Laghdaíonn Cistanche Deserticola Polysaccharide Osteoclastogenesis Agus Ath-ionsú Cnámh Trí Chomharthaíocht RANKL a Chosc agus Táirgeadh Speiceas Ocsaigin Imoibríoch

Déan teagmháil le:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Amhrán Dezhi et al

Is galar meitibileach é oistéapóróis arb iad is sainairíonna é osteopenia agus meath microstructural cnámh. Is iad oistéaclaistí na príomhchealla éifeachtóra a dhíghrádaíonn maitrís cnámh agus is cúis le forbairt oistéapóróis a n-fheidhm neamhghnácha. Cuireann carnadh speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) le linn meitibileacht cheallacha iomadú agus difreáil osteoclast chun cinn, dá bhrí sin, tá ról tábhachtach aige in oistéapóróis.Cistanchefásachpolaisiúicríd(CDP) tá gníomhaíocht antitumor, frith-athlastach agus frithocsaídeach aige. Mar sin féin, níl tionchar CDP ar osteoclasts soiléir. Sa staidéar seo, baineadh úsáid as staining fosfatase aigéad tartrate-resistant, inmunofluorescence, imoibriú slabhra tras-trascríobh droim ar ais-polaiméiráis, agus anailís blot an iarthair chun a léiriú go bhfuil CDP.(Cistanchefásachpolaisiúicríd)osteoclastogenesis bac agus resorption hydroxyapatite. Ina theannta sin, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)chuir sé bac freisin ar léiriú géinte marcála osteoclast lena n-áirítear Ctsk, Mmp9, agus Acp5, agus ní raibh aon éifeacht aige ar ghníomhaí gabhdóra de léiriú fachtóir núicléach κB (RANK). Léirigh anailísí meicniúla an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)Méadaíonn sé léiriú na n-einsímí frithocsaídeacha chun táirgeadh ROS trí mheán RANKL a mhaolú in osteoclasts agus cuireann sé bac ar fhachtóir núicléach cealla T gníomhachtaithe agus gníomhachtú kinase próitéine mitogen-activated. Tugann na torthaí seo le tuiscint go bhféadfadh CDP a bheith ina dhruga iarrthóra chun cóireáil a dhéanamh ar oistéapóróis de bharr gníomhaíocht iomarcach oistéaclaist.

EOCHAIRFHOCALathshlánú cnámh,Cistanchefásachpolaisiúicríd, MAPK, osteoclast, speiceas ocsaigin imoibríoch

bodybuilding cistanche

1|RÉAMHRÁ

Tá ról ríthábhachtach ag an gcothromaíocht idir foirmiú cnámh, arna idirghabháil ag osteoblasts, agus ionsú cnámh, arna idirghabháil ag osteoclasts, maidir le hoiméastáis meitibileach cnámh a chothabháil (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Nuair a sháraíonn resorption cnámh foirmiú cnámh, tarlaíonn oistéapóróis, arb iad is sainairíonna mais cnámh laghdaithe agus damáiste microstructural cnámh (Ikeda, 2008). Is galar coitianta é oistéapóróis i ndaoine scothaosta agus i mná iar-menopausal agus níl a phaitigineas soiléir go hiomlán (Cooper & Melton, 1992). Is é easnamh estrogen príomhchúis oistéapóróis (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Ina theannta sin, is féidir speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) a tharlódh trí ghníomhaí receptor fachtóir núicléach κB ligand (RANKL) agus tá baint acu le foirmiú osteoclast (Yip et al., 2005), agus mar sin féadfaidh siad cur le forbairt oistéapóróis (Manolagas, 2010). Fuair ​​​​roinnt staidéir amach go méadaíonn easnamh Nrf2-frithocsaídeach leibhéil ROS agus cuireann sé chun cinn idirdhealú osteoclast RANKL-spreagtha (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Dá bhrí sin, ba cheart laghdú a dhéanamh ar tháirgeadh ROS le linn difreála osteoclast a mheas mar straitéis theiripeach chun oistéapóróis a chóireáil.

