Athraítear Nochtadh Sceite Díosail Léiriú Líonraí a Bhaineann le Giniúint Néar-ghlúin in Inchinn riabhacha Cuid 2

Ullmhúchán sampla próitéine

Chun samplaí próitéine a ullmhú, leithlisíodh na cinn ó 80 go 100 larbhaí ainéistéiseach (5 pdf) go cúramach agus nite iad le PBS sular aistríodh iad go maolán lysis a bhí comhdhéanta de 15% TCA/aicéatón réamhfhuaraithe ina raibh 0.07% béite-mercaptoethanol (ME). )agus manglam coscaire próitéáis (an monaróir de dhíth) i dtoirt iomlán 500 ul.

Le blianta beaga anuas, tá suim mhór curtha in éifeachtaí samplaí próitéine ar chuimhne. Tá níos mó agus níos mó daoine ag tosú ar an tábhacht a bhaineann le aiste bia do shláinte a thuiscint, go háirithe ról tábhachtach próitéine i gcorp an duine.

Is iad próitéiní bunábhair tógála an chorp daonna agus tá ról tábhachtach acu i gcorp an duine. Mar gheall air seo, tá samplaí próitéine ina gcainéal tábhachtach do go leor daoine agus iad ar thóir na sláinte agus na háilleachta. Chomh maith le muscle a thógáil agus an corp a dhealbhú, is féidir le samplaí próitéine cuimhne duine a fheabhsú freisin.

Tá staidéar déanta ag roinnt eolaithe ar an ngaol idir próitéiní agus cuimhne. Fuair ​​​​siad amach go bhfuil iontógáil fadtéarmach próitéin leordhóthanach tairbheach do gach gné de shláinte fhisiciúil, go háirithe cuimhne. Tá fianaise ag fás go bhfuil tionchar tábhachtach ag iontógáil próitéine aiste bia ar fheidhm na hinchinne agus cuimhne.

Tá próitéin ina chomhpháirt thábhachtach de néaróin san inchinn an duine, agus mar sin tá tionchar tábhachtach ag iontógáil laethúil próitéine ar chuimhne agus ar chumas smaointeoireachta daoine. Ní hamháin go gcomhlíonann iontógáil próitéine fadtéarmach riachtanais próitéin an chomhlachta ach cuidíonn sé leis an inchinn fanacht gníomhach agus sláintiúil.

Ina theannta sin, is féidir le próitéin cabhrú leis an gcomhlacht cothromaíocht siúcra fola a choinneáil agus giúmar cobhsaí a chothabháil. Tá sé seo an-tábhachtach chun cuimhne agus scileanna smaointeoireachta a chothabháil. Mar sin, is féidir le hiontógáil measartha próitéine cabhrú le feabhas a chur ar fheidhmeanna cognaíocha éagsúla agus ar staid mhothúchánach an chorp daonna.

Tríd is tríd, tá gaol láidir idir samplaí próitéine agus cuimhne. Má mhéadaítear d’iontógáil próitéine, cabhraíonn sé seo d’inchinn agus do chorp a choinneáil sláintiúil, ag feabhsú scileanna smaointeoireachta agus cuimhne. I gcás daoine ar gá dóibh a gcuimhne a fheabhsú, tá sé an-riachtanach méid cuí próitéine a ithe. Ba cheart dúinn bianna próitéine a ithe go cuí agus aird a thabhairt ar bhéilí réasúnta chun comhlacht sláintiúil agus intinn ghéar a choinneáil. Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid cuimhne a fheabhsú, agus is féidir le Cistanche deserticola feabhas mór a chur ar chuimhne, toisc go bhfuil éifeachtaí frithocsaídeacha, frith-athlastacha agus frith-aosaithe ag Cistanche deserticola, rud a d'fhéadfadh cabhrú le ocsaídiú agus imoibrithe athlastacha san inchinn a laghdú, rud a chosnaíonn an sláinte an néarchóras. Ina theannta sin, is féidir le Cistanche deserticola fás agus deisiú na gcealla nerve a chur chun cinn freisin, rud a fheabhsóidh nascacht agus feidhm líonraí neural. Is féidir leis na héifeachtaí seo cabhrú le feabhas a chur ar chuimhne, ar fhoghlaim agus ar luas smaointeoireachta, agus féadfaidh siad cosc ​​a chur ar fhorbairt mhífheidhm chognaíoch agus galair neurodegenerative.

