Rialaíonn Aigéad Ascorbach an Díolúine, an Fhrith-ocsaídiúcháin agus an Apoptóis i gCromán Haliotis Discus Hannai Ino Cuid 1

Teibí: Rinneadh an staidéar reatha chun imscrúdú a dhéanamh ar rólanna aigéid ascorbic (AA) i bhfreagairt imdhíonachta, frith-ocsaídiúcháin, agus apoptosis i mbeagán focal (Haliotis discus hannai Ino). Cothaíodh seacht n-aiste bia leath-íonaithe le leibhéil grádaithe AA (0, 5{0, 100, 200, 500, 1000, agus 5000 mg/kg) go dtí an leathcheann (tosaigh meáchan: 12.01 ± 0.001 g, fad bhlaosc tosaigh: 48.44 ± 0.069 mm) ar feadh 100 lá. Ní raibh aon tionchar ag AA aiste bia ar mharthanas, ar ráta meáchain a fháil, agus ar mhéadú laethúil ar fhad bhlaosc. Méadaíodh go suntasach an t-ábhar AA i geolbhaigh, matán, agus faireoga díleácha na gcnámharlach le AA aiste bia. I dtéarmaí díolúine, d'fheabhsaigh aiste bia AA go mór an comhaireamh iomlán hemocyte, pléasctha riospráide, agus gníomhaíocht phagocytic i haemolymph, agus gníomhaíocht lísímí i haemolymph saor ó chealla (CFH). Sa fhaireog díleáite, cuireadh na conairí comharthaíochta neamhspleácha TLR-MyD agus TLR-MyD faoi chois trí fhorlíonadh aiste bia AA. Tháinig méadú suntasach ar na leibhéil mRNA de -defensin agus arginase-I sa fhaireog díleácha ag AA aiste bia. Sa ghológ, ní raibh ach cosán comharthaíochta cleithiúnach TLR-MyD{88-dúlagair ag AA chothaithe chun athlasadh sa chuasán a laghdú. Rinneadh leibhéal na miotas déanta 6 sa gholbh a uasrialáil go suntasach le AA chothaithe. Tar éis ionfhabhtú Vibrio parahaemolyticus, cuireadh an chonair chomharthaíochta TLR sa fhaireog díleá faoi chois ag AA chothaithe, rud a laghdaigh athlasadh sa chnámharlach. I dtéarmaí frith-ocsaídiúcháin, rinneadh superoxide dismutase, glutathione peroxidase, agus gníomhaíochtaí catalase, chomh maith le cumas iomlán frith-ocsaídiúcháin agus ábhar laghdaithe glutathione i CFH, a rialáil go suntasach. Rinneadh an cion malondialdehyde a íosrialáil go suntasach ag AA chothaithe. Feabhsaíodh an cumas frith-ocsaídiúcháin trí chonair Keap1-Nrf2 a spreagadh i gcéin. I dtéarmaí apoptosis, d'fhéadfadh AA aiste bia an cumas frith-apoptosis a fheabhsú tríd an easghluaiseachta comharthaíochta JNK-Bcl-2/Bax i gcéin. Mar fhocal scoir, bhí baint ag AA aiste bia le díolúine, frith-ocsaídiú, agus apoptosis a rialáil i mbeagán focal.

Is féidir le glycoside cistanche méadú freisin ar ghníomhaíocht SOD i bhfíocháin chroí agus ae, agus laghdaítear go mór an t-ábhar lipofuscin agus MDA i ngach fíocháin, ag scavening go héifeachtach fréamhacha ocsaigine imoibríocha éagsúla (OH-, H₂O₂, etc.) agus a chosaint i gcoinne damáiste DNA a dhéantar. ag OH-radacach. Tá cumas láidir scavenging fréamhacha saor in aisce ag gliocóisídí cistanche feinileatánóideach, cumas laghdaithe níos airde ná vitimín C, feabhas a chur ar ghníomhaíocht SOD i bhfionraí sperm, laghdaigh ábhar MDA, agus tá éifeacht chosanta áirithe acu ar fheidhm membrane sperm. Is féidir le polaisiúicrídí cistanche feabhas a chur ar ghníomhaíocht SOD agus GSH-Px in erythrocytes agus fíocháin scamhóg lucha senescent turgnamhacha de bharr D-galactós, chomh maith le hábhar MDA agus collagen sa scamhóg agus plasma a laghdú, agus ábhar elastin a mhéadú. éifeacht scavenging maith ar DPPH, fadú am hypoxia i lucha senescent, feabhas a chur ar ghníomhaíocht SOD i serum, agus moill a chur ar dhíghiniúint fiseolaíoch na scamhóg i lucha senescent turgnamhach Le díghiniúint moirfeolaíoch cheallacha, tá sé léirithe ag turgnaimh go bhfuil an cumas frithocsaídeach maith ag Cistanche. agus tá an cumas aige a bheith ina dhruga chun galair aosaithe craicinn a chosc agus a chóireáil. Ag an am céanna, tá cumas suntasach ag echinacoside i Cistanche fréamhacha saor in aisce DPPH a scavening agus tá an cumas aige speicis ocsaigine imoibríocha a scaveneáil agus cosc ​​a chur ar dhíghrádú collagen saor ó radacach saor in aisce, agus tá éifeacht mhaith deisiúcháin aige freisin ar damáiste anion radacach saor ó thymine.

