Athruithe ar Aistriú Próitéin agus Próisis Chatabacha Aigéad Carbocsaileacha i nGalar Duán Diaibéiteach

Coimriú: Galar Duán Diaibéiteach (DKD)fós mar phríomhchúis legalar duáin deiridhainneoin na mblianta staidéir. Athruithe snaglomerulus agus tubules duáincuireann an bheirt leis anpataigineas DKDcé gur dhírigh formhór na n-iarrachtaí imscrúdaithe ar an glomerulus. D’fhéachamar le scrúdú a dhéanamh ar shloinneadh difreálach DKD daonna sa glomerulus agus sa tubule cóngarach agus ár dtorthaí a dhaingniú i múnla luiche db/db diaibéiteas. Anailís líonra tras-eagraithe ar shonraí RNAseq ó glomerulus daonna micrea-dháilte léasair (LMD) agus tubule cóngarach DKD agusnephrectomy tagarthanocht samplaí conairí saibhrithe lena n-áirítear gabhdóirí cosúil le róslabhras, comharthaíocht olfactory, agus ribosome (aistriúchán próitéin) sa tubule cóngarach de shamplaí bithóipse DKD daonna. Saibhríodh bealach an aistriúcháin sa glomerulus freisin. Aistriúchán méadaithe iduáin diaibéitiss bailíochtaithe ag baint úsáide as próifíliú polyribosómach sa mhúnla luch db/db diaibéiteas. Ag baint úsáide as seicheamhú RNA núicléach aonair (RNA-Seq) de na duáin ó lucha db/db, thugamar tosaíocht do bhealaí breise a aithníodh i DKD daonna. An cosán forluiteach barr a aithníodh i mbraislí feadáin chóngaracha snRNAseq agus sa fheadán cóngarach LMD daonnaBhí urrann catabolism aigéad carbocsaileach. Ag baint úsáide as crómatagrafaíocht leacht-mhais-speictriméadracht ultra-fheidhmíochta, fuarthas amach freisin go raibh an cosán catabólachta aigéid shailligh dírialaithe sa mhúnla luiche db/db. Rinneadh an meitibilít Acetyl-CoA a ísliú i lucha db/db, ag ailíniú le léiriú difreálach daonna na ngéinte ACOX1 agus ACACB. Go hachomair, léiríonn ár dtorthaí go bhfuil athruithe feadánacha cóngaracha in aistriúchán próitéine aguscatabolism aigéad carbocsaileachis príomhghnéithe sa duine agus samarbh DKD.

Eochairfhocail:síniú slonn géine; seicheamhú RNA núicléach aonair;meitibileacht; próifíliú ribosomal

Luibheanna NUA DODuán Diaibéitis

1. Réamhrá

Bíonn tionchar ag Diaibéiteas mellitus (DM) ar bhreis is 400 milliún duine ar fud an domhain [1] agus os cionn 30 milliún i SAM [2]. Tá galar duáin diaibéitis (DKD) ar cheann de na deacrachtaí is tromchúisí a bhaineann le DM, a dhéanann difear do 19 milliún duine sna Stáit Aontaithe [3], agus is é an phríomhchúis legalar duáin deiridh(ESKD) [4]. Breathnaítear ar DKD go clasaiceach mar ghalar glomerular; áfach, ag díriú go hiomlán ar phaiteolaíocht glomerular mar phríomhshuíomh an ghortaithe féachtar ar athruithe tábhachtacha bitheolaíocha san urrann tubulointerstitial a chuireann le paiteolaíocht DKD [5]. Go deimhin, is minic a bhíonn prognóis agus dul chun cinn DKD atrophy feadánacha comhthreomhar agus méid an ghalair interstitial [6,7]. Baineann fianaise eile leis an bpointe seo go gcuirtear moill ar dhul chun cinn DKD trí dhíriú ar an bhfeadán cóngarach le coscairí SGLT2 [8].

Admhaítear go bhfuil na meicníochtaí ceallacha as a dtiocfaidh forbairt agus dul chun cinn DKD casta. Tá mínormáltachtaí meitibileach, athlasadh, strus ocsaídiúcháin, agus athruithe ar homeostasis próitéin mar thréith ag an milieu diaibéitis. Cuireann na maoluithe seo go léir le strus cille agus le forbairt DKD. Tá fianaise ag fás go bhfuil aistriúchán athraithe, an chéim bhunúsach i léiriú géine a chruthaíonn próitéiní feidhmiúla, tábhachtach maidir le freagairt agus cur le strus cille [9,10]. Cuireann athruithe san aistriúchán le héagothroime i hoiméastáis próitéine agus bíonn tionchar acu ar shláinte an duine agus ar ghalair [11–14].

