Tá Stór Cítocnámharlach agus Glacadóir Dromchla Difriúil ag Cealla Duán Leanbh Cloí agus Fionraí

Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com

Veronika Dill¹, Florian Pfaff¹, Aline ZimmerID², Máirtín Beoir¹, Michael EschbaumerID^1*

Teibí

Cultúr cealla ainmhithe, le cealla aonair ag fás ifionraí, go hidéalach i dtimpeallacht atá sainmhínithe go ceimiceach, mar phríomhghné de tháirgeadh bithchógaisíochta. Níl fachtóirí fáis eisghineacha ag baint leis an timpeallacht shintéiseach agus de ghnáth teastaíonn próiseas oiriúnaithe ama-íditheach chun clóin chill a roghnú a iomadaíonn i.fionraígo dtí líon na gceall ard. Tá na meicníochtaí móilíneacha a éascaíonn an t-oiriúnú agus a tharlaíonn taobh istigh den chill anaithnid den chuid is mó. Go háirithe le haghaidh línte cille a úsáidtear le haghaidh táirgeadh antigen víreasach cosúil le cealla duáin hamster leanbh (BHK), tá sé an-neamh-inmhianaithe srian a chur ar fhás víreas trí éabhlóid na saintréithe cealla neamh-inmhianaithe. An chomparáid idir cealla BHK ag fás go cloí agus cealla fionraí le éagsúlaso-ghabhálachtgo víreas galar crúb agus béil nochtar difríochtaí i léiriú na ngabhdóirí ceallacha ar nós integrins agus sulfates heparan agus in eagrú an cíteascóp actin. Anailísí tras-scríofa agus fáscinéiticléirigh sé éagsúlacht línte cille BHK agus dheimhnigh sé an tábhacht a bhaineann le clóin chillíní tuismitheora dea-shaintréithe agus scagadh meabhrach chun a chinntiú nach gcailltear gnéithe ceallacha riachtanacha le linn oiriúnú.

Coscann Cistanche tubulosa galar duáin, cliceáil anseo chun an sampla a fháil

1. Réamhrá

Baineadh úsáid as teicneolaíocht saothraithe ceall ainmhithe ar dtús chun antaigin víreas a tháirgeadh i dtáirgeadh vacsaíní, ach le déanaí athraítear ardáin táirgthe baictéar nó giosta do phróitéiní athchuingreach go córais chealla mhamach freisin [1, 2]. Tábhachtach sa dá chomhthéacs tá cealla duáin hamster leanbh (BHK), a dhíorthaítear ó hamstar órga na Siria (Mesocricetus auratus). Ar dtús, bhí cealla BHK ina líne cille mamaigh a bhí ag fás go cloí, ag brath ar ancaire le patrún fáis fibroblast i gcoinníollacha cultúir cille caighdeánach lena n-áirítear serum bó féatais (FBS) [3, 4]. oiriúnú cealla BHK greamaitheacha gofionraíIs scéal rathúil é fás sna meáin saor ó shéiream in éineacht le coinníollacha cultúir ar scála mór maidir le táirgeadh próitéiní athchuingeacha (m.sh., fachtóir VIII) le táirgeacht ard [1, 2]. Ina theannta sin, tá cealla BHK so-ghabhálach do raon leathan víreas, lena n-áirítear víreas an ghalair crúibe is béil (FMD) [5]. Chun freastal ar an éileamh méadaitheach ar vacsaíní FMD i go leor áiteanna ar fud an domhain, ní mór cainníochtaí móra antigen a tháirgeadh chomh saor agus is féidir, rud is féidir a bhaint amach trí dhlúis inmharthana cille a mhéadú ar thaobh na gcealla agus laghdú ar chostais trí phróiseáil suas agus iartheachtacha a shimpliú. den antigen ar thaobh an táirgthe [6]. Laghdaíonn meáin saor ó chomhpháirt ainmhithe (ACFM) an baol éillithe ó ghníomhairí teagmhasacha agus déanann siad an próiseas a shimpliú freisin nuair nach gá serum a fhorlíonadh [6, 7]. Mar sin féin, is próiseas ama agus de réir a chéile é oiriúnú cealla le fás i bhfionraí gan serum agus in ACFM [6, 8]. Sroicheann cealla BHK dlús cille de 3.5×106 ceall/mL go héasca i bhfionraí ach bíonn an baol ag baint leis an oiriúnú i gcónaí go dtiocfaidh forbairt ar airíonna cille neamh-inmhianaithe i gcomparáid leis an daonra tosaigh, rud a d’fhéadfadh a bheith mar thoradh ar fheidhmíocht lag fáis, táirgeacht chill-shonrach neamhleor, nó sócmhainní mealligineacha. [5, 7]. Ina dhiaidh sin, is féidir le hathruithe ar na cealla a bheith mar thoradh ar éagsúlachtaí víreasacha gan choinne le linn an phróisis oiriúnaithe cultúrtha. Go háirithe maidir le táirgeadh antaiginí vacsaíne, tá athrú ar shaintréithe víreas agus antigenicity an-neamh-inmhianaithe. Tá difríocht idir cealla BHK cheana féin ina so-ghabhálacht agus a bhféidearthacht cineálacha áirithe víreas FMDV a iomadú [9]. Ar ndóigh, beidh athruithe suntasacha ar an gcill féin ag gabháil leis an athrú ó fhás fibroblastic atá ag brath ar ancaireacht trí chomhiomlánú agus foirmiú sféaróid go cealla a fhásann go neamhspleách ar fionraí [4, 6]. Mar thoradh ar chaillteanas comharthaíochta integrin mar gheall ar chur isteach ar theagmháil maitrís-chill extracellular, tá athruithe ar léiriú próitéine membrane agus in eagrú an cítea-chnámharlaigh actin atá ina fhaighteoir tábhachtach de chomharthaíocht integrin-mediated [6, 10]. Ag an am céanna, tá ról tábhachtach ag na integrins seo in ionfhabhtú FMDV toisc go bhfuil siad mar receptor FMDV san óstach nádúrtha agus an receptor príomhúil i gcultúr cille [11].

Tuiscint níos doimhne ar na difríochtaí ceallacha idir cealla HK atá ag fás go cloíte agus cealla ifionraíosclófar féidearthachtaí nua d’innealtóireacht na gceall agus simpleoidh sé roghnú na gclón ceall oiriúnach le haghaidh táirgeadh antaiginí vacsaíne.