Díorthaítear oistéaclaistí ón lineage hematopoietic monocyte nó macrophage agus is iad na cealla ilnúiclithe amháin a fheidhmíonn ath-ionsú cnámh (Teitelbaum, 2000). Mar sin, tá tábhacht mhór ag baint le taighde a bhaineann le foirmiú osteoclast chun cóireálacha éifeachtacha a fhorbairt do ghalair meitibileachta cnámh (Lorenzo, 2017). Is cítocíní tábhachtacha iad fachtóir a spreagann coilíneacht Macrophage (M-CSF) agus RANKL, arna dtáirgeadh ag osteoblasts agus cealla T gníomhachtaithe, a rialaíonn osteoclastogenesis (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). Spreagann RANKL léiriú fachtóir núicléach cealla T gníomhachtaithe (NFATc1), atá ina fhachtóir ríthábhachtach trascríobh gníomhach le linn foirmiú osteoclast (Ishida et al., 2002). Cuireann NFATc1 gníomhachtaithe chun cinn léiriú géinte marcála osteoclast mar phosphatase aigéad tartrate-resistant (TRAcP) agus cathepsin K (CTSK) a rialaíonn osteoclastogenesis agus feidhm osteoclast (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchefásachpolaisiúicríd(CDP) scoite amach ó na gais méithe deCistancheagus tá rialáil imdhíonachta, antitumor, antiaging, agus éifeachtaí cógaseolaíochta eile aige (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)Bhí éifeacht coisctheach aige ar tháirgeadh ocsaíd nítreach (NO) spreagtha lipopolysaccharide i gcealla micrillialacha luiche (cealla BV-2; Nan et al., 2013). Ina theannta sin, tá sliocht saibhir feinileatánóideach (ECD) deCistanchefeabhsaíodh cumas snámha na lucha trí laghdú a dhéanamh ar dhamáiste matáin, moill a chur ar charnadh aigéid lachtaigh, agus feabhas a chur ar stóráil fuinnimh (Cai et al., 2010). Mar sin féin, ní fios fós éifeachtaí CDP ar fheidhm agus ar ghníomhaíocht osteoclast.

Sa staidéar seo, léirigh muid go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cuireann sé bac ar dhifreáil osteoclast arna spreagadh ag RANKL agus ar ionsú cnámh. Ba é an bun-mheicníocht ná an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)feabhsaíonn sé léiriú na n-einsímí frithocsaídeacha chun táirgeadh ROS a mhaolú, agus ansin cuireann sé cascáidí comharthaíochta NFAT atá gníomhachtaithe RANKL agus próitéin kinase gníomhachtaithe mitogen (MAPK) faoi chois. Tugann na torthaí seo le fios go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)d'fhéadfaí é a úsáid chun cóireáil a dhéanamh ar oistéapóróis de bharr an iomarca ionsúite cnámh oistéaclaíoch.

maca ginseng cistanche

2|ABHAIR AGUS MODHANNA

2.1|Ábhair

CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)(íonacht > 98 faoin gcéad ) a ceannaíodh ó Solarbio (Beijing, an tSín) agus ullmhaíodh é ag tiúchan stoic 1 mM i saline maolánach fosfáit (PBS). Tá antasubstaintí sainiúil do c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosfarylated (p) -ERK, p-p38, p-JNK, agus -actin a fuarthas ó Santa Biteicneolaíocht Cruz (San Jose, CA). Táirgeadh antasubstaintí do V-ATPase d2 mar a thuairiscítear roimhe seo (H. Feng et al., 2009). Fuarthas an córas measúnaithe 3-(4,5-dimethylthiazol-2-il)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) agus luciferase ó Promega (Sydney, An Astráil) . Ceannaíodh M-CSF athchuingreach ó R&D Systems (Minneapolis, MN). Cuireadh próitéin GST-rRANKL athchuingreach in iúl agus íonaithe mar a thuairiscítear roimhe seo (Xu et al., 2000).