Nuair a dhéantar eiseamail bithóipse duán daonna a cheistiú, baintear úsáid rialta as micreascópacht éadrom, micreascópacht leictreoin tarchurtha, agus imdhíon-imoibrithe chun cur ar chumas an phaiteolaí diagnóis agus prognóis a dhéanamh. Mar sin féin, tá teorainneacha ag na huirlisí diagnóiseacha seo maidir le teacht ar na meicníochtaí móilíneacha is bun le galar duáin lena n-áirítear DKD. Dá bhrí sin, baineadh úsáid as samhlacha ainmhithe DM go stairiúil chun staidéar a dhéanamh ar mheicníochtaí paiteolaíocha DKD; áfach, níl aon cheann de na samhlacha seo insamhladh go cuí DKD daonna [15]. Cé go bhfuil spreagadh ag baint le hiarrachtaí le déanaí chun teicnící ceistithe móilíneacha níos forbartha a chur i bhfeidhm ar eiseamail bithóipse duán daonna [16], creidimid gur cur chuige turgnamhach tábhachtach é samhlacha ainmhithe a úsáid i gcomhthráth le fíochán duáin dhaonna chun léargais uathúla a sholáthar ar bhunsraith mhóilíneach DKD.

Rinneamar iarracht síniú difreálach DKD daonna a scrúdú sa tubule glomerulus agus cóngarach. Rinneamar hipitéisiú go gcinneann an síniú traipeolaíoch tubular cóngarach, chomh maith le síniú an glomerulus, torthaí DKD freisin. Thugamar aghaidh ar an hipitéis seo trí eiseamail bhithóipse duán daonna a cheistiú le micrithdháileadh léasair ar réigiúin feadánacha glomerular agus cóngaracha chun conairí a bhaineann le DKD agus a dhul chun cinn a aithint. Ina dhiaidh sin, comhthacaíodh príomhbhealaí i múnla luiche diaibéitis ag baint úsáide as cur chuige ilmhódach de sheicheamhú RNA núicléach aonair (RNA-Seq), próifíliú polyribosomal, agus meitibileacht. Chomh maith le maoluithe in aistriú próitéine, tacaíonn ár dtorthaí leis an ról a d’fhéadfadh a bheith ag meitibileacht aigéid charbocsaileacha mar phríomhfhachtóir i ndul chun cinn galar duáin diaibéitis.

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2. Ábhair agus Modhanna

2.1. Ábhair Dhaonna

D'fhaomh an Bord Athbhreithnithe Institiúideach ar Scoil Leighis Ollscoil Indiana (IRB uimh. 190657223) an staidéar seo. Fuarthas seacht sampla duán is fiche ó Chuibhreannas Tionscadal Leigheas Beachtais Duán agus Cohórt Biopsy Biobank Indiana [17]. Bithóipsí tásc le haghaidh proteinuria nó laghdú ar fheidhm duánach in ábhair a bhfuil diaibéiteas mellitus orthu a bhí i bithóipse duán. Fuarthas ocht sampla dhéag ó dhaoine fásta a raibh galar diaibéitis duáin orthu agus gan an dara lot glomerular. Fuarthas naoi gcinn de shamplaí tagartha gan fianaise histologach de DKD ó pharenchyma neamh-neoplastic d'eiseamail nephrectomy nó ó dheontóirí éagtha. Baineadh athróga cliniciúla agus histeapaiteolaíocha as an taifead sláinte leictreonach. Sainmhíníodh an ráta scagacháin glomerular measta bonnlíne (eGFR) mar an luach is gaire do dháta na bithóipse mura dtagann laghdú 20% nó níos mó ar atreorú bithóipse deasctha eGFR. Sa chás seo, socraíodh eGFR laistigh de bhliain amháin roimh bithóipse agus roimh an laghdú 20% mar bhonnlíne le haghaidh ríomhanna dul chun cinn.