Cliceáil fios forlíontaí chun cuimhne a threisiú

Tar éis homogenization gairid, deascadh próitéiní ar feadh 12 h ag 20 céim , agus lártheifneoiriú ina dhiaidh sin ag 12, 000 rpm ar feadh 5 nóiméad ag4 céim . Baineadh an súiteán, agus nitear an millín próitéine faoi dhó le haicéatón fuar (ina raibh 0.07% ME agus mhanglaim coscairí próitéas). agus 2.0 M thiourea ag oighear sonicationon.

Rinneadh na samplaí próitéine intuaslagtha a lártheifneoiriú ag 15,000 rpm ar feadh 10 nóiméad ag 4 céim go dtí cáithníní intuaslagtha réamhshuite, agus tomhaiseadh tiúchan na samplaí próitéine deiridh ag baint úsáide as an Bradfordmethod.

Anailís próitéamaíocht tréchur ard bunaithe ar TMT

Laghdaíodh, alcailíodh agus díleádh samplaí trí phróitéisí trypsin agus lys-C a chur leis go seicheamhach. Rinneadh peptides a lipéadú ansin trí úsáid a bhaint as 10-clibeanna isobaracha plexTMT de réir threoracha an déantóra. Meascaíodh samplaí lipéadaithe agus ansin rinneadh iad a bhriseadh go mín ag baint úsáide as céimseicromatagrafaíocht droim ar ais ard pH.

Ansin rinne LC-MS/MS anailís ar chodáin aonair ag baint úsáide as céimseicromatagrafaíocht droim ar ais ar líne agus mais-speictriméadracht comhleá ar mhais-speictriméadar Comhleá Thermofsher Lumos. Fuarthas sonraí ag baint úsáide as an modh MS3 réamhtheachtaithe sioncronach bunaithe ar roghnúchán, mar a thuairiscítear roimhe seo (McAlister et al. 2014). Baineadh úsáid as ardán bogearraí MaxQuant (Cox and Mann 2008) le cuardach bunachar sonraí agus asbhaint faisnéise tuairisceora TMT.

Baineadh úsáid as MSStats (Choiet al. 2014) i gcomparáid le sonraí TMT ar fud na samplaí).Anailís thrasscriptomach Rinneadh thart ar 80–100 cloigeann a leithlisiú ó shuthanna ainéistéisithe (120 h), a ní le PBS, agus faoi réir eastóscadh RNA iomlán ag baint úsáide as Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis). , USA) imoibrí de réir threoracha an mhonaróra.

Rinneadh meastóireacht ar cháilíocht agus ar chainníocht RNA ag baint úsáide as speictreafótaiméadar NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA) agus tuilleadh ag Bithanailíseoir Agilent 2100 chun an tiúchan íosta de 50 ng/ul agus uimhir RNA sláine (RIN) de 8 a chinntiú. Rinneadh ullmhú na leabharlainne ansin ag baint úsáide as an Illumina HiSeqcording 4000according an prótacal: "Sreabhadh oibre Prep Leabharlann Iomlán RNA TruSeqStranded le Ribo-Zero Gold," agus cuireadh na samplaí in ord de réir na gcoinníollacha seo a leanas: "Rith Deiridh péireáilte, timthriallta R1=75 (snáithe antisense), Innéacs=8 timthriallta, R2=75 timthriallta (snáithe mothaithe)."