2.2|Cultúr cille

Fuarthas cealla RAW264.7 (cealla macrophage luch) ó Bhailiúchán Cultúir Cineál Meiriceánach (ATCC, Manassas, VA) agus saothraíodh iad i meán riachtanach íosta modhnaithe (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, An Astráil) arna fhorlíonadh le serum bó féatais 10 faoin gcéad, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de peinicillin, agus 100 ug/ml de streptomycin (meán iomlán). Rinneadh monaicítí díorthaithe smeara (BMManna) a leithlisiú ó lucha C57BL/6J 6 seachtaine d’aois, a eotanaíodh de réir nósanna imeachta arna gceadú ag Coiste Eitice Ainmhithe Ollscoil Iarthar na hAstráile (RA/3/100/1244). Scaradh cnámha fada saor ó fhíocháin bhoga agus sruthaíodh an smior ón femur agus an tibia, a saothraíodh ansin i meán iomlán i láthair M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Measúnacht osteoclastogenesis

Plátáladh BMManna isteach i bplátaí saothraithe 96-tobar ag dlús 6 × 103 cealla in aghaidh an tobair agus déileáladh leo le meán iomlán ina raibh M-CSF (50 ng / ml) agus GST-rRANKL (100 ng / ml), i láthair nó easpa tiúchana éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>aithníodh trí núicléas) mar oistéaclaistí.

2.4|Measúnachtaí citotocsaineachta

Síolaíodh BMManna isteach i bplátaí 96 tobar ag 6 × 103 cill in aghaidh an tobair agus fágadh iad thar oíche chun cloí leo. An lá dár gcionn, gor na cealla le tiúchain éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd). Tar éis 48 uair eile, cuireadh an tuaslagán MTS (20 µl/tobar) leis agus gor é le cealla ar feadh 2 uair. Socraíodh an t-ionsúiteacht ag 490 nm le léitheoir microplate (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Staining imdhíonfluaraiseacha

Síolaíodh BMManna ag dlús 6 × 103 cealla in aghaidh an tobair i láthair M-CSF (50 ng/ml) thar oíche. Spreagadh cealla ansin le M-CSF agus GST-rRANKL (100 ng/ml) go dtí gur foirmíodh osteoclasts aibí. Cóireáladh na hoistéaclasta ansin le tiúchain éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar feadh 48 uair roimh shocrú le 4 faoin gcéad paraformaildéad, tréscaoilteach le 0.1 faoin gcéad Triton X-100-PBS, agus blocáil le 3 faoin gcéad albaimin serum bó i PBS. Goradh cealla ullmhaithe le phalloidin comhchuingeach rhodamine ar feadh 45 nóiméad sa dorchadas chun stain le haghaidh F-actin. Ansin nite cealla le PBS, núicléas frithdhaite le 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), agus gléasta le clúdaigh clúdaigh do mhicreascópacht chomhfhócasach.

taithí cistanche

2.6|Measúnacht ar ionsú hiodrocsapatite

Chun gníomhaíocht osteoclast a thomhas spreagadh BMManna (1 × 105 cealla in aghaidh an tobair) saothraithe ar phlátaí brataithe collagen sé-tobar (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) le GST-rRANKL (100 ng / ml) agus M-CSF (50 ng / ml) go dtí go gineadh osteoclasts aibí (Zhou et al., 2016). Ansin scoiteadh cealla go réidh ón bpláta ag baint úsáide as tuaslagán díthiomsaithe cille (Sigma-Aldrich) agus cuireadh líon comhionann oistéaclaistí aibí ar thoibreacha aonair i bplátaí 96-tobar brataithe le hidroxyapatite (Corning Osteoassay, Corning, NY). Goradh osteoclasts aibí i meán ina raibh GST-rRANKL agus M-CSF le nó gan CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ag na tiúchain léirithe. Tar éis 48 uair an chloig, bhí leath de na toibreacha dhaite go himdhíon-histochemically le haghaidh gníomhaíochta TRAcP, mar a thuairiscítear thuas, chun líon na gceall ilnúicléithe in aghaidh an tobair a mheas. Rinneadh na toibreacha a bhí fágtha a thuar ar feadh 10 nóiméad chun cealla a bhaint agus chun na limistéir athshorbtha a thomhas. Tógadh grianghraif de limistéir athsorbtha faoi mhicreascópacht chaighdeánach éadrom agus úsáideadh na bogearraí Image J (Institiúidí Náisiúnta Sláinte, Bethesda, MD) chun céatadán an achair dromchla hiodrocsapatite a d'athshocraíonn na hoistéaclasta a chainníochtú.

