Chomh maith le Gníomhaíocht MET in Orgánaigh Mhúnla Éagsúla chun Reatha Saoil a Chur Chun Cinn

Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais

RÉAMHRÁ

Cruthaíonn cealla epithelial lionsa (LECs) monolayer de chealla a líneáil capsule anterior an lionsa agus a leathnú go dtí an bogha lionsa meánchiorcal [1, 2]. Tá tógáil agus gnáthfheidhm na LECanna riachtanach chun trédhearcacht agus hoiméastáis meitibileach an lionsa iomláin a chothabháil[3]. Léiríonn fianaise mhéadaitheach go bhféadfadh sé go n-eascródh modhnú, dínádúrú, agus comhiomlánú próitéiní lionsa lena n-áirítear einsímí agus criostaláin de bharr seanaoise LECanna, rud a fhágann go dtiocfaidh teimhneacht lionsa nó fiú cataracts [3-5] as seo ar deireadh. Tá cataracht a bhaineann le haois (ARC) fós mar phríomhchúis le lagú amhairc agus daille, rud a chuireann isteach go mór ar chaighdeán maireachtála daoine scothaosta [6]. Faoi láthair, níl aon straitéisí éifeachtacha ann chun dul chun cinn ARC a chosc. Dá bhrí sin, is gá idirghabháil cógaseolaíochta a fhorbairt a fhéadfaidh trédhearcacht an lionsa a fheabhsú agus moill a chur ar dhul chun cinn ARC.

Le fiche nó tríocha bliain anuas, tá dul chun cinn suntasach bainte amach ag eolaithe maidir le sláinte a fheabhsú agus saolré a leathnú ag baint úsáide as roinnt idirghabhálacha géiniteacha, aiste bia agus cógaseolaíochta [7]. Tá Metformin (MET) ar cheann de na gníomhairí frith-aosaithe a ndéantar staidéar forleathan air. Tugann staidéir shubstaintiúla le fios gur féidir le MET an seanchas a mhaolú agus saolré sláintiúil a leathnú i gcórais mhúnlaí ainmhithe éagsúla. Ní hamháin gur féidir le MET saolré Caenorhabditis elegans a fhadú ach freisin a shláinte agus a bheocht a fheabhsú [8]. Is féidir le MET an carnadh damáiste DNA a bhaineann le haois agus strus ocsaídiúcháin a bhaineann le damáiste DNA i gaschealla midgut Drosophila a laghdú chun a saolré a leathnú [9]. Léiríonn staidéir roimhe seo freisin go bhfeabhsaíonn riarachán MET íseal-dáileog ainsealach sláinte agus saolré lucha [10]. Thairis sin, léiríonn fianaise atá ag teacht chun cinn, nuair a dhéileáiltear le hothair diaibéiteas le MET, go léiríonn siad sochair mharthanais, fiú i gcomparáid le rialuithe nach bhfuil diaibéiteas acu [11].

KSL09

Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh eolais a fháil

I dteannta le gníomhaíocht MET a chothaíonn saolré MET i samhail-orgánaigh éagsúla, díríonn MET ar ilbhealaí comharthaíochta ceallacha chun galair a bhaineann le haois a fheabhsú. Tá sé léirithe go ndéanann MET autophagy a mhodhnú go príomha trí ghníomhachtú próitéin kinase próitéine (AMPK) adenosine monophosphate (AMP) agus cosc a chur ar neurodegeneration agus neuroinflammation chun ról neuroprotective a imirt i ngalar Parkinson [12]. Mar an gcéanna, maolaíonn MET athruithe a bhaineann le haois i gcill endothelial sinusoidal ae tríd an AMPK agus cosáin ocsaíd nítreach endothelial [13].cistanche dosage redditThairis sin, cuireann gníomhachtú ainsealach AMPK ag MET cosc ar chardiomyopathy trí autophagy a rialáil i lucha OVE26 le diaibéiteas [14]. Ina theannta sin, maolaíonn MET meath cardashoithíoch a bhaineann le haois trí fheabhas a chur ar autophagy agus srian calórach [15]. Ina theannta sin, is féidir le cóireáil MET bac a chur ar atherosclerosis a bhaineann le haois i lucha agus coiníní ApoE a tharlódh de bharr aiste bia ard-saill, rud a chosc go suntasach ar chailciú plaic atherosclerotic, ag laghdú leibhéil próitéine C-imoibríoch ard-íogaireachta, agus ag cur faoi chois gníomhachtú an fachtóir núicléach kappa B(NF-kB)chonair sna soithigh fola [16-18].

