otqTeanga
Baile / Eolas / Ábhar

Eolas

Cuireann an Protease Calpain2a teorainn le díolúine dúchasach trí dhíriú ar TRAF6 in Éisc Teleost

Dec 19, 2023

Tá príomhról aistrithe comhartha ag fachtóir 6 (TRAF6) atá bainteach le gabhdóirí TNF i mbealaí comharthaíochta antibacterial agus antiviral araon. Mar sin féin, is lú tuairiscí meicníochtaí rialála TRAF6 i veirteabraigh níos ísle. Sa staidéar seo, sainaithnímid calpain2a, mar bhall den teaghlach proteases atá ag brath ar chailciam le gníomhaíocht einsímí hidrealaíoch uathúil, agus feidhmíonn sé mar phríomh-rialtóir le haghaidh imdhíonacht antibacterial agus antiviral in iasc teleost. Nuair a dhéantar lipopolysaccharide (LPS) a spreagadh, cuireann cnagadh calpain2a chun cinn an t-uasrialú de chitocíní athlastacha. Go meicniúil, idirghníomhaíonn calpain2a le TRAF6 agus laghdaíonn sé leibhéal próitéine TRAF6 trí hidrealú. Tar éis gníomhaíocht einsímeach a chailleadh, cuireann calpain2a tsóiteáin bac go hiomaíoch ar fhoirmiú dimer agus uath-uibídiú TRAF6. Cothaítear freagairt fhrithvíreasach cheallacha freisin. Cothaíonn calpain shóiteáin2a easpa gníomhaíochta hidrealáis uileláithreacht fachtóir rialála IFN (IRF) 3/7 ó TRAF6. Nuair a chuirtear le chéile iad, rangaíonn na torthaí seo calpain2a mar rialtóir diúltach ar fhreagraí imdhíonachta dúchasacha trí dhíriú ar TRAF6 in iasc teileaost.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa-feabhas a chur ar chóras imdhíonachta

Mar an chéad líne cosanta i gcoinne pataiginí ionracha, tá ról tábhachtach ag díolúine dúchasach chun an corp a chosaint ó ionradh baictéarach agus ionfhabhtuithe víreasacha. Aithníonn gabhdóirí aitheanta patrún (PRRanna) ar an scannán patrúin mhóilíneacha a bhaineann le pataiginí (PAMPanna)1–3 láithreach. Is iad na trí PRRanna is forleithne a ndéantar staidéar orthu maidir le díolúine dúchasach ná gabhdóirí cosúil le Dola (TLRanna), gabhdóirí cosúil le RIG-I (RLRanna), agus gabhdóirí cosúil le NOD (NLRanna), a aithníonn PAMPanna éagsúla agus a spreagann cascáidí comhartha chun cytokines proinflammatory a ghníomhachtú agus fachtóir frithvíreasach 4–6. Is cuid riachtanach den chomhrac i gcoinne ionradh baictéarach agus ionfhabhtuithe víreasacha é fachtóir TNF receptor-related (TRAF) 6. Mar chonair chomhartha tábhachtach arna ghníomhachtú ag lipopolysaccharide (LPS), tá cosán fachtóir trascríobh núicléach-κB (NF-κB) mapáilte go mion. Rinneadh staidéar forleathan ar an gcuid is mó de na feidhmeanna próitéine i gcosán comharthaíochta NF-κB1,7. Gníomhaíonn TLRanna fachtóir difreála myeloid 88 (MyD88) den chéad uair mar fhreagra ar LPS, agus gníomhaíonn IRAK4 mar idirghabhálaí trí IRAK1 agus IRAK2 a ghníomhachtú, a nascann MyD88 le TRAF68–11. Déanann Ubc13 agus Uev1A catalú ar uileláithreacht K63-nasctha TRAF6, a aistríonn slabhra ubiquitin K63 go TAB2 agus TAB3, as a dtiocfaidh gníomhachtú TAK112–16. Gníomhachtaíonn TRAF6-gníomhachtóir IKK 2 (TRIKA2) atá comhdhéanta de TAK1, TAB1 agus TAB2, coscaire IκB kinase (IKK) / fosfarylation17–19. Téann fachtóir trascríobh NF- κB isteach sa núicléas agus cuireann sé chun cinn táirgeadh cítocíní athlastacha20. Nuair a aithníonn TLR7/9 an víreas, tarchuireann an coimpléasc MyD{88- IRAKs-TRAF6 comharthaí chuig fachtóir rialála IFN (IRF) 7, cuireann sé uileláithreacht IRF7 chun cinn, agus gníomhaíonn sé a fosfarlú isteach sa núicléas21,22. Sa chonair chomharthaíochta RLR, gníomhaíonn RIG I agus géine 5 a bhaineann le meileanóma a bhaineann le difreáil (MDA5) próitéin chomharthaíochta frithvíreasach miteachondrial (MAVS)23,24. Gné thábhachtach de thús tarchur comhartha RLR23,25,26 is ea comhiomlánú MAVS. Is iad TRAF2/3/6 na chéad fhachtóirí a ghníomhaigh MAVS27,28. Gníomhóidh TRAF3 comharthaíocht TBK1-IRF3, agus gníomhóidh an coimpléasc MAVS-TRAF6 comharthaíocht NF-κB, a chothaíonn slonn IFN{-127,29.

Desert ginseng-Improve immunity (12)

sochair cistanche do na fir-neartú chóras imdhíonachta

Tá meicníocht mhóilíneach gníomhachtaithe TRAF6 léirithe cheana féin. Téann TRAF6 i bhfoirm dimer faoi uath-ubiquitination faoi catalysis Ubc13 agus Uev1A, a bhaineann leis an bhfearann ​​​​mhéar Ring agus fearann ​​​​mhéara ZF. Deimhníonn múnla TRAF6/Ubc13~UB an ról tábhachtach atá ag dimer TRAF6 i gcomhiomlánú agus tarchur slabhra ubiquitin K6330. Ina theannta sin, tuairiscíodh go n-earcaíonn an fhearainn Ring finger agus mhéara ZF comhchuingeacha E2~ub sa mhúnla criostail zebrafish TRAF6, agus fuarthas amach go bhféadfadh TRAF6 heitraidiméir a chruthú le TRAF5 ón teaghlach TRAF céanna den chéad uair16. Tá na próitéiní teaghlaigh dí-uibítíniúcháin: A20, CYLD, USP2a, USP4, agus USP20 ag díriú ar TRAF6 chun uileláithreacht K63-nasctha a bhaint agus comharthaíocht iartheachtach31–35 a laghdú. Déanann an córas giosta dhá-hibrideach scagadh amach ar an idirghníomhú idir UBE2O agus TRAF6 agus deimhníonn sé go mbíonn tionchar díreach ag an idirghníomhaíocht seo ar ghníomhachtú TRAF6 ag MyD8836. I bpróiseas aistrithe comhartha iartheachtach TRAF6, idirghníomhaíonn ECSIT mar phróitéin idirmheánach le TRAF6 agus TAK1 faoi seach, agus neartaíonn an idirghníomhaíocht seo an ceangal idir TRAF6 agus TAK137. I gcomharthaíocht TLR4 arna spreagadh ag LPS, cuireann PRDX cosc ​​ar TRAF6 ECSIT a earcú chun an slabhra ubiquitin K63 a sheachadadh agus cuireann sé bac freisin ar BECN1 a ghníomhaíonn TRAF6 sa chonair uathphagy38. Gníomhaíonn MST4 fosfarylation TRAF6 ag Thr463 agus Thr486 agus cuireann sé cosc ​​ar mhaolú TRAF6 agus uileláithreacht39. I mamaigh, tá staidéar déanta go forleathan ar mheicníocht rialaithe próitéin TRAF6 i díolúine antibacterial agus antiviral. Mar sin féin, is lú staidéar a dhéantar ar thaighde TRAF6 i veirteabraigh íochtair. Braitheann an freagra imdhíonachta in iasc teileaost go príomha ar bhealaí TLR agus RLR chun an fhreagairt imdhíonachta a fhorghníomhú tar éis ionfhabhtú paitigin. Dá bhrí sin, tá sé ríthábhachtach iniúchadh a dhéanamh ar mheicníocht rialála na gconairí comharthaíochta trí mheán TRAF. Is teaghlach de phróitéisí atá spleách ar chailciam é calpain2 (m-calpain), atá comhdhéanta de níos mó ná 16 bhall i mamaigh agus go leor orgánaigh eile40. Baineann an staidéar is luaithe ar an teaghlach próitéine calpain le gluaiseacht cille41. cuireann calpain imirce cille chun cinn agus fuarthas go gcuireann sé bac ar imirce neodrófail agus ar ghníomhachtú p38 MAPK agus ERK MAPK42. Tá gníomhaíocht hidrealáis ar cheann de na feidhmeanna tábhachtacha atá ag calpain. I rialáil imdhíonachta, cuireann calpain scaoileadh NF-κB chun cinn trí IkB a hidrealú agus gníomhaíonn sé an chonair chomharthaíochta43. Sa staidéar seo, chinneamar go n-idirghníomhaíonn calpain2a le TRAF6 agus go bhfeidhmíonn sé mar rialtóir diúltach ar fhreagraí antibacterial agus antiviral in iasc teleost, miiuy croaker (Miichthys miiuy). cuireann calpain2a díghrádú leibhéal próitéine TRAF6 chun cinn trína ghníomhaíocht hidrealáis. Idir an dá linn, cuireann easpa gníomhaíochta hidrealáis mutant calpain2a bac ar fhoirmiú slabhra ubiquitin K63 trí chosc a chur ar dimer TRAF6. Léirítear go gcuireann calpain2a agus calpain tsóiteáin2a deireadh le uileláithreacht TRAF6 go ECSIT/BENC1/IRF3/IRF7. Cuireann calpain2a stop le próiseas comharthaíochta NF-κB agus IFN trí dhíriú ar TRAF6. Soláthraíonn ár dtorthaí móilín chun staidéar a dhéanamh ar rialáil imdhíonachta trí mheán TRAF i veirteabraigh níos ísle.