Anailís sonraí

Uaslódáladh an dá thacar sonraí do staidéir próitéamacha agus tras-traipeolaíochta ag an am céanna agus rinneadh anailís orthu ag baint úsáide as an uirlis ar líne Metascape, a cheadaíonn nótaí géine do speicis éagsúla, lena n-áirítear Danio rerio (Zhou et al. 2019). anailísithe trí úsáid a bhaint as bogearraí Anailíse Conairí Ingenuity (IPA) (Krämer et al. 2014).

Uaslódáladh tacair sonraí ina raibh aitheantóirí géine nó próitéine agus luachanna slonn comhfhreagracha isteach san fheidhmchlár. Mapáladh gach aitheantóir chuig a bhunachar eolais inIngenuity oibiachta comhfhreagrach.

Socraíodh scoite athrú slonn de 1.3-huaire chun móilíní a raibh rialú difreálach ar a slonn a aithint. D’aithin anailís fheidhmiúil na feidhmeanna bitheolaíocha agus/nó na galair ba shuntasaí don tacar sonraí. Breithníodh móilíní ón tacar sonraí a bhain leis an scoite agus a raibh baint acu le feidhmeanna bitheolaíocha don anailís. Baineadh úsáid as tástáil bheacht FishertailedFisher chun p-luach a ríomh lena gcinntear an dóchúlacht go n-eascródh gach feidhm bhitheolaíoch agus/nó galar a shanntar don tacar sonraí sin de réir seans amháin.

Anailís cosáin

Chun luacháil a dhéanamh ar an méid a chuir ceachtar de na hathruithe próifíle ortrascriptome proteome ar bhealaí ar leith, rinneadh an dá thacar sonraí a uaslódáil chuig bogearraí an IPA (Krämer et al. 2014). Ansin rinneadh tuilleadh measúnaithe agus léirmhínithe ar na cosáin chanónacha is suntasaí athraithe trí úsáid a bhaint as PCR agus blotting an iarthair mar a thuairiscítear thíos.

Blotting an Iarthair

Lódáladh 25 µg de phróitéiní ar NuPAGE 12% (Novex, CA) agus aistríodh iad chuig PVDFmembranes (Novex, CA) mar a thuairiscítear (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Cuireadh bac ar na scannáin le bainne bearrtha 5% i Tris-bufferedsaline agus 0.01% tween 20 (maolán TBST) le haghaidh teocht an tseomra 30 nóiméad agus ansin goradh iad thar oíche ag 4 céim le ceachtar coinín polyclonal anti-Cyp1A1(Abcam, CA) nó luch monaclónach frith-GAPDH( Abcam, CA), caolaithe i maolán TBST ina bhfuil 1% bainne bearrtha.

Tar éis níocháin i TBST, goraíodh na blotaí le hantasubstaintí tánaisteacha frith-choinín-HRP (Abcam, CA) nó gabhar frith-luiche-HRP (Santa Cruz, CA) ar feadh 2 h, agus ina dhiaidh sin forbraíodh le foshraith blotting an iarthair Pierce™ ECL Plus ( Thermo Fisher Scientific, USA). Rinneadh na bannaí a léirshamhlú trí íomháú ag baint úsáide as Scanóir LI-COR agus rinneadh anailís orthu trí dhlúsiméadracht (LI_COR Biosciences,NE).

PCR fíor-ama

Rinneadh RNA iomlán a leithlisiú ó na cinn ag baint úsáide as imoibrí TRIzol (Sigma Aldrich, Saint Louis, SAM) de réir threoracha an déantóra agus ansin tomhaiseadh é ag baint úsáide as speictreafótaiméadar NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, MA). Trascríobhadh méid 1 ug de shampla eachRNA droim ar ais ag baint úsáide as supermix trascríobh droim ar ais iScript™ (Bio-Rad, CA), agus rinneadh PCR fíor-ama ag baint úsáide as SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermix (Bio-Rad, CA), agus tá na primers liostaithe i dTábla Forlíontach 1.Ríomhadh leibhéil abairt choibhneasta ag baint úsáide as an modh 2-ΔΔCT, agus baineadh úsáid as an T-tástáil staidrimh chun na difríochtaí suntasacha a mheas.