2.7|Measúnachtaí tuairisceora Luciferase

Chun gníomhachtú trascríobh NFATc1 a imscrúdú, aistríodh cealla RAW264.7 go cobhsaí le tógáil tuairisceora luciferase freagrúil NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Saothraíodh cealla tras-aistrithe i bplátaí 48 tobar ag dlús 1.5 × 105 cill in aghaidh an tobair agus rinneadh réamhchóireáil orthu le tiúchain éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar feadh 1 uair. Tar éis réamhchóireáil, spreagadh cealla le GST-rRANKL (100 ng / ml) ar feadh 24 h, agus rinneadh gníomhaíocht luciferase a thomhas ag baint úsáide as an gcóras measúnaithe tuairisceora luciferase de réir phrótacal an mhonaróra (Promega).

2.8|Anailís chainníochtúil frithghníomhú slabhra tras-trascríobh-polaiméaráise (RT-PCR).

Rinneadh RNA iomlán a leithlisiú ó chealla ag baint úsáide as imoibrí Trizol de réir phrótacal an mhonaróra (Thermo Fisher Scientific). Rinneadh DNA comhlántach a shintéisiú ag baint úsáide as transcriptase droim ar ais víreas leoicéime Moloney murine le 1 ug de theimpléad RNA agus primers oligo-dT. Rinneadh aimpliú imoibrithe slabhra polaiméire ar sheichimh shonracha ag baint úsáide as an gclár seo a leanas: 94 céim ar feadh 5 nóiméad, agus 30 timthriall de 94 céim ar feadh 40 s, 60 céim ar feadh 40 s, agus 72 céim ar feadh 40 s, agus céim síneadh deiridh de 5 nóiméad ag 72 céim . Taispeántar an fhaisnéis mhionsonraithe maidir le primers sonracha i dTábla 1. Ríomhadh leibhéil RNA teachtaire coibhneasta trí normalú go dtí léiriú na géine coimeádta Hmbs.

2.9|Anailís blot an Iarthair

Saothraíodh BMManna i meán iomlán le M-CSF i bplátaí sé tobar agus spreagtar iad le GST-rRANKL (100 ng/ml) do na hamanna sonraithe. Rinneadh cealla a liostáil i maolán lysis radai-imdhíonachta agus réitíodh próitéiní trí leictreafóiréis glóthach dodeicile sulfáit-polyacrylamide sóidiam agus aistríodh iad chuig seicní polai(fluairíd vinilideéine) (GE Healthcare, Silverwater, An Astráil). Cuireadh bac ar na seicní i mbainne bearrtha 5 faoin gcéad ar feadh 1 uair agus ansin scrúdaíodh iad le hantasubstaintí príomhúla sonracha éagsúla le croitheadh ​​mín thar oíche ag 4 chéim. Níodh na scannáin agus ina dhiaidh sin goraíodh iad le antasubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha sár-ráidis each-ráite. Braitheadh ​​ansin imoibríocht antashubstainte le himoibrí cemiluminescence feabhsaithe (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) agus léirshamhlú le Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2. 10|Brath ROS incheallach

Braitheadh ​​leibhéil ROS incheallach ag baint úsáide as trealamh measúnaithe braite ROS ceallach diacetate 2′,7′-déchlorofluorescein (Abcam, Melbourne, an Astráil). Saothraíodh BMManna (5 × 103 cealla in aghaidh an tobair) i bplátaí tobair 96 agus déileáladh leo le RANKL (100 ng / ml), M-CSF (50 ng / ml), agus CDP ar feadh 72 uair. Rinneadh leibhéil ROS intracellular a thomhas ag baint úsáide as diacetate 2′,7′-dichlorofluorescein, a ocsaídíonn isteach i DCF fluaraiseacha i láthair ROS. Níodh cealla i maolán Hank agus goradh sa dorchadas ar feadh 30 nóiméad le 10 µM de DCFH‐DA. Fuarthas íomhánna trí úsáid a bhaint as micreascópacht chomhfhócasach.