Bunaithe ar na breathnuithe seo, rinne an staidéar seo iarracht féachaint an bhféadfadh MET moill a chur ar aosú ARC agus an mheicníocht mhóilíneach bhunúsach. Is iad seo a leanas ár dtorthaí: (i) chuir cóireáil MET íseal-dáileog ainsealach moill ar sheansacht LECanna i lucha a bhí in aois nádúrtha, rud a chuir bac ar theimhneacht an lionsa; (i) bhí an cosán AMPK díghníomhaithe, agus lagaíodh flosc uathphagic i LECanna seanaoise;(i) ) chuir cóireáil MET íseal-dáileog ainsealach moill ar sheansacht LECanna i lucha atá in aois go nádúrtha trí chonair AMPK a ghníomhachtú agus feabhas a chur ar uathphagy. Tacaíonn ár dtorthaí leis an ról tuartha atá ag MET in aghaidh aosaithe agus cuireann siad dóthain fianaise ar fáil go bhféadfadh MET a bheith ina rogha theiripeach féideartha do ARC.

TORTHAÍ

Bhí baint ag seangaireacht LECanna le ARC i lucha d'aois nádúrtha

Rinneadh imscrúdú forleathan ar mheicníochtaí iomadúla féideartha ARC, lena n-áirítear éifeacht an aosaithe.sochair sliocht cistanche,Mar sin féin, ní léir an bhaint atá idir seanchas na LECanna agus ARC in vivo. Rinneamar hipitéis go bhféadfadh ARC in vivo a bheith mar thoradh ar shinsearacht na LECanna. Mar sin, rinneamar múnla luiche de ARC. Léirigh ár dtorthaí gur tháinig laghdú suntasach ar thrédhearcacht an lionsa i lucha aosta go nádúrtha (lucha níos sine) i gcomparáid leis an gceann sa ghrúpa rialaithe (lucha óga)(Fig.1a). Mar a léirítear i bhFíor.1b, ba é 95.23 faoin gcéad minicíocht cataracts san aoisghrúpa nádúrtha. Léirigh measúnacht staining H&E go raibh na LECanna sa ghrúpa rialaithe cruinn i gcruth agus socraithe go rialta, agus go raibh dlús na ngnáth LECanna sách ard, ach go raibh LECanna na lucha d'aois nádúrtha cothrom i gcruth agus eagraithe go míchothrom, agus bhí an dlús de tháinig laghdú suntasach ar LECanna seanaoise (Fíor 1c). Ina theannta sin, léirigh staining gal SA- -go raibh an cóimheas idir LECanna seanaoise ardaithe i lucha a d’aois go nádúrtha (Fíor 1d). Ina theannta sin, rinneamar anailís ar léiriú próitéine ar mharcóirí a bhaineann le seangacht trí ruaimniú IHC agus anailís blotála an iarthair. Léirigh staining IHC gur méadaíodh an slonn de p21 agus p53 i LECanna lucha atá in aois go nádúrtha i gcomparáid le lucha óga (Fig. 1e, f). Mar an gcéanna, fuaireamar amach freisin go raibh an slonn próitéine de p21 agus p53 níos airde i capsules lionsa na lucha d'aois nádúrtha ná i capsúil lionsa na lucha óga (Fíor 1g). Thug na torthaí seo le fios go raibh baint ag seanchas na LECanna le ARC i lucha d'aois nádúrtha.