Sa staidéar seo, ag fás go cloíte cealla BHK agus ACFM-oiriúnaithefionraíScrúdaíodh cealla BHK maidir le léiriú gabhdóirí ceallacha ar nós integrins agus sulfáití heparan (HS), a gcumas próitéiní a chur i láthair ar dhromchla na cille, agus eagrú an chnámharlaigh actin cheallacha. Soláthraíonn anailísí trascriptome agus cinéitic fáis faisnéis faoi éagsúlacht na línte cille BHK a tástáladh.

is féidir le cistanche duáin a chothú agus feidhm na duáin a fheabhsú

2. Ábhair agus modhanna

2.1 Línte cille agus cultúr cille

Ba iad na príomhlínte cille a úsáideadh ná dhá dhíorthaigh chlúiteach BHK-21 clón 13 (ó Chineál American Culture Collection [ATCC] CCL-10, a choinnítear mar CCLV-RIE 164 agus 179 sa Bhailiúchán de Línte Cille i Leigheas Tréidliachta , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, an Ghearmáin; i mbeagán focal: BHK164 nó BHK179) agus anfionraílínte cille BHK21C13-2P (BHK-2P) arna soláthar ag an mBailiúchán Eorpach de Chultúr Ceall Fíordheimhnithe (ECACC; 84111301) agus BHK-InVitrus (BHK-InV, dá ngairtear "líne #8" freisin mar a bhí inár bhfoilseachán níos luaithe [12]; Sigma-Aldrich, St. Louis, SAM).

Le haghaidh cinéitic fáis, úsáideadh na línte cille seo a leanas ina theannta sin: Choinnigh BHK-2P i nGlaschú Íosmhéid Meán Riachtanach (GMEM) le 10 faoin gcéad FBS ("líne #2") nó oiriúnaithe don ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Darmstadt, an Ghearmáin) in dhá phróiseas éagsúla (línte #4 agus #5), móide ceithre cinn eilefionraílínte cille: BHK21C13 in oiriúint d'fhás ifionraítrí serum (líne #3), BHK21-C (líne #6), BHK21-Hektor (líne #7) agus táirgeadh BHK (líne #9) [12] a aistarraingt de réir a chéile. Ba é Merck KGaA a sholáthair na cealla seo go léir.

Díorthaítear gach cill BHK-21 a úsáideadh sa staidéar ar deireadh ó líne chill chlón 13 BHK de Macpherson agus Stoker [13]. Úsáidtear an téarma "líne cille" go scaoilte; níl gach ceann de na haon líne déag BHK a bhfuil cur síos orthu sa staidéar reatha ina gcilllínte fíor-shonracha seachas díorthaigh a shaothraítear faoi choinníollacha éagsúla. Chun tagairt a dhéanamh níos éasca, coinnítear uimhriú na línte comhsheasmhach leis an uimhriú san fhoilseachán roimhe seo [12].

Níor cuireadh líne chill #1 ón bhfoilseachán roimhe seo san áireamh sa staidéar seo agus mar sin ní úsáidtear an uimhir seo. Ina ionad sin, is chuig an bpríomhoide aon tagairt do BHK-2chealla P nach luann na línte #2, #4, nó #5fionraílíne chill BHK21C13-2P (ECACC84111301) tugtha isteach ag tús na coda seo.

Na línte cille ubhagán hamster Síneach (Cricetulus griseus) (CHO) CHO-K1 (ATCCCCL-61, arna sealbhú mar CCLV-RIE 134) agus CHO677 (CRL 2244, arna shealbhú mar CCLV-RIE 1524) chomh maith leIB-RS Baineadh úsáid as -2 cealla (Instituto Biolo’gico-Rim Suı´no-2, arna sealbhú mar CCLV-RIE 103) agus cealla duán bó-ainmhithe Madin-Darby (i mbeagán focal: MDBK, arna sealbhú mar CCLV-RIE261) mar rialuithe i dturgnaimh chitoiméadrachta sreafa.

Bhí coinníollacha cultúir 37 ˚C, 5 faoin gcéad CO2, agus le haghaidhfionraícealla 320 rpm i bith-imoibreoirí TubeSpin (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, an Eilvéis) ag 80 faoin gcéad taiseachas coibhneasta. Saothraíodh na línte cille greamaitheacha go léir in Íos-Iolar Meán Riachtanach (MEM) arna fhorlíonadh le salainn Hanks agus Earle (Sigma-Aldrich) le 10 faoin gcéad FBS. Cuireadh na línte cille crochta go léir in oiriúint chun fás i meán Cellvento™ BHK200 (Merck KGaA) seachas líne cille #2, a saothraíodh mar a thuairiscítear thuas.

Rinneadh tomhais ar dhlús agus inmharthanacht na gceall ag baint úsáide as trypan blue (Bio-Rad, Hercules, CA, SAM) agus cuntar cille uathoibríoch (samhail TC20, Bio-Rad).

2.2 Anailís cuar fáis ar chealla fionraí

Rinneadh anailísí cuar fáis mar thurgnaimh bhaisc, a rinneadh i ndúblaigh, dhá uair ina n-aonar, le dlús síolaithe de 0.6 × 106 cealla/mL. Rinneadh dlús cille inmharthana (VCD) agus inmharthanacht i faoin gcéad a thomhas go laethúil suas le sé lá tar éis ionaclaithe cille.

Rinneadh na ríomhanna cille-shonracha de réir na gcothromóidí a thug [14]:

X: VCD (in aghaidh an mL); t: pointí ama samplála (uair an chloig); n agus n-1: dhá phointe samplála as a chéile.

Uimhir Rannán Cille (cd):

2.3 Cíteiméadracht sreafa

Rinneadh anailísí cíteaiméadracha sreafa ag baint úsáide as an uirlis cíteiméadrachta sreafa FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, UK). Leagadh amach smionagar cille bunaithe ar na patrúin scaipthe chun tosaigh agus taobh. Maidir le staining actin, rinneadh an déine fluaraiseachta airmheánach sa chainéal Alexa 488 a thomhas go díreach. I gcás gach stains antasubstainte, socraíodh an céatadán de chealla Alexa 488 nó PE-dearfach le geata eatramh a socraíodh a theorainn níos ísle bunaithe ar rialú isitíopa. Rinneadh na turgnaimh go léir trí huaire go neamhspleách.

2.3.1 Smáil antasubstainte ar ghabhdóirí dromchla cealla.

dromchla. D'fheidhmigh cealla MDBK mar rialú dearfach do léiriú cealla v 3, IB-RS-2 mar rialú dearfach do léiriú v 8, agus d'fheidhmigh cealla CHO-K1 mar rialú dearfach do léiriú HS . Ní chuireann cealla CHO677 in iúl aon cheann de na integrins a tástáladh ná HS agus mar sin bhí siad mar rialú diúltach i ngach turgnamh. Úsáideadh na hantasubstaintí seo a leanas: le haghaidh v 3, clón comhchuingeach PE LM609 (caolú 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); le haghaidh v 8, antashubstaint phríomhúil 11E8, clón 68, luch IgG2a (caolú 1:100) (ar fáil go cineálta ag an Dr StephenNishimura) le frith-luch gabhar antashubstainte tánaisteach IgG2a (caolú 1:1000) comhchuingeach le Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ); le haghaidh HS, clón 10E4, luch IgM (caolú 1:200)(Amsbio, Abingdon, RA) le gabhar tánaisteach frith-luiche IgM mu slabhra (caolú 1:2000) comhchuingeach le Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Cambridge, RA) . Níor úsáideadh ach antashubstaint phríomhúil amháin i ngach turgnamh.