Torthaí agus plé

Dhá mhóruirlis is ea anailísí próitéamacha agus tras-traipeolaíocha chun tuiscint a fháil ar na meicníochtaí móilíneacha is bun le próisis ghalair agus an fhreagairt ar spreagthaigh chomhshaoil ​​(Duan et al. 2017; García-Estrada et al.2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al.2017); . Anseo, rinneamar anailís dhomhainléirithe ag na leibhéil tras-traipeolaíocha agus próitéamacha araon i gcinn na suthanna séabraéisí a nochtar do DEPe.

Rinneadh na cinn, comhdhéanta d'fhíochán inchinne den chuid is mó, a leithlisiú chun deireadh a chur le próifílí slonn fíocháin eile toisc go bhfuil suim againn i slite paiteolaíocha intreacha an CNS a chinneadh.

Próifíl léiriú cinn na zebrafishembryos

Fuarthas 11,172 próitéin braite agus 14,748 sprioc mRNA as anailís próifíle as níos mó ná 26,{5}} géinte códaithe (Howe et al. 2013). I measc na 11,172 próitéin a aithníodh ó na samplaí lipéadaithe TMT (Tábla Forlíontach 2), rinneadh 141 próitéin a rialáil go suntasach, agus rinneadh íosrialáil ar 607 (Tábla Forlíontach 3 agus Fíor 1a). Mar an gcéanna, bhí 367 athscríbhinní upregulated, agus 149 downregulated i measc na 14,748 athscríbhinní (Tábla Forlíontach 4) braitheadh ​​​​san anailís RNA-seq (Fíor. 1b agus Tábla Forlíontach 5).
I bhformhór na gcásanna, bhí na torthaí ó na hanailísí próitéamacha agus tras-rialaithe uasrialaithe comhsheasmhach. Mar shampla, áirítear le próitéin ard-uasrialaithe cíteochrome P450 Cyp1a, Cyp1c1, gáma fo-aonad próitéine ceangailteach Guaninenucleotide, Annexin, Plexin B2b isoform gearr, ball Dehydrogenase/reductase (teaghlach SDR) 13-cosúil le 1, S-antigen ofretina/faireog pineal (gabháil) b, agus Sulfotransferase6B1.

Mar an gcéanna, i measc na ngéinte a bhfuil an rialáil tras-traipeolaíoch is airde acu tá cíteochrome P450 (Cyp1a), cemokine (C-C móitíf) ligand 27a, athbhrúiteoir aryl-hydrocarbonreceptor A, cytochrome P450 (Cyp1b), agus glycoprotein C teaghlach Rh. ní raibh an-chomhghaolú i gcónaí.

Mar shampla, tá Complexin 2, Spectrin alpha, slabhra solais myosin cairdiach-1, próitéin idirghníomhaithe SEC23, fo-aonaid membrane ATPsynthase EA, Cytochrome b, agus deacetylase próitéin atá ag brath ar NAD i measc na bpróitéiní an-íosrialaithe ar an mbarr, agus tá próitéin membrane deighleog an reitineauter 1a. , iompróir tuaslagáit 5 (iompróir iaidíde), FBJ murine osteosarcoma víreasach oncogene homolog B, complexin 4c, FOSlike antigen 1a, opsin 1, agus v-fos léiríonn an rialachán is airde de trascríobh (Táblaí 1 agus 2).

