Maolaíonn Kaempferol Damáiste LD-mitochondrial Trí Uathphagy a Chur Chun Cinn: Impleachtaí i nGalar Parkinson Cuid 1

Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais

Coimriú:Léiríonn fianaise atá ag teacht chun cinn gur féidir le sil-leagan agus sárocsaídiú braoiníní lipid (LD) gan choinne dlús a chur le strus organelle agus go bhfuil ról ríthábhachtach aige i bpataigineas galair néar-mheathlúcháin (NDDanna). Inár staidéar roimhe seo, dheimhnigh muid gur léirigh kaempferol (Ka), móilín beag flavonoid nádúrtha, éifeachtaí neuroprotective ar lucha le galar Parkinson (PD) de bharr LPS. Ina theannta sin, léirigh staidéir roimhe seo go bhfuil ról tábhachtach ag autophagy i rialáil sil-leagan cealla LD. Sa staidéar reatha, léirigh muid go ndearna Ka cosaint i gcoinne caillteanas néarónach agus easnaimh iompraíochta i lucha PD MPTP/p-spreagtha, in éineacht le strus ocsaídiúcháin lipid laghdaithe sa substantia nigra pars compacta (SNpc). I gcealla néarónacha saothraithe, léirigh Ka raon comhchruinnithe sách sábháilte agus chuir sé go mór faoi chois carnadh LD agus apoptosis ceallacha arna tharlú ag MPP móide . Léirigh tuilleadh staidéir go raibh éifeacht chosanta Ka ag brath ar uathphagy, go háirithe lipophagy. Go ríthábhachtach, chuir Ka autophagy chun cinn chun idirghabháil a dhéanamh ar dhíghrádú LD i líseasóim, rud a mhaolaigh ansin sil-leagan agus sárocsaídiú lipid agus an damáiste mitochondrial mar thoradh air, rud a laghdaigh bás néaróin. Ina theannta sin, chuir AAV-shAtg5-idirghabhála Atg5 deireadh le héifeachtaí neuroprotective Ka i gcoinne ocsaídiúcháin lipid i lucha PD. Léiríonn an obair seo go gcuireann Ka cosc ​​​​ar dhíghiniúint néarónach dopaminergic i PD trí chosc a chur ar dhamáiste mitochondrial sárocsaídithe lipid-idirghabhála trí liopaí-ophagy a chur chun cinn agus soláthraíonn sé straitéis teiripeach nua féideartha do PD agus NDDanna gaolmhara.

Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh eolais a fháil

1. Réamhrá

Is galar néar-mheathlúcháin coitianta (NDD) é galar Parkinson (PD) arb é is sainairíonna go paiteolaíoch é an caillteanas forásach de néaróin dopaminergic (DA) sa substantia nigra pars compacta (SNpc). Cé go bhfuil etiology beacht agus cúrsa nádúrtha na galair seo fós le soiléiriú go hiomlán,iomadúlaTá baint ag próisis agus mífheidhmí ar leibhéal an chórais, lena n-áirítear feidhmeanna mitochondrial, hoiméastáis dopamine, neuroinflammation, agus autophagy, le pathogenesis PD [1,2]. Léirigh tuarascálacha le déanaí go raibh baint ag braoiníní lipid (LD).lipotocsaineachtd'fhéadfadh sé a bheith rannpháirteach i bpaiteolaíocht PD [3,4]. Is organelles an-dinimiciúil iad LDanna a eascraíonn as an membrane reticulum endoplasmic (ER) agus de ghnáth feidhmíonn siad mar shuíomhanna intracellular de stóráil neodrach lipid [5]. Léiríodh le déanaí go bhfuil ról i bhfad níos leithne ag LDanna ná stóráil aigéid shailligh (FA) agus go bhfuil siad rannpháirteach i go leor galair. Mar shampla, cruthaíonn cealla myeloid, lena n-áirítear macrophages, leukocytes, agus eosinophils, LDanna mar fhreagra ar athlasadh agus strus, agus LDanna ina láithreáin de tháirgeadh agus de stóráil cítocín athlastach agus tá baint acu le cur i láthair antigen agus imréiteach pataigin [6]. Rud atá tábhachtach, in atherosclerosis, tá sé léirithe go bhfuil cealla cúr saibhir LD díobhálach i ngach céim den ghalar [7].

Is féidir le Cistanche díolúine a fheabhsú

Mar sin féin, níor rinneadh staidéar forleathan ar LDanna sa lárchóras néaróg (CNS), agus is beag páipéar a thuairiscigh láithreacht histological LDanna i bhfíochán inchinn an duine [8,9]. Mar sin féin, d'fhéadfadh go mbeadh feidhmeanna tábhachtacha ag LDanna san inchinn, mar a dheimhnigh staidéir le déanaí go raibh LDanna comhiomlánaithe i neurodegeneration luathaithe glia i múnla Drosophila [10]. Tuairiscíodh le déanaí, i lucha, go bhfuil cealla ola-dhearga O-dearfach lipid-ualaithe, lena n-áirítear néaróin, próitéin aigéadach snáithíneach glial (GFAP) móide astrocytes, agus móilín oiriúnaitheora ianaithe cailciam-cheangailteach-1 (IBA{{7}). }) móide microglia, i láthair i go leor réigiún inchinn agus tá sé léirithe a bheith rannpháirteach i bpróisis a bhaineann le haois [1]. Léirigh ár gcuid oibre roimhe seo freisin carnadh méadaithe LD san inchinn i múnla luch PD [12]. Le chéile, tugann na staidéir seo le fios go bhféadfadh baint a bheith ag LDanna le pathogenesis PD, chomh maith le NDDanna eile.