Cliceáil ar Cistanche Tubulosa

【Le haghaidh tuilleadh eolais:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Eochairfhocail: abalone; aigéad ascorbic; imdhíonach; frith-ocsaídiúcháin; apoptóis

1. Réamhrá

Is eol gur micronutrient riachtanach é aigéad ascorbic (AA), ar a dtugtar vitimín C freisin, a fheidhmíonn mar chomhfhachtóir a bhaineann le gníomhaíocht il-einsímí daonna a fheabhsú agus a chuireann le freagairt imdhíonachta agus le forbairt an néarchórais i ndaoine [1,2 ]. Mar gheall ar chumas teoranta AA a chaomhnú san orgánach, tá gá le iontógáil rialta agus leordhóthanach chun easnamh AA a chosc. Tá gá le AA i rianmhéideanna ó fhoinsí exogenous le haghaidh meánfhás, gníomhaíochtaí fiseolaíocha, atáirgeadh, agus sláinte i bhformhór na mamaigh [3-5]. Maidir le feidhmeanna imdhíonachta, cuireann AA le sláine bacainn imdhíonachta agus cneasaithe créachta a chothabháil [1]. Is féidir leis feidhm na fagaicítí a threisiú, mar shampla feabhas a chur ar a n-ghluaiseacht, cemotaxis, fagaicíotóis, agus marú miocróbach [6-9]. Thuairiscigh staidéir roimhe seo éifeachtaí imdhíonachta éagsúla AA ar chealla B, cealla T, agus cealla NK i mamaigh [10-12]. Idir an dá linn, tá baint ag AA le apoptosis freisin. Coscann sé apoptosis miócairdiach trí chosc a chur ar Bax (BCL-2 próitéin X a bhaineann) agus méadaíonn sé cumas Bcl-2 (rialtóir apoptosis bcl-2) cosc ​​a chur ar scaoileadh cytochrome-C ó mitochondria isteach sa chiteaplasma. agus ina dhiaidh sin laghdaítear caspase-3, rud a chuireann tús le apoptosis [13]. Mar fhrithocsaídeach nádúrtha, laghdaíonn AA speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) agus speicis nítrigine imoibríoch (RNS) trí leictreoin a thabhairt dóibh agus ocsaídiú comhdhúile eile a chosc [14-17]. Is féidir le AA móilíní frith-ocsaídiúcháin eile a chumasú freisin, mar shampla glutathione (GSH), -carotene, urate, agus -tocopherol, chun athghiniúint óna fréamhacha saor in aisce faoi seach [18,19].

I gcodarsnacht le hainmhithe talún, is beag tuairisc atá ann ar fhreagairt imdhíonachta agus apoptosis in ainmhithe uisceacha. Is féidir le méideanna cothaitheacha-cuí AA fás, sláinte, agus friotaíocht struis in ainmhithe uisceacha a bharrfheabhsú [20]. Díríonn formhór na staidéar ar AA in ainmhithe uisceacha ar na híoscheanglais AA le haghaidh uasfhás fáis a mheas agus ar aiste bia ar a gcostas is lú a fhoirmiú. Athraíonn na riachtanais AA i measc speiceas, méid, réim bia agus coinníollacha feirmeoireachta. Tá an méid AA cothaithe molta idir 10 agus 10,000 mg/kg [21]. Ba é 53–186 mg/kg i tilapia na Níle (Oreochromis niloticus), 1200 mg/kg i dtuinnín gorm an Aigéin Chiúin (Thunnus orientalis) agus 5000–1000 mg/kg in íosriachtanas AA chothaithe chun tacú leis an uasráta fáis (WG) agus 53–186 mg/kg in. ribí róibéis kuruma (Marsupenaeus japonicas) [22–24]. Mar sin féin, níor chuir an WG nó an ráta fáis sonrach (SGR) isteach go mór ar AA aiste bia i roinnt speiceas éisc, mar shampla sturgeon Siberian (Acipenser baerii), bran mara dearg (Pagrus major) agus eascann Seapánach (Anguilla japonica) [25-27 ].