Torthaí

idirghníomhaíonn calpain2a le TRAF6 agus rialaíonn sé comharthaíocht NF- κB go diúltach.

Chun léargais a fháil ar phróitéiní a bhaineann le TRAF i bhfreagairt imdhíonachta dúchasach in éisc theleost, rinneamar saintréith de chuid an chroaker miiuy TRAF6 idirghníomhaithe ag baint úsáide as íonú cleamhnais agus mais-speictriméadracht. Arna chur in eagar de réir déine cainníochtaithe gan lipéad (LFQ), rinneamar cuid de na sonraí a idircheapadh agus thaispeáin muid iad (Fíor 1a). I measc na bpróitéiní a bhaineann le TRAF, b’fhéidir go mbeadh gníomhaíocht rialaithe TRAF6 ag calpain2a agus go gcuirfí isteach ar bhealaí comharthaíochta idirghabhála TRAF. Ar an gcéad dul síos, ba cheart imscrúdú a dhéanamh ar an ngaol idir calpain2a agus TRAF6 ag an leibhéal próitéine, rinneamar seiceáil ar idirghníomhaíocht calpain2a le TRAF6 i línte cille duánach Miiuy Croaker (MKC). Léirigh turgnaimh communoprecipitation ingenous go n-idirghníomhaíonn calpain2a le TRAF6 (Fíor 1b, c). Mar a léirítear le haistriú neamhbhuan agus turgnaimh coimmunoprecipitation, d'idirghníomhaigh calpain2a ró-bhrúite agus TRAF6 lena chéile (Fíor 1d, e). Léiríonn siad seo go léir go n-idirghníomhaíonn calpain2a le TRAF6 agus tá gá le turgnaimh bhreise chun meicníocht a ngníomhartha a fhiosrú. Trí ailíniú iolrach de phróitéiní daonna, lucha, iasc riabhánach, agus b'fhéidir go n-éireoidh siad le próitéiní calpain2a, déantar calpain2a a chaomhnú go héabhlóideach idir iasc agus mamaigh (Fíor 1f). Chun feidhm calpain2a i ndíolúine dúchasach a chinneadh, rinneamar scrúdú an raibh baint ag calpain2a le gníomhachtú NF-κB de bharr spreagadh LPS. D'aistrigh muid cealla epithelioma papulosum cyprinid (EPC) le tuairisceoir luciferase NF-κB, tuairisceoir renilla luciferase rialaithe inmheánaigh, agus ionchódú veicteora calpain2a nó veicteoir folamh. laghdaigh calpain2a gníomhaíocht tuairisceora NF-κB go suntasach ar spreagadh LPS ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 1g). Thairis sin, tháinig laghdú suntasach ar cítocíní proinflammatory ar nós tionscnóir IL{-1 agus IL-8 a fhreagraíonn do spreagadh LPS i gcealla EPC calpain2a-overexpressed (Fíor 1h, i), ag moladh ról féideartha do calpain2a i gcomharthú athlastacha. conairí a spreagann spreagadh LPS.

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-feabhas a chur ar chóras imdhíonachta

Cliceáil anseo chun táirgí Cistanche Feabhsú Díolúine a fheiceáil

【Iarr tuilleadh】 Ríomhphost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Rialú diúltach ar chomharthaíocht NF-κB arna spreagadh ag LPS ag calpain2a.

Chun ról ionchasach calpain2a i gcomharthú NF-κB a fhiosrú, d’aistrigheamar calpain2a in MKC le grádán ama LPS agus rinneamar measúnú ar cítocíní pro-athlastacha a fhreagraíonn do LPS. Mar thoradh ar ró-eisiúint calpain2a rinneadh íosrialáil ar na slonn IL-1 , IL-8, agus IL-6 (Fíor 2a). Ina dhiaidh sin, dhearamar dhá RNA trasnaíochta beaga a bhaineann go sonrach le calpain2a (siRNAs) a laghdaíodh go héifeachtach ar calpain2a (Fíor 2b, d). D'fheabhsaigh Cnoc an Dúin caipitilin2a cítocíní pro-athlastacha LPS-spreagtha go suntasach lena n-áirítear IL-1 agus IL{-8 i línte cille stéig MKC agus Miiuy (MIC) (Fíor 2c, e). Sa ghrúpa cealla spreagtha ag LPS, d'fheabhsaigh leagadh caipitilin2a iomadú cille. Ar an gcaoi chéanna, in éagmais aon spreagadh, fuaireamar amach gur chuir laghdú caipitilin2a feabhas ar iomadú cille freisin (Fíor 2f). Chun a fháil amach ar chuir calpain2a bac ar phróitéiní i gcomharthaíocht LPS-spreagtha NF-κB, chuir calpain2a bac suntasach ar leibhéal próitéin indéine TRAF6 ach níor chuir sé MyD88, IRAK4, nó TAK1 (Fíor 2g). Go hachomair, mhol cinéitic calpain2a agus slonn cítocine pro-athlastach rannpháirtíocht fheidhmiúil calpain2a i gcomharthaíocht LPS-spreagtha NF-κB.

Fig. 1 calpain2a interacts with TRAF6 and inhibits the NF-κB Signaling Pathway. a List of TRAF6 interactome based on Label-free quantification intensity (section). b, c MKC cells seeded in 6 cm2 dishes. After 24 h, cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-TRAF6 or anti-calpain2a affinity gels. Then the immunoprecipitates and cell lysates were analyzed by IB with the anti-TRAF6 and anti-calpain2a Abs, respectively. d, e HEK 293 cells seeded in 6 cm2 dishes were transfected with the plasmids calpain2a-Flag and TRAF6-Myc (2 μg each). After 24 h, cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-Myc d or anti-Flag e affinity gels. Then the immunoprecipitates and cell lysates were analyzed by IB with the anti-Myc and anti-Flag Abs, respectively. f The same amino acids among human calpain2a (Hu-calpain2), mouse calpain2a (Mu-calpain2), zebrafish calpain2a (ZF-calpain2a) and miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) are highlighted with black background. g–I EPC cells were transfected with calpain2a-Flag or empty vector together with the NF-κB, IL-1β, and IL-8 luciferase reporters. At 24 h post-transfection, cells were untreated (Mock) or treated with LPS for 6 h. The luciferase activity value was achieved against the Renilla luciferase activity (n = 3 per group). Western blot analysis was used to measure the expression of the transiently transfected calpain2a Flag. The expression of Tubulin was used as a loading control. Data were analyzed by two-way ANOVA (g, h, i). **p < 0.01. All experiments were performed in at least three independent experiments.


Fíor 1 idirghníomhaíonn calpain2a le TRAF6 agus cuireann sé cosc ​​ar Chonair Chomharthaíochta NF-κB. a Liosta idirghníomhaithe TRAF6 bunaithe ar dhéine cainníochtaithe saor ó Lipéad (cuid). b, c cealla MKC curtha i miasa 6 cm2. Tar éis 24 h, bhí lysates cille imdhíon-réamhshocraithe (IP) le glóthacha cleamhnais frith-TRAF6 nó frith-calpain2a. Ansin rinne IB anailís ar na immunoprecipitates agus lysates cille leis an frith-TRAF6 agus frith-calpain2a ABS, faoi seach. d, e Aistríodh 293 cill HEK a síolaíodh i miasa 6 cm2 leis na plasmids calpain2a-Flag agus TRAF6-Myc (2 ug an ceann). Tar éis 24 h, rinneadh lísáití cille imdhíon-réamhshocraithe (IP) le glóthacha cleamhnais frith-Myc d nó frith-Bhratach. Ansin rinne IB anailís ar imdhíonprecipitates agus lysates cille leis na Abs frith-Myc agus frith-Bratach, faoi seach. f Tá na aimínaigéid chéanna i measc calpain2a daonna (Hu-calpain2), calpain2a luiche (Mu-calpain2), calpaí séabra iascaigh2a (ZF-calpain2a) agus miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) aibhsithe le cúlra dubh. Aistríodh cealla EPC g–I le calpain2a-Bratach nó veicteoir folamh mar aon leis na tuairisceoirí luciferase NF-κB, IL{{{-1 , agus IL-8. Ag 24 h tar éis an aistrithe, ní raibh cóireáil ar chealla (Bréagán) nó cóireáilte le LPS ar feadh 6 h. Baineadh an luach gníomhaíochta luciferase amach i gcoinne ghníomhaíocht Renilla luciferase (n=3 in aghaidh an ghrúpa). Baineadh úsáid as anailís bhloic thiar chun slonn na Bratach calpain2a a aistrítear go sealadach a thomhas. Baineadh úsáid as an abairt Tubulin mar rialú luchtaithe. Rinneadh anailís ar na sonraí ag ANOVA déthreo (g, h, i). **p < 0.01. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí thurgnamh neamhspleách ar a laghad.