Nitear cealla fionraí le saline maolánach fosfáit (PBS). Scaradh cealla greamaitheacha ag baint úsáide as 10 mM EDTA i PBS agus ansin nite le PBS. Tar éis níocháin, rinneadh cealla a scagadh trí strainer cille (mogalra níolóin, trastomhas pore 70 μm, VWR, Radnor, SAM) chun cnuasacha cille a bhaint agus rinneadh iad a choigeartú go 1 × 106 cealla / ml roimh 1 μL de BEO/ Cuireadh stain cille marbh DEAD FixableViolet (Thermo Fisher Scientific) le fionraí cille 1 ml ar feadh 30 nóiméad. Rinneadh an chéim seo agus na céimeanna seo a leanas a chosaint ó sholas agus ag 4 ˚C. Goradh an príomh-antasubstaint ar feadh 30 nóiméad agus goradh an antashubstaint thánaisteach ar feadh 20-30 nóiméad. Rinneadh céim níocháin le maolán 2 mL FACS (PBS, 0.1 faoin gcéad azide sóidiam, 0.1 faoin gcéad BSA) agus lártheifneoiriú ag 300 × g, 5 min, 4 ˚C tar éis gach céim. Ar deireadh, athchuireadh na cealla dhaite i maolán 300 μL FACS.

2.3.2 Staining gnímh.

Rinneadh actin filiméadach a dhathú le himoibrí Phalloidin-iFluor 488(ab176753, Abcam), arna ullmhú de réir na mbileog sonraí. Scaradh BHK179, BHK-2P, agus BHK-InVcells mar a thuairiscítear thuas agus socraíodh iad le 4 faoin gcéad formaildéad ar feadh 20 nóiméad ag teocht an tseomra (RT). Níodh cealla faoi dhó le PBS agus tréscaoilteadh cealla seasta 1 × 106 le 0.1 faoin gcéad Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i PBS, agus ina dhiaidh sin goir ag RT ar feadh 3 nóiméad. Nite cealla faoi dhó le PBS (lártheifneoiriú ag 300 × g, 5 min) sular cuireadh an réiteach stoc phalloidin ullmhaithe, caolaithe 1:1000 i maolán FACS, agus gor ar feadh 20 min atRT. Ar deireadh, nite cealla faoi dhó le maolán FACS agus cuireadh ar fionraí iad i maolán FACS 300 μL. Rinneadh anailís dhíreach ar chealla dhaite le micreascóp fluaraiseachta agus úsáideadh iad le haghaidh anailíse FACS.

2.3.3 Turgnaimh aistrithe.

BHK164 agus BHK-2Aistríodh cealla P le ceachtar EGFP-N1, plasmid a léiríonn próitéin fluaraiseachta glas feabhsaithe (EGFP) (Clontech), nó i sraith eile turgnaimh le pVSV-G, plasmid a léiríonn próitéin G soithíoch. víreas stomatitis Indiana (VSV), ag baint úsáide as Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) de réir threoracha an mhonaróra. I mbeagán focal, rinneadh 2 ug de DNA plasmid agus 1.875 μL nó 3.75 μLof lipofectamine caolaithe i meán Cellvento ™ BHK200 a mheascadh agus a ghoradh ag RT ar feadh 20 nóiméad chun foirmiú casta a cheadú. Ina dhiaidh sin, aistríodh na meascáin seo go cealla i12-plátaí tobair (thart ar 4×105 cealla/mL) agus cuireadh an meán suas go dtí 200 μL. Goradh na cealla ag 37 ˚C ar feadh 24 h.

Le haghaidh anailíse FACS, baineadh ábhar iomlán na dtoibreacha tar éis 24 h. Rinneadh na cealla aistrithe pEGFP a ní trí huaire le PBS agus cuireadh ar fionraí iad i maolán 300 μL FACS. Rinneadh dúblach amháin de chealla aistrithe pVSV-G a thréscaoilteacht le PBS le 0.1 faoin gcéad (v/v) TritonX-100 ar feadh 5 nóiméad ag RT roimh staining antashubstainte, agus d'fhan an ceann eile neamh-thréscaoilteach. Rinneadh staining antashubstainte mar a thuairiscítear thuas le serum coinín polaclónach VSV 274/E (caolú 1:500, arna sholáthar go cineálta ag an Dr. Stefan Finke) agus frith-choineachán gabhar antashubstainte tánaisteach (H móide L) comhchuingeach le Alexa Fluor 488 (caolú 1: 1000; Thermo Fisher Scientific).

2.4 Anailís staidrimh

Rinneadh anailís ar na sonraí agus úsáid á baint as leagan GraphPad Prism 0 7.04 do Windows (GraphPad Software, La Jolla, USA). Rinneadh gnáth-anailís aontreo ar athraitheacht leis an iar-theo Tukey chun difríochtaí idir grúpaí cóireála a mheas. Socraíodh an tairseach le haghaidh suntas staidrimh ag p-luach 0.001.

2.5 Anailís thrascríofa

2.5.1 Astarraingt RNA, ullmhú leabharlainne, agus seicheamhú.

Baineadh úsáid as trí bhaisc neamhspleácha de gach ceann de na línte cille BHK179 greamaitheacha agus na línte cille fionraí BHK-2P agus BHK-InV le haghaidh anailíse tras-scríbhinne. Ar an meán, cuireadh cealla 8.3×105 BHK179, 1.6×107 BHK-2Pcells, agus 1.4×107 BHK-InV cealla in TRIzol Imoibrí (Thermo Fisher Scientific). Tar éis 0.2 toirte trichloromethane a chur leis an lysate cille, gor agus lártheifneoiriú, bailíodh an chéim uiscí agus measctha le toirt amháin de 100 faoin gcéad eatánól. As seo, baineadh RNA iomlán ag baint úsáide as an RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, an Ghearmáin) le díleá DNase ar-cholún leis an RNase-Free DNase Set (Qiagen) de réir treoracha na monaróirí. Cuireadh an ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) leis agus úsáideadh é mar rialú inmheánach do gach céim a leanas. Ansin, rinneadh mRNA il-adeinylated a leithlisiú ó 1-3 ug de RNA iomlán ardcháilíochta ag baint úsáide as trealamh Micrimhilseogra DIRECT mRNA Dynabeads (ThermoFisher Scientific). Rinneadh an mRNA a ilroinnt ina dhiaidh sin agus úsáideadh é le haghaidh sintéise cDNA agus ullmhú leabharlainne ag baint úsáide as Kit Prep Sample Prep mRNA LT TruSeq Stranded (Illumina, San Diego, SAM) de réir threoracha an mhonaróra. Rinneadh seicheamhú ag an Heinrich-Pette-Institut, Hamburg, ag baint úsáide as trealamh NextSeq 500 (2x75 bp) agus HiSeq 4000 (1x50 bp) (Illumina).