Tá sé léirithe go bhfeabhsaítear forlíonadh aiste bia AA le feidhmeanna imdhíonachta, mar shampla fagaicíotóis agus gníomhaíocht lísímí i go leor speiceas éisc [28-30]. Tuairiscíodh go mairfidh méadú ar nochtadh pataigin (m.sh., baictéir agus paraisítí) i tilapia na Níle, catfish na hÁise (Clarias batrachus), agus ribí róibéis bán san Aigéan Ciúin (Litopenaeus vannamei) tar éis iontógáil AA chothaithe [31-34]. Laghdaigh easnamh AA gníomhaíocht lísímí (LZM), comhlánú comhpháirt 3 (C3), agus ábhar C4 i gcarbán féir (Ctenopharyngodon idella) [35]. Féadfaidh sé leibhéil na peptides frithmhiocróbach a laghdú freisin, mar -defensin agus hepcidin, agus cítocíní frith-athlastacha lena n-áirítear interleukin (IL) 4/13A, IL-10, agus fachtóir fáis a chlaochlú (TGF) 1/2; agus cítocíní pro-athlastacha á n-uasrialáil, lena n-áirítear IL-1 agus fachtóir núicléach κB (NF-κB) i gcarbán féir [35]. Ina theannta sin, d’uasrialáil easnamh AA fachtóir gníomhachtaithe próitéas apoptotic-1, caspase-3, agus caspase-7–9 chun apoptosis cille i gcarbán féir a ghéarú [35,36].

Tá Abalone ar cheann de na speicis tráchtála is tábhachtaí san ord Archeogastropoda moileasc. Is ainmhí eiseamláireach tábhachtach é chun staidéar a dhéanamh ar bhitheolaíocht éiceolaíoch agus forbraíochta gastrapóid (Maoilisc) [37,38]. I measc na speiceas saothraithe ubhán, is é an tAigéan Ciúin muran (H. discus hannai Ino) an speiceas feirmeoireachta is fearr sa tSín. Thuairiscigh Mai nach raibh tionchar suntasach ag forlíonadh aiste bia AA ó 0 go 8000 mg/kg ar SGR nó ar ráta marthanais (SR) na n-ógánach ógánach [39]. Tá Wu et al. thuairiscigh go raibh tionchar ag AA aiste bia ar léiriú géinte a bhaineann le freagraí frith-ocsaídiúcháin i gland díleácha na n-abalóin chun a fhriotaíocht strus a fheabhsú [40]. Ina theannta sin, d’fhéadfadh caillteanais ollmhóra eacnamaíocha a bheith mar thoradh ar ráig na ngalar don tionscal éalaithe [41,42]. Níl díolúine oiriúnaitheach ag mollusks agus braitheann siad ar dhíolúine dúchasach [43]. Mar sin, bhí sé mar aidhm ag an staidéar reatha imscrúdú a dhéanamh ar róil AA i rialáil díolúine, frith-ocsaídiúcháin, agus apoptosis in H. discus hannai macalla agus soláthróidh sé teagasc eolaíoch maidir le rialáil shláintiúil ar fhoirmiú aiste bia i gcnámharlach.

2. Ábhair agus Modhanna

2.1. Ráiteas Eiticiúil

D'fhormheas Coiste um Chúram Ainmhithe Ollscoil Aigéan na Síne (Formheas Uimh. SPXY2020012) na nósanna imeachta cúram agus láimhseála ainmhithe go léir a rinneadh sa staidéar seo.