2. 11|Anailísí staidrimh

Tá na sonraí go léir ionadaíoch ar thrí thurgnamh a dhéantar ar a laghad trí chéile mura gcuirtear a mhalairt in iúl. Cuirtear sonraí in iúl mar mheán ± SD. Baineadh úsáid as anailís aontreo ar an éagsúlacht agus tástálacha post hoc Mac Léinn–Newman–Keuls ina dhiaidh sin chun tábhacht na ndifríochtaí idir torthaí a chinneadh, agus measadh go raibh p < 0.05="">

3|TORTHAÍ

3.1|Cuireann CDP bac ar osteoclastogenesis de bharr RANKL agus comhleá osteoclast

Chun a chinneadh an bhfuil CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)in ann foirmiú osteoclast RANKL-spreagtha a chosc, rinneamar measúnacht osteoclastogenesis den chéad uair ag baint úsáide as BMManna luch (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). Cóireáladh BMManna le RANKL agus M-CSF ar feadh 5 lá le tiúchan méadaithe CDP. Laghdaigh CDP líon na gceall ilnúicléithe TRAcP- deimhneach nuair a bhí an tiúchan de CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)bainte amach 5 µM nó níos airde (Fíor 1a,b). CDP a mheas(Cistanchefásachpolaisiúicríd)tocsaineacht agus a dhearbhú nach raibh na torthaí seo ina léiriú ar bhás nó ar líon na gceall, rinneamar measúnacht MTS. Cuireadh cóireáil ar BMManna le RANKL agus M-CSF ar feadh 48 uair le dáileoga éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd). Ní raibh aon éifeacht ag CDP ar iomadú BMM ag an tiúchan de 15 µM nó níos lú (Fíor 1c).

Chun éifeachtaí CDP a thástáil(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar chomhleá osteoclast, tionscnaíodh osteoclasts le cóireáil RANKL agus M-CSF, le nó gan dáileoga éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd). Rinneadh oistéaclastanna a dhathú le rhodamine-phalloidin agus DAPI chun líon na núicléis in aghaidh an oistéaclast a mheas (Fíor 2a). Tháinig laghdú ar líon na n-osteoclast agus ar mheánlíon na núicléas in aghaidh an oistéaclast i ndiaidh CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cóireáil (5–10 µM; Fíor 2b,c). Dá bhrí sin, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)Bhí éifeachtaí coisctheacha aige ar osteoclastogenesis de bharr RANKL agus ar chomhleá osteoclast ar bhealach dáileog-spleách.

3.2|CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)maolaíonn sé gníomhaíocht aisghabhála hiodrocsaapaitít osteoclastach arna spreagadh ag RANKL

Rinneadh measúnacht ar ionsú hiodrocsapatite chun éifeacht CDP a bhrath(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar fheidhm osteoclast (Fíor 3a). Tar éis gor 24 uair an chloig, níor tháinig aon athrú ar líon na n-oistéaclasta in aghaidh an tobair agus tháinig laghdú suntasach ar an limistéar aisghabhála hiodrocsapatite trí chóireáil le CDP 5 agus 10 µM i gcomparáid le grúpaí rialaithe (Fíor 3b,c). Léiríonn na torthaí sin an CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)tá éifeachtaí coisctheacha láidre aige ar fhoirmiú osteoclast agus ar ghníomhaíocht aisghabhála osteoclast gan aon éifeachtaí citotocsaineacha.

3.3|CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)inhibits osteoclast marcóir léiriú géine

Imscrúdú breise a dhéanamh ar éifeachtaí coisctheacha CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar osteoclastogenesis agus resorption cnámh osteoclastic, déileáladh le BMMs le RANKL agus M-CSF ar feadh 5 lá le tiúchain éagsúla CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd). Rinneadh RT-PCR ansin chun léiriú géinte marcála osteoclast a bhrath. Chuir CDP bac ar léiriú Nfatc1, fachtóir trascríobh ríthábhachtach le linn osteoclastogenesis(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar mhodh dáileog-spleách (Fíor 4a). Ina theannta sin, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)(5 agus 10 µM) íosrialáil slonn na ngéinte a bhaineann le hathionsú cnámh, lena n-áirítear Mmp9, Ctsk, agus Acp5 (Fíor 4b–d).