De ghnáth, déantar LDanna intracellular a dhíghrádú ilíosóimagus FAnna a sheachadadh chuig miteacoindria lena dtomhailt mar fhoinse fuinnimh mhalartach le linn tréimhsí ídiú cothaitheach [13]. Mar sin féin, tá cumas íseal ag néaróin maidir le tomhaltas FA mitochondrial le haghaidh táirgeadh fuinnimh [14]. Déanann an tréith seo néaróin go háirithe íogair do charnadh LD agus sárocsaídiú. Ina theannta sin, cuireann carnadh LDanna le ráta ocsaídiúcháin FA agus cuireann sé brú leanúnach ar an slabhra iompair leictreon mitochondrial, a mhéadaíonn táirgeadh speiceas ocsaigine imoibríoch (ROS) trí choimpléisc slabhra iompair leictreon I agus II [15] chun strus ocsaídiúcháin a mhéadú. Mar thoradh ar ró-ualach lipid freisin tá táirgeadh ROS ag foinsí extramitochondrial cosúil le fosfáit dinucleotide nicotinamide adenine (NADPH) agus ocsaídiúcháin eileeinsímí. In éineacht le léiriú laghdaithe einsímí frithocsaídeacha agus an cumas íseal do thomhaltas FA i néaróin, déanann carnadh LD strus ocsaídiúcháin a idirghabháil agus d'fhéadfadh damáiste mitochondrial a bheith mar thoradh air,mífheidhm lysosomal, autophagy lochtach, agus gníomhachtú freagraí athlastacha [6,17]. Mura féidir na LDanna carntha a chosc nó a bhaint, téann néaróin an-ghníomhacha faoi phaitifiseolaíocht, rud a fhágann go n-eascraíonn néar-mheathlú [17]. Léiríonn fianaise go bhfuil ról lárnach ag an bpróiseas catabólach lysosome-idirghabhála ar a dtugtar autophagy maidir le homeostasis LD ceallacha a chothabháil i bhfíocháin iolracha [17,18]. Go mion, is féidir LDanna a fhorlámhú go roghnach in autophagosomes agus a sheachadadh chuig lysosomes le haghaidh díghrádaithe ag lipáis aigéad lysosomal, próiseas ar a dtugtar lipophagy go sonrach [19]. Dá bhrí sin, d’fhéadfadh sé gur cur chuige nua a bheadh ​​i gceist le díriú ar LDanna agus ar a gcosán bainte uathphagic maidir le bainistiú néar-mhíghlúthú.

Le blianta beaga anuas tá suim mhór tar éis a bheith faighte ag staidéar ar tháirgí nádúrtha agus ar ghníomhairí aiste bia mar fhoinsí le haghaidh cóireálacha agus straitéisí féideartha NDD [20]. Is móilín beag polyphenolic nádúrtha é Kaempferol (Ka) atá le fáil i roinnt luibheanna leighis na Síne agus foinsí aiste bia [21]. Tuairiscíodh go bhfuil éifeachtaí antibacterial, frith-aosaithe agus inmunomodulatory ag Ka, chomh maith le gníomhaíochtaí frithocsaídeacha agus neuroprotective [20,22,23]. Tuairiscíodh roimhe seo go raibh Ka bac ar athlasadh i gcealla microglial BV2 in vitro [24] agus méadú ar fhriotaíocht néaróin DA ar neuroinflammation in vivo [25]. Mar sin féin, níl imscrúdú déanta fós ar éifeacht Kaon LDs in PD.

Mar gheall ar an tábhacht a bhaineann le LDs agus an nasc dlúth idir LDs, mitochondria, agus autophagy [16], a bhfuil baint acu go léir le PD, ní mór dúinn hipitéisiú go inhibits Ka sárocsaídiú LD agus cosc ​​neurodegeneration DA i PD. Sa staidéar reatha, léirigh muid go ndearna Ka cosaint shuntasach i gcoinne néarmheathlú i múnla PD murine trí chosc a chur ar charnadh LD. Léirigh tuilleadh staidéir gur spreag Ka autophagy agus laghdaigh sé carnadh LDanna ocsaídithe chun mífheidhm mitochondrial agus táirgeadh mitochondrial ROS (mtROS) a mhaolú, rud a chuir cosc ​​ar bhás apoptotic néarónach. Féadfaidh na torthaí a fuarthas sa staidéar seo cuidiú le cinntí cliniciúla a threorú maidir le húsáid an mhóilín nádúrtha Ka in NDDanna ar nós PD.

2. Ábhair agus modhanna

2.1. Ainmhithe turgnamhacha

Fuarthas lucha C57BL/6J (fireann,4-mí d'aois) ó Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing). Coinníodh agus tógadh lucha in Ionad Acmhainní Ainmhithe Dhámh an Leighis, Ollscoil Leighis Nanjing, agus san áis ainmhithe ag Ospidéal Nanjing Drum Tower, tá cead ag lucha rochtain a fháil ar bhia agus uisce i seomra le teocht chomhthimpeallach 22 céim ± 2 chéim C agus timthriall éadrom/dorcha de 12:12 h Rinneadh na nósanna imeachta ainmhithe go léir i gcomhréir dhlúth le treoirlíne Threoir na nInstitiúidí Náisiúnta Sláinte um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Saotharlainne.