2.2. Microdissection Léasair ar Fhíochán Duán Daonna agus Seicheamhú RNA

Gearradh cryosections de thiús 12 µm ó bhlocanna fíocháin reoite a chaomhnaíodh i meán Teocht Gearrtha is Fearr, cloí le sleamhnáin membrane sulfíde polyphenylene (PPS), agus próiseáilte ag baint úsáide as prótacal Rapid Stain mar a thuairiscítear roimhe seo [18,19]. Scaradh achar íosta de 500,000 µm2 le haghaidh urranna feadánacha glomerular agus cóngaracha ag baint úsáide as an léasair UV bíogach ar an Leica LMD6500 agus cuspóir 20 ×. Bailíodh fíochán scartha i bhfeadán steiriúil saor ó RNAse ina raibh Maolán Eastóscadh RNA agus scoiteadh RNA de réir threoracha an mhonaróra (Arcturus PicoPure RNA Leithlisiú Kit, ThermoFisher, Waltham, MA, SAM). Cinneadh cáilíocht RNA trí úsáid a bhaint as Bithanailíseoir Agilent 2100.

Rinneadh seicheamhú ag Lárionad Géanómaíochta Leighis Ollscoil Indiana. Laghdaíodh RNA Ribosomal ag baint úsáide as an bprótacal RiboGone-Mamalian Kit (Cat #634847, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA). Baineadh úsáid as prótacal RNA RNA Ionchuir Íseal Uilíoch SMARTer v2 (Cat #634938, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA) le haghaidh sintéise cDNA agus tógáil leabharlainne. Rinneadh seicheamhú le cumraíocht deireadh péireáilte 2 × 75 bp ar an Illumina HiSeq 4000 ag baint úsáide as an HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit, agus mapáladh na sonraí seicheamhaithe chuig an genome hg38 ag baint úsáide as STAR. Sannadh léamha seicheamhaithe uath-mhapáilte do na géinte géanóm tagartha hg38 ag baint úsáide as Rsubread featureCounts [20,21].

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2.3. Faomhadh Staidéir Ainmhithe

D'fhaomh Coiste Institiúideach um Chúram Ainmhithe Ollscoil Indiana gach prótacal ainmhithe agus cloíonn siad le Treoir na nInstitiúidí Náisiúnta Sláinte um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Saotharlainne. Le haghaidh seicheamhú RNA mórchóir, próifíliú polyribosómach, agus meitibilít, fuarthas brú lucha fireann C57BL/6J (# 000664, rialú cúlra / lucha C57) agus B6.BKS-Leprdb/J (#000697, lucha db) ó Shaotharlann Jackson ( Bar Harbor, ME, USA). Bhí lucha idir 9–12 seachtain d’aois agus meáigh siad ~30 g (C57 lucha) nó 40–50 g (lucha db). Rinneadh lucha a íobairt agus baineadh duáin (n=4 nó 5 in aghaidh an ghrúpa).

2.4. Leithlisiú Fíocháin Duán Luiche agus Bulc-Seicheamhú RNA

Rinneadh snap-reoite ar na duáin agus baineadh RNA trí úsáid a bhaint as Kit QIAGEN RNeasy Plus Midi le colún bainte DNA géanómaíochta. Cinneadh cáilíocht RNA trí úsáid a bhaint as Bithanailíseoir Agilent 2100. Úsáideadh an Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit chun leabharlann a thógáil. Rinneadh seicheamhú le cumraíocht deiridh péireáilte 2 × 75 bp ar Illumina HiSeq 4000 ag baint úsáide as an HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit, agus mapáladh na sonraí seicheamhaithe chuig an genome mm10 ag baint úsáide as STAR. Sannadh léamha seicheamhaithe uath-mhapáilte do na géinte géanóm tagartha mm10 ag baint úsáide as Comhaireamh Gné Rsubread.