2.5.2 Anailís staitistiúil ar shloinneadh géine difreálach.

Rinneadh seiceáil cáilíochta ar na léamha amh ó gach leabharlann seicheamhaithe ag baint úsáide as FastQC (leagan {{0}}.11.9; Babraham Institute, Cambridge, UK) le béim ar dháileadh fad léite agus éilliú oiriúntóra roimh agus tar éis an oiriúnaitheora scamhadh ag baint úsáide as Trim Galore (leagan 0.6.4_dev, Institiúid Babraham) agus Cutadapt (leagan 2.10) [15]. Agus Bradán [16] á n-úsáid agat, rinneadh na léananna bearrtha amh a shamhailléarscáil ansin chuig géanóm hamstar órga na Siria.

Go hachomair, fuarthas na tagairtí géanómaíochta agus tras-scríbhinne de GCF{{{{0}}.1_MesAur1.0 ón Lárionad Náisiúnta um Fhaisnéis Biteicneolaíochta (NCBI) agus comhcheangailte le seichimh thagartha de spike- ERCC i rialuithe. Tógadh innéacs tras-sgrìobhaidh feasach ar mheabhlaireacht [17] chun ailíniú roghnach le Bradán a cheadú. Chun cainníochtú a dhéanamh, úsáideadh deich macasamhail de strapa tosaithe agus cumasaíodh cúiteamh do laofachtaí seicheamh-shonracha, laofachtaí GC, agus laofacht suímh 5′ nó 3′.

Ina dhiaidh sin, rinneadh comhghaolú idir na sonraí cainníochtaithe do rialuithe spike-in ERCC agus a dtiúchan teoiriciúil, chun fadhbanna a bhrath le linn ullmhú samplaí.

Ina theannta sin, rinneadh na sonraí cainníochtaithe a bhaineann go sonrach le géine a scagadh ar dtús (ach géinte atá le feiceáil i níos mó ná macasamhlú amháin le níos mó ná 15 chomhaireamh), normalaithe ag baint úsáide as trasfhoirmiú loga rialta (rlog), agus úsáideadh iad le haghaidh anailíse sonraí taiscéalaíoch, m.sh. le PCA. Aithníodh géinte léirithe go difreálach agus ina dhiaidh sin úsáideadh iad le haghaidh anailíse cosáin ag baint úsáide as DESeq2 [18]. Rinneadh anailís ar na sonraí slonn le haghaidh géinte atá léirithe go suntasach difreálach idir na péirí líne cille BHK-2P agus BHK179, BHK-InV agus BHK-2P, agus BHK-InV agus BHK179. Ina dhiaidh sin, coigeartaíodh an t-athrú fillte logartamach dénártha (log2) mar thoradh air trí úsáid a bhaint as feidhmeanna "lfcShrink" agus "apglm" in DESeq2 chun comhaireamh léite íseal nó athraitheach a d'fhéadfadh rómheastachán athraithis a bheith mar thoradh air [19].

Socraíodh na critéir le haghaidh géine atá léirithe go suntasach difriúil go dtí uasluach coigeartaithe de {{0}}.05 agus íosluach absalóideach an loga laghdaithe 2 athrú fillte de 1. Pathway agus Na critéir socraíodh le haghaidh géine a léiríodh go suntasach difriúil go huasluach coigeartaithe de 0.05 agus íosluach absalóideach an athraithe fillte log2 shrunk de 1. Rinneadh anailís cosáin agus saibhrithe ag baint úsáide as an bhfeidhm "saibhrithe" sa phróifíl bhraisle (leagan 3.16.0).

is féidir le cistanche duáin a chothú agus feidhm na duáin a fheabhsú

3. Torthaí

3.1 Tá so-ghabhálacht líne cille do FMDV neamhspleách ar a ráta fáis aonair agus uimhir rannáin na gceall

Rinneadh turgnaimh bhaisc le naoi línte cille fionraí éagsúla BHK thar thréimhse sé lá agus rinneadh dlús cille inmharthana (VCD) agus inmharthanacht a thomhas go laethúil. Bunaithe ar bhreathnuithe roimhe seo go raibh difríocht idir na línte cille ó thaobh a so-ghabhálacht maidir le séiritíopa FMDV Asia{{{0}} [12], scrúdaíodh an bhfuil meitibileacht cheallacha ardaithe agus ráta fáis nasctha le claonadh laghdaithe d’ionfhabhtú leis seo. víreas (Tábla 1). Tá dhá cheann de na trí línte cille fionraí BHK so-ghabhálach ag fás go mall cealla le líon beag rannán cille (cd) de 0.60 (#3) agus 0.70 (#9), agus tá an tríú líne cille so-ghabhálach (#8) ag an ráta fáis is airde agus cd (μ=0.035, cd=1.62) i measc na línte cille go léir a tástáladh.

Ní raibh aon tionchar ag tarraingt siar serum agus oiriúnú don fhás in ACFM ar an so-ghabhálacht do FMDV inár sraith de línte cille scrúdaithe. Is é líne cille #2 an réamhtheachtaí atá ag fás go mall, ag brath ar shéiream, ar línte cille P BHK, arna chothabháil i bhfionraí le GMEM le séiream bó féatais. Le linn oiriúnú d'fhás i ACFM, roghnaíodh na cealla le haghaidh VCD ard, atá nasctha le ráta ard fáis agus cd. Cosúil leis an bpríomhlíne chealla BHK-2P a úsáideadh don staidéar, díorthaítear línte cille #4 agus #5 ó chilllíne #2 freisin ach tá difríocht idir iad sa mhodh oiriúnaithe do ACFM. Léirigh na línte cille P BHK go léir a coinníodh in ACFM próifíl fáis an-chosúil. Níor bhain aon cheann de na ceallalínte seo le hoiriúnú do ACFM go raibh an bhunlíne #2 frithsheasmhach cheana féin toisc go raibh an bhunlíne #2 frithsheasmhach in aghaidh na so-ghabhálacht maidir le séiritíopa FMDV Asia. Mar an gcéanna, níor chonacthas aon athrú ar an so-ghabhálacht do líne cille fionraí #3. Agus iad ag fás go cloí (cf. líne cille #1 i [12]), bhí na cealla so-ghabhálach do FMDV Asia-1 agus choinnigh siad an tréith seo le linn oiriúnú d'fhás ar fhionraí. Ag an am céanna, ní bhfuair siad próifíl fáis tapa cealla fionraí eile.

3.2 Cuireann cealla fionraí níos lú gabhdóirí príomhúla i láthair ach tá níos mó gabhdóirí tánaisteacha do FMDV ar a ndromchla ná cealla BHK greamaitheacha

Is é an chéad chéim chun víreas a ionfhabhtú le cill ná an cáithnín víreasach a cheangal le móilíní gabhdóra ar dhromchla na cille. Chun anailís a dhéanamh ar na difríochtaí idir cealla BHK atá ag fás go cloíte agus cealla BHK i bhfionraí, rinneadh tástáil ar antasubstaintí chuig gabhdóirí ceallacha a bhfuil baint acu leis an idirghníomhaíocht maitrís eischeallach agus ar eol go bhfuil ról tábhachtach acu in ionfhabhtú FMDV. Scrúdaíodh Integrins v 3 agus v 8 mar ghabhdóirí cille ionadaíocha a aithníonn móitíf ceangailteach RGD (Arg-Gly-Asp) agus a idirghníomhaíonn le comhpháirteanna serum agus an maitrís extracellular ach a úsáideann FMDV freisin mar a phríomhghabhdóirí nádúrtha. Níor léirigh ceachtar de na línte cille crochta a tástáladh (BHK-InV agus BHK-2P) integrin v 3 nó v 8 ar dhromchla na cille. Cé nach raibh an difríocht idir BHK greamaitheachta agus fionraí BHK suntasach do integrin v 8 (Fíor 1b), léirigh céatadán i bhfad níos airde de BHK179 cloíte integrin v 3 i gcomparáid leis na línte cille fionraí BHK-InV agus BHK-2P ( Fíor 1a).