2.2. Imoibrithe

MPTP(M0896),3-MA (M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC> 95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>Fuarthas 99.0 faoin gcéad ,96,353)do thurgnaimh in vitro ó Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAM). Ceannaíodh BODIPY 493/503(D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) ó Thermo Fisher Scientific. I gcás turgnaimh ainmhithe, tuaslagadh Ka i dtuaslagán 10 faoin gcéad DMSO i 16 faoin gcéad SBE- -CD i saline steiriúil. Le haghaidh turgnaimh cille, ullmhaíodh Ka i DMSO (Sigma-Aldrich) agus PBS (tá an tiúchan DMSO deiridh 0.01 faoin gcéad), pH 7.4.

2.3. Ionduchtú agus cóireáil meitile-4-feinil-1,2,3,6-teitreahidrea-piridín (MPTP)- samhail luch PD spreagtha

Chun éifeachtaí Ka sa tsamhail PD de MPTP/p-thocsaineacht a mheas, rinneadh lucha (fireann, 4-5 mí d'aois) a roinnt go randamach sa ghrúpa cóireáilte le saline, grúpa cóireáilte MPTP, MPTP móide Ka-chóireáilte. grúpa, agus grúpa cóireáilte Ka amháin. Sa ghrúpa cóireáilte MPTP, fuair lucha riarachán MPTP ainsealach le prótacal cosúil leis an gceann a thuairiscítear roimhe seo [26]: tuaslagadh MPTP i saline agus instealladh go subcutaneously ag 25 mg / kg agus ina dhiaidh sin 250 mg / kg probenecid (tuaslagtha i sulfoxide dimethyl) instealladh inperitoneally (ip) ag eatraimh de 1 h gach 3.5 lá thar thréimhse 5 seachtaine. Fuair ​​lucha rialaithe instealladh salanda agus probenecid. Sa ghrúpa MPTP móide Ka-chóireáilte, fuair lucha Ka(50 mg/kg, instealladh amháin / lá le linn turgnaimh, Jingzhu Biteicneolaíocht, Nanjing, an tSín) intraperitoneally (ip) laethúil 3 d roimh chóireáil le MPTP agus thar an 5 MPTP seachtainí insteallta. Seachtain amháin tar éis an instealladh MPTP deireanach, cuireadh lucha faoi thástáil iompraíochta dalláilte ar ghrúpaí. Ina dhiaidh sin, rinneadh ainéistéiseach ar na lucha go léir le 40 mg/kg pentobarbital sóidiam agus íobairt do bhrath próitéiní inchinn agus imdhíon-histochemistry nó anailís qPCR.

2.4. Máinliacht stereotacsach in vivo agus cóireálacha turgnamhacha

Rinneadh máinliacht steiréatacsach faoi ainéistéise pentobarbital sóidiam (425 mg/kg, ip) mar a thuairiscítear [25]. Aistríodh Luiche Atg5 agus shRNA rialaithe le veicteoirí pacáistithe (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP) chun AAV a ghiniúint. Le haghaidh microinstealladh, cuirtear lucha ainéistéiseach i bhfearas steiréatachtach. Instealladh iad leis an 1μL AAV le leictreoid ghloine dírithe ar DG(AP:-0.3 mm; ML:±0.13 mm; DV:-0.45 mm) ag a ráta 0.25 μL/nóiméad Ansin coinníodh an tsnáthaid ar feadh 2-nóiméad breise 2 sheachtain tar éis microinstealladh víreas, cuireadh lucha faoi sheoladh múnla PD MPTP-spreagtha agus (nó) cóireáil Ka.

Fuarthas shRNA Atg5 ó Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Maidir le ciúnas Atg5, léiríodh na primers i dTábla Forlíontach 1.

2.5. Anailís iompraíochta

Seachtain amháin tar éis an instealladh deiridh de MPTP nó saline, rinneadh an tástáil rotarod agus tástáil cuaille mar a thuairiscítear roimhe seo [27]. Maidir leis an tástáil rotarod, rinneadh lucha i dtaithí ar an rótaróid in dhá thriail (6 nóiméad le luas luathaithe de 12-20 rpm) in aghaidh an lae ar feadh 2 lá as a chéile roimh thús an turgnaimh. Ansin, tástáladh na lucha ag 20 rpm ar feadh 300 s ar feadh 3 lá as a chéile eile. Taifeadadh an latency titim ag baint úsáide as Córas Anailíse Rotarod (Jiliang, Shanghai, An tSín). Chun an tástáil cuaille, cuireadh lucha ceann suas ar bharr cuaille adhmaid ingearach (garbh-dhromchlú, airde 50 cm, trastomhas 1 cm). Cuireadh na lucha go léir i dtaithí ar an ngaireas 2 lá roimh thástáil agus ansin tástáladh iad ar feadh trí huaire sa tríú lá. Taifeadadh an t-am iomlán (T-iomlán, go dtí gur shroich an luch an t-urlár lena ceithre lapaí) agus an t-am sealaithe (T-casadh, chun an luch a chasadh go hiomlán síos). Rinneadh an turgnamh a dhalladh ar ghrúpaí luiche do gach tástáil iompraíochta agus rinneadh an tástáil trí huaire.

2.6. Bailiúchán samplaí inchinn

Tar éis na dtástálacha iompraíochta deiridh, rinneadh ainéistéiseach ar lucha le sóidiam pentobarbital (40 mg/kg, ip). Maidir le qPCR, blotting an iarthair, agus anailís crómatagrafaíocht leachta ardfheidhmíochta (HPLC), baineadh na brains iomlána go tapa as ainmhithe agus ansin rinneadh na fíocháin midbrain agus striatum a dháileadh go tapa, réamh-reoite ag nítrigin leachtach. Stóráladh na samplaí go léir ag -80 céim go dtí go ndearnadh anailís orthu.