KSL10

Is féidir le Cistanche frith-aging

Chuir riarachán MET íseal-dáileog ainsealach feabhas ar thrédhearcacht an lionsa agus mhaolaigh sé sinsiúlacht LECanna Sula ndearnamar tástáil ar éifeacht metformin ar ARC, chinneamar an bhfuil an riarachán MET íseal-dáileog ainsealach sábháilte do lucha. Tar éis cóireáil MET ar feadh 10 mí, fuair 28 lucha (18 sa ghrúpa d'aois nádúrtha agus 10 sa ghrúpa MET) bás de bharr cúiseanna nádúrtha. Fuaireamar amach go raibh lucha beo sa dá ghrúpa sláintiúil, agus ní raibh aon difríocht shuntasach i meáchain choirp agus meáchain orgán idir an dá ghrúpa (Tábla 1). Dá bhrí sin, léirigh na torthaí seo go raibh an dáileog de metformin a úsáideadh sa staidéar sábháilte do na hainmhithe agus go bhféadfaí é a úsáid le haghaidh turgnaimh ina dhiaidh sin.

Ina dhiaidh sin, riaradh MET íseal-dáileog ainsealach le measúnú an bhféadfadh MET bac a chur ar theimhneacht an lionsa agus faoiseamh a dhéanamh ar sheanaoise LECanna a bhaineann le haois i lucha atá in aois go nádúrtha. De réir mar a bheifí ag súil leis, cuireadh feabhas mór ar thrédhearcacht an lionsa sa ghrúpa MET i gcomparáid le trédhearcacht an lionsa san aoisghrúpa nádúrtha (Fíor 2a). Ina theannta sin, dhearbhaigh breathnuithe moirfeolaíocha gur léirigh lionsa an ghrúpa MET laghdú ar theimhneacht. Ba é 95.23 faoin gcéad minicíocht na gcataracts san aoisghrúpa nádúrtha, ach ba é 19.00 faoin gcéad (Fíor 2b) an minicíocht sa ghrúpa MET (Fíor.2b). Léirigh measúnacht staining H&E go raibh dlús na LECanna sa ghrúpa MET i bhfad níos airde. ná sin i lucha aosta go nádúrtha (Fig. 2c). Ina theannta sin, bhí LECanna an ghrúpa MET sách cruinn i gcomparáid le cinn an ghrúpa d'aois nádúrtha (Fíor 2c). SA- -Léirigh staining gal gur tháinig laghdú suntasach ar chóimheas na LECanna seanaoise sa ghrúpa MET i gcomparáid leis an gcóimheas san aoisghrúpa nádúrtha (Fíor 2d). Léirigh anailís IHC gur tháinig laghdú níos mó ar léiriú p21 agus p53 i LECanna an ghrúpa MET ná san aoisghrúpa nádúrtha (Fig.2e, f). Ar an dul céanna, léirigh anailís blot an iarthair go raibh laghdú thar cuimse ar léiriú próitéine de p21 agus p53 i capsúil lionsa an ghrúpa MET i gcomparáid leo siúd den aoisghrúpa nádúrtha (Fig.2g). Léirigh na torthaí seo go bhféadfadh riarachán ainsealach MET íseal-dáileog feabhas a chur ar thrédhearcacht an lionsa agus maolú a dhéanamh ar sheansacht LECanna.

KSL11

Laghdaigh riarachán MET íseal-dáileog ainsealach an seangacht LECanna i lucha aosta go nádúrtha trí ghníomhachtú AMPK Tacaíonn méid ollmhór sonraí leis an gconclúid gur leor AMPK a ghníomhachtú chun saolré orgánaigh mhúnla a shíneadh, rud a mhéadaíonn a achomharc mar sprioc fad saoil [19,20] . Agus an teoiric seo á cur san áireamh, rinneamar measúnú ar léiriú an chosáin AMPK i LECanna na lucha. Laghdaíodh an leibhéal mRNA coibhneasta FAS sa ghrúpa d'aois nádúrtha agus méadaíodh é sa ghrúpa MET (Fíor 3a). Mar a léirítear i bhFíor.3b,c, laghdaíodh an léiriú ar AMPKa fosfarlaithe (Thr172) agus ACC fosfarlaithe (Ser79) i LECanna lucha atá in aois go nádúrtha i gcomparáid le lucha óga. Mar sin féin, ardaíodh an léiriú ar AMPKa fosfarylated (Thr172) agus ACC fosfarylated (Ser79) i LECs an ghrúpa MET i gcomparáid leo siúd den aoisghrúpa nádúrtha. Ina theannta sin, léirigh anailís blot an iarthair go raibh an léiriú próitéine de AMPKa (Thr172) agus fosfarylated ACC (Ser79) íslithe go suntasach i capsúil lionsa na ndaoine aosta go nádúrtha, agus leibhéil léirithe próitéine AMPKa fosfarylated (Thr172) agus fosfarylated ACC ( Ser79)i capsúil lionsa an Ghrúpa MET (Fig.3d). Léirigh na sonraí seo go raibh an cosán AMPK díghníomhaithe i LECanna lucha a bhí in aois go nádúrtha. Ina theannta sin, mhaolaigh riarachán ainsealach íseal-dáileog MET seangacht LECanna i lucha a d'aois go nádúrtha trí ghníomhachtú AMPK.