Idirghníomhú calpain2a le TRAF6.

Rinneadh anailís ar an bhfearann ​​ag baint úsáide as an mBunachar Sonraí Fearainn Caomhnaithe (CDD) NCBI. Tá trí fhearann ​​i gceist le calpain2a: fearann ​​prótacail cistéin de theaghlach Calpain (CysPc) (aa 46-339), fo-aonad mór lárnach de chuid Calpain III (aa 360-499), agus fearann ​​C-críochfort Penta-EF ( aa 500-697). Chun a fháil amach cé acu fearann(í) de calpain2a a bhí ag teastáil dá idirghníomhaíocht le TRAF6, chruthaíomar trí shóiteán teasctha: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697), agus calpain (500-697). (Fíor 3a). Aistríodh cealla HEK293 le calpain2a-Bratach fiáin (WT), mutants teasctha calpain2a-Bratach, nó veicteoir TRAF6-HA. Fuaireamar amach go bhféadfadh calpain2a lánfhad agus trí shóiteán teasctha idirghníomhú le TRAF6 (Fíor 3c). Tá TRAF6 comhdhéanta d’fhearann ​​C-críochfort TRAF, fearann ​​corna corna, fearann ​​méara Sinc, agus fearann ​​méarfháinne38. Chun scrúdú a dhéanamh ar an bhfearann/na fearainn TRAF6 a bhí ag teastáil dá idirghníomhaíocht le calpain2a, rinneamar sraith de shóiteáin teasctha TRAF6, lena n-áirítear TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36) }}), agus TRAF6 (400-574). Idir an dá linn, rinneamar na mutants fearainn: TRAF6ΔRing (ina scriostar an fearann ​​finger Ring), TRAF6ΔZF (ina scriostar an bhfearann ​​​​mhéara Sinc), TRAF6ΔCC (ina scriostar an fearann ​​coiled-coil), agus TRAF6ΔTRAF-C ( ina scriostar an fearann ​​C-críochfort TRAF) (Fíor 3b). D'idirghníomhaigh calpain2a le fad iomlán TRAF6 chomh maith le teasctha TRAF6 ina raibh fearann ​​C-críochfort TRAF, fearann ​​coiled-corna, fearann ​​méara Sinc (Fíor 3d, f), ach ní le fearann ​​méarfháinne (Fíor 3e). . Thaispeáin measúnachtaí Luciferase gur chuir ró-eisiúint calpain2a agus na mutants teasctha seo bac suntasach ar ghníomhaíocht tuairisceora NF-κB agus IL-1 i gcealla EPC (Fíor 3h). Ina theannta sin, rinneadh imscrúdú ar chomhlonnaithe focheallacha caipitilin2a le TRAF6. D’aistrigheamar cealla EPC le TRAF6-GFP agus veicteoir folamh nó calpain2a-mCherry. Léirigh anailís micreascópachta comhfhócasach go raibh forluí ar chomharthaí glasa TRAF6 le comharthaí dearga calpain2a, rud a léirigh go bhfuil calpain2a ag comhlonnú le TRAF6 i gcealla EPC (Fíor 3i, j). Tugann na sonraí seo le fios gurb é bunús struchtúrach na bhfearann ​​​​iolrach de TRAF6 (fearann ​​C-críochfort TRAF, fearann ​​coiled-coil, fearann ​​​​méara Sinc) ach nach bhfuil an fearann ​​méarfháinne cinntitheach maidir lena chomhlachas le calpain2a (Fíor 3g).

Fig. 2 calpain2a negative regulates LPS-induced NF-κB Signaling Pathway. an IL-1β, IL-8, and IL-6 mRNA in MKC transduced with calpain2a-Flag or empty vector and treated with saline (0) or challenged with LPS for various times (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n = 3 per group). b, d MKC cells and MIC cells were transfected with si-calpain2a #1 and si-calpain2a #2 (100 nM) or si-ctrl (100 nM). At 48 h post-transfection, calpain2a expression was measured by qRT PCR (n = 3 per group). The level of calpain2a protein was determined by Western blotting. c, e IL-1β, IL-8 mRNA in MKC and MIC stably transduced with si-calpain2a #1 or si-ctrl (control vector) and treated with saline (0) or challenged with LPS for various times (4 h, 8 h) (n = 3 per group). f MKC cells were transfected with either si-ctrl or si-calpain2a #1. At 36 h post-transfection, the cells were stimulated with LPS for 12 h, then cell proliferation assay was measured (n = 3 per group). Scale bar, 100 μm. g calpain2a-Flag was transfected into MKC cells which were challenged with LPS at various times (3 h, 6 h, 9 h). Immunoblot analysis of cell lysates with indicated Abs. Relative mRNA level was normalized to the expression of the gene encoding β-actin in each sample. All experiments were performed in at least three independent experiments. Data were analyzed by two-way ANOVA (a, c, e, f) or one-way ANOVA (b, d). *p < 0.05, **p < 0.01.

Fíor 2 rialaíonn calpain2a diúltach Conair Chomharthaíochta NF-κB de bharr LPS. an IL-1 , IL-8, agus IL-6 mRNA i MKC aistrithe le calpain2a-Bratach nó veicteoir folamh agus cóireáilte le saline (0) nó a dúshlán le LPS do éagsúla uair (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n=3 in aghaidh an ghrúpa). b, d Aistríodh cealla MKC agus cealla MIC le si-calpain2a #1 agus si-calpain2a #2 (100 nM) nó si-ctrl (100 nM). Ag 48 h iar-aistrithe, tomhaiseadh slonn calpain2a ag qRT PCR (n=3 in aghaidh an ghrúpa). Socraíodh leibhéal na próitéine calpain2a ag blotáil an Iarthair. c, e IL-1 , IL-8 mRNA i MKC agus MIC aistrithe go cobhsaí le si-calpain2a #1 nó si-ctrl (veicteoir rialaithe) agus cóireáilte le saline (0) nó dúshlán le LPS do éagsúla uair (4 h, 8 h) (n=3 in aghaidh an ghrúpa). f Aistríodh cealla MKC le si-ctrl nó si-calpain2a #1. Ag 36 h iar-aistrithe, spreagadh na cealla le LPS ar feadh 12 h, ansin tomhaiseadh measúnacht iomadú cille (n=3 in aghaidh an ghrúpa). Barra scála, 100 μm. g aistríodh calpain2a-Flag isteach i gcealla MKC a ndearnadh dúshlán dóibh le LPS ag amanna éagsúla (3 h, 6 h, 9 h). Anailís Immunoblot ar lysates cille le ABS léirithe. Normalaíodh leibhéal coibhneasta mRNA go dtí léiriú na géine ionchódaithe -actin i ngach sampla. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí thurgnamh neamhspleách ar a laghad. Rinneadh anailís ar na sonraí trí ANOVA dhá bhealach (a, c, e, f) nó ANOVA aontreo (b, d). *p < 0.05, **p < 0.01.

Fig. 3 The interaction of calpain2a with TRAF6. a, b Schematic diagrams of domain organization in miiuy croaker calpain2a, TRAF6, and mutants were used in this study.


Fíor 3 Idirghníomhaíocht calpain2a le TRAF6. a, b Baineadh úsáid as léaráidí scéimeacha d'eagrú fearainn i miiuy croaker calpain2a, TRAF6, agus mutants sa staidéar seo. Seasann "+" don idirghníomhaíocht le TRAF6 nó le calpain2a, ciallaíonn "-" gan aon idirghníomhaíocht. c Aistríodh cealla HEK293 le bréige, calpain2a-Bratach fiáin (WT), agus mutants teasctha calpain2a-Bratach, nó TRAF6-HA mar a léiríodh. Ag 24 h tar éis an aistrithe, baineadh cealla aistrithe agus cuireadh lísáití cille faoi dhíon-eagrú le hantasubstaint frith-HA agus IB ina dhiaidh sin ag baint úsáide as antashubstaint frith-HA nó frith-Bhratach. d–f Aistríodh cealla HEK293 le mutants teasctha bréige, TRAF{{21}HA (WT), agus TRAF6-HA, nó calpain2a-Flag mar a léirítear. Ag 24 h tar éis an aistrithe, baineadh cealla aistrithe agus cuireadh lísáití cille faoi dhíondheascadh le antasubstaint frith-HA d, f, nó antashubstaint frith-Bhratach e agus IB ina dhiaidh sin ag baint úsáide as antashubstaint frith-HA nó frith-Bhratach. g Suíomh idirghníomhaíochta TRAF6 agus calpain2a. h Aistríodh cealla EPC le TRAF6-HA, calpain2a-Flag, nó mutants teasctha calpain2a-Bratach mar aon le tuairisceoirí luciferase NF-κB agus IL-1. Tar éis 36 h iar-aistrithe, baineadh amach luach gníomhaíochta luciferase i gcoinne na gníomhaíochta renilla luciferase (n=3 in aghaidh an ghrúpa). I j Aistríodh cealla EPC le bréige, calpain2a-mCherry, agus TRAF6-GFP. Taispeántar núicléis dhaite DAPI i gorm. braitheadh ​​calpain2a le fluaraiseacht dearg, agus braitheadh ​​TRAF6 le fluaraiseacht glas. Barra scála, 10 μm. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí thurgnamh neamhspleách ar a laghad. Rinneadh anailís ar na sonraí trí ANOVA aontreo (h). **p < 0.01.

cuireann calpain2a bac ar leibhéal slonn próitéine TRAF6 trí ghníomhaíocht próitéalaíoch.