Tá teorainn le hantasubstaintí a aithníonn próitéiní séabra iasc, ach dheimhnigheamar sampla de na hathruithe seo ag baint úsáide as anailís blotála an iarthair. Deimhníodh an upregulation ofCyp1A próitéine agus downregulation de Complexin 2 (CPLX2) ag baint úsáide as GAPDH mar loadingcontrol (Fíor 2a). Deimhníodh leibhéil níos airde de thrascríobh TAT agus UGT1B1 agus leibhéil níos ísle CHNRB agus TH2 freisin ag qPCR ag baint úsáide as Elf-alpha mar rialú inmheánach (Fíor 2b).

Nóta géine

Tá go leor uirlisí bithfhaisnéise agus bogearraí ar líne ann ar féidir leo faisnéis úsáideach a thabhairt anótáil ongéine. Ina measc, úsáideadh Metascape, le cumas anótála géine le haghaidh Danio rerio (Zhouet al. 2019), sa saothar seo.

Uaslódáladh an dá thacar sonraí le haghaidh staidéar próitéamaíoch agus tras-scríofa ag an am céanna agus rinneadh anailís orthu ag baint úsáide as an uirlis ar líne seo. Tar éis aschur na n-athruithe próitéamacha agus tras-scríofa araon sna bogearraí a chomhcheangal, rinneadh roinnt próiseas cosúil le freagairt ar spreagadh seineafóiteach, meitibileacht xeanóibíteach ag cytochrome P450, agus rialú ciorclach ar léiriú géine. fuarthas ar chóireáil DEPe (Fíor 3a).

Mhol an anailís seo freisin leibhéil faoi chois de phróisis bhitheolaíocha, mar shampla "Amharc-aireachtáil," "Grianghrafaistriú," agus "inmheánú gabhdóirí próitéin-chúpláilte G." Ní raibh coinne leis na hathruithe i bpróifílí léirithe fís-bhainteacha ó tharla go raibh súile níos lú mar thoradh ar chóireáil DEPe le linn na luathfhorbartha (níor léirítear sonraí).

Comharthaíocht meitibileachta xenobiotic

Is féidir le xenobiotics, ar comhdhúile eachtracha nádúrtha nó sintéiseacha ceimiceacha iad, an freagra struis cheallacha a spreagadh, rud a fhágann go n-eascraíonn idirdhealú, iomadú, apoptosis nó neacróis. Go deimhin, ní mór don chorp é féin a chosaint go gníomhach ar xeanóibít, agus ar chomhdhúile inghineacha tocsaineacha agus a gcuid meitibilítí, trí einsímí agus iompróirí a bhfuil baint acu lena ndíothú agus lena ndíthocsainiú a chur in iúl.

Aicmítear na heinsímí seo i dtrí ghrúpa: einsímí PhaseI (CYP, ALDH, FMO) a thugann isteach polaraíocht isteach sna seineabhithí; Einsímí Chéim II (UGT, GST, SULT) a thugann hidreafaileacht isteach trí chomhchuingeach móilíní hidreafaileacha amhail sulfáit, aigéad glúcúrónach, agus glutathione chuig na seineabitheolaíocht; agus einsímí Chéim III (MDR1, OATP2, MRP) a iompraíonn na seineabóitigh nó na comhchuingeacha a chruthaítear le linn Céim II go dtí an limistéar extracellular.

Cothaítear na heinsímí seo trí eascainí comharthaíochta a bhaineann le gabhdóirí sonracha (CAR, PXR, AHR) agus trí ghníomhú trí bhíthin fachtóirí trascríobh MAPK (NRF2, MAF)(Omiecinski et al. 2011).

In éagmais gníomhachtaithe, tá an receptor constitutivelyactive (CAR) suite sa choimpléasc asa cíteaplasma le CCRP agus HSP90. Ach nuair a bhíonn gníomhaí i láthair, aistríonn CAR isteach sa núicléas agus ceanglaíonn sé le RXR chun heitraidiméir a fhoirmiú agus ceanglaíonn sé a thuilleadh le roinnt malairtí den mhóitíf athfhillteach, mar shampla DR3, DR4, ER6, agus ER8, agus cuireann sé le rialachán giniúna (Tábla Forlíontach 2).