D'athchóirigh riarachán MET íseal-dáileog ainsealach an flosc autophagic chun sos na LECanna i lucha aosta go nádúrtha a mhaolú Léirigh staidéir roimhe seo go bhféadfadh ról tábhachtach a bheith ag autophagy chun éifeachtaí díobhálacha aosú a chomhrac [21,22]. Chun anailís bhreise a dhéanamh ar na hathruithe móilíneacha agus ceallacha sa lionsa tar éis cóireála MET, chinneamar léiriú LC3 agus p62 toisc go nglactar leo go forleathan mar bhithmharcóirí ar leibhéil na n-uathphagy. Mar a léirítear i bhFíor 4a, méadaíodh an leibhéal slonn coibhneasta p62 mRNA go suntasach sa ghrúpa d'aois nádúrtha i gcomparáid le leibhéal an ghrúpa rialaithe; áfach, rinneadh an leibhéal slonn coibhneasta mRNA de p62 a ísliú go substaintiúil sa ghrúpa MET i gcomparáid leis an leibhéal san aoisghrúpa nádúrtha.cistanche genghis khanIna theannta sin, léirigh staining IHC gur méadaíodh na leibhéil de phróitéin a bhaineann le micreafeadán 1 slabhra éadrom 3(LC3-II/l) agus p62 i LECanna lucha atá in aois go nádúrtha. Ina theannta sin, léirigh ár dtorthaí go raibh laghdú suntasach ar leibhéil LC3-II/l agus p62 i LECanna an Ghrúpa MET (Fíor 4b, c). Méadaíodh na leibhéil próitéine LC3-ll agus p62 go suntasach sna capsúil lionsa den aoisghrúpa nádúrtha (Fíor 4d). San iomlán, rinneamar tuairimíocht go raibh lagú ar an flosc autophagic i LECanna na lucha atá in aois go nádúrtha agus go bhféadfaí é a chur ar ais trí riarachán MET íseal-dáileog ainsealach chun senescence LECs i lucha aosta go nádúrtha a mhaolú.

PLÉ

Tá cataracts neamhchóireáilte mar phríomhchúis le daille ar fud an domhain arb iad is sainairíonna iad teimhneacht an lionsa criostalach [23]. Tá sé léirithe ag staidéir eipidéimeolaíocha gurb é aois an fachtóir riosca is mó le haghaidh cataracts, ar a dtugtar ARC, agus is é an t-aon chóireáil ná baint máinliachta [24]. Léirigh staidéir roimhe seo gurb é seangacht LECanna an phríomhchúis le ARC [25]. Go dtí seo, ní raibh aon ghníomhairí teiripeacha éifeachtacha ann chun scamallacht an lionsa a chosc agus le híogaireacht LECanna a mhaolú gan fo-iarmhairtí neamh-inmhianaithe. Ba é fócas an staidéir seo ná measúnú a dhéanamh ar an mbonn móilíneach bitheolaíoch le híogaireacht na LECanna agus ar an meicníocht chun gnáth LECanna a chosaint ar sheanchas. Léirigh ár dtorthaí go raibh baint ag díghníomhú AMPK agus lagú autophagy le seangacht LECs agus ARC. Ina theannta sin, fuaireamar amach go bhféadfadh MET LECanna a chosaint ar sheanchas agus bac a chur ar scamallacht an lionsa trí AMPK a ghníomhachtú agus feabhas a chur ar uathphagy.