3.4|Sochtann CDP gníomhaíocht NFATc1 agus léiriú próitéine iartheachtacha

Scrúdú a dhéanamh ar éifeacht an CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)maidir le gníomhaíocht NFATc1 de bharr RANKL, rinneadh measúnacht tuairisceora luciferase. Cóireáil le CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd), ag tiúchan 5 µM agus níos airde, bac suntasach ar ghníomhaíocht NFATc1 de bharr RANKL (Fíor 5a). Ina theannta sin, léirigh anailís blot an iarthair go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)faoi ​​chois go suntasach léiriú próitéine de NFATc1 agus c-Fos i BMManna atá cóireáilte le RANKL agus M-CSF ar feadh 3 agus 5 lá (Fíor 5b). Thairis sin, rinneadh íosrialáil ar léiriú próitéiní a bhaineann le feidhm osteoclast, mar V-ATPase-d2 agus CTSK, i láthair CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)i gcomparáid le grúpaí rialaithe. Mar sin féin, ní raibh aon éifeacht ag CDP ar léiriú RANK (Fíor 5b).

3.5|Cuireann CDP léiriú einsímí frithocsaídeacha chun cinn chun táirgeadh ROS a scamhadh le linn osteoclastogenesis de bharr RANKL

Chun iniúchadh a dhéanamh ar an meicníocht bhunúsach de chosc osteoclastogenesis CDP-spleách, déileáladh le BMMs le RANKL (100 ng / ml) agus M-CSF (50 ng / ml) mar aon le PBS nó CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ar feadh 72 uair an chloig. Rinneamar scrúdú ar éifeacht CDP ar tháirgeadh ROS intracellular arna spreagadh ag RANKL. Méadaíodh leibhéil ROS incheallacha trí chóireáil RANKL, a mhaolaigh CDP (5 agus 10 µM; Fíor 6a). Laghdaíodh líon na gceall ROS-dearfach agus déine staining ROS le cóireáil CDP ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 6b, c). Léirigh anailís blot an Iarthair go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)chuir sé slonn thioredoxin (TRX1) agus glutathione reductase (GSR) chun cinn agus ag an am céanna an slonn de ocsaíd nítreach synthase (NOS2) inducible i BMManna a ndearnadh cóireáil orthu le RANKL agus M-CSF ar feadh 3 lá (Fíor 6d).

Chun CDP a fhiosrú tuilleadh(Cistanchefásachpolaisiúicríd)faoi ​​chois difreáil osteoclast trí tháirgeadh ROS a laghdú, ansin chóireáil againn BMMs le sárocsaíd (10 µM) chun aithris a dhéanamh ar an stádas ROS ard i gcealla. Spreag RANKL agus M-CSF BMManna ar feadh 3 lá agus léirigh torthaí anailís blot an iarthair agus RT-PCR gur chuir sárocsaíd chun cinn léiriú NFATc1 agus c-Fos i gcomparáid leis na grúpaí rialaithe. Ag teacht leis na torthaí i bhFíor 5, cuireadh an abairt NFATc1 agus c-Fos faoi chois ag CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)agus sháraigh sárocsaíd éifeacht coisctheach CDP (Fíor 6e,f). Thug na sonraí seo le fios go ndearna CDP athbhrú ar léiriú NFATc1 agus c-Fos trí tháirgeadh ROS a scamhadh.

3.6|CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)represses cosáin MAPK le linn osteoclastogenesis RANKL-spreagtha

Ansin, rinneamar imscrúdú ar éifeacht CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cóireáil ar léiriú TRAF6 trí mheán RANKL agus gníomhachtú conair MAPK. Tar éis goir i meán saor ó shéiream ar feadh 2 hr, spreagadh BMManna le RANKL, le nó gan CDP, ar feadh 60 nóiméad. Ní raibh aon éifeacht ag spreagadh le CDP (10 µM) ar léiriú TRAF6 agus fosfarlú caolaithe JNK2 agus ERK1/2 ag 10 agus 20 min (Fíor 7). Ina theannta sin, chuir CDP bac suntasach ar fhosfarylation p38(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cóireáil 60 min i gcomparáid le grúpaí rialaithe (Fíor 7). Léiríonn na sonraí seo an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)shochtann sé cosáin chomharthaíochta MAPK spreagtha ag RANKL, ag teacht lena éifeacht coisctheach ar fhoirmiú agus ar ghníomhaíocht osteoclast.