Cuireadh méideanna arda HS i láthair ar dhromchla an dá líne cille fionraí. Bhí an léiriú ar HS an-éagsúil idir na cultúir mhacasamhlaithe de chealla cloíte BHK179. I gcomparáid leis na línte cille fionraí, bhí níos lú cealla i gcultúir BHK179 HS-dearfach, cé nach raibh an difríocht suntasach ag an leibhéal tábhachta réamhshocraithe (Fíor 2).

Nocht anailís stainse agus micreascópach difríochtaí móra i socrú an chiteoscéail actin idir cealla greamaitheacha agus fionraí (Fíor 3). Déantar na filiméid actin i gcealla greamaitheacha BHK179 a dháileadh go haonfhoirmeach ar an gcill iomlán i bpatrún mín reticular (Fíor 3a), ach bhí staining idirleata aictin (Fíor 3b) ar chealla a d'fhás i bhfionraí. Is díol spéise é go raibh an chainníocht actin filiméadach difriúil idir na línte cille fionraí BHK-InV agus BHK-2P. Bhí an déine fluaraiseachta airmheánach (MFI) tar éis staining phalloidin i bhfad níos airde i gcealla BHK-InV i gcomparáid le BHK-2P, rud a léiríonn cion actin filiméadach níos airde sna cealla seo (Fíor 3c).

3.3 Tá difríocht idir na cealla fionraí ó thaobh éifeachtúlachta aistrithe ach níl siad in ann próitéiní dromchla a thaispeáint

Mar gheall ar na difríochtaí i gcomhfhoirmiú actin idir cealla greamaitheacha agus fionraí, scrúdaíodh na cealla maidir lena n-aistritheacht agus an cumas próitéiní a chur i láthair ar a ndromchla. Go ginearálta, laghdaítear an éifeachtúlacht aistrithe, arna thomhas ag léiriú EGFP, i gcealla fionraí (Fíor 4a). Agus dáileog íseal den imoibrí aistrithe á úsáid, léirigh céatadán suntasach níos airde de chealla greamaitheacha EGFP i gcomparáid leis na cealla fionraí. Nuair a úsáideadh dáileog ard imoibrí aistrithe, rinneadh céatadán níos airde de chealla fionraí a aistriú go rathúil, cé nach raibh an difríocht idir dáileoga ard agus íseal suntasach. Chun an cheist a fhreagairt an bhfuil cealla fionraí fós in ann próitéiní cosúil le gabhdóirí ceallacha a chur i láthair ar a ndromchla, aistríodh cealla le códú plasmid don phróitéin VSV G (Fíor 4b). Permebilized sraith amháin cealla roimh staining chun cuntas a thabhairt ar an bhféidearthacht go raibh an próitéin G in iúl ach nach bhfuil ar taispeáint ar an dromchla cheallacha. Ní raibh aon difríocht shuntasach sa chumas an próitéin VSV G a chur in iúl agus a chur i láthair idir cealla greamaitheacha agus fionraí, ná nuair a bhí dáileog íseal nó dáileog ard d'imoibrí aistrithe á úsáid.

3.4 Nochtann anailís transcriptome difríochtaí i léiriú na ngéinte a bhaineann leis an maitrís extracellular idir cealla fionraí

Rinneadh anailís tras-traipéiseach chun tuilleadh imscrúdaithe a dhéanamh ar na difríochtaí idir cealla BHK atá ag fás go cloíte agus cealla BHK i bhfionraí agus chun a shoiléiriú cén fáth a bhfuil difríocht idir cealla crochta maidir lena so-ghabhálacht do FMDV. Líne chealla BHK cloíte (BHK179) saothraithe i MEM arna fhorlíonadh le FBS chomh maith le líne cille atá ag fás go tapa FMDV-so-ghabhálach (BHK-InV) agus ag fás go tapa líne ceall resistant (BHK-2P), araon oiriúnaithe do ACFM, roghnaíodh don anailís.

Le hanailís príomh-chomhpháirte (PCA) leagadh béim ar an dlúthghaol idir macasamhlacha bitheolaíocha na línte cille aonair (Fíor 5a). Tá gach macasamhlú den líne chill chéanna suite go dlúth le chéile sa phlota gan mórán comhartha ar éifeachtaí baisc-go-bhaisc. Léiríodh an chéad phríomh-chomhpháirt (arb ionann é agus 81 faoin gcéad den éagsúlacht sa tacar sonraí normalaithe) mar an difríocht tras-scríbhinne idir cealla ag fás i bhfionraí agus cealla ag fás i gcomhlíonadh, agus b’ionann an dara príomh-chomhpháirt (15 faoin gcéad den athraithis) don difríocht idir an línte cille crochta BHK-2P agus BHK-InV, b’fhéidir go mbaineann siad le so-ghabhálacht d’ionfhabhtú FMDV. Le chéile, bhí an chéad dá phríomh-chomhpháirt in ann 96 faoin gcéad den éagsúlacht a fuarthas laistigh den tacar sonraí a mhíniú, rud a léiríonn gur aithin an anailís transcriptome difríochtaí ábhartha idir na trí líne chill.

Fuarthas an líon is lú géinte sainráite go difreálach nuair a dhéantar comparáid idir BHK-InV agus BHK-2P (590 uas-rialaithe; 304 síos-rialaithe). Chonacthas uimhreacha cosúla sa chomparáid idir BHK-2P nó BHK-InV ina n-aonar le BHK179 (uasrialáil 1527 agus 1519; 1308 agus 943 anuasrialaithe, faoi seach) (Fíor 5b). Nuair a cuireadh an dá líne cille fionraí (BHK-InV agus BHK-2P) le chéile agus i gcomparáid leis an gcilllíne BHK179 cloíte, cuireadh géinte 1814 in iúl go difreálach. Cé go gcuirtear 411 géin in iúl go heisiach go héagsúil nuair a dhéantar comparáid idir BHK179 agus BHK-InV, cuirtear beagnach dhá oiread (701 géinte) in iúl go heisiach idir BHK179 agus BHK-2P. Idir an dá líne cille fionraí, níor léiríodh ach 104 géine go heisiach go difriúil.