Is próiseas bunúsach bitheolaíoch é an t-íogaireacht agus tá laghdú ginearálta ar fheidhm fíocháin ag gabháil leis. De réir mar a mhéadaíonn an saolré, déantar drochshláinte ar mhífheidhm a bhaineann le haois mar ARC

saincheisteanna [26]. Tuairiscíodh go bhfuil baint ag seangaireacht LECanna le tarlú agus forbairt ARC [5]. Léirigh ár dtorthaí go raibh LECanna na lucha d'aois nádúrtha cothrom i gcruth agus socraithe go míchothrom, agus tháinig laghdú suntasach ar dhlús na LECanna (Fíor 1c, d). Ina theannta sin, bhí an abairt de ghéinte a bhaineann le dul in aois (p21 agus p53) upregulated i LECs na lucha d'aois nádúrtha (Fig. 1e, f, g). Thug ár dtorthaí le tuiscint go raibh baint ag seanaoise na LECanna le tarlú agus forbairt ARC. Mar sin, d’fhéadfadh go mbeadh gá le tuiscint chruinn ar na meicníochtaí móilíneacha atá mar bhonn le híogaireacht na LECanna chun réasúnaíocht a sholáthar do straitéisí cóireála nua.

Is é MET an cógas hipoglycémach béil is forleithne ar fud an domhain le haghaidh diaibéiteas cineál 2. Léiríonn fianaise atá ag teacht chun cinn go bhfuil éifeachtaí tairbhiúla ag MET ar an tsláinte thar iad siúd a bhaineann le feabhas a chur ar glycemia [27]. Deimhníodh go bhfuil meicníochtaí MET tábhachtach chun díriú ar bhealaí bunúsacha san aosú bitheolaíoch, mar shampla AMPK a ghníomhachtú, autophagy a mhéadú, athlasadh a chosc, agus éifeachtaí frith-ocsaídiúcháin a fheidhmiú [28]. I ndaoine, tá MET in úsáid i gcleachtas cliniciúil ar feadh níos mó ná 60 bliain; tá próifíl ard sábháilteachta aige agus tá sé i riocht uathúil chun idirghabháil a dhéanamh i roinnt bealaí ríthábhachtacha atá freagrach as aosú agus galair a bhaineann le haois. Mar sin féin, níor tuairiscíodh riamh éifeachtaí MET ar ARC agus meicníocht rialála na n-éifeachtaí sin. Mar thoradh air sin, inár staidéar, d'fheabhsaigh riarachán ainsealach MET íseal-dáileog i lucha a d'aois go nádúrtha trédhearcacht an lionsa (Fíor 2a) agus mhaolaigh sé seangacht LECs in vivo (Fíor 2).

KSL12

Aithnítear go forleathan go ngníomhaíonn MET an cosán AMPK arb é an mheicníocht fhéideartha atá ag MET chun éifeacht frith-aosaithe a fheidhmiú [29]. Tá ról ríthábhachtach ag AMPK, braiteoir fuinnimh cheallacha, maidir le cothromaíocht fuinnimh cheallacha a rialáil [30]. Tá sé léirithe ag staidéir éagsúla go bhfuil AMPK mar chomhtháthóir agus mar idirghabhálaí ar roinnt bealaí agus próisis a nascann fuinníocht le fad saoil. Inár staidéar, fuaireamar amach go raibh díghníomhú AMPK ina ghné de LECanna seanaoise i lucha atá in aois go nádúrtha (Fig.3). Ina dhiaidh sin, léiríodh go spreagfadh MET an cosán AMPK chun cosc a chur ar sheansacht LECanna (Fíor 3). Mar ghníomhachtóir AMPK bunaithe, déantar ról MET maidir le haosú a chosc go ginearálta a chur i leith a éifeachtaí ar mhodhnú cosáin chomharthaíochta iartheachtacha, mar athchóiriú autophagy, gníomhachtú Sirt1 agus Foxo1 agus cosc mTOR [31,32]. Chuir ár staidéar líne nua fianaise ar fáil a leag béim ar thábhacht na feidhme AMPK a ghníomhaíonn MET chun cosc a chur ar tharla ARC.