2.5. Leithlisiú Fíocháin Duán Luiche agus Seicheamhú Aonair-Núicléach RNA

Rinneadh meastóireacht ar lucha 5, 8, 11, 16, agus 20 seachtaine d'aois (n=5 san iomlán, BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J #000642). Baineadh úsáid as heitrisiogótaí ón brú céanna mar rialuithe cúlra (n=3). Rinneadh albaimin fuail a thomhas le paca albaimin luiche ELISA (Bethyl Laboratories, E99-134, Montgomery, TX, USA) agus tomhaiseadh creatinín fuail le trealamh measúnaithe creatinine QuantiChrom (Bioassay System, DICT-500, Hayward , CA, SAM). Ar an oighear, cuireadh cuid de gach duán le 1 ml de mhaolán lysis Nuclei EZ arna fhorlíonadh le 2% coscaire protease (Thermofisher), agus 1% Superase (Thermofisher). Tar éis mionnú, cuireadh 1 ml maolán leis agus rinneadh aonchineálú ar fhíochán ag baint úsáide as an Grinder Fíocháin KONTES Dounce (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA). Meascadh aonchineálach go réidh le 2 ml maolán agus goradh ar oighear é ar feadh 5 nóiméad. Scagadh homogenate trí strainer 40 µm agus cóireáilte le maolán lysis arna fhorlíonadh le 1% Superbase, ansin scagtha arís trí30 µm strainer, agus ina dhiaidh sin athchuireadh i PBS arna fhorlíonadh le 2% BSA agus 1%Sáráis. Scagadh an fionraí seo trí 5 ansinµm scagaire agus an tiúchancoigeartaíodh é go 1-3 milliún núicléas/ml sula gcuirtear isteach le haghaidh seicheamhú.

Rinneadh seicheamhú núicléach aonair 30 RNA ag Lárionad Géanómaíochta Leighis Ollscoil Indiana ag baint úsáide as an gcóras aonchealla Cróimiam leagan 3 (10× Genomics, San Francisco, CA, USA) agus an Seicheamhóir NovaSeq6000 (Illumina, San Diego, CA, SAM). Baineadh úsáid as Cell Ranger 4.0 chun comhaid FASTQ a bhí sonrach do shamplaí a ghiniúint agus rinneadh léamha a ailíniú leis an géanóm tagartha mm10 ag baint úsáide as STAR. Baineadh úsáid as Seurat v 3.0.1 chun samplaí a chomhtháthú ag baint úsáide as na méadrachtaí rialaithe cáilíochta seo a leanas: áiríodh comhaireamh géine idir 200-3000 agus faoin gcéad géine miteachondrial níos lú ná 50%. San iomlán, coinníodh 58,405 cill le haghaidh anailíse iartheachtach. Rinneadh réamhphróiseáil chaighdeánach, roghnú gnéithe, laghdú toise (20 príomh-chomhpháirt), sainaithint ancaire idir samplaí, agus comhtháthú.a dhéantar de réir mhodhanna ancaireachta Seurat v3.Rinneadh anótáil ar bhraislí bunaithe armarcóirí slonn géine coitianta [22] agus ag baint úsáide as Kidney Cell Explorer [23].

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2.6. Leithlisiú Fíocháin Duán Luiche agus Próifíliú Polyribosomal

Rinneadh rialú cúlra agus lucha db a íobairt ag 9 agus 12 seachtaine d'aois. Rinneadh perfusion cairdiach tríd an bhfiontar clé le 6 ml de chicliheicsimide (100 µg/mL i PBS). Cuireadh duáin bhuainte láithreach i maolán lysis comhdhéanta de 1% Triton X-100, 0.1% deoxycholate, 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, Táibléad Cocktail Coscóir Protease saor ó EDTA (Roche, Penzberg , an Ghearmáin), ciocliheicsimíd 50 µg/mL, agus RNAsin (caolú 1:500). Rinneadh aonchineálú ar fhíocháin ag 4 ◦C ag baint úsáide as homogenizer fíocháin Precellys (Precellys, Montigny-le-Bretonneux, an Fhrainc). Goradh aonchineálaigh fíocháin ar oighear ar feadh 10 nóiméad, agus ansin lártheifneoiríodh iad ag 9600 × g ar feadh 10 nóiméad. Cuireadh an comhshuíomh le barr grádán siúcróis a ghin BioComp Gradient Master (10% siúcróssa bhreis ar shiúcrós 50% i 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, agus 50 mg/mLcioglaiheicsimide) agus lártheifneoirithe ag 284,000× g ar feadh 2 uair ag 4◦C. Baineadh na grádáinón mbarr i mbainteoir Biocomp (Biocomp Instruments, Fredericton, NB, Ceanada),agus rinneadh monatóireacht leanúnach ar ábhar RNA na gcodán ribosómach eluted le UVionsúiteacht ag 254 nm.