Le haghaidh anailíse imdhíon-histochemical, bhí lucha perfused tras-cairdiach le 4 faoin gcéad paraformaldehyde (PFA). Baineadh brains, iar-seasta, díhiodráitithe, leabaithe in OCT (Fíocháin-Tek), agus rinneadh codanna sraitheacha de na brains a chriosghearradh （30 μm in aghaidh an tslis） trí gach strataim agus midbrain iomlán ag baint úsáide as microtome reo (Leica CM1950, Nussloch, an Ghearmáin ). Bailíodh na hailt go léir i sé shraith ar leith agus stóráiltear slisní inchinn i 50 faoin gcéad glycerin agus reoite ag -20 céim go dtí an anailís.

Maidir le TEM, bhí lucha perfused le 2.5 faoin gcéad glutaraldehyde agus 2 faoin gcéad paraformaldehyde mar a thuairiscítear 【12】. Cuid bheag （<1 mm²）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Anailís imdhíon-aisticeimiceach

Rinsíodh slisní inchinn i PBS agus 3 faoin gcéad H2O ina dhiaidh sin, ar feadh 10 nóiméid gortha ansin le 0.3 faoin gcéad Triton X-100 i PBS forlíonta 5 faoin gcéad BSA ar feadh 1 h. Ina dhiaidh sin, goradh sleamhnáin leis na príomh-antasubstaintí ag 4 céim thar oíche i PBS ina raibh 5 faoin gcéad BSA ag 4 céim thar oíche, ansin nite agus gortha in antasubstaintí tánaisteacha ar feadh 1 h ag teocht an tseomra, agus ina dhiaidh sin gor le diaminobenzidine (DAB) nó gléasta isteach. DAPI (Teicneolaíochtaí Beatha, Cat P36931)mar staining imdhíonfluaraiseacha le haghaidh 5 nóiméad. Le haghaidh staining Nissl, rinneadh na sleamhnáin a chumasc i dtuaslagán cresyl violet (CV) (0.1g violet cresile, 99 ml H,O, agus 1 faoin gcéad d'aigéad aicéiteach 1 ml) ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra díhiodráitíodh iad le halcól agus xiléin. Breathnaíodh íomhánna agus gabhadh grianghraif faoi mhicreascóp Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Stáit Aontaithe Mheiriceá). Fuarthas líon iomlán na néaróin TH-dearfach agus Nissl's-dearfach sa SNpc go séireolaíoch trí úsáid a bhaint as an modh codántóra optúla le bogearraí MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Anailís crómatagrafaíocht leachta ardfheidhmíochta (HPLC).

Rinneadh samplaí striatal lucha a aonchineálú le {{0}}.1 M aigéad sárchlórach (1 mg fíocháin in 100 μL aigéad sárchlórach) agus 0.1 mM EDTA, cóireáilte ag ultrasonaic agus lártheifneoirithe ag 20,000 rpm ar feadh 30 nóiméad mar a tuairiscíodh [27]. Ansin bailíodh leachtanna supernatant le haghaidh tomhais. Is tuaslagán measctha é an chéim shoghluaiste atá comhdhéanta de 90 mM fosfáit sóidiam monobasic, 1.7 mM 1-aigéad sulfónach ochtán, citrate 50 mM, 50 μM EDTA, aicéatóintríle 10 faoin gcéad leis an ráta sreafa de 0.2 ml/nóim. Ag an am céanna, le haghaidh ríomh cuar caighdeánach cainníochtúil, ullmhaíodh tuaslagán caighdeáin stoic le haghaidh dopamine agus aigéad aicéiteach déhidrocsa-feinile (DOPAC)(Sigma-Aldrich, SAM) i 0.1 M HClO4. isteach sa chéim shoghluaiste agus tástáladh é ag brathadóir leictriceimiceach ESA Coulochem ⅢI (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific) Tomhaiseadh samplaí agus cainníochtaíodh buaicphointí. Rinneadh tiúchain na monaimíní a chainníochtú trí chomparáid a dhéanamh leis an gcaighdeán ag baint úsáide as bogearraí ClarityChrom (Knauer, an Ghearmáin) agus ansin Tiontaíodh an t-ábhar i strataim de réir an chóimheas caolaithe Léiríodh cuar caighdeánach DA agus DOPAC i bhFíor Forlíontach 1a agus b.

2.8. Cultúir agus cóireálacha cealla

Rinneadh cultúir néaróin bunscoile mesencephalic mar a thuairiscítear roimhe seo [12]. Go hachomair, baineadh go cúramach na fíocháin mesencephalic de lucha C57BL/6 ar lá suthach 14/15(E14/15), dícheangailte go meicniúil chun na seicní agus na soithigh fola móra a bhaint, agus ansin scartha. Ansin, díleádh iad le trypsin-EDTA(Amresco, Solon, OH, USA) agus ansin scagadh trí 100- μm scagaire chun fionraí aonchealla a fháil. Ina dhiaidh sin, plástar na cealla ar phola-L-lísín -plátaí tobair 12-/24-pre-brataithe ag 2.5×10 cealla céime/ml ina bhfuil meán Neurobasal (Cat 21103049, GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) forlíonta le B27 (2 faoin gcéad v:v, Cat 17504044, GibcoTM) agus peinicillin/streiptimícin (0.5 faoin gcéad v:v) Coinníodh na cultúir i seomra humidified (37 céim , 5 faoin gcéad gorlann CO2) Athraíodh an meán cultúir gach 3 lá agus is féidir cealla a úsáid ar 7-10 lá.