Chun iniúchadh a dhéanamh ar mheicníocht rialála calpain2a ar TRAF6, rinneamar scrúdú ar dtús an raibh tionchar ag calpain2a ar TRAF6 ag leibhéal na próitéine. calpain2a-Myc agus TRAF6-Aistríodh Bratach go cealla EPC, díghrádaíodh leibhéal próitéine TRAF6 i bpáirt ag 30 h (Fíor 4a). Mar a léirítear i bhFíor 4b, chuir calpain2a díghrádú TRAF6 chun cinn ar bhealach a bhí ag brath ar dháileog. I láthair calpain2a, níor chuir sé isteach ar leibhéal mRNA TRAF6, rud a léiríonn nach mbíonn tionchar ag calpain2a ach ar leibhéal próitéin TRAF6. Idir an dá linn, léirigh an measúnú inhibitor cycloheximide (CHX) go bhféadfadh calpain2a dlús a chur le leathré an phróitéin TRAF6 (Fíor 4c). Mar thoradh ar ró-eisiúint calpain2a i gcealla MKC, díchobhsaíodh TRAF6 inghin (Fíor 4d). Chun imscrúdú a dhéanamh an raibh díghrádú TRAF6 arna idirghabháil ag calpain2a ag brath ar na cosáin ubiquitin-proteasome, autophagosome, lysosomal, nó eile, déileáladh le cealla EPC leis na himoibrithe a chuir bac ar na conairí seo: MG132, 3-MA, agus NH4Cl. Mar sin féin, níor aisiompaíodh díchobhsú TRAF6 trí mheán calpain2a ag an gcoscóir proteasomal MG132, an t-inhibitor autophagic 3-MA, nó an t-inhibitor lysosomal NH4Cl (Fíor 4e). Ansin, déileáladh le cealla EPC leis na himoibrithe: E-64 (inhibitor calpain a dhíghníomhaíonn gníomhaíocht hidrolase calpain) agus PMSF (coisctheoir serine protease nonspecific). Fuaireamar cosc ​​ar choscóir calpain E-64 ar dhíghrádú ag leibhéal próitéin TRAF6 (Fíor 4f). Mar a léirítear i bhFíor 4g, d'aisiompaigh E-64 díghrádú leibhéil próitéin TRAF6 inghineacha ag calpain2a.

Fig. 4 calpain2a inhibits TRAF6 protein expression. a The time gradient experiment of empty vectors or calpain2a-Myc plasmids together with TRAF6- Flag was conducted in EPC cells. The cell lysates were subjected to IB with anti-Myc, anti-Flag, and anti–Tubulin Abs. RNA was extracted from cells and reverse transcribed, and then TRAF6 and actin were amplified by PCR primers. b EPC cells were seeded in 12-well plates overnight and co-transfected with TRAF6-Flag and calpain2a-Myc (0.3, 0.6, or 0.9 μg) for 48 h. The expression of TRAF6-Flag and calpain2a-Myc proteins was detected by Western blotting. RNA was extracted from cells and reverse transcribed, then TRAF6 and actin were amplified by PCR primers. c calpain2a-Myc or empty vectors were co-transfected with TRAF6-Flag into EPC cells. At 36 h post-transfection, the transfected cells were treated with cycloheximide (CHX) for 2 or 4 h. d MKC cells were transfected with calpain2a-Flag or empty vectors. At 48 h post-transfection, the cell lysates were subjected to IB with anti-TRAF6, anti-Flag, and anti-Tubulin Abs. e, f EPC cells were transfected with the indicated plasmids in the presence or absence of MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 or 75 μM), or PMSF for 6 h before immunoblot analysis was performed. g MKC cells were transfected with calpain2a-Flag in the presence or absence of E-64 (50 or 75 μM) for 6 h before immunoblot analysis was performed. h calpain2a-Flag and calpain2a-ΔCysPc-Flag were co-transfected with TRAF6-HA into EPC cells. At 48 h post-transfection, the cell lysates were subjected to IB with indicated Abs. I calpain2a-Flag and calpain2a-ΔCysPc-Flag were cotransfected into MKC cells. At 48 h post-transfection, the cell lysates were subjected to IB with anti-TRAF6, anti-Flag, and anti-Tubulin Abs. j IL-1β, IL-8 mRNA in MKC stably transduced with calpain2a-Flag and calpain2a-ΔCysPc-Flag and treated with saline (0) or challenged with LPS for 4 h (n = 3 per group). Relative mRNA level was normalized to the expression of the gene encoding β-actin in each sample. All experiments were performed in at least three independent experiments. Data were analyzed by two-way ANOVA (j). **p < 0.01.


Cuireann Fíor 4 bac ar abairt próitéin TRAF6. a Rinneadh an turgnamh grádán ama ar veicteoirí folmha nó plasmidí calpain2a-Myc mar aon le Bratach TRAF6- i gcealla EPC. Cuireadh na lysates cille faoi réir IB le frith-Myc, frith-Bratach, agus frith-Tubulin ABS. Baineadh RNA as cealla agus tras-scríofa droim ar ais, agus ansin aimplíodh TRAF6 agus actin le primers PCR. b Síolaíodh cealla EPC i 12-plátaí tobair thar oíche agus aistríodh iad le TRAF6-Bratach agus calpain2a-Myc (0.3, 0.6, nó {{ 18}}.9 ug) ar feadh 48 h. Braitheadh ​​an slonn ar phróitéiní TRAF{6-Bratach agus calpain2a-Myc le blotting an Iarthair. Baineadh RNA as cealla agus tras-scríofa droim ar ais, ansin aimplíodh TRAF6 agus actin le primers PCR. c aistríodh calpain2a-Myc nó veicteoirí folmha le TRAF6-Bratach go cealla EPC. Ag 36 h tar éis an aistrithe, déileáladh leis na cealla aistrithe le cycloheximide (CHX) ar feadh 2 nó 4 h. d Aistríodh cealla MKC le calpain2a-Bratach nó veicteoirí folamh. Ag 48 h iar-aistrithe, cuireadh na lysates cille faoi réir IB le frith-TRAF6, frith-Bratach, agus frith-Tubulin ABS. e, f aistríodh cealla EPC leis na plasmidí sonraithe i láthair nó in easnamh MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 nó 75 μM), nó PMSF ar feadh 6 h sula ndearnadh anailís imdhíonoblot. g Aistríodh cealla MKC le calpain2a-Flag i láthair nó in éagmais E{{50}} (50 nó 75 μM) ar feadh 6 h sula ndearnadh anailís inmunoblot. h aistríodh calpain2a-Flag agus calpain2a-ΔCysPc-Flag le TRAF6-HA go cealla EPC. Ag 48 h tar éis an aistrithe, cuireadh na lysates cille faoi réir IB le ABS léirithe. Rinneadh I calpain2a-Bratach agus calpain2a-ΔCysPc-Flag a chomhaistriú isteach i gcealla MKC. Ag 48 h iar-aistrithe, cuireadh na lysates cille faoi réir IB le frith-TRAF6, frith-Bratach, agus frith-Tubulin ABS. j IL-1 , IL-8 mRNA i MKC aistrithe go cobhsaí le calpain2a-Flag agus calpain2a-ΔCysPc-Flag agus cóireáilte le saline (0) nó dúshlán le LPS ar feadh 4 h (n=3). in aghaidh an ghrúpa). Normalaíodh leibhéal coibhneasta mRNA go dtí léiriú na géine ionchódaithe -actin i ngach sampla. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí thurgnamh neamhspleách ar a laghad. Rinneadh anailís ar na sonraí ag ANOVA déthreo (j). **p < 0.01.