4|PLÉ

Tá go leor aird tarraingthe ag Cistanche, ar a dtugtar "ginseng Desert," le déanaí as a chumas díolúine a mhodhnú agus gníomhú go cosantach le linn aosaithe agus strus ocsaídiúcháin (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Tá sé léirithe go gcuireann gliocóisídí arna n-ionadú feinilpropanoid, na príomh-chomhpháirteanna gníomhacha de Cistanche, bac ar ghníomhaíocht NÍL i macrófagáin (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Ina theannta sin, aCistanchelaghdaigh sliocht strus ocsaídiúcháin i miócairdiam athfhruiliú tar éis ischemia agus bhí ról suntasach aige i gcosc ar bhealaí apoptotic as a dtiocfaidh cardioprotection (Yu, Li, & Cao, 2016). Mar chomhpháirt thábhachtach de Cistanche, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)tá éagsúlacht feidhmeanna cógaseolaíochta aige. Fuair ​​​​ár staidéar reatha amach go ndearna CDP athbhrú ar dhifreáil agus gníomhachtú osteoclast RANKL-gníomhachtaithe trí tháirgeadh ROS a mhaolú chomh maith le gníomhachtú NFAT agus MAPK.

Mar phosphatase aigéad, tá TRAcP ann i gcealla éagsúla agus tá sé flúirseach in osteoclasts agus macrophages alveolar (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). Is einsím tréithiúil é TRAcP d’osteoclastanna agus tá dlúthbhaint ag a léiriú le feidhm osteoclast, a mheastar mar tháscaire ar ghníomhaíocht osteoclast agus ar ionsú cnámh (Minkin, 1982). In ár staidéar, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)chuir sé bac ar líon na gcealla TRAcP-dearfach, rud a thugann le fios gur chuir CDP bac ar osteoclastogenesis de bharr RANKL(Cistanchefásachpolaisiúicríd). Braitheann díghrádú maitrís cnámh ag osteoclasts ar chatepsin K (CTSK) agus MMPanna (Gruber, 2015). Anseo, rinne CDP íosrialú suntasach ar léiriú géinte feidhmiúla osteoclast mar Mmp9, Ctsk, agus Acp5.

Déantar difreáil agus feidhm oistéaclasta a rialú ag ilbhealaí comharthaíochta (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Tar éis ceangal le RANK, earcaíonn RANKL próitéin oiriúntóra TRAF6 chun léiriú NFATc1 a ghníomhachtú, rud atá ina fhachtóir trascríobh tábhachtach d’fhoirmiú osteoclast, a dhéanann difear do léiriú géine osteoclast-shonrach, lena n-áirítear TRAcP agus CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Sa staidéar seo, fuair muid amach go CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)ní raibh aon éifeacht aige ar léiriú RANK agus TRAF6 in osteoclasts. Mar sin féin, CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)bac ar ghníomhachtú NFATc1 de bharr RANKL le linn osteoclastogenesis BMManna. Thairis sin, léiríodh gur chuir ROS, arna dtáirgeadh ag mitochondria i bpróiseas seachadta leictreoin, iomadú agus difreáil osteoclasts agus díghrádú maitrís cnámh rialaithe chun cinn (Ha et al., 2004). Fuair ​​​​staidéar le déanaí gur spreag RANKL allmhairiú núicléach Bach1 agus mhaolaigh táirgeadh einsím frithocsaídeach Nrf2-mediated, rud a chuir le léiriú ROS intracellular agus osteoclastogenesis i lucha (Kanzaki et al., 2017). Ina theannta sin, tháinig méadú ar ghiniúint ROS intracellular trí fhoirmiú agus gníomhaíocht osteoclast feabhsaithe homocysteine ​​(Koh et al., 2006). Fuair ​​​​ár staidéar amach gur laghdaigh CDP carnadh ROS in osteoclasts trí léiriú NOS2 a chosc agus léiriú einsímí frithocsaídeacha a chur chun cinn, mar shampla TRX1 agus glutathione reductase. Nuair a dhéileálamar le BMManna le sárocsaíd chun carnadh ROS intracellular a fheabhsú léirigh na torthaí go bhféadfadh méadú ar ROS léiriú NFATc1 a fheabhsú go raibh ROS in aghaidh an tsrutha ó NFATc1. Fuaireamar amach freisin gur sháraigh sárocsaíd éifeacht coisctheach CDP ar léiriú NFATc1. Mar sin, tugann ár sonraí le fios go gcuireann CDP bac ar charnadh ROS chun léiriú NFATc1 a chosc, agus ansin chun foirmiú agus feidhmiú osteoclast a chosc.