Nocht ár n-anailís próitéamaíochta gníomhachtú meitibileacht xenobiotic. Go deimhin, léiríonn upregulation soiléir CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (heme oxygenase 1), CAT (catalase), agus CES1 (carboxylesterase 1) ionduchtú meitibileacht Chéim I, agus méadú ar léiriú UGT1A1 (UDP glucuronosyltransferase family 1 ball A1) agus GSTP1 ( Léiríonn glutathioneS-transferase pi 1) gníomhachtú meitibileacht PhaseII.

Is díol spéise é go dtugann íosrialáil aistrithe sulfáit cosúil le SULT1A1 (sulfotransferasefamily 1A ball 1), SULT1C2 (sulfotransferasefamily 1C ball 2), agus SULT2B1 (teaghlach sulfotransferase 2B ball 1) le fios gur fearr go dtarlaíonn méadú hidreafhile i meitibileacht Chéim II le glútan aigéadach agus glútanóis trí chéile. , ach ní conjugation sulfáit (Fig. 4).

Tá torthaí an staidéir tras-traipeolaíoch comhsheasmhach go leor, mar go bhfuil CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1, agus UGT1A1 go léir uasrialaithe ag leibhéil theRNA. Mar sin féin, léiríonn SULT2B1 upregulation ag an leibhéal RNA (cé go tearcionadaithe ag na leibhéil próitéine).

D'fhéadfadh sé seo a bheith mar gheall ar mheicníochtaí eile a chothaíonn díghrádú nó díghníomhú cóireála einsím le haistriú sulfáit le DEPe. Is é an rud is ábhar iontais go háirithe ná gur tharla na hathruithe seo i meitibileacht xenobiotic i gcinn (brains is dócha) an éisc. Tá cur síos déanta ar léiriú géinte xenobiotic i néarchóras na mamaigh, ach is é seo an 1ú tuarascáil díobh in brains zebrafish (McMillan and Tyndale 2018).

Tá na torthaí seo comhsheasmhach le staidéar comhchosúil a rinne Shankar agus comhoibrithe a rinne tástáil ar éifeachtaí grúpaí éagsúla de hidreacarbóin aramatacha iltimthriallach (PAHanna) ar fhorbairt suthanna agus a rinne measúnú breise ar thionchar gach réime cóireála ar an bpróifíl tras-scríofa.

Ar an gcorp iomlán de 48 suthanna hpost-toirchithe (hpf), léirigh siad an upregulation de Cyp1a ag an dá leibhéal trascríobh agus próitéin a bheith ina biomarker luath iontaofa gníomhachtú AHR xenobiotic agus athruithe trascríobh iartheachtacha (Shankar et al. 2019).

Rinne an NRF2-idirghabháil ar fhreagairt struis ocsaídiúcháin

Is féidir le strus ocsaídiúcháin apoptosis a spreagadh agus necróis agus creidtear go bhfuil baint aige le néar-mhíothlú (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015).

Ceanglaíonn fachtóir núicléach-erythroid 2-fachtóir gaolmhar 2(Nrf2) le heilimintí freagartha frithocsaídeacha tionscnóra (ARE) agus cuireann sé a n-trascríobh i ngníomh. Tá baint ag Nrf2 Neamhghníomhach le próitéin Keap1 atá ceangailteach le hactin agus coinnítear é sa chiteaplasma.

Spreagtar strus trí-ocsaídiúcháin, déantar Nrf2 a phosphorylated mar fhreagra ar na cosáin kinase próitéine C, fosfatidylinositol 3-kinase, agus MAP kinase. Is féidir leis an Nrf2 fosfarlaithe ansin traslonnú go dtí an núicléas agus a cheangal ar AREsto einsímí díthocsainiúcháin agus frithocsaídeacha a thrasghníomhú (Tábla Forlíontach 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com