Chun a chinneadh an raibh díghrádú TRAF6 ag brath ar ghníomhaíocht hidrolase calpain2a. Ag baint leasa as staidéir struchtúracha agus bithcheimiceacha roimhe seo ar calpain2a i mamaigh, shóigheamar na hiarmhair cistéin, histidine, agus asparagine de calpain2a go alanine (calpain2a C105A, H262A, N286A, agus 3 A), a chaill an comhordú catalaíoch-triad44-46. Thugamar faoi deara nach raibh tionchar ag an sóchán seo ar dhíghrádú TRAF6 (Fíor Forlíontach 1a). Mar sin, rinneamar an fearann ​​protease a mhionathrú, arb é fearann ​​​​calpain cysteine ​​protease (CysPc) de calpain2a (ainmnithe mar calpain2a-ΔCysPc). Ní chuireann calpain2a-ΔCysPc (Fig. 4h, i) isteach ar TRAF6 róbhrúite ná ar TRAF6 inghinte. Mar sin féin, bíonn tionchar ag an am céanna ar chitocíní pro-athlastacha IL-1 agus IL{-8 ag calpain2a de chineál fiáin nó mutated ar spreagadh LPS (Fíor 4j). Ní chuireann easpa gníomhaíochta hidrolase caipitil tsóiteáin isteach ar leibhéal próitéin TRAF6, ach bhí tionchar fós ag an easpa gníomhaíochta hidrolase calpain2a mutant ar léiriú cítocíní pro-athlastacha le sruth. Spreag sé seo ár n-imscrúdú ar na meicníochtaí féideartha trína rialaíonn calpain2a TRAF6. Nuair a chuirtear le chéile iad, léiríonn na torthaí seo go rialaíonn calpain2a comharthaíocht NF-κB trí léiriú leibhéil próitéin TRAF6 a shochtadh, trína ghníomhaíocht hidrolase calpain.

cuireann calpain2a bac ar ghníomhaíocht ubiquitin-ligase TRAF6.

Ansin, rinneamar iniúchadh ar na meicníochtaí móilíneacha trína rialaíonn calpain2a comharthaíocht NF-κB gníomhachtaithe TRAF go diúltach, agus cibé an modhnaítear gníomhaíocht ligáis ubiquitin in idirghníomhú calpain2a le TRAF6 nuair a chailltear gníomhaíocht einsímeach. Chuireamar cóireáil ar chealla MKC le LPS agus ansin rinneamar imdhíon-réamhshamhlú TRAF6. Dhearbhaigh measúnacht uileláithreachta le próitéiní athchuingeacha íonaithe gur laghdaigh calpain2a agus calpain2a-ΔCysPc uileláithreacht TRAF6 (Fíor 5a). Mar a léirítear i bhFíor 5b, c, laghdaigh calpain2a agus calpain2a-ΔCysPc go suntasach na próitéiní uileláithrithe WT agus K63 de TRAF6. Laghdaigh grádáin chomhchruinnithe de chalpitin2a agus de chalpitin2a-ΔCysPc próitéiní uileláithreach WT agus K63 de TRAF6 ar bhealach dáileog-spleách. chuir calpain2a-ΔCysPc cosc ​​fós ar chomhiomlánú slabhra K63 ubiquitin de TRAF6 gan cur isteach ar leibhéal próitéin TRAF6 (Fíor 5d, e). Ansin d'aistrigh muid cealla MKC chun Myc-clib TRAF6 a chur in iúl i láthair nó in éagmais calpain2a-ΔCysPc le clib Bratach, rinneamar turgnaimh imdhíon-precipitation le antashubstaint frith-Myc agus anailís déanta ag immunoblot le frith-UB. Rinne calpain2a- ΔCysPc (Fíor 5f) maolú mór ar uileláithreacht den sórt sin de TRAF6. Arna spreagadh ag LPS, seachadann TRAF6 slabhra ubiquitin K{63-nasctha go TAK1, a spreagann uathfhosfarú TAK1 agus a ghníomhaíonn NF-κB18. Feabhsaíodh próitéiní ubiquitin WT agus K63 de TAK1 go mór i láthair TRAF6, ach cuireadh bac ar ubiquitination nasctha TAK i láthair calpain2a-ΔCysPc (Fíor 5g, h). Tacaíonn na sonraí seo leis an gcaoi chéanna a chuireann easpa gníomhaíochta hidrealáis mutant calpain2a bac ar ghníomhaíocht ligáis ubiquitin TRAF6 gan cur isteach ar leibhéil próitéin TRAF6.

Cistanche deserticola-improve immunity (7)

Buntáistí cistanche tubulosa- an córas imdhíonachta a neartú

cuireann calpain2a bac ar homo-oligomerization TRAF6.

Tá príomhról ag slabhra ubiquitin Lys63 arna shintéisiú ag TRAF6 maidir le haistriú comhartha. Tuairiscíodh go bhfuil maolú TRAF6 riachtanach chun a slabhra ubiquitin a shintéisiú16. Tá dlúthbhaint ag an tsamhail dimerization leis an meascán de Ubc13 chun K63 ubiquitination16,30 a tháirgeadh. Chun a fhíorú an bhféadfadh iasc TRAF6 dimers a dhéanamh, d'úsáideamar plasmids TRAF6 le clibeanna éagsúla: Myc-clib TRAF6 agus HA-clib TRAF6 le haghaidh turgnaimh comh-IP. Rinneadh measúnacht IP ag baint úsáide as antashubstaint frith-HA, rinne HATRAF6 idirghníomhú le Myc-TRAF6 (Fíor 6a). Chun éifeacht coisctheach calpain2a in idirghníomhú diméir TRAF a iniúchadh, cuireadh calpain2a le clib Bratach, TRAF6 le clib HA agus TRAF6 le clib Myc in iúl go neamhbhuan i gcealla HEK293. De réir mar a bheifí ag súil leis, laghdaíodh idirghníomhú dimer TRAF i láithreacht calpain2a (Fíor 6b). Ag an am céanna, chun láithreacht díghrádú TRAF6 ag calpain2a a sheachaint. D'aistrigheamar calpain2a-ΔCysPc le clib Bratach agus fuaireamar amach gur tháinig laghdú de réir a chéile ar idirghníomhú dimer TRAF i láthair calpain2a- ΔCysPc (Fíor 6c). Mar a léirítear i bhFíor 6d, e, fuaireamar ubiquitination feabhsaithe HA-TRAF6 WT agus K63 de Myc-TRAF6. Cé go ndearnadh cealla HEK293 a chomh-aistriú le calpain2a agus calpain2a- ΔCysPc, chuirfí an uileláithreacht fheabhsaithe faoi chois. Tugann na torthaí seo le tuiscint go gcuireann calpain2a de chineál fiáin agus calpain tsóiteáin2a araon, a bhfuil easpa gníomhaíochta hidrealaáis acu, bac ar homaigiméiriú TRAF6 agus uath-uathláithreachas.

cuireann calpain2a bac ar sheachadadh uileláithreacht TRAF6 chuig ECSIT agus BECN1.

Mar a léirítear i bhFíor 5d, fuaireamar amach gur chuir calpain2a isteach ar an bpróiseas uileláithreachta ó TRAF6 go TAK1. Tuairiscíodh gur ghníomhaigh ECSIT mar phróitéin oiriúnaitheach de TAK1 agus TRAF6 chun comharthaíocht NF-κB trí spreagadh LPS a chur chun cinn37. Chun a fhíorú an raibh na feidhmeanna atá luaite ag ECSIT in iasc teleost, rinneamar ailínithe seicheamh iolracha de phróitéiní ECSIT i lucha daonna, agus féadfaidh sé croaker (Fíor Forlíontach 1b). D'aistrigh muid cealla EPC le tuairisceoir luciferase NF-κB, chuir ECSIT feabhas suntasach ar ghníomhaíocht tuairisceora NF-κB tar éis spreagadh LPS (Fíor Forlíontach 1c). Mar thoradh ar ró-léiriú ECSIT i gcealla MKC rinneadh suas-rialú leibhéal mRNA TNF- (Fíor Forlíontach 1d). Tar éis iasc ECSIT agus TRAF6 a aistriú i gcealla HEK293, fuair muid amach go ndearna TRAF6 idirghníomhú le ECIST (Fíor 7a). Ar an gcaoi chéanna, bhí ECSIT agus TAK1 comh-aistrithe, agus choinnigh an dá phróitéin idirghníomhaíocht freisin (Fíor 7b). Ina dhiaidh sin, chun a fhíorú an gcuireann calpain2a-ΔCysPc bac ar fhoirmiú an choimpléasc TRAF6- ECSIT, aistríomar na trí plasmid go cealla HEK293 agus fuaireamar amach gur chuir calpain2a-ΔCysPc cosc ​​ar choimpléasc TRAF (Fíor 7c). ). Chun próiseas tarchurtha an slabhra ubiquitin i gcomharthaí NF-κB a fhíorú. Mar a léirítear i bhFíor 7d, d'fhéadfadh TRAF6 uileláithreachas ECSIT a chur chun cinn; mar a bhíothas ag súil leis, chuir calpain2a-ΔCysPc bac ar an bpróiseas trínar tharchuir TRAF6 an slabhra ubiquitin chuig ECSIT. Próitéin thábhachtach is ea BECN1 in uathphagaíocht LPS-spreagtha. Deimhníodh go bhféadfadh ubiquitination K63 BECN1 a mhodhnú agus a ghníomhachtú. Baineann einsím deubiquitinating A20 ubiquitination BECN1 agus cuireann sé cosc ​​ar uathphagy de bharr LPS, agus is é TRAF6 an ligáis E3 atá freagrach as uileláithreacht BECN1 sa chomhartha seo47. Mar a léirítear i bhFíor 7e, rinne TRAF6 idirghníomhú le BECN1 agus chuir sé uileláithreacht BECN1 chun cinn. Ansin d'aistrigh muid BECN1, TRAF6, calpain2a, agus calpain2a-ΔCysPc isteach i gcealla HEK293, chuir TRAF6 uileláithreacht BECN1 chun cinn. chuir calpain2a-ΔCysPc bac ar an bpróiseas trína tharchuir TRAF6 an slabhra ubiquitin go BECN1 (Fíor 7f). Tugann na torthaí seo le tuiscint go gcuireann calpain2a de chineál fiáin agus calpain tsóiteáin a bhfuil easpa gníomhaíochta hidrealáis bac ar chumas uileláithreachta TRAF6 in uathphagaíocht LPS-spreagtha agus comharthaíocht NF-κB.

