bunaidh, BS agus MC; scríbhneoireacht — athbhreithniú agus eagarthóireacht, MP, LL, DP, NM agus VP; léirshamhlú, MS, MC, agus MP; maoirseacht, MS; riarachán tionscadail, MS; sealbhú maoinithe, BS Tá leagan foilsithe na lámhscríbhinne léite agus aontaithe ag na húdair go léir.

Maoiniú:

Maoiníodh an taighde seo ag Cistí le haghaidh Taighde Roinne 2021 (Ollscoil Molise) do na Ballstáit, agus ag seisiún glao ar Dheontais 2021a Fhondúireacht Jerome Lejeune, #2043 chuig MS.

Ráiteas an Bhoird Athbhreithnithe Institiúideach:

Neamhbhainteach.

Ráiteas Toilithe Feasach:

Neamhbhainteach.

Ráiteas Infhaighteachta Sonraí:

Neamhbhainteach.

Buíochas:

Gabhaimid buíochas le Claudia Tonini as an gcabhair leis an measúnú colaistéaról

Coinbhleachtaí Leasa:

Ní dhearbhaíonn na húdair aon choinbhleacht leasa.

Tagairtí

1. Björkhem, I. ; Meaney, S.; Fogelman, AM Colaistéaról Inchinn: Saol Fada Rúnda taobh thiar de Bhacainn. Arterioscler. Throm. Vasc. Biol. 2004, 24, 806–815. [CrossRef] [PubMed]

2. Colardo, M.; Martinla, N.; Pensabene, D.; Siteni, S.; Di Bartolomeo, S.; Pallottini, V. ; Segatto, M. Neurotrophins mar phríomh-rialtóirí meitibileachta cille: Impleachtaí do hoiméastáis colaistéaróil. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Goritz, C. ; Mauch, DH; Pfrieger, FW Déanann meicníochtaí iolracha idirghabháil ar synaptogenesis colaistéaról-spreagtha i néaróin CNS. Mol. cill. Neurosci. 2005, 29, 190–201. [CrossRef] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Leathnú membrane plasma: Tasc Herculean néaróin. Nát. An tUrr Neurosci. 2009, 10, 251–261. [CrossRef]

5. Takamori, S.; Holt, M. ; Steinius, K.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H. ; Schenck, S.; Brügger, B. ; Ringler, P.; et al. Anatamaíocht Mhóilíneach Organelle Gáinneála. Cill 2006, 127, 831–846. [CrossRef] [PubMed]

6. Suzuki, S.; Kiyosue, K.; Hazama, S.; Ógúra, A.; Kashihara, M.; Hara, T. ; Koshimizu, H.; Kojima, M. Rialaíonn fachtóir neurotrófach inchinn-díorthaithe meitibileacht colaistéaróil le haghaidh forbairt synapse. J. Neurosci. 2007, 27, 6417–6427. [CrossRef]

7. Segatto, M. ; Leboffe, L. ; Trapani, L. ; Pallottini, V. Teip Hoiméastáis Cholesterol san Inchinn: Impleachtaí do Dhífheidhmiú Synaptach agus Meath Cognaíoch. Curr. Med. Ceimic. 2014, 21, 2788–2802. [CrossRef] [PubMed]

8. Íosa, DJ; Dietschy, JM Rialáil rátaí sintéise colaistéaróil in vivo san ae agus conablach an fhrancaigh arna dtomhas ag baint úsáide as [3H]uisce. J. lipid Res. 1980, 21, 364–376. [CrossRef]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. meitibileacht colaistéaról i néaróin agus astrocytes. Clár. lipid Res. 2011, 50, 357–371. [CrossRef]

10. Nieweg, K. ; Schaller, H.; Pfrieger, FW Difríochtaí marcáilte i sintéis colaistéaróil idir néaróin agus cealla glial ó fhrancaigh iarbhreithe. J. Neurochem. 2009, 109, 125–134. [CrossRef]

11. Oram, JF; Heinecke, JW ATP-cheangailteach iompróir caiséad A1: Onnmhaireoir colaistéaról cille a chosnaíonn i gcoinne galar cardashoithíoch. Fisiol. Ath. 2005, 85, 1343–1372. [CrossRef]

12. Pfrieger, FW Foinsiú allamuigh san inchinn: An mbraitheann néaróin ar sheachadadh colaistéaról ag astrocytes? BithAistí 2003, 25, 72–78. [CrossRef]

13. Christopherson, KS; Uillian, EM; Stokes, CCA; Mullach Eanaigh, CE; Ifreann, JW; Agah, A.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA Is próitéiní rúnda astrocyte iad thrombospondins a chuireann synaptogenesis CNS chun cinn. Cill 2005, 120, 421–433. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com