2.2. Aiste bia Turgnamhach

Ceapadh an aiste bia basal (AA{{{{10}}}}) ó chomhábhair íonaithe chun thart ar 30 faoin gcéad de phróitéin chothaithe agus 3.5 faoin gcéad de lipidí aiste bia (Tábla 1). Baineadh úsáid as cáiséin (saor ó vitimín) agus geilitín mar fhoinsí próitéine, agus úsáideadh ola pónaire soighe agus ola éisc menhaden (1:1) mar fhoinsí lipid, a d'fhéadfadh a bheith leordhóthanach chun an fás is fearr a choinneáil do H. discus hannai [44-46 ]. Cuireadh leibhéil ghrádaithe AA (0, 50, 1{00, 200, 500, 1000, agus 5000 mg/kg) leis an réim bia basal chun na seacht n-aistí bia turgnamhacha a fhoirmiú. Cuireadh an AA leis na aistí bia i bhfoirm L-ascorbyl-2-monafosfáit. Ainmníodh na haistí bia seo mar AA0, AA50, AA100, AA200, AA500, AA1000 agus AA5000, faoi seach. Ba é 0.00, 47.31, 78.25, 189.05, 451.73, 919.99, agus 4821.17 mg/kg, faoi seach, ábhair anailísithe AA sa réim bia. Baineadh úsáid as an modh crómatagrafaíocht leachtach ardfheidhmíochta chun anailís a dhéanamh ar ábhar AA aiste bia [40]. Rinneadh an próitéin amh aiste bia, lipid amh, agus fuinseog a thomhas de réir mhodhanna caighdeánacha Chumann na gCeimiceoirí Anailíseach [47].

2.3. Tástáil Láisteála

Cuireadh láisteadh AA chothaithe i láthair mar an éifeachtacht coinneála (RE). Rinneadh na aistí bia turgnamhacha le trí mhacasamhlú a thumadh san uisce farraige ag 23.0 ± 0.5 ◦C. Tógadh na aistí bia tumtha amach ag am leithroinnte (1, 3, 6, agus 12 h, faoi seach) agus rinneadh lyophilized chun anailís a dhéanamh ar ábhar AA.

RE ( faoin gcéad )=(AA coinnithe san aiste bia tar éis an tumoideachais)/(AA san aiste bia roimh thumoideachas) × 100.

2.4. Triail Bheatha

Fuarthas ógánaigh i gcéin ó chuideachta iascaigh i Fuzhou (Fujian, an tSín) agus bhí siad i dtaithí ar choinníollacha saotharlainne ar feadh coicíse, leis an aiste bia basal, i gcóras uisce athfhillte le humair (10{{1{{21) }}}} × 50 × 40 cm). Ina dhiaidh sin, sannadh go randamach ar 21 umar (meáchan tosaigh: 12.01 ± 0.001 g, fad sliogáin tosaigh: 48.44 ± 0.069 mm) do 21 umar (45 balún in aghaidh an umair). Measadh gur cóireáil amháin a bhí i ngach trí umar. Coinníodh gach umar faoi sholas éadrom le drapaí plaisteacha dubha. Rinneadh beathú de na cábáin de láimh uair amháin sa lá ag 17:00. Baineadh na feces agus aistí bia neamhite ag 8:00 gach maidin. Le linn na 100-triail beathú lae, bhí teocht an uisce 23.0 ± 0.5 ◦C, bhí an tsalandacht 30–33‰, bhí pH 7.4–7.9 agus bhí ocsaigin tuaslagtha níos mó ná nó cothrom le 7.0 mg/L.

2.5. Tástáil Dúshlán Vibrio Parahaemolyticus

Tar éis na trialach beathúcháin, baineadh úsáid as cúig choileán déag ó gach umar don tástáil dhúshlán le V. parahaemolyticus pataigineach. Tugadh dúshlán do na macalla le 100 µL de V. parahaemolyticus (1.2 × 106 cfu/mL) trí instealladh matán in vivo. Bailíodh an fhaireog díleá ag 0, 6, 12, 24, 48, agus 72 h, faoi seach, agus é a stóráil ag −80 ◦C le haghaidh anailíse qPCR.

2.6. Bailiúchán Samplach

Nuair a cuireadh deireadh leis an triail bheathú, rinneadh na crainn ghalláin a troscadh ar feadh trí lá sula ndearnadh iad a chomhaireamh agus a mheá. Rinneadh ainéistéitic ar gach ubhagán le 5 faoin gcéad d'alcól eitile roimh shampláil. Bailíodh hemolymph ó cheithre chluasáin i ngach umar chun anailís a dhéanamh ar chomhaireamh iomlán hemocyte (THC), pléasctha riospráide (RB), agus gníomhaíocht phagocytic (PA). Chun anailís a dhéanamh ar ghníomhaíocht na heinsíme i haemolymph saor ó chill (CFH), bailíodh an haemalymph ó dheich n-abalóin eile i ngach umar agus lártheifneoiríodh é (3000 × g ag 4 ◦C) ar feadh 10 nóiméad; Stóráladh an CFH ag −80 ◦C go dtí go n-úsáidfí é. Rinneadh an fhaireog díleá, geolbhaigh, matán, agus maintlín a shampláil ó dheich n-abalóin a tógadh le haemolymph in aghaidh an umair agus a stóráil ag −80 ◦C go dtí go n-úsáidtear iad.