Rialú diúltach ar fhreagra frithvíreasach ag calpain2a.

Sa chonair RLR, feidhmíonn TRAF6 mar ligáis E3 arna earcú ag MAVS chun NF-κB a ghníomhachtú, táirgeadh IFNanna agus cytokines. An chéad uair eile rinneamar scrúdú ar cibé an raibh ról ag calpain2a chun TRAF6 a chosc sa phróiseas frithvíreasach trí mheán an IFN. I gcealla EPC, cuireadh tuairisceoirí luciferase faoi thiomáint IFN-1, ISRE, agus IRF3 in iúl. Fuaireamar amach gur laghdaigh calpain2a na gníomhaíochtaí luciferase seo atá faoi thiomáint ag tionscnóirí ar bhealach dáileog-spleách ar spreagadh Ploy(I:C) agus ionfhabhtú rhabdovirus cheats Siniperca (SCRV) (Fíor 8a, b). D'fheabhsaigh Cnoc an Dúin caipitilin2a slonn géine a spreag Ploy(I:C) agus SCRV go suntasach lena n-áirítear Viperin, Mx1, agus ISG15 (Fíor 8c, d). Mar thoradh ar thitim caipitilin2a tháinig léiriú níos airde ar inmharthanacht cille ar ionfhabhtú SCRV i gcealla MKC (Fíor 8e). Mar a léirítear i bhFíor 8f, léirigh measúnachtaí ar iomadú cille gur fheabhsaigh leagadh caipitilin2a iomadú cille ar ionfhabhtú SCRV. Chuir overexpression de calpain2a iomadú víreas chun cinn go géar, mar a léirítear le macasamhlú víreasach tar éis ionfhabhtú SCRV (Fíor 8g). laghdaigh calpain2a agus calpain2a-ΔCysPc tuairisceoirí luciferase IFN-1, ISRE agus IRF3 faoi thiomáint ag tionscnóirí ar spreagadh Ploy(I:C) agus ionfhabhtú SCRV (Fíor Forlíontach 2a, b). Tugann na torthaí seo le tuiscint go bhféadfadh calpain2a an chonair chomharthaíochta RLR a rialáil go diúltach trí chosc a chur ar TRAF6, rud a chuirfeadh bac ar ghníomhachtú IFN.

Fig. 5 calpain2a inhibits TRAF6 ubiquitin-ligase activity. a Ubiquitination of endogenous TRAF6 in MKC cells transduced with calpain2a-Flag and calpain2a-ΔCysPc-Flag and unchallenged (−) or challenged with LPS (+), assessed by immunoblot analysis with anti-ubiquitin after immunoprecipitation with anti-TRAF6 and input immunoblot analysis with indicated Abs. b, c HEK293 cells were cotransfected with TRAF6-HA and WT-ubiquitin-His or K63O ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. d, e HEK293 cells were cotransfected with TRAF6-HA and WT-ubiquitin-His or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag (0.5 μg, 1 μg), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0.5 μg, 1 μg) or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. f Ubiquitination of overexpressed TRAF6 in MKC cells transduced with calpain2a-ΔCysPc-Flag, assessed by immunoblot analysis with anti-ubiquitin after immunoprecipitation with anti-Myc and input immunoblot analysis with indicated Abs. g, h HEK293 cells were cotransfected with TAK1-Myc, TRAF6-HA, and WT-ubiquitin-His or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. All the immunoprecipitates and input immunoblot analysis with anti-Myc, anti-Flag, anti-HA, and anti-Tubulin Abs. All experiments were performed in at least three independent experiments.


Cuireann Fíor 5 bac ar ghníomhaíocht ubiquitin-ligáis TRAF6. a Ubiquitination of endogenous TRAF6 i gcealla MKC aistrithe le calpain2a-Flag agus calpain2a-ΔCysPc-Flag agus gan dúshlán (−) nó dúshlán le LPS (+), arna measúnú ag anailís immunoblot le frith-ubiquitin tar éis inmunprecipitation le frith-TRAF6 agus anailís immunoblot ionchuir le ABS léirithe. b, c Rinneadh cealla HEK293 a chomh-aistrithe le TRAF6-HA agus WT-ubiquitin-His nó K63O ubiquitin-His (ina gcoimeádtar ach lísín 63) mar aon le calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a líseáil agus a íonú le Ni-NTA agarose. d, e Rinneadh cealla HEK293 a chomh-aistrithe le TRAF{{30}HA agus WT-ubiquitin-His nó K63O-ubiquitin-His (ina gcoimeádtar ach lísín 63) mar aon le calpain2a-Flag ({{45) }}.5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0.5 ug, 1 ug) nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a líseáil agus a íonú le Ni-NTA agarose. f Ubiquitination of overexpressed TRAF6 i gcealla MKC aistrithe le calpain2a-ΔCysPc-Flag, arna mheasúnú ag anailís imdhíon-blot le frith-ubiquitin tar éis inmunprecipitation le frith-Myc agus anailís inmunoblot ionchuir le Abs léirithe. g, h comhthraschuireadh cealla HEK293 le TAK1-Myc, TRAF6-HA, agus WT-ubiquitin-His nó K63O-ubiquitin-His (ina gcoimeádtar ach lísín 63) mar aon le calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Bratach nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a líseáil agus a íonú le Ni-NTA agarose. Gach an immunoprecipitates agus anailís immunoblot ionchur le frith-Myc, frith-Bratach, frith-HA, agus frith-Tubulin ABS. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí thurgnamh neamhspleách ar a laghad.

Sochtann calpain2a uileláithreachas IRF3 agus IRF7 ó TRAF6.

Tuairiscítear go bhfuil gníomhaíocht TRAF6 riachtanach chun IRF3 agus NF-κB48 a ghníomhachtú sa chomhartha antiviral a spreag an coimpléasc MAVS-TRAF3/6. Mar a léirítear i bhFíor 9a, b, cuireann TRAF6 chun cinn uileláithreacht nasctha WT agus K de IRF3, agus cuirtear cosc ​​ar an bhfeabhsú seo ag abairt calpain2a- ΔCysPc. Idir an dá linn, nuair a spreagann an víreas comhartha comharthaíochta atá ag brath ar TLR, tá dlúthbhaint ag TRAF6 le IRF7 agus cuireann sé chun cinn uileláithreacht IRF7 mar aon le fachtóirí frithvíreasacha arna ngníomhú22,49,50. Cuireann TRAF6 chun cinn uileláithreacht nasctha WT agus K de IRF7, agus cuirtear bac ar an bhfeabhsú seo ag abairt calpain2a-ΔCysPc (Fíor 9c, d). Tugann na sonraí seo le fios go gcuireann calpain2a de chineál fiáin agus calpain tsóiteáin a bhfuil easpa gníomhaíochta hidrealáis bac orthu uileláithreacht TRAF de IRF3 agus IRF7.