Mar a luadh thuas, déanann AMPK cumarsáid le go leor bealaí agus próitéiní chun éifeacht frith-seansúlachta a fheidhmiú, lena n-áirítear méadú ar autophagy. Tá spéis fhorleathan tarraingthe ag autophagy, atá ag teacht chun cinn mar chroíphróiseas um dhearbhú fad saoil, mar sprioc teiripeach féideartha do ghalair a bhaineann le haois. Is próiseas bitheolaíoch casta ilchéime sreabhán é autophagy. Tugtar flosc autophagic ar phróiseas iomlán an autophagy, a úsáidtear go forleathan chun leibhéal an autophagy a léiriú. Mar tháscaire ar uathphagaíocht, tá LC3-Il ceangailte go docht leis an scannán uathphagosómach atá díghrádaithe ag einsímí líseasómacha.síneadh saoil cistancheAr an gcaoi chéanna, is gnách go ndéantar p62, substráit autophagy-shonrach, a dhíghrádú in autophagolysosome, agus léiríonn a léiriú go hindíreach leibhéal an autophagy. Sa staidéar reatha, thug ár dtorthaí le tuiscint gur tháinig laghdú suntasach ar leibhéal na n-uathphagy i LECanna seanaoise (Fíor 4), ach d'aisiompaigh MET lagú na n-uathphagy a bhaineann le haois (Fíor 4). Cuirtear meicníocht mhóilíneach frith-aosaithe MET i leith príomhfheidhm AMPK i gcealla toisc go bhfeabhsaíonn sé go ginearálta autophagy trí ghníomhachtú AMPK [33]. Ina theannta sin, taispeántar go gcuireann MET leis an uathphagaíocht go díreach, rud a chuidíonn le cosc a chur ar sheansacht [34]. Mar sin féin, tá gá le staidéir níos mionsonraithe chun na meicníochtaí bunúsacha a shoiléiriú, rud a chruthaíonn go gcuireann MET leis an uathphagy trí chosán AMPK neamhspleách nó cleithiúnach.

Tá sé léirithe nach bhfuil baint ag leitheadúlacht ARC le gnéas i ndaonraí de bhunadh na hÁise [35, 36]. Dá bhrí sin, níor mheasamar gnéas mar fhachtóir a d'fhéadfadh tionchar a bheith aige ar ARC. Ba cheart ár staidéar a léirmhíniú agus na teorainneacha thuasluaite á gcur san áireamh.

CONCLÚID

Go hachomair, chruthaíomar go bhféadfadh díghníomhú an chosáin AMPK agus lagú útarphagy a bhaineann le haois cur le héirim na LECanna agus le tarlú ARC. Ina theannta sin, léirigh na sonraí ónár dturgnaimh gur chuir MET moill éifeachtach ar sheanaoise na LECanna agus ar fhoirmiú ARC trí ghníomhachtú an chosáin AMPK agus méadú ar uathphagy. Is bunlíne iad ár dtorthaí le haghaidh tuilleadh imscrúdaithe ar na meicníochtaí móilíneacha atá úsáideach i ról MET le linn phróiseas ARC a bheith ag dul in aois agus beidh siad faisnéiseach le haghaidh staidéir níos déine ar fhorbairt straitéisí nua in aghaidh theacht chun cinn agus forbairt ARC.

ÁBHAR AGUS MODHANNA Imoibrithe

Ceannaíodh MET ó Bristol-Myers Squibb Company(tSín).Antasubstaintí in aghaidh p21 (ab188224), p53 (ab131442), AMPKa(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -actin (ab8226) agus Fuarthas SQSTM1/p62 (3340-1) ó Abcam(MA, USA).Ceannaíodh antasubstaintí in aghaidh LC3 (12741) agus carboxylase CoA fosfa-aicéitil (p-ACC)(Ser79)(3661) ó Cell Signaling Technology ( MA, SAM).

Ainmhithe agus cóireáil

Ceannaíodh lucha fireann C57BL6J a bhí 3 agus 8 mí d'aois ó Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Beijing, an tSín). Bhí na lucha lonnaithe i gcoinníollacha teocht-rialaithe (teocht, 20-25 céim agus taiseachas coibhneasta, 55 ± 15 faoin gcéad ) le timthriall éadrom / dorcha 12 h, le rochtain saor in aisce ar bhia agus uisce. D'fhaomh coiste eitice Ollscoil Leighis Harbin gach nós imeachta agus prótacal a rinneadh ar ainmhithe.