2.7. Ábhar Aigéad Ascorbic

Braitheadh ​​an t-ábhar AA sa CFH, matán, maintlín, geolbhaigh, agus faireoga díleácha trí úsáid a bhaint as trealamh measúnaithe ascorbate ferric-laghdaithe (BioVision, Milpitas, CA, USA). D'fhéadfaí an CFH a úsáid go díreach chun ábhar AA a thomhas de réir threoracha an mhonaróra. Rinneadh na samplaí 0.1 g de mhatán, maintlín, geolbhaigh, agus faireog díleácha a homogenized i 1 ml d'uisce driogtha réamhfhuaraithe. Rinneadh an t-ábhar AA a thomhas trí ionsúiteacht ag 593 nm.

2.8. Paraiméadair Imdhíonachta i Hemolymph

Meascadh an hemolymph go críochnúil agus úsáid á baint as toirt chomhionann d’fhrith-théachtach réamhfhuaraithe (100 mmol/L EDTA Na2, 450 mmol/L NaCl, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L HEPES, pH 7.3, 850 mOs mol/kg) chun caolaigh an hemolymph.

Rinneadh THC a chomhaireamh ag baint úsáide as haemocytometer faoin micreascóp (CX31, OLYMPUS, Tóiceo, an tSeapáin).

Rinneadh laghdú ar nitroblue tetrazolium (NBT) i hemocytes, ar féidir gníomhaíocht RB a léiriú, a thomhas de réir modhanna Anderson et al., le roinnt modhnuithe [48]. Go hachomair, coigeartaíodh an hemolymph go 5 × 1 0 6 cealla / ml ag baint úsáide as anticoagulant agus lártheifneoiríodh é ag 3000 × g ag 4 ◦C ar feadh 10 nóiméad. Rinneadh an deascán cille a dhaite le 100 µL de 1 µg/mL PMA (aicéatáit mhiristáit phorbol, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, SAM) arna thuaslagadh ag DMSO (sulfocsaíd démheitile, Solarbio, Beijing, an tSín) agus gortha ag 37 ◦C do 30 nóim. Tar éis goir, cuireadh 100 µL de 0.3 faoin gcéad NBT tuaslagtha ag Hank's Balanced Salt Solution (Solarbio, Beijing, an tSín) leis na cealla agus gor é ag 37 ◦C ar feadh 30 nóiméad roimh lártheifneoiriú (560 × g ag 4 ◦C ar feadh 10 nóiméad) . Baineadh an súiteán go réidh, agus cuireadh deireadh leis an imoibriú le meatánól 200 µL ar feadh 10 nóiméad. Ina dhiaidh sin, nite an chill trí huaire le meatánól 70 faoin gcéad (v/v) sular triomaíodh é. Rinneadh an criostal gorm formazan a thuaslagadh ag baint úsáide as 120 µL de 2 M KOH agus 140 µL de DMSO. Léadh an dlús optúil (OD) i speictreafótaiméadar ag 630 nm i gcoinne bán KOH/DMSO.

Cinneadh an PA de hemolymph tar éis na modhanna a thuairiscítear roimhe seo de Xue et al. [49]. Go hachomair, cuireadh 50 µL de hemolymph caolaithe ar sleamhnán gloine agus gor é ag 25 ◦C ar feadh 20 nóiméad chun greamaitheacht a chur chun cinn. Ansin, cuireadh 50 µL giosta (Saccharomyces cerevisiae) le 1 × 106 cealla / ml leis an monolayer hemocyte roimh gor (25 ◦C ar feadh 30 nóiméad). Nitear an sleamhnán go réidh faoi dhó le saline maolánach fosfáit steiriliú (PBS) agus socraíodh é le meatánól ar feadh 5 min. Tar éis sin, rinneadh an sleamhnán a dhaite le réiteach Giemsa ar feadh 20 min. Rinneadh na cealla a chomhaireamh faoi lionsa tumoideachais ola. Léirigh an ráta phagocytic gníomhaíocht phagocytic.