Baineann ERK, JNK, agus p38 leis an teaghlach MAPK, a bhfuil baint aige freisin le rialáil na difreála osteoclast (Seger & Krebs, 1995). Gníomhaíonn RANKL an cosán MAPK trí phosphorylation ERK, JNK, agus p38 a mhéadú (Mizukami et al., 2002). Léirigh muid an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)athbhrú ar fosfarylation RANKL-idirghabhála na bpríomhphróitéiní sa chonair MAPK, rud a chuireann le héifeacht coisctheach CDP ar léiriú géinte marcála osteoclast. Go bhfios dúinn, is é seo an chéad staidéar a léiríonn éifeachtaí coisctheacha CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)maidir le táirgeadh ROS, NFAT, agus gníomhachtú MAPK, a léiríonn meicníochtaí nua gníomhaíochta CDP in vitro.

Go hachomair, léirigh muid an CDP sin(Cistanchefásachpolaisiúicríd)maolaíonn sé osteoclastogenesis agus ionsú hiodrocsapatite, agus léiriú géinte marcála osteoclast lena n-áirítear Ctsk, Mmp9, agus Acp5. CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)bhí sé in ann táirgeadh ROS trí mheán RANKL a chosc, chomh maith le gníomhachtú NFAT agus MAPK (Fíor 8). Le chéile, tugann ár dtorthaí le fios go bhfuil CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)féadfaidh sé ionadaíocht a dhéanamh ar dhruga iarrthóra chun cóireáil a dhéanamh ar riochtaí a bhaineann le osteoclast in éineacht le ró-tháirgeadh ROS.

FIGIÚR 8 Léaráid scéimreach den CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)feidhm i difreáil osteoclast. CDP(Cistanchefásachpolaisiúicríd)cuireann sé cosc ​​ar tháirgeadh ROS arna spreagadh ag RANKL, chomh maith le gníomhachtú NFATc1 agus MAPK, rud a chuireann cosc ​​ar osteoclastogenesis. CDP,Cistanchefásachpolaisiúicríd; MAPK, próitéin kinase gníomhachtaithe mitogen; NFATc1, fachtóir núicléach de chill T gníomhachtaithe; RANKL, gníomhaí receptor fachtóir núicléach κB ligand; ROS, speiceas ocsaigin imoibríoch [Is féidir an figiúr datha a fheiceáil ag wileyonlinelibrary.com]

BUÍOCHAS

Thacaigh Fondúireacht Eolaíochta Dúlra na Síne (81572164), an Clár Náisiúnta Taighde agus Forbartha Príomhtheicneolaíochta na Síne (2017YFC1103300), Fondúireacht Eolaíochta Nádúrtha Cúige Guangxi (2016GXNSFAA380295), agus Tionscadal Taighde Eolaíochta agus Teicneolaíochta Ollscoil Guangxi leis an staidéar seo. Cúige (KY2015YB054). Faigheann sé tacaíocht i bpáirt freisin ag Tionscadal Plean Forbartha Taighde agus Teicneolaíochta Guangxi (GKG13349003, 1598013-15), Ciste Bonneagair Taighde Leighis & Sláinte Iarthar na hAstráile, Fondúireacht Airtrítis na hAstráile, Dámhachtainí Comhoibrithe Taighde Ollscoil Iarthar na hAstráile (UWA), agus Comhairle Taighde Sláinte agus Leighis na hAstráile (NHMRC, Uimh. 1107828 agus 1027932).

COIMHLINTÍ LEASA

Dearbhaíonn na húdair nach bhfuil aon choinbhleachtaí leasa ann

Ó:'Cistanchefásachpolaisiúicrídmaolaíonn sé osteoclastogenesis agus ionsú cnámh trí chomharthaíocht RANKL agus táirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch a chosc le Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018; 233: 9674-9684