Línte cille: saothraíodh línte cille SH-SY5Y i 10 faoin gcéad FBS agus 1 faoin gcéad peinicillin/streiptimícin i gorlann humidithe ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO2. Sna turgnaimh, déileáladh le cealla SH-SY5Y le MPP （200 μM） nó dáileoga éagsúla Ka (0,3,30,60,100,300,600 μM) ar feadh 24 h. Spreagadh Ka (3,10,30,60μM,3 h) cealla primed-SH-SY5Y le MPp móide （400 μM） ar feadh 24 h. Spreagadh Ka (30 μM,3 h) le (nó gan) 3-MA (3 mM,1 h) nó -tócaifearóil (50 μM,1h, Sigma-Aldrich,47783) le cealla príomhúla-SH-SH5Y le MPP móide (200 μM) ar feadh 24 h.

2.9. Measúnú inmharthanachta cille CCK8

Braitheadh ​​inmharthanacht cille athraithe cóireála Ka ag Cell Counting Kit-8(CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA). Go hachomair, síolaíodh cealla SHSY5Y i 96- pláta tobair agus ansin cóireáilte le tiúchain éagsúla Ka (3,30,60,100,300,600 μM) ar feadh 24 h. Ansin cuireadh imoibrí 10ulof CCK-8 le gach tobar ar feadh 4 h. Ar deireadh, aimsíodh an t-ionsúcht ag an Speictream Multiskan (Thermo Fisher Scientific) ag 450 nm.

2.10.ATP measúnacht

Braitheadh ​​na leibhéil ATP ceallacha ag Kit Measúnaithe Bithluminescence ATP (Beyotime Biotechnology Co., China〕de réir threoracha an mhonaróra. Tar éis cóireála, rinneadh cealla a líseadh agus a lártheifneoiriú ag 12,000 rpm ar feadh 5 nóiméad ag 4 chéim agus Cuireadh an tuaslagán oibre (100μL) le 20μL den sampla i 96-pláta tobair, agus tomhaiseadh an luminescence láithreach ar léitheoir micreaphláta uathoibríoch.Gnáthaíodh tomhais ó na samplaí go léir go tiúchan próitéine.

2. 11. Agus -K -ATPase measúnacht

Le haghaidh Na móide -K móide -ATPase tomhais (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, an tSín), rinneadh na cealla a shonicated agus a lártheifneoiriú ag 6000 rpm ar feadh 10 nóiméad chun súiche a fháil. Cuireadh réitigh imoibrithe de bhrath Na móide -K móide -ATPase leis agus gor iad de réir threoracha an mhonaróra. Ansin aimsíodh an t-ionsúcht ag 660 nm. Normalaíodh tomhais na samplaí go léir go tiúchan próitéine.

2.12. Anailís blotála an Iarthair

Cuireadh cealla nó fíocháin inchinne sa mhaolán RIPA (50 mM Tris(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 faoin gcéad NP{5}}(FNNO021, Thermo), 0.5 faoin gcéad sóidiam deoxycholate (D6750, Sigma), 0.1 faoin gcéad SDS (74255, Sigma) forlíonta le coscairí protease agus phosphatase (Roche, Shanghai, An tSín) Cinneadh comhchruinnithe próitéine leis an Micrimhilseogra BCA Kit (Beyotime, Shanghai, An tSín) A {{13) }}scaradh SDS-PAGE próitéin ug de gach sampla ag baint úsáide as glóthacha polyacrylamide TGX (Bio-Rad, Hercules, California, SAM) agus ansin aistríodh chuig membrane défhluairíd pholaivinileideine (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). goraíodh na seicní le antasubstaintí príomhúla sonracha éagsúla i TBST ag 4 chéim thar oíche agus ansin nite agus gor iad in antasubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha horseradish peroxidase(HRP) ar feadh 1 h ag teocht an tseomra. (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) agus rinneadh anailís orthu ag baint úsáide as an gcóras íomháithe ImageQuantM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, SAM).

2.13. Fíor-ama cainníochtúil(Q)-agus trascríobh droim ar ais (RT)-PCR

Baineadh RNA iomlán as fíocháin inchinne agus cealla saothraithe ag baint úsáide as imoibrí Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAM). Rinneadh tras-scríobh droim ar ais ag baint úsáide as trealamh imoibrí TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, an tSeapáin). Rinneadh qPCR fíor-ama ag baint úsáide as SYBR Green Master Mix (Bithchórais Fheidhmeach) in ionstraim StepOnePlus (Bithchórais Fheidhmeach). Cheannaigh agus dheimhnigh an Ginearálta (Shanghai, an tSín) na primers. Léiríodh na primers a úsáideadh le haghaidh qPCR i dTábla Forlíontach 2.

2.14. Measúnacht díhidrogenase lactate (LDH).

De réir threoracha an déantóra, plátaíodh cealla i 96-phláta tobair ag 5000 cill/tobar, agus bailíodh meán cultúir chun leibhéil LDH a thomhas le trealamh measúnaithe (Institiúid Bithinnealtóireacht Nanjing Jiancheng). Ansin braitheadh ​​ionsú na samplaí ag an Speictream Multiskan (Thermo Fisher Scientific) ag 450 nm.

2.15.BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11, agus MitoTracker staining dearg domhain

Níodh cealla beo le PBS agus goraíodh iad le 2ug/ml BOD-IPY 493/503(InvitrogenTM, Cat D3922)nó BODIPY 581/591 C11 (BD-Cl1） (2.0 μM , InvitrogenTM, Cat D3861） i PBS ar feadh 15 nóiméad ag céim 37. Le haghaidh staining Deep Red MitoTracker, goraíodh cealla beo le 0.5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) i PBS ar feadh 30 nóiméad ag 37 céim. nite faoi dhó i PBS agus seasta i 3.5 faoin gcéad PFA ar feadh 10 nóiméad agus ina dhiaidh sin níocháin agus counterstaining le Hoechst 33342 (Sigma, Cat B2261) ar feadh 10 nóiméad sular clúdaíodh ar sleamhnáin gloine le haghaidh íomháithe. (Olympus, Tóiceo, an tSeapáin).