2.9. Paraiméadair Bhithcheimiceacha i CFH

Cinneadh na gníomhaíochtaí einsímeacha frith-ocsaídiúcháin (cosúil le SOD, catalase (CAT), agus glutathione peroxidase (GPX)), cumas iomlán frith-ocsaídiúcháin (T-AOC), agus ábhar malondialdehyde (MDA) agus GSH i CFH ag baint úsáide as an. feisteáin measúnaithe tráchtála (Institiúid Bithinnealtóireacht Nanjing Jiancheng, Catalóg: T-AOC, A015-2-1; SOD, A001-3-2; CAT, A007- 1-1; GSH, A006-2-1; GPX , A005-1-2; MDA, A003-1-2). Bhí an T-AOC bunaithe ar ghiniúint fréamhacha glas ABTS (2, 20 -azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-aigéad sulfónach)) nuair a ocsaídíodh an ABTS. Rinneadh an SOD, GSH, agus GPX a thomhas ag absorbances ag 450 nm, 405 nm, agus 421 nm, faoi seach, ag baint úsáide as speictreafótaiméadar ultraivialait (Ultrospec 2100 pro, Biochrom, Holliston, MA, USA). Cinneadh an CAT agus an MDA ag baint úsáide as modhanna moluibdáit amóiniam agus TBA (aigéad thiobarbituric) [50,51].

Rinneadh gníomhaíocht LZM agus ábhar C3 agus C4 sa CFH a thomhas ag baint úsáide as trealamh measúnaithe tráchtála (Institiúid Bithinnealtóireacht Nanjing Jiancheng, Nanjing, an tSín. Catalóg: LZM, A050-1-1; C3, E032-1-1; C4 , E033-1-1). Tomhaiseadh an LZM de réir tarchurtha ag 530 nm. Socraíodh an C3 agus C4 ag 340 nm.

2. 10. Eastóscadh RNA Iomlán agus PCR Cainníochtúil Fíor-Ama

Baineadh an RNA iomlán ón bhfaireog díleácha agus ón gill trí úsáid a bhaint as trealamh leithlisithe RNA iomlán fíocháin (Vazyme, Nanjing, an tSín) agus imoibrí TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAM) de réir threoracha an mhonaróra. Cinneadh tiúchan agus íonacht RNA iomlán a bhaintear trí úsáid a bhaint as Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAM). Rinneadh an DNA comhlántach (cDNA) a shintéisiú trí úsáid a bhaint as trealamh trascríobh droim ar ais (PrimeScript® RT imoibrí Kit le gDNA Eraser, Takara, an tSeapáin).

Dearadh na primers go léir trí úsáid a bhaint as Primer Premier 6.0 (Tábla Forlíontach S1) agus rinne Sangon Biotech (Shanghai, an tSín) iad a shintéisiú. Rinneadh an t-imoibriú aimpliúcháin i dtoirt iomlán de 25 µL, ina raibh 0.5 µL de réamh-phríomhairí tosaigh agus droim ar ais, 12.5 µL de 2 × SYBR Green Realtime Master Mix (Vazyme), 1 µL de cDNA agus 10.5 µL de ddH2O aimridithe. Baineadh úsáid as na coinníollacha teirmeachaíocha seo a leanas chun próifílí slonn gach géine a chinneadh: 95 ◦C ar feadh 30 s; 40 timthriall de 95 ◦C ar feadh 10 s agus 60 ◦C ar feadh 30 s; le gor ina dhiaidh sin ag 95 ◦C ar feadh 15 s, 60 ◦C ar feadh 1 nóiméad agus 95 ◦C ar feadh 1 s chun fluaraiseacht a bhrath. Gnáthaíodh leibhéil slonn na sprice géine go dtí an meascán den dá ghéin tagartha is cobhsaí ( -actin agus gapdh), a bailíochtaíodh ag baint úsáide as geNorm agus NormFinder [52,53]. Ríomhadh na habairtí géine coibhneasta ag baint úsáide as an modh 2−∆∆CT [54].