Nuair a dhéantar comparáid idir an tacar de ghéinte léirithe go difreálach de na línte cille BHK179-so-ghabhálach FMDV BHK179 agus BHK-InV leis an líne cille FMDV-resistant BHK-2P, fuarthas amach go raibh fo-thacar de 553 géinte in iúl go difriúil sa dá chomparáid ( Fíor 5c). Toisc go bhféadfadh baint a bheith ag na géinte seo le so-ghabhálacht FMDV, rinneadh anailís saibhrithe téarma GO agus tugadh le fios go bhfuil baint ag go leor de na géinte seo le comhpháirteanna ceallacha na maitrís eischeallach (ECM), seicní cille, agus acomhail cille-chealla (Fíor 5d). .

Ós rud é gur thugamar faoi deara difríochtaí idir na línte cille a bhaineann le hidirghníomhaíochtaí ECM, rinneadh athanailís ar an transcriptome le fócas ar léiriú integrins v 1, v 3, v 6, v 8, chomh maith le actin, go léir a d'fhéadfadh a bheith ábhartha maidir le so-ghabhálacht i leith ionfhabhtú FMDV. (Fíor 5e). Cé is moite d’ACTA2, ní raibh aon difríocht shuntasach i léiriú na ngéinte a bhaineann le actin idir cealla BHK-InV agus BHK-2P ag an leibhéal mRNA. Bhí an comhaireamh géine normalaithe do gach géinte a bhain le haicsean i bhfad níos airde sa líne chillín ghreamaitheach BHK179 ná sna línte cille fionraí (S1 Fíor).

Léirigh na trí chilllíne go léir méideanna comhchosúla de thrascríbhinní ITGAV, códaithe le haghaidh fo-aonad integrin v ach léirigh siad slonn difreálach do na fo-aonaid integrin. Go mion, léirigh na línte cille fionraí BHK-2P agus BHK-InV i bhfad níos lú ITGB1, ITGB3, agus ITGB6 i gcomparáid leis an líne cille cloí BHK179. Léiríodh ITGB3 agus ITGB8 go suntasach difriúil idir na línte cille fionraí BHK-2P agus BHK-InV. Rud suimiúil, ba é ITGB8 an t-aon ghéin códaithe fo-aonad integrin a bhí ró-bhrúite go mór i gcilllínte so-ghabhálach FMDV BHK179 agus BHK-InV i gcomparáid leis an líne cille BHK-resistant FMDV-2P (Fíor 5e).

is féidir le cistanche duáin a chothú agus feidhm na duáin a fheabhsú

4. Plé

Is próiseas ama de réir a chéile é oiriúnú na gceall chun fás i bhfionraí agus i meáin saor ó shéiream, ach is gá sa bhiteicneolaíocht chun línte cille ard-táirgeachta a ghiniúint a úsáidtear chun antasubstaintí, antaiginí vacsaínithe, nó próitéiní eile a tháirgeadh [1, 8 ]. Go deimhin, tá an próiseas seo i gcónaí lán leis an mbaol go bhfaighidh cealla airíonna neamh-inmhianaithe i gcomparáid leis an ábhar cille bunaidh [7]. I gcás táirgeadh antaiginí vacsaíne, tá an-tábhacht ag baint le so-ghabhálacht na líne cille don sprioc-víreas. Maidir le víreas an ghalair crúibe is béil (FMDV), is feiniméan aitheanta é go bhfuil línte cille BHK áirithe frithsheasmhach in aghaidh ionfhabhtaithe nó go gcaillfidh siad a so-ghabhálacht le linn foshaothrú arís agus arís eile [20–22]. Ina theannta sin, is féidir airíonna antaigineacha an víris a bheith athraitheach ag brath ar chill an óstaigh [9].

Fásann cealla fionraí go neamhspleách ar dhromchla agus tá siad gafa ag meáin chothaitheacha atá saibhir i ocsaigin, rud a ligeann dóibh fás go tapa. Is gné riachtanach é iolrú tapa na gceall chun an cultúr a mhéadú go méideanna móra go héasca agus i mbeagán ama. Is gá serum a bhaint as an meán chun costais a laghdú, an baol éillithe agus chun próisis íosscála a shimpliú [23, 24].

Bhí sé mar aidhm ag anailís fáis bhaisc ar línte cille fionraí éagsúla BHK a chinneadh an bhfuil an roghnú i dtreo daonra cille atá ag fás go tapa i gcoinníollacha saor ó shéiream díobhálach d'iomadú FMDV. Déanta na fírinne, d'fhás dhá cheann de na trí chilllíne so-ghabhálach go mall ach fuarthas amach go raibh a n-oirghabháil i leith FMDV neamhspleách ar a meitibileacht fáis. Is dóichí go bhfuil so-ghabhálacht FMDV caillte (nó coinnithe) cheana féin le linn an oiriúnú tosaigh d'fhás ar fhionraí. Mar thoradh ar scaradh na gcealla ón dromchla agus ag tarraingt siar serum sna céimeanna seo a leanas d'oiriúnú d'fhás fionraí tá athruithe ar leibhéal léirithe na próitéiní agus na próitéiní dromchla a bhfuil baint acu leis an gcíteoscnámhar [7].

Is teaghlach tábhachtach de ghabhdóirí dromchla cille iad Integrins atá comhtháite isteach sa chillscannán agus a mheánaíonn comharthaíocht cille go cille chomh maith le nasc láidir idir an chill agus an dromchla trí chomhpháirteanna maitrís extracellular (ECM) a cheangal [10, 25 ]. Braitheann rialáil timthriall cille, eagrú an cíteischnámharlaigh, agus traslonnú móilíní receptor nascent chuig an membrane cille ar integrins [25]. I gcás go leor integrins, déantar nascadh an ECM, chomh maith le ceangailteach na ligands a sholáthraítear do na cealla trí serum a chur leis an meán cultúir, a idirghabháil ag móitíf RGD [6, 25] agus is dócha go n-athróidh sé nuair a bheidh an lasca cille ó cloí le fás fionraí. Úsáideann FMDV aitheantas an mhóitíf RGD ag integrins freisin chun endocytosis receptor-mediated den cháithnín víreas a thionscnamh [26]. Tá an móitíf RGD i VP1 de FMDV caomhnaithe go mór [27], agus is gabhdóirí aitheanta iad na integrins v 1, v 3, v 6, agus v 8 a úsáideann FMDV in vivo agus in vitro [28-31]. Toisc go bhféadfadh na difríochtaí amhrasta i proteome dromchla cille idir cealla greamaitheacha agus fionraí a bheith ríthábhachtach freisin do na difríochtaí i so-ghabhálacht d’ionfhabhtú FMDV, baineadh úsáid as antasubstaintí atá ceangailteach don integrin v 3 agus v 8 chun líne cille BHK greamaitheach a stainiú chomh maith le a so-ghabhálach agus líne cille BHK fionraí frithsheasmhach. Níor rinneadh staining v 6 toisc go bhfuil sé léirithe roimhe seo nach gcuirtear an integrin seo in iúl ar dhromchla cealla BHK [32], cé go bhfuil ITGB6 mRNA inbhraite. Ar an gcaoi chéanna, in ainneoin an ardleibhéil de léiriú mRNA ITGB8 a bhraitear i gcealla BHK179 agus BHK-InV, ní cosúil go gcuirtear v 8 integrin i láthair ar dhromchla cealla BHK i gcoitinne. Fuarthas Integrin v 3 go mion ar an líne cille greamaitheacha, ach ní ar na línte cille fionraí.