Plé

Tá TRAF6 ar cheann de na seacht mball den teaghlach fachtóirí gabhdóirí (TRAFanna) fachtóir neacróis meall (TNF), a aithníodh mar oiriúntóir comhartha agus a fheidhmíonn aistriú comhartha51,52. Tá an fearann ​​Ring finger i dteaghlach TRAF, ar leis an ngníomhaíocht E3 ligáis é. Cuireann ligáis E3 leis an bhfearann ​​​​HECT polaibiachtúlacht an tsubstráit chun cinn, agus éilíonn E3anna leis an bhfearann ​​​​Ring E2~ub polyubiquitination53,54 a tharchur. Deimhníodh go bhfuil baint ag an einsím dimer Ub-cheangailteach Ubc13/Uev1A le comhiomlánú pola-uibíleasú TRAF616. Cé go bhfuil K124 de luch TRAF6 bainte amach, caillfidh TRAF6 gníomhaíocht uath-uathláimhe K63, agus cuireann an sóchán ar an suíomh seo deireadh le uileláithreacht NEMO arna idirghabháil ag TRAF agus le gníomhachtú TAK1, IKK, agus NF-κB55 . Tá sé beacht toisc go gceanglaíonn PRDX1 leis an bhfearann ​​TRAF6 Ring Finger atá i K124 agus cuireann sé deireadh le uileláithreacht TRAF638. Tá sé tuairiscithe go bhfuil dlúthbhaint ag uileláithreacht TRAF6 le maolú a bhfearann ​​​​N-críochfort (fearann ​​​​mhéara fáinne agus ZF). Rinneadh mutadh ar shuímh idirghníomhaíochta iolracha N-críochfoirt le Ubc13, agus níorbh fhéidir le Ubc13 poly~ub a tharchur chuig TRAF616. Léirigh an t-idirghníomhú idir mutants calpain2a agus TRAF6 go raibh an chuid is mó de na fearainn de TRAF6 ag idirghníomhú le calpain2a, ach amháin i gcás an fhearainn Ring finger. Mar gheall ar an idirghníomhú idir calpain2a agus fearann ​​méara ZF TRAF6, rinneamar tuairimíocht go bhféadfadh calpain2a bac a chur ar uath-uathláithreacht trí mhaolú a dhéanamh ar mhaolú TRAF6. Ina dhiaidh sin, dheimhnigh muid idirghníomhú clibeanna éagsúla TRAF6. De réir mar a mhéadaigh an abairt de chalpain2a mutant easpa gníomhaíochta hidrolase, lagaigh idirghníomhú clibeanna éagsúla TRAF6. Cuireann HA-clibeáilte TRAF6 uileláithreacht TRAF6 le clib Myc chun cinn, agus cuireann calpain2a mutant cosc ​​ar an uileláithreacht feabhsaithe ag TRAF6 le clib HA. Mar idirmheánach i bpróiseas tarchur comhartha TRAF6-TAK1, ceanglaíonn ECSIT le fearann ​​C-críochfort TRAF6 (fearann ​​CC agus fearann ​​TRAF-C) agus deimhnítear go bhfuil baint aige le comharthaíocht NF-κB37. Tháinig laghdú ar léiriú cítocíní proin-lasracha i gcealla ECSITKD THP{-1. Mar sin féin, tar éis ró-eisiúint ECSIT i gcealla ECSITKD THP{-1, tháinig méadú suntasach ar ghéinte mar IRF7, IL{{-1 , agus CD4437. Ceanglaíonn PRDX1 leis an bhfearann ​​Ring finger de TRAF6 agus cuireann sé cosc ​​ar uileláithreacht ECSIT agus BECN1 i NF-κB agus comharthaí uathphagaíochta trí fhoirmiú pola-ubiquitination TRAF638 a chosc. Maidir le héisc teileost, dheimhnigh muid an cosán comharthaíochta NF-κB gníomhachtaithe ECSIT, rinneamar idirghníomhú le TRAF6 agus TAK1 faoi seach, agus tharchuireamar an slabhra polyubiquitin arna tháirgeadh ag TRAF6. caipitilin2a ceangailte le fearann ​​ZF, fearann ​​CC, agus fearann ​​TRAF-C de TRAF6, rud a chuir bac ar idirghníomhaíocht TRAF{6-ECSIT. Deimhníomar gur chuir easpa gníomhaíochta hidrealáis mutant calpain2a cosc ​​ar an slabhra polyubiquitin ó TRAF6 go ECSIT agus BECN1.

Fig. 6 calpain2a attenuates autoubiquitination of TRAF6. a HEK293 cells were transfected with TRAF6-Myc, TRAF6-HA, or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with HA antibody. b HEK293 cells were transfected with TRAF6-Myc, TRAF6-HA, empty vector, or calpain2a-Flag. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with HA antibody. c HEK293 cells were transfected with TRAF6-Myc, TRAF6-HA, empty vector, or different concentrations of calpain2a-ΔCysPc-Flag. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with HA antibody. d, e HEK293 cells were cotransfected with TRAF6-Myc, TRAF6-HA, and WT-ubiquitin-His or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. The immunoprecipitates and input immunoblot analysis with anti-Myc, anti-Flag, anti-HA, and anti-Tubulin Abs. All experiments were performed in at least three independent experiments.

I bhFíor 6 maolaíonn calpain2a uath-uathghléasadh TRAF6. aistríodh cealla HEK293 le TRAF6-Myc, TRAF6-HA, nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h iar-aistrithe, rinneadh na cealla a lysed agus anailís IP le antashubstaint HA. b Aistríodh cealla HEK293 le TRAF6-Myc, TRAF6-HA, veicteoir folamh, nó calpain2a-Flag. Tar éis 24 h iar-aistrithe, rinneadh na cealla a lysed agus anailís IP le antashubstaint HA. c Aistríodh cealla HEK293 le TRAF6-Myc, TRAF6-HA, veicteoir folamh, nó tiúchain éagsúla calpain2a-ΔCysPc-Flag. Tar éis 24 h iar-aistrithe, rinneadh na cealla a lysed agus anailís IP le antashubstaint HA. d, e Rinneadh cealla HEK293 a chomh-aistrithe le TRAF6-Myc, TRAF{6-HA, agus WT-ubiquitin-His nó K63O-ubiquitin-His (ina gcoimeádtar ach lísín 63) mar aon le calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Bratach nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a líseáil agus a íonú le Ni-NTA agarose. An immunoprecipitates agus anailís immunoblot ionchur le frith-Myc, frith-Bratach, frith-HA, agus frith-Tubulin Abs. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí thurgnamh neamhspleách ar a laghad.

Fig. 7 calpain2a inhibits TRAF6-mediated ubiquitination of ECSIT and BECN1. a HEK293 cells were transfected with ECSIT-Myc, TRAF6-Flag, or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with Flag antibody. b HEK293 cells were transfected with TAK1-Flag, ECSIT-Myc, or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with Myc antibody. c HEK293 cells were transfected with TRAF6-Myc, ECSIT-HA, empty vector, or different concentrations of calpain2a-ΔCysPc-Flag. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with Myc antibody. d HEK293 cells were cotransfected with ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. e HEK293 cells were transfected with BECN1-Flag, TRAF6-Myc, or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with Myc antibody. f HEK293 cells were cotransfected with BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. The immunoprecipitates and inputs with anti-Myc, anti-Flag, anti-HA, and anti-Tubulin Abs. All experiments were performed in at least three independent experiments.


Cuireann Fíor 7 bac ar uileláithreacht trí mheán TRAF ar ECSIT agus BECN1. aistríodh cealla HEK293 le ECSIT-Myc, TRAF6-Bratach, nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a líseáil agus rinneadh anailís ar IP le hantasubstaint Bratach. b Aistríodh cealla HEK293 le TAK1-Bratach, ECSIT-Myc, nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a liostáil agus rinneadh anailís ar IP le hantasubstaint Myc. c Aistríodh cealla HEK293 le TRAF6-Myc, ECSIT-HA, veicteoir folamh, nó tiúchain éagsúla caipitilin2a-ΔCysPc-Flag. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a liostáil agus rinneadh anailís ar IP le hantasubstaint Myc. d Rinneadh cealla HEK293 a chomh-aistrithe le ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His mar aon le calpain2a-Brat, calpain2a-ΔCysPc-Flag nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a líseáil agus a íonú le Ni-NTA agarose. e Aistríodh cealla HEK293 le BECN1-Bratach, TRAF6-Myc, nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a liostáil agus rinneadh anailís ar IP le hantasubstaint Myc. f Rinneadh cealla HEK293 a chomh-aistrithe le BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His mar aon le calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh na cealla a líseáil agus a íonú le Ni-NTA agarose. An immunoprecipitates agus ionchuir le frith-Myc, frith-Bratach, frith-HA, agus frith-Tubulin ABS. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí thurgnamh neamhspleách ar a laghad.

Tugaimid faoi deara go bhfuil gníomhaíocht hidrolase ag calpain2a mar cheann den teaghlach proteases atá ag brath ar chailciam. Tá ról dearfach rialála ag m-calpain (calpain-2) i gcosán comharthaíochta NF-κB de chealla ae HepG2. Neamhspleách ar an gcur chuige proteasome 26 s, hidrealaíonn calpain2a IkB chun an fachtóir trascríobh NF-κB a scaoileadh. Cuireann an t-inhibitor sonrach de phróitéin calpain cosc ​​ar dhíghrádú IkB 56. Mar sin féin, i gcás calpain, is beag staidéar atá ar fhreagairt imdhíonachta dúchasach éisc. I gcealla MKC, chuir ró-eisiúint caipitilin2a bac ar cítocíní pro-athlastacha iartheachtacha NF-κB de bharr LPS. Bhí an feiniméan seo contrártha leis na torthaí i gcealla ae HepG2. D’fhéadfadh sé go raibh iarmhairtí difriúla mar thoradh ar shainiúlacht speiceas an teaghlaigh próitéine calpain. Ar an gcaoi chéanna, d'úsáideamar an t-inhibitor sonrach den phróitéin calpain E-64 chun calpain2a a chosc ó hidrealú TRAF6. Cuireann easpa gníomhaíochta hidrealáis bac ar ghníomhaíocht ligáis ubiquitin TRAF6 gan cur isteach ar a leibhéil próitéine. Níor aimsigh muid suíomhanna einsím-ghníomhacha le haghaidh caipitilin2a. De réir staidéir roimhe seo i mamaigh, is iad na trí shuíomh: cistéin (C105A), histidine (H262A), agus iarmhair asparagine (N286A). Mar sin féin, deimhníonn ár dturgnaimh nach ndéanann na trí shuíomh gníomhacha de miiuy croaker calpain2a difear do léiriú leibhéil próitéin TRAF6, ach ní dhéanann an tsóiteáin calpain2a gan fearann ​​​​hydrolase. Dá bhrí sin, roghnaigh muid an fearann ​​struchtúrach iomlán a ghníomhaíonn einsímí a shóchán. Cé go bhfuil calpain2a próitéine sách caomhnaithe i mamaigh agus i veirteabraigh íochtair, tá tuilleadh imscrúdaithe tuillte ag na suíomhanna gníomhaíochta einsímeacha sonracha.