2.7. Meitibileacht

Chun sínithe meitibileachta a mheasúnú, ullmhaíodh samplaí de lucha rialaithe cúlra agus db (n=5 in aghaidh an ghrúpa) ag baint úsáide as an gcóras uathoibrithe MicroLab STAR® (Hamilton Company, Reno, NV, USA). Rinneadh anailís mheitibileach ar Metabolon Inc. Go hachomair, próiseáladh fíocháin duáin a bhí reoite snap-reoite de réir an mhodha eastósctha caighdeánach Metabolon de réir prótacail na cuideachta. Rinneadh anailís ar na sleachta ar chrómatagrafaíocht leachta ultrafheidhmíochta ACQUITY Uiscí (UPLC) le colún C18 (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1.7 µm) agus ardtaifeach/cruinn Thermo Eolaíoch Q-Exactive mais-speictriméadar comhéadain le foinse ianaithe leictrispré téite (HESI-II) agus anailísí mais Orbitrap a oibrítear ag 35,000 olltaifeach.

Baineadh sonraí amh, sainaithníodh agus próiseáladh QC ag baint úsáide as crua-earraí agus bogearraí Metabolon's (Durham, NC, SAM). Rinneadh beanna a chainníochtú trí úsáid a bhaint as achar faoin gcuar. Rinneadh anailísí staitistiúla caighdeánacha le t-tástáil dhá shampla Welch in ArrayStudio ar shonraí log-chlaochlaithe.

2.8. Léiriú Géine Difreálach, Anailís Conair, agus Staitisticí

Rinneadh normalú cainníochtúil ar shonraí LMD daonna agus fíocháin duán luiche ó sheicheamhú RNA agus socraíodh slonn difreálach trí úsáid a bhaint as tástáil bheacht in edgeR le luachanna p < 0.05 a mheastar a bheith suntasach go staitistiúil tar éis Benjamini–Hochberg bréagach ceartú tástála iolrach ráta fionnachtana (FDR). Maidir le samplaí duán luiche a ndearnadh seicheamhú snRNA orthu, socraíodh slonn difreálach trí úsáid a bhaint as tástáil Wilcoxon Rank Sum le luachanna p coigeartaithe Bonferroni < 0.05 a measadh a bheith suntasach go staitistiúil. Cuirtear p-luachanna neamhcheartaithe ar fáil sa lámhscríbhinn, áfach. Rinneadh imscrúdú ar shonraí slonn géine le haghaidh cosáin saibhrithe i Gene Ontology, Kegg, agus Reactome ag baint úsáide as anailís líonra tras-eagraithe mar a thuairiscítear roimhe seo [19,24-26]. Go hachomair, déantar gach géin códaithe próitéine, beag beann ar p-luach, a ordú de réir líonraí idirghníomhaíochta próitéine-próitéine. Baineadh úsáid as algartam Monte Carlo chun géinte a bhraisliú trí fheidhmeanna bitheolaíocha comhroinnte. Cinntear an tábhacht trí úsáid a bhaint as t-tástáil Welch dhá eireaball tar éis 500 iomalartú randamach chun an ráta fionnachtana bréagach a mheas le luachanna p < 0.05 a mheastar a bheith suntasach go staitistiúil. Ós rud é nach gcuirtear in iúl ach fo-thacar de ghéinte in aon chill ar leith le haghaidh sonraí snRNA-seq, níl an modh tras-scríbhinne indéanta don chineál seo sonraí. Bhain anailís cosán le haghaidh snRNA-seq le saibhriú géinte a cuireadh in iúl go difreálach i Gene Ontology, Kegg, agus Reactome de réir tástála beacht Fisher, gan cuntas a thabhairt ar idirghníomhaíochtaí líonra próitéine-próitéine. Cumascadh gach cnuasach cille tubular cóngarach thar gach pointe ama chun géinte saibhrithe a aithint idir lucha rialaithe agus db. Rinneadh an bhraisle aonair podocyte a chumasc thar phointí ama freisin. Cuireadh an modh seo i bhfeidhm ar shonraí RNA-seq daonna freisin nuair a bhí measúnú á dhéanamh ar fhorluí leis an tacar sonraí snRNA-seq. Baineadh úsáid as luachanna p ceartaithe FDR le haghaidh conairí chun forluí a aithint idir fo-dheighiltí meaitseála. PAM (deighilt timpeallmedoids) chun samplaí diaibéitis daonna a chnuasach de réir na ngéinte a bhí i gceist i ngach conair fhorluiteach. Cinneadh gnéithe cliniciúla difreálacha ag baint úsáide as tástáil Wilcoxon Rank Sum idir grúpaí cnuasaithe.