2. 16. Hoechst agus PI staining

Bhí dhaite cealla le Hoechst 33,342 (1 ul caolaithe i 50 0 ul PBS, Sigma, Cat B2261) agus （nó） PI (0.1 ul caolaithe i 500 ul PBS, Solarbio, CA1020) ar feadh 10 nóim. agus breathnaíodh le micreascópacht fhluaraiseachta (Olympus, Tóiceo, an tSeapáin).

2. 17. Cíteiméadracht sreafa

Rinneadh cealla a dhíleá agus a rinsiú le D-hank's ansin dhaite le Annexin V-FITC (5 ul caolaithe i 500ul PBS)/PI (0.1 ul caolaithe i 500 ul PBS) trealamh apoptosis (CA1020, Solarbio, Beijing, Chian) de réir phrótacal an mhonaróra. Ina dhiaidh sin, rinneadh anailís ar chealla apoptotic ag baint úsáide as cíteiméadracht sreafa (guava easyCyteTM 8, Millipore, SAM). Rinneadh tomhais fhéideartha membrane mitochondrial ROS agus mitochondrial mar a foilsíodh 【12】. Bhí dhaite cealla SH-SY5Y le MitoSOX (2.5 μM, Invitrogen, USA) nó le Jul (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) ag 37 céim ar feadh 30 nóiméad. Tar éis níocháin le PBS faoi dhó, athchuireadh na cealla ansin i PBS fuar ina raibh 1 faoin gcéad FBS le haghaidh anailísí ciiméadracha sreafa. Rinneadh anailís ar na sonraí leis na bogearraí FCS Express (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2. 18. Measúnachtaí riospráid capall mara

Rinneadh feidhm riospráide mitochondrial i gcealla beo SH-SY5Y a thomhas trí úsáid a bhaint as anailísí flux eischeallach Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, SAM) trí athruithe ar an ráta tomhaltais ocsaigine (OCR). Cealla SH-SY5Y curtha ag 3 × 103 ceadaíodh do chealla/tobar cloí leis na plátaí saothraithe ceall Seahorse agus teacht ar chomhlearthacht thart ar 80 faoin gcéad tráth an turgnaimh. An lá dár gcionn, rinneadh réamhchóireáil ar chealla le Ka agus ansin nochtadh do MPp móide ar feadh 24 uair eile. Braitheadh ​​OCR faoi choinníollacha basal agus cuireadh 1 μM oligomycin, 1 μM FCCP, chomh maith le 1 μM rotenone & antimycin A leis go seicheamhach.

2. 19. Anailís staitistiúil

Cuireadh sonraí i láthair mar mheán ± SEM. Socraíodh tábhacht na difríochta ag t-thástáil an Mhic Léinn, Anailís Dhá-threo ar athraithí, nó anailís aontreo ar athraithí (ANOVA) agus triail iar hoc Tukey ina dhiaidh sin. Measadh go raibh an difríocht suntasach ag P<>

3. Torthaí

Toradh 1. Athchóiríonn Ka mífheidhmiú mótair agus méadaíonn sé leibhéil dopamine i striatum lucha múnla MPTP/p PD

Chun imscrúdú a dhéanamh ar an éifeacht neuroprotective de Kaon PD pathogenesis, 4-insteadh lucha fireann mhí d'aois C57BL/6 leis an MPTP neurotoxin chun an tsamhail MPTP/p PD a bhunú agus cóireáilte le Ka (Fig. la). Tar éis ionduchtú múnla, baineadh úsáid as an tástáil rotarod agus an tástáil cuaille chun feidhmíocht mhótair agus iompraíochta lucha a mheas sna grúpaí éagsúla. Mar a thaispeántar, laghdaíodh an t-am feidhmíochta rotarod go suntasach i lucha cóireáilte MPTP, agus cuireadh cosc ​​​​ar an éifeacht seo le Ka (Fíor 1b). D'athchóirigh Ka freisin na heasnaimh iompraíochta a tharlódh le MPTP, mar a léirigh na laghduithe ar an am casadh agus an t-am iomlán sa tástáil cuaille (Fíor lc agus d), gan cur isteach ar mheáchain choirp na lucha (Fig. le). Ina theannta sin, léirigh anailís HPLC gur tháinig laghdú suntasach ar an leibhéal dopamine sa striatum i lucha MPTP/p-dhúshlánach, agus athchóiríodh an leibhéal seo trí chóireáil Ka (Fíor 1f. Laghdaigh cóireáil Ka freisin an laghdú MPTP/p-spreagtha i déhidroxy. - leibhéil aigéid aicéiteach feinile (DOPAC, meitibilít dopamine) sa striatum (Fíor 1g) Tugann na torthaí seo le fios go ndéanann Ka mífheidhmiú mótair a athchóiriú agus go méadaíonn sé leibhéil dopamine sa striatum i lucha PD a tharchuirtear le MPTP.