2. 11. Blot an Iarthair

Baineadh próitéin iomlán an fhaireog díleá agus an gill ag baint úsáide as an modh RIPA (Solarbio) [55] le mhanglaim inhibitor protease agus phosphatase (Roche, Basel, an Eilvéis). De réir an lámhleabhair, baineadh próitéin núicléach an fhaireog díleá agus an gheolbhaigh ag baint úsáide as Kit Eastóscadh Próitéin Núicléach agus Cíteaplasma (Beyotime, Shanghai, An tSín). Rinneadh tiúchan próitéine a thomhas ag baint úsáide as an BCA Próitéin Cainníochtú Kit (Vazyme, Nanjing, an tSín), agus caolaíodh gach sampla próitéine go tiúchan coibhéiseach de 1.5 µg/µL ag baint úsáide as imoibrí RIPA. Scaradh samplaí próitéine ón bhfaireog díleáite agus ón gill trí úsáid a bhaint as SDS-PAGE agus aistríodh iad ina dhiaidh sin chuig membrane PVDF 0.45 µm. Cuireadh bac ar an PVDF ag baint úsáide as 5 faoin gcéad bainne púdraithe nonfat (Beyotime, Shanghai, An tSín) mar ullmhúchán do TBST ag teocht an tseomra ar feadh 1 h. Rinneadh an scannán a ní trí huaire le TBST roimh gor trí úsáid a bhaint as antashubstaint phríomhúil thar oíche ag 4 ◦C ag 60 rpm. Tar éis sin, nite an membrane gor trí huaire le TBST agus gor é ag baint úsáide as frith-coinín gabhar frith-coinín antashubstaint tánaisteach peroxidase-raonta comhchuingeach (Beyotime, Shanghai, An tSín) ar feadh 1 h ag teocht an tseomra. Rinneadh an membrane PVDF a léirshamhlú ag baint úsáide as trealamh ceimiceach ECL (Vazyme, Nanjing, an tSín). Baineadh úsáid as GAPDH (1:500, AB-P-R001, Goodhere Biotechnology, Hangzhou, an tSín) agus Lamin B (1:500, WL01775, Wanleibio, Shenyang, an tSín) mar phróitéiní tagartha. Ba iad na príomh-antasubstaintí sprice ná difreáil myeloid príomhfhreagairt 88 (MyD88, 1:500, WL02494, Wanleibio, Shenyang, an tSín), c-Meitheamh N-críochfort kinase (JNK, 1:500, WL01295, Wanleibio, Shenyang, an tSín), aibí. -IL-1 (1:500, WL00891, Wanleibio, Shenyang, An tSín), NF-κB p65 (1:500, WL01980, Wanleibio, Shenyang, An tSín), próitéin chomhlachú ECH cosúil le ceilch 1 (Keap1, 1). :1000, WL03285, Wanleibio, Shenyang, an tSín) agus cleaved-caspase3 (1:500, WL02117, Wanleibio, Shenyang, an tSín). Ríomhadh cainníochtú blot an Iarthair ag baint úsáide as ImageJ (Leagan 1.53, Wayne Rasband agus ranníocóirí, An Institiúid Náisiúnta Sláinte, Bethesda, MD, SAM).

2.12. Ríomhaireachtaí agus Anailís Staitistiúil

Baineadh úsáid as bogearraí SPSS 24 (IBM, Armonk, NY, USA) le haghaidh anailísí staitistiúla. Cuireadh ANOVA aontreo i bhfeidhm le tástáil ilraoin Tukey chun difríochtaí staidrimh idir na grúpaí seo a bhrath ag an leibhéal suntasachta de 0.05. Cuireadh na sonraí go léir in iúl mar mheán ± SE (earráid chaighdeánach).

Ríomhadh an SR, WGR (ráta meáchan a fháil), agus DISL (incrimint laethúil ar fhad sliogán) mar seo a leanas:

SR ( faoin gcéad )=(líon na ndaoine a tháinig slán ón gcósta/líon na dtosach cearnach) × 100;

WGR ( faoin gcéad )=[(meáchan deiridh (g) − meáchan tosaigh (g))/meáchan tosaigh (g)] × 100;

DISL (µm/lá)=[fad scealla deiridh (mm) - fad blaosc tosaigh(mm)]/laethanta × 1000.

3. Torthaí

3.1. Éifeachtúlacht Choinneála Aigéad Ascorbic san aiste bia

Léirítear an RE de AA aiste bia ag eatraimh éagsúla atá tumtha in uisce farraige i bhFíor Forlíontach S1. Go ginearálta, laghdaíodh RE an AA sa réim bia le fad an tumoideachais in uisce farraige. Le linn an turgnaimh bheathú, d'fhan an aiste bia san uisce farraige ar feadh thart ar 12 h. Mar sin, mhair an triail láisteála ar feadh 12 h in uisce farraige faoi na coinníollacha beathaithe céanna. Tar éis tumoideachas 3 h, bhí an RE de AA in aistí bia sa raon ó 95.25 faoin gcéad go 97.43 faoin gcéad . Coinníodh RE an AA ag níos mó ná 95 faoin gcéad sa tumoideachas 6 h. Tar éis tumadh ar feadh 12 h, b'ionann an RE de AA in AA50, AA100, AA200, AA500, AA1000, agus AA5000 89.78 faoin gcéad , 90.88 faoin gcéad , 89.38 faoin gcéad , 91.03 faoin gcéad , 87.44 faoin gcéad , 87.44 {7 faoin gcéad faoi seach , 87.44 faoin gcéad , 87.44 {7} faoi seach.