Seachas integrins, is féidir ceangailteach ligand, imeachtaí inmheánaithe, agus comharthaíocht intracellular a idirghabháil le proteoglycans sulfáit heparan (HS) [33] agus is minic a breathnaítear sealbhú HS mar receptor tánaisteach tar éis pasáiste arís agus arís eile de FMDV sa chultúr [34]. Léirigh staining antashubstainte ar leith go raibh flúirseach HS ar an dá líne cille fionraí agus go pointe níos lú freisin ar na cealla BHK greamaitheacha. Is eol go ndéanann sócháin sa ghéanóim FMDV, as a dtagann athruithe ar na próitéiní capsid víreasacha chun úsáid HS a úsáid mar ghabhdóir, an víreas a mhaolú san ósta nádúrtha [35]. Mar sin d’fhéadfadh infhaighteacht HS a bheith ina fhachtóir ríthábhachtach d’antaigin athraithe neamhspleáchas FMDV na líne cille a bhfuil an víreas oiriúnaithe dó.

Toisc go bhfuil baint ag díorma ceallacha le hathruithe sa mheicníocht conarthach actin-myosin [7] agus go mbíonn ceanglais dhifriúla marthanais ag baint le saothrú cealla i bhfionraí, m.sh. friotaíocht in aghaidh ard-strus lomadh mar gheall ar chorraíl an tsreabháin chultúir [6], tá an creatlach actin curtha. suim mhór sa staidéar seo. Nocht anailís mhicreascópach athshocrú comhfhoirmiúil ar an gcíteischnámharlach ó dháileadh reticular i gcealla fáis greamaitheacha go struchtúr dlúth sféarúil i gcoinníollacha fionraíochta. D'fhéadfadh gur meicníocht coigeartaithe é seo don ardstrus lomadh thuasluaite agus is eol freisin go dtarlaíonn sé i gcealla CHO faoi na coinníollacha céanna [6]. Ach is fiú a thabhairt faoi deara freisin, cé nach raibh aon difríocht shuntasach i léiriú an chuid is mó de ghéinte actin idir cealla BHK-InV agus BHK-2P ag an leibhéal mRNA, braitheadh ​​i bhfad níos mó próitéin filiméadach actin sa BHK so-ghabhálach FMDV. -InV ná an BHK atá frithsheasmhach in FMDV-2P. D'fhéadfadh sé seo a bheith nasctha le rátaí éagsúla polaiméirithe actin globular isteach i actin filamentous.

Ar a laghad i gcealla greamaitheacha, braitheann iontráil FMDV ar dhinimic actin. Cothaíonn iontráil víreasach ruffles actin agus tá cur síos ar chur isteach ar an ngréasán filiméid actin trí actin filiméadach a thiontú go actin globular ag céim luath an ionfhabhtaithe [36-38]. Ag breithiúnas ón éifeacht cíteapatach (CPE) a fheictear i gcealla BHK greamaitheacha nuair a bhíonn ionfhabhtaithe le FMDV téann an cítea-chnámharlach trí athshocruithe dian i go leor dá chomhpháirteanna [38]. Ní fheictear CPE den sórt sin i gcealla crochta mar gheall ar a gcruth sféarúil cheana féin ach d’fhéadfadh go mbeadh buntáiste éigin ag baint leis an víreas ardaithe mar gheall ar an gcion aictin ardaithe. De bharr na ndifríochtaí sa cítea-chnámharlach actin, rinneadh turgnaimh aistrithe chun an éifeachtúlacht aistrithe idir fionraí agus BHK greamaitheacha a chur i gcomparáid agus chun a fháil amach an gcuireann cíteascóp dlúth na gcealla fionraí bac ar chur i láthair próitéiní ar an dromchla ceallacha. Is é an t-eolas coitianta go bhfuil sé an-deacair línte cille fionraí a aistriú, rud a tharlaíonn mar gheall ar cheangal laghdaithe an choimpléasc aistrithe chuig an membrane cille agus ina dhiaidh sin laghdaíodh glacadh pálasta DNA [39]. Deimhníodh é seo freisin ag ár dturgnaimh. Ach cé gur laghdaíodh an éifeachtúlacht aistrithe i gcealla BHK-2P i gcomparáid leis an líne chealla BHK cloíte, ní raibh aon difríocht ann maidir leis an gcumas an próitéin VSV G aistrithe a thaispeáint ar an dromchla ceallacha. Breathnaíodh difríocht i gcéatadán na gceall daite idir na plasmidí slonn pEGFP-N1 agus pVSV-G i gcealla BHK-2P. Ní dhearnadh tuilleadh imscrúduithe air seo, ach d’fhéadfadh teorainn dhifriúil braite a bheith mar chúis leis idir an staining imdhíonfluaraiseach a úsáidtear chun VSV-G a shamhlú agus fluaraiseacht dúchasach EGFP.

Ar deireadh, rinneadh anailís tras-sgrìobhaidh chun tuilleadh faisnéise a thabhairt faoi na difríochtaí tras-trascríobhacha idir cealla BHK greamaitheacha agus fionraí ar thaobh amháin agus idir línte cille BHK so-ghabhálach FMDV agus FMDV-resistant ar an láimh eile. Tá ár dtorthaí ag teacht le staidéir eile ar athruithe tras-trascríobhacha i gcealla CHO, MDCK, nó HEK le linn an athraithe ó fhás greamaitheach go fionraí. Go ginearálta, baineann an chuid is mó de na hathruithe le struchtúr cítea-chnámharlaigh, meitibileacht cheallacha, agus idirghníomhaíochtaí comhpháirteanna ECM agus déantar iad a rialáil le haghaidh cealla fionraí [7, 40, 41]. Is ionadh é, léirigh an chill chrochta FMDV-resistant BHK-2P íosrialáil na dtacar géine seo, rud a d'fhéadfadh na leibhéil laghdaithe actin i BHK a mhíniú freisin i gcomparáid leis na cealla BHK-InV. Léirigh anailís shonrach ar shloinneadh fo-aonad integrin leibhéil chomhchosúla de thrascríbhinní fo-aonad V integrin i ngach ceann de na trí chilllíne. Fuarthas an abairt is airde i ngach línte cille don fho-aonad integrin 1. Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara gur féidir le integrin 1 heterodimers a fhoirmiú le deich slabhraí éagsúla agus go bhfuil sé in iúl go bunúsach ag formhór na gcealla mamaigh [6, 42]. Mar an gcéanna, tá an subunit V in ann heterodimer a fhoirmiú le cúig slabhraí éagsúla, ach ní chuirtear 6 agus 8 i láthair ach ar dhromchla na cille i gcomhcheangal le V [42]. Léirítear é seo go cruinn ag an iliomad athscríbhinní a breathnaíodh ar na fo-aonaid integrin aonair. Tá comhghaol maith freisin idir an trascríobh ardaithe de 3 i gcealla greamaitheacha agus an comhartha níos airde do integrin v 3 sna turgnaimh staining antasubstainte. Ar an láimh eile, níor léiríodh na difríochtaí breathnaithe i leibhéil mRNA ITGB3 agus ITGB8 idir BHK-2P agus BHK-InV sa staining dromchla. Ní raibh muid in ann a réiteach cibé an raibh sé seo ach mar gheall ar íogaireacht neamhionanna a chur idir an mRNA agus modhanna cainníochtaithe próitéine nó táscach de bhloc iar-trascríobh de léiriú próitéine nó cur i láthair dromchla [43]. Tríd is tríd, léirigh na línte cille fionraí BHK{-2P agus BHK-InV go suntasach níos lú ITGB1, ITGB3, agus ITGB6 mRNA i gcomparáid leis an líne cille cloíte.