Toradh 2. Maolaíonn Ka caillteanas néaróin DA sa SNpc de lucha múnla MPTP/p PD

Ansin, chun éifeacht neuroprotective Kaon MPTP/p-spreagtha DA lagú neuronal a mheas tuilleadh, scrúdaigh muid tyrosine hydroxylase (THD móide néaróin sa SNpc murine trí imdhíonadh. Mar a léirítear i bhFíor. i líon na néaróin TH móide, a mhaolaigh an chóireáil Ka. Ina theannta sin, comhaireamh steireolaíoch na néaróin iomlán sa SNpc, mar atá sainmhínithe ag Nissl

Fíor.1. Maolaíonn cóireáil Ka mífheidhmiú mótair agus méadaítear leibhéil dopamine i striatum lucha múnla MPTP/p PD.

(a) Léaráid scéimreach den dearadh turgnamhach. (b) Tomhaiseadh an t-am ar an tslat don tástáil rótaróide ar thrí lá as a chéile.(cd) Taifeadadh an t-am chun casadh timpeall (am casadh) agus síos cuaille (am dreapadóireachta) don tástáil cuaille. (e)Tomhaiseadh meáchain choirp na luiche ag deireadh an staidéir. (fg) Rinneadh anailís ar Dhopamine (DA) agus aigéad aicéiteach dé-hiodrocsa-feinile (DOPAC) sa striatum ag crómatagrafaíocht leacht ardfheidhmíochta. Sloinntear na sonraí mar mheán ± SEM.n =9-10 do gach grúpa in (b,c,d); n =6-8 do gach grúpa in (f, g).ns, níl sé suntasach, *P<><><0.001,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

staining, a dheimhnigh gur léirigh caillteanas cealla TH bás ceallacha ach níor tháinig laghdú ar léiriú TH agus léirigh sé gur athchóirigh cóireáil Ka an laghdú ar líon na néaróin Nissl-dearfach sa SNpc de lucha cóireáilte MPTP ó 43.3 faoin gcéad go 25.4 faoin gcéad ( Fig.2c agus d). Ina theannta sin, chuir Ka feabhas suntasach ar an laghdú MPTP-spreagtha i TH agus abairt próitéin DAT, arna thomhas ag blotting an Iarthair ( Fíor. 2e-g). Deimhníonn an fhianaise seo éifeacht neuroprotective Ka ar mhúnla luch PD.

Toradh 3. Laghdaíonn Ka carnadh na bhfolús LD agus an strus ocsaídiúcháin i lucha MPTP/p-chóireáilte san SNpc

Léiríonn fianaise mhéadaithe rannpháirtíocht LDanna in NDDs[10], go comhsheasmhach, d'aithin ár gcuid oibre roimhe seo LDanna méadaithe sa SNpc de lucha PD MPTP-spreagtha[12]. Is féidir LDanna a aithint go héasca agus struchtúir bhabhta, íseal-dlúis a thaispeáint le hábhar aonchineálach éagruthach [28]. De ghnáth, is féidir LDanna a dhíghrádú trí autophagy chun carnadh a sheachaint [29]. Chun imscrúdú a dhéanamh an bhféadfadh Ka rialáil a dhéanamh ar LDanna i PD, rinneadh anailís ar an carnadh LDanna trí mhicreascópacht leictreoin tarchurtha (TEM) sa SNpc rialaithe, MPTP/p, agus MPTP/p móide Ka lucha. Mar a léiríodh inár gcuid oibre roimhe seo [12], méadaíodh líon agus méid na LDanna i lucha MPTP / p i gcomparáid le rialuithe cóireáilte le saline (Fíor 3a agus b) agus laghdaíodh go suntasach iad i lucha cóireáilte le Ka (Fig.3c- e). Ina theannta sin, i lucha Ka-chóireáilte, breathnaíodh LDanna níos minice in aice láimhe, iata i, nó díghrádaithe ag autolysosomes, a shainmhínítear mar gráinníní lipofuscin dlúth-leictreonach. Léirigh staining histological breise ar néaróin TH * le BODIPY, dath a lipéadaíonn lipidí neodracha go sonrach agus a úsáidtear go coitianta chun LDanna a bhrath [30], go raibh líon agus méid BODIPY LDs sa SNpc araon níos airde i lucha PD ná i rialuithe, agus tháinig laghdú suntasach ar chóireáil Ka (Fig.3f-h).

Mura féidir LDanna a dhíghrádú go tráthúil, féadfaidh na LDanna carntha dul faoi shárocsaídiú agus cur le strus mitochondrial ROS-idirghabhála [4], rud a mhéadaíonn néarthocsaineacht agus dul chun cinn galair. Mar sin, rinneamar scrúdú breise ar phróifílí slonn na ngéinte a bhaineann le cosaint i gcoinne tocsaineacht FA saor in aisce (Gpx8), ag neodrú speiceas ocsaídiúcháin, fréamhacha superocsaíde (Sod3) agus sárocsaíd hidrigine (Cat), agus meitibileacht FA (Acsbg1 agus Dbi) mar a tuairiscíodh [31] , agus tháinig laghdú suntasach ar gach ceann díobh seo sa SNpc de lucha cóireáilte MPTP i gcomparáid le rialuithe, agus feabhsaíodh na héifeachtaí seo i lucha PD cóireáilte le Ka (Fig.3i). Mar an gcéanna, mhéadaigh MPTP/p na leibhéil slonn mRNA freisin

Fíor.2. Maolaíonn Ka caillteanas néaróin DA sa SNpc de lucha múnla MPTP/p PD.