Roinneadh na lucha sna trí ghrúpa seo a leanas:(i) grúpa rialaithe a bhfuil lucha óga (3 mhí d'aois, meáchan coirp=29.72± 1.66 g, n =40)a fuair gnáth-aiste bia luchóg íonaithe agus uisce ad libitum ; Nuair a bhí na lucha 10 mí d'aois, roinneadh 120 lucha go randamach ina dhá ghrúpa: aoisghrúpa nádúrtha agus grúpa MET. (i) fuair grúpa d’aois nádúrtha (lucha níos sine, 20 mí d’aois, meáchan coirp=32.98±1.93g, n=60) aiste bia luch caighdeánach íonaithe agus uisce ad libitum;(ii)grúpa MET ( 20 mí d'aois, meáchan coirp=31.21±2.81 g,n=60)cothaithe ar aiste bia caighdeánach luch íonaithe agus uisce go dtí go raibh na lucha 10 mí d'aois; ina dhiaidh sin, cuireadh tús leis na cóireálacha. Tugadh aiste bia do lucha sa ghrúpa MET arna fhorlíonadh le 0.1 faoin gcéad MET (Bristol Myers Squibb, an tSín) agus uisce faoi shaoirse ar feadh 10 mí.

leithlisiú lionsaí agus capsúil lionsa

Eotanaíodh na lucha trí dhíláithriú ceirbheacsach. Bhí excised an tsúil ar fad láithreach ó gach ainmhí turgnamhach agus a chur i saline steiriúla. Cuireadh an néar snáthoptaice in airde agus socraíodh é le tweezers. Rinneadh incision ansin ar an nerve snáthoptaice a théann isteach sa tsúil, agus tarraingíodh an sclera ar ais chun an lionsa a nochtadh.cistean nzIna dhiaidh sin, d’úsáideamar tweezers chun na blúirí coirp ciliary a bhí ceangailte d’eitleán meánchiorcal an lionsa a bhaint go réidh. Tógadh grianghraif den lionsa úr láithreach, agus socraíodh an lionsa go tapa le 4 faoin gcéad paraformaildéad ag teocht an tseomra. Rinneadh na capsúil lionsa iomlána a scafa go tapa ón lionsa a bhí fágtha, iad a reo i nítrigin leachtach, agus iad a stóráil ag 80 céim C le haghaidh turgnaimh ina dhiaidh sin.

Haematoxylin agus eóisin (S&E)

Socraíodh an lionsa úr láithreach le 4 faoin gcéad paraformaildéad ag teocht an tseomra agus leabaithe i pairifín. Le haghaidh scrúdú histeolaíoch, gearradh na fíocháin i 4- slisní μm. Tar éis deparaffinization agus rehydration, bhí na hailt paraifín ullmhaithe dhaite le tuaslagán hematoxylin (H) ar feadh 8 nóiméad, agus ina dhiaidh sin 5 tumadh in eatánól aigéad 1 faoin gcéad (1 faoin gcéad HCI in eatánól 70 faoin gcéad)

agus sruthlaithe le huisce driogtha. Ina dhiaidh sin, rinneadh na hailt a dhaite le tuaslagán eosin (E) ar feadh 3 min, agus ina dhiaidh sin díhiodráitíodh iad le halcól grádaithe agus imréitigh le xiléin. Breathnaíodh athruithe moirfeolaíocha faoi mhicreascóp (Nikon, Eclipse, an tSeapáin).

Measúnacht senescence-associated -galactosidase (SA- -Gal) Tomhaiseadh an ghníomhaíocht senescence-associated -galactosidase (SA- -Gal) trí úsáid a bhaint as trealamh staining SA- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). De réir threoracha an mhonaróra, nite na codanna fíocháin, tar éis sraith cóireálacha, le saline maolánach fosfáit (PBS) ar feadh 5 nóiméad (trí uair) agus ansin goraíodh iad i dtuaslagán staining gal SA{- -(pH 6.0) ag 37 céim gan CO2 ar feadh 24 h. Gabhadh na híomhánna faoi mhicreascóp solais (Nikon, Eclipse, an tSeapáin). Measadh céatadán na gceall SA- -gal-dearfach mar mheánlíon na gceall deimhneach/meánlíon na gceall iomlán.