3.2. Feidhmíocht Fáis agus Dáileadh Aigéad Ascorbic i bhFíocháin

The SR and growth performance of abalone-fed gradient levels of AA supplementation are shown in Table 2. The SR (%), WGR (%), and DISL (µm/day) were not significantly affected by dietary AA levels (p>0.05). Bhí éagsúlacht sa SR idir 80.74 faoin gcéad agus 88.15 faoin gcéad , agus bhí an WGR agus an DISL sa raon ó 29.32 faoin gcéad go 31.52 faoin gcéad agus 17.92 go 20.01 µm/lá, faoi seach.

The AA distribution in tissues, including CFH, muscle, mantle, gill, and digestive gland, is shown in Figure 1. No significant differences in AA content in CFH and mantle of abalone after dietary AA were observed (p>0.05). Bhí raon ábhar AA i CFH agus maintlín ó 2.89 µg/mL go 4.52 µg/mL agus 81.63 µg/g go 103.08 µg/g, faoi seach. Méadaíodh go suntasach an t-ábhar AA i matán, geolbhaigh, agus faireoga díleácha (lch<0.05) and reached their peak at the AA5000 group. The AA content in the muscle, gill, and digestive gland was 64.88–128.20 µg/g, 308.98–382.19 µg/g, and 130.08–206.09 µg/g, respectively.

3.3. Paraiméadair Imdhíonachta Hemolymph

Cuirtear an THC, RB agus PA de haemolymph i láthair i dTábla 3. Mhéadaigh an THC go suntasach leis an méadú ar chothaithe AA, ag dul ó 1.07 × 107-1.65 × 107 cealla / ml, agus shroich sé a bhuaic ag an ngrúpa AA1000.

Méadaíodh go suntasach an RB sa haemocyte balone agus shroich sé an leibhéal ab airde ag an ngrúpa AA10{{10}}{{20}} (0 .35 OD630/107 cealla·mL−1 ). De réir mar a mhéadaigh forlíonadh AA chothaithe ó 189.05 mg/kg go 919.99 mg/kg, méadaíodh an RB go suntasach ó 0.20 cealla OD630/107 ·mL-1 go 0.35 cealla OD630/107·mL−1 (p <0.05). D'fhéadfadh tionchar a bheith ag AA aiste bia ar an LAP i haemaicítí de bhána (p < 0.05). Bhí PA na n-óg sa ghrúpa AA1000 agus AA5000 i bhfad níos airde ná mar a bhí i ngrúpaí AA0, AA50, agus AA100 agus bhain sé an t-uasmhéid (48.92 faoin gcéad) amach sa ghrúpa AA5000.

Léirítear na paraiméadair a bhaineann le himdhíonacht sa CFH de chnámharlach, lena n-áirítear ábhar LZM, C3, agus C4, i dTábla 4. Ardaíodh gníomhaíocht LZM go suntasach (p < 0.{{10} }5) agus bhain sé amach na leibhéil is airde sa ghrúpa AA1000, áit a raibh a ghníomhaíocht 56.25 U/mL. Níor nocht na sonraí aon éifeachtaí suntasacha le haghaidh ábhar C3 i measc na gcóireálacha go léir (p> 0.05); mar sin féin, d'fhan an t-ábhar C3 ag méadú le forlíonadh AA chothaithe. Níor chuir AA aiste bia isteach go mór ar ábhar C4 (p> 0.05).

3.4. Paraiméadair Frith-ocsaídiúcháin i CFH

Léirítear na gníomhaíochtaí einsímí frith-ocsaídiúcháin i CH na mara ina bhfuil SOD, CAT, agus GPX, chomh maith le cumas T-AOC agus ábhar MDA agus GSH i dTábla 5. Bhí tionchar suntasach ag aiste bia AA ar ghníomhaíochtaí SOD, CAT, agus GPX, agus an T-AOC agus a bhfuil i GSH agus MDA. Rinneadh gníomhaíochtaí SOD, CAT, agus GPX, agus an t-inneachar T-AOC agus GSH a uasrialáil go suntasach (p < 0.05), agus rinneadh íosrialáil suntasach ar inneachar MDA i gcéin (p < 0.05 ). Níor tugadh faoi deara aon difríochtaí suntasacha idir na grúpaí AA1000 agus AA5000 idir na paraiméadair frith-ocsaídiúcháin seo i CFH na gcapall.

【Le haghaidh tuilleadh eolais:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】