(ab) Micreafógraif de néaróin tyrosine hydroxylase(TH)-dearfach (a) agus comhaireamh steireolaíoch de néaróin TH-dearfach sa substantia nigra pars compacta (SNpc)(b).Tá barraí scála mar a léirítear. -cealla dearfacha(c) agus comhaireamh steireolaíoch na gceall cresile violet-dearfach sa SNpc(d). Barra scála, 120 μm. (m.sh.) Anailís blot an Iarthair ar slonn próitéin TH agus DAT sa SNpc (e) agus anailís chainníochtúil (f,g). Déantar na sonraí cainníochtaithe a normalú chuig an ngrúpa rialaithe saline. Sloinntear na sonraí mar mheán ± SEM.*P<0.05,><0.01,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.)="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" noxl,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Toradh 4. Cosnaíonn Ka cealla SH-SY5Y in aghaidh apoptóis móide-spreagtha MPP

Coscann MPP plus , meitibilít gníomhach MPTP, einsímí coimpléasc mitochondrial agus is cúis le bás cille a bhaineann go díreach le PD[32]. D'fhiosraigh muid an chéad uair eile an bhféadfadh Ka cosc ​​a chur ar apoptosis néarónach in vitro móide-spreagtha MPP. Mar a léirítear i bhFíor 4a agus b, spreag MPPt (400 μM, 24 h) scaoileadh LDH ó chealla SH-SY5Y, agus mhaolaigh Ka(30 agus 60 μM) scaoileadh LDH go suntasach gan cur isteach ar mharthanas cille (Fig.4a). Ós rud é gur spreag Ka éifeacht chosanta shubstaintiúil ag tiúchan 30 μM (Fig.4b), d'úsáideamar an tiúchan seo i dturgnaimh ina dhiaidh sin Léirigh torthaí staining Hoechst/PI freisin gur laghdaigh Ka go suntasach céatadán na gcealla le comhdhlúthú crómatin móide-spreagtha MPP. (Fíor 4c agus d) agus apoptosis ceallacha, mar is léir ó dhéine méadaithe fluaraiseachta Hoechst (Fíor 4c) agus an céatadán de chealla dhaite Hoechst/PI (Hoechst móide /PI móide) (Fig.4e). braite ag citeiméadracht sreafa, bhí apoptosis cille spreagtha MPPt, is léir ón gcéatadán méadaithe de chealla dhaite V Iarscríbhinnín (AV móide /PI- agus AV móide /Prt) faoi chosaint ag Ka(Fíor 4f agus g). Athruithe MPP móide-spreagtha i slonn próitéine a bhaineann le apoptosis, mar is léir ón upregulation B cl-2, íosrialáil Bax (Fíor.4hi-j), agus scoilteacht laghdaithe caspase-3(Fig.4h, k). Tugann na sonraí seo le fios gur féidir le Ka deireadh a chur le héifeachtaí díobhálacha MPp móide ar Mharthanas cille.

Toradh 5. Sochtann Ka carnadh LD móide-spreagtha agus sárocsaídiú lipid, rud a dhéanann idirghabháil ar damáiste mitochondrial i gcealla SH-SY5Y

Léirigh staidéir le déanaí gur féidir le carnadh LD gan choinne a bheith mar thoradh ar strus méadaithe sárocsaídiúcháin lipid-idirghabhála agus dlús a chur le mífheidhm mitochondrial, rud a chuireann neurodegeneration chun cinn [10]. Léirigh ár gcuid oibre roimhe seo freisin go raibh baint ag na LDanna méadaithe sa SNpc le paiteolaíocht PD i lucha [12]. Chun imscrúdú a dhéanamh an raibh baint ag éifeacht chosanta Ka le carnadh LD in vitro, rinneamar staining LD-shonrach ar dtús i gcealla SH-SY5Y ag baint úsáide as BODIPY 493/503 agus breathnaíodh ar thaisceadh LD méadaithe (leibhéil fheabhsaithe lipidí neodracha)

Fíor 3. Laghdaigh Ka carnadh na bhfolús LD dlúth-leictreonach agus ocsaídiú lipid i lucha MPTP/p-chóireáilte i SNpc.

(ac)Íomhánna ionadaíocha EM a thaispeánann folúis leictreon-gheal (braoiníní lipid), folúis uathphagacha leictreon-dlúth a bhfuil uathliosóim (ALS) iontu, nó líosóim ina bhfuil lipofuscin (Lys) i SNpc lucha atá cóireáilte le seile (a), MPTP/p (b), agus MPTP/p móide Ka (c). Barraí scála, 500 nm. Le(a,b) mar a léiríodh inár gcuid oibre roimhe seo (PMID: 29967574). (de)Cainníochtú na bhfolús LD leictreon-gheal in aghaidh an néaróin sa SNpc sna lucha sonraithe. n =3 lucha,10-12 néaróin in aghaidh an ghrúpa. (fh)Rinneadh codanna lár-lárnach ó saline-, MPTP/p-, agus MPTP/p móide lucha cóireáilte le haghaidh néaróin BODIPY (LDs) agus TH (DA). Taispeánann na painéil is deise formhéaduithe BODIPY móide TH móide néaróin. Léiríonn saigheada LDanna.(gh), Cainníochtú COMHLACHT móide uimhir agus méid LD. (ii) rinneadh anailís ar léiriú mRNA ar ghéinte FFA a bhaineann le tocsaineacht (Gpx8, Sod3, Gat, Acsbg1, agus Dbi)(i) agus géinte struis ocsaídiúcháin (Nox1, Nox2, agus Nox4)(j)i SNpc na lucha a luaitear de réir fíor-ama qPCR.n=4-5 in aghaidh an ghrúpa, trí thurgnamh neamhspleách. Sloinntear na sonraí mar mheán ± SEM; ns, ní suntasach, *P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mptp,="">

Baintear an t-alt seo ashttps://doi.org/10.1016/j.redox.2021.101911Arna fháil 23 Samhain 2020