5. ConclúidíIn

Mar fhocal scoir, tá sé ríthábhachtach in ullmhú na gcealla fionraí úsáid a bhaint as clón cille tuismitheora a bhfuil tréithe aitheanta go maith aige agus an daonra cille dá bharr a scagadh go cúramach le linn an phróisis oiriúnaithe chun a chinntiú go gcoimeádann an líne cille gnéithe riachtanacha, sa chás seo. , an claonadh i leith FMDV. Ina theannta sin, ba cheart modhanna nua-aimseartha amhail anailís FACS agus trascríobhómaíocht a úsáid chun línte táirgeachta cille a thréithriú tuilleadh.

is féidir le cistanche duáin a chothú agus feidhm na duáin a fheabhsú

Buíochas

Gabhaimid buíochas le Patrick Zitzow as a thacaíocht theicniúil den scoth.

Ranníocaíochtaí Údair

Coincheapú:Veronika Dill, Michael Eschbaumer.

Anailís fhoirmiúil:Veronika Dill, Florian Pfaff.

Maoiniú a fháil:Aline Zimmer, Martin Beoir.

Imscrúdú:Veronika Dill.

Modheolaíocht:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Riarachán tionscadail:Martin Beer.Acmhainní: Aline Zimmer.

Maoirseacht:Michael Eschbaumer.

Amharcléiriú:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Scríobh – dréacht bunaidh:Veronika Dill.

Scríobh – léirmheas & eagarthóireacht:Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, MichaelEschbaumer.

Tagairtí

1. Merten OW. Dul chun cinn i gcultúr na gceall: spleáchas ar ancaireacht. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661): 20140040.

2. Dingermann T. Próitéiní teiripeacha athchuingeacha: ardáin táirgeachta agus dúshláin. Biteicneolaíocht J.2008; 3(1):90–7.

3. Hernandez R, Brown DT. Fás agus cothabháil cealla duáin hamster leanbh (BHK). Curr Prótacal Micrimhilseogra. 2010; Caibidil 4:Aguisín 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D, et al. Cealla BHK a tháirgeann próitéin athchuingreach a oiriúnú do mheáin serum-saor in aisce agus meán saor ó phróitéin. Cíteicneolaíocht. 1998; 26(1):59–64.

5. Guskey LE, Jenkin HM. Ceall BHK-21 a oiriúnú d’fhás i gcultúr croitheora agus dúshlán ina dhiaidh sin ag víreas einceifilíteas Seapánach. Appl Microbiol. 1975; 30(3):433–8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.433-438.1975 PMID: 1237269

6. Walther CG, Whitfield R, James DC. Tábhacht an Idirghníomhaíochta idir Integrin agus Actin Cytoskeleton i bhFionraí Oiriúnú cealla CHO. Biteicneolaíocht Appl Biochem. 2016; 178(7):1286–302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Y, Scharfenberg K, Rapp E, Reichl U. Monatóireacht a dhéanamh ar athruithe i proteome le linn oiriúnú céimseach ar líne cille MDCK ó chloí le fás ar fhionraí. Vacsaín. 2015; 33(35):4269–80.

8. Costa AR, Withers J, Rodrigues ME, McLoughlin N, Henriques M, Oliveira R, et al. Tionchar oiriúnú cille do choinníollacha serum-saor in aisce ar phróifíl glycosylation antasubstainte monaclónach arna dtáirgeadh ag cealla ubhagán hamster Síneach. N Biteicneolaíocht. 2013; 30(5):563–72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12 . 002 PMID:23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR, et al. Roghnú cille óstach de leagan antaigineach den víreas galar crúb agus béil. J Gen Viol. 1989; 70 (Pt 1): 45-57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. Idirghníomhaíochtaí Integrin-actin. Cill Mol Life Sci. 2005; 62(10):1081–99.

11. O'Donnell V, Pacheco JM, Gregg D, Baxt B. Anailís ar léiriú gabhdóra integrin víreas galar crúibe is béil i bhfíocháin ó eallach naive agus ionfhabhtaithe. J Comp Pathol. 2009; 141(2–3):98–112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beoir M, Eschbaumer M. FMDV Asia-1 a oiriúnú do Chultúr Fionraí: Sáraítear Friotaíocht Cille mar gheall ar Athruithe Capsid Víreas. Víris. 2017; 9(8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID: 28820470

13. Macpherson I, Stoker M. Claochlú Polyoma ar chlóin ceall hamstar - imscrúdú ar fhachtóirí géiniteacha a théann i bhfeidhm ar inniúlacht cille. Víreolaíocht. 1962; 16:147-51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden T, Kallel H. Próiseas saothraithe cille microcarrier chun víreas confadh a iomadú i gcealla Vero a fhástar i mbith-imoibreoir corraithe faoi choinníollacha saor ó chomhábhair ainmhíoch go hiomlán. Vacsaín. 2007; 25(19):3879–89.

15. Baineann Martin M. Cutadapt seichimh oiriúntóra as léamha seicheamhaithe ard-thréchuir. EMBnetjournal. 2011; 17:10-2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Soláthraíonn Bradán cainníochtú tapa agus feasach ar an slonn trascríobh. Modhanna Nat. 2017; 14(4):417–9.

17. Srivastava A, Malik L, Sarkar H, Zakeri M, Almodaresi F, Soneson C, et al. Bíonn tionchar ag modheolaíocht ailínithe agus mapála ar mheastachán flúirse tras-scríbhinní. Géanóim Biol. 2020; 21(1):239.

18. Love MI, Huber W, Anders S. Meastachán measartha ar fhilleadh agus ar scaipeadh sonraí RNA-seq le DESeq2. Géanóim Biol. 2014; 15(12):550.

19. Zhu A, Ibrahim JG, Grá MI. Dáiltí réamhearbaill throma le haghaidh sonraí comhairimh seichimh: an torann a bhaint agus difríochtaí móra a chaomhnú. Bithfhaisnéisíocht. 2019; 35(12):2084–92.

20. Clarke JB, Spier RE. Athrú ar an so-ghabhálacht de dhaonraí BHK agus línte cille clónáilte do thrí shraith de víreas galar crúibe is béil. Arch Virol. 1980; 63(1):1–9.