Imoibriú slabhra polaiméaráise fíor-ama cainníochtúil (gRT-PCR) Baineadh RNA iomlán as na capsúil lionsa de lucha ag baint úsáide as an imoibrí TRlzol. Rinneadh tras-scríobh droim ar ais leis an ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen). Rinneadh anailís chainníochtúil imoibriú slabhrúil tras-trascríobh-polaiméiráis (qRT-PCR) ag baint úsáide as SYBR Green Supermix

trealamh (Takara, Tóiceo, an tSeapáin), le -actin mar rialú ingenous. Fiosraíodh na tras-scríbhinní le haghaidh roinnt sprice géine, lena n-áirítear FAS (ar aghaidh, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'agus droim ar ais,5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (ar aghaidh,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} agus droim ar ais,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') agus -actin (ar aghaidh, 5 '-TCGTGGCCGCCCTAGGCAC-3'agus droim ar ais,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. An gaol bhí leibhéil de gach léiriú géine

modh. normalaithe go -actin agus ríomh ag baint úsáide as 2-△△ct r staining Immunohistochemical (IHC)Úsáideadh iomlán de 5 rannóg ionadaíocha ó gach ceann de na 10 lionsa roghnaithe in aghaidh an ghrúpa le haghaidh anailís imdhíon-histochemical (IHC) measúnú a dhéanamh ar léiriú p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3, agus p62. Tar éis na samplaí ullmhaithe a ghoradh ag 60 céim ar feadh 2 h, cuireadh trí shraith alcóil xiléin agus grádaithe iad le haghaidh díphairifínithe. Ina dhiaidh sin, bhí na samplaí bruite i 0.1 M d'aigéad citreach (pH 6.1) ar feadh 30 nóiméad agus fuaraithe go teocht an tseomra. Tar éis níocháin trí huaire le PBS, bhí na samplaí sáithithe le 0.3 faoin gcéad HO, chun gníomhaíocht peroxidase ingenous a chosc. Ina dhiaidh sin, cuireadh antasubstaintí príomhúla leis agus fuaraíodh iad ag 4 céim C, thar oíche. Goradh na antasubstaintí tánaisteacha comhfhreagracha ar feadh 1 h ag 37 céim C. Tar éis níocháin le PBS, goradh na samplaí i diaminobenzidine (DAB) go dtí gur tháinig an déine stainne inmhianaithe chun cinn. Gabhadh íomhánna de na cealla imdhíonta trí úsáid a bhaint as micreascóp Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, an tSeapáin).

Anailís blot an Iarthair

Baineadh próitéin iomlán as capsúil lionsa lucha trí úsáid a bhaint as measúnacht radai-imdhíonachta maolán (RIPA) le manglam coscaire protease (Pierce, SAM), agus úsáideadh trealamh aigéad bicinchoninic (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA) chun an tiúchan próitéine a chainníochtú. . Rinneadh anailís ar an bpróitéin iomlán (40 ug) ag baint úsáide as leictreafóiréis glóthach dodeicil sulfáit-polyacrylamide sóidiam (SDS-PAGE) agus aistríodh go leictreafóiréiseach é go seicní scagaire défhluairíde polaivinileideéine (PvDF) (Millipore, an Ghearmáin). Goradh na seicní thar oíche le hantasubstaint phríomhúil ag 4 céim C. An lá dár gcionn, goraíodh na seicní le antasubstaintí tánaisteacha comhfhreagracha ar feadh 1 h ag 37 céim C. Rinneadh na bannaí imdhíon-imoibríocha a léirshamhlú ag baint úsáide as modh an tsubstráit chemiluminescent le Super Signal West Pico. trealamh (Pierce Biteicneolaíocht, SAM). Rinneadh trí thurgnaimh neamhspleácha.

Anailís staitistiúil

Cuireadh na sonraí in iúl mar mheándiallas caighdeánach (SD). Rinneadh anailís staitistiúil ag baint úsáide as bogearraí GraphPad Prism 7.0 agus Microsoft Excel. Rinneadh próitéin a chainníochtú trí úsáid a bhaint as bogearraí Image J. Baineadh úsáid as t-tástáil agus anailís athraithis an Mhic Léinn (ANOVA) chun tábhacht staitistiúil na sonraí turgnamhacha a ríomh. Difríochtaí le P-luach<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">