Desert ginseng-Improve immunity (15)

cistanche córas imdhíonachta a mhéadú plandaí

Go hachomair, d'aithin muid calpain2a mar rialtóir diúltach ar chomharthaíocht NF-κB spreagtha ag LPS agus ar ghníomhachtú IFN de bharr víreas (Fíor 9e). I mais-speictriméadracht, féadfaidh calpain2a idirghníomhú le TRAF6 agus thaispeáineamar an feiniméan seo trí thurgnamh comh-fhuascailte ingenous. Fuaireamar amach go bhfuil baint ag calpain2a leis an gcosán comharthaíochta NF-κB arna spreagadh ag LPS a rialáil. Ina theannta sin, tá ról tábhachtach ag TRAF6 freisin maidir le bealaí comharthaíochta frithvíreasacha. D’úsáideamar SCRV agus Ploy(I:C) chun cosán comharthaíochta IFN a spreagadh agus fuaireamar amach go bhféadfadh calpain2a bac a chur ar chomharthaíocht IFN trí leibhéal próitéine agus uathfhlaithiúnas TRAF6 a rialáil. Toisc gur féidir le TLR3 an struchtúr RNA dúbailte-snáithe (dsRNA) a tháirgtear trí ionfhabhtuithe víreasacha a aithint. Tá níos mó spéise againn i rialúchán calpain2a ar chonair chomharthaíochta IFN idirghabhálaithe TRAF a shoiléiriú ach ní chuireann muid gaol féideartha idir cosán comharthaíochta calpain2a agus TLR3 as an áireamh. chuir calpain2a díghrádú TRAF6 chun cinn ar bhealach hidrealaíoch agus rinne sé idirghníomhú le TRAF6 chun cosc ​​a chur ar fhoirmiú dimers agus uath-uathláithreacht. Chuir an cosc ​​seo cosc ​​ar idirghníomhú TRAF6 agus ECSIT agus ar an bpróiseas aistrithe uileláithreach ó TRAF6 go ECSIT, BECN1, IRF3, agus IRF7. Cuirfidh ár dtorthaí reatha le tuiscint ar na meicníochtaí diúltacha rialála trí dhíriú ar TRAF6 i bhfreagraí imdhíonachta dúchasacha. Ina theannta sin, léiríonn an taighde seo an príomhról atá ag homooligomerization TRAF6 agus uath-uibítíniúchán i bpróiseas freagairt imdhíonachta dúchasach na n-iasc. Ag an am céanna, moltar calpain2a mar mheicníocht rialála próitéin chun freagairt imdhíonachta TRAF6 a chosc agus na gnáthbhealaí comhartha ordúil a chosc. Tá na léargais cabhrach chun imdhíoneolaíocht veirteabrach agus éabhlóid an chórais imdhíonachta veirteabrach a thuiscint.

Fig. 8 calpain2a inhibits SCRV- or Poly(I: C)-induced IFN activation. a b EPC cells were transfected with different concentrations of calpain2a-Flag or empty vector together with the IFN-1, ISRE, and IRF3-pro luciferase reporters. At 24 h post-transfection, cells were mock-infected or infected with SCRV or Poly(I: C) for 12 h (n = 3 per group). Western blot analysis was used to measure the expression of transiently transfected calpain2a-Flag. The expression of Tubulin was used as a loading control. c, d Viperin, Mx1, ISG15 mRNA in MKC stably transduced with si-calpain2a #1 or si-ctrl (control vector) and treated with saline (0) or challenged with SCRV or Poly(I: C) for 24 h. Relative mRNA level was normalized to the expression of the gene encoding β-actin in each sample (n = 3 per group). e, f MKC cells were transfected with either si-ctrl or si-calpain2a #1. At 24 h post-transfection, the cells were stimulated with SCRV for 24 h, then cell viability assay and cell proliferation assay were measured (n = 3 per group). Scale bar, 100 μm. g MKC cells were transfected with calpain2a-Flag or pcDNA3.1, then infected with SCRV for 24 h (n = 3 per group). The qRT-PCR analysis was conducted for intracellular and supernatant SCRV RNA expression. All experiments were performed in at least three independent experiments. Data were analyzed by one-way ANOVA (a, b), two-way ANOVA (c, d, e, f), or two-tailed Student's t-test (g). *p < 0.05, **p < 0.01.


Cuireann Fíor 8 bac ar ghníomhachtú IFN de bharr SCRV nó Poly(I:C). ab Aistríodh cealla EPC le tiúchain éagsúla calpain2a-Bratach nó veicteoir folamh mar aon leis na tuairisceoirí IFN-1, ISRE, agus IRF3-pro luciferase. Ag 24 h tar éis an aistrithe, bhí cealla ionfhabhtaithe nó ionfhabhtaithe le SCRV nó Poly(I:C) ar feadh 12 h (n=3 in aghaidh an ghrúpa). Baineadh úsáid as anailís bhloic thiar chun slonn calpain2a-Bratach a aistrítear go sealadach a thomhas. Baineadh úsáid as an abairt Tubulin mar rialú luchtaithe. c, d Viperin, Mx1, ISG15 mRNA i MKC aistrithe go cobhsaí le si-calpain2a #1 nó si-ctrl (veicteoir rialaithe) agus cóireáilte le saline (0) nó agóid le SCRV nó Poly(I:C) do 24 h. Normalaíodh leibhéal coibhneasta mRNA go dtí léiriú na géine ionchódaithe -actin i ngach sampla (n=3 in aghaidh an ghrúpa). e, f Aistríodh cealla MKC le si-ctrl nó si-calpain2a #1. Ag 24 h iar-aistriú, spreagadh na cealla le SCRV ar feadh 24 h, ansin tomhaiseadh measúnacht inmharthanachta cille agus measúnacht iomadú cille (n=3 in aghaidh an ghrúpa). Barra scála, 100 μm. g Aistríodh cealla MKC le calpain2a-Flag nó pcDNA3.1, ansin ionfhabhtaithe le SCRV ar feadh 24 h (n=3 in aghaidh an ghrúpa). Rinneadh an anailís qRT-PCR maidir le slonn SCRV RNA incheallach agus fornáthach. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí thurgnamh neamhspleách ar a laghad. Rinneadh anailís ar na sonraí trí ANOVA aontreo (a, b), ANOVA déthreo (c, d, e, f), nó t-tástáil an Mhic Léinn dhá eireaball (g). *p < 0.05, **p < 0.01.

Modhanna

Cultúr cille.

Ceannaíodh 293 línte cille duán suthach daonna (HEK) agus línte cille Epithelioma papulosum cyprini (EPC) ó Bhailiúchán Cultúir Cineál Mheiriceá agus coinníodh inár saotharlann iad. Saothraíodh línte cille duáin Miiuy (M. miiuy) (MKC) agus línte cille stéig cróicéir Miiuy (MIC) ó fhíocháin duáin agus stéig de shrócair miiuy57,58. Saothraíodh línte cille duán Miiuy crócaí agus línte cille stéig Miiuy ag 26 céim i gorlann taisithe ina raibh 0.5% CO2 i meán L-15 (HyClone, SAM) arna fhorlíonadh le 15% FBS (Gibco , SAM), 100 U/ml peinicillin (Gibco, SAM), 100 ug/ml streiptimícin (Gibco, SAM), agus 20 U/ml heparin (Solarbio, an tSín). Fásadh cealla epithelioma papulosum cyprini ag 26 céim i gorlann taisithe ina raibh 5% CO2 i meán 199 (Hioclón) arna fhorlíonadh le 10% FBS, 2 mM L-glutamine, peinicillin 100 U / ml, agus streiptimícin 100 mg / ml. Duán suthach daonna Fásadh 293 cealla ag 37 céim i gorlann taisithe ina raibh 5% CO2 i meán Eagle (DMEM) (Invitrogen) modhnaithe Dulbecco arna fhorlíonadh le 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml peinicillin, agus 100 mg /ml streptomycin.

Fig. 9 calpain2a inhibits TRAF6-mediated ubiquitination of IRF7 and IRF3. b HEK293 cells were cotransfected with IRF3-Myc, TRAF6-HA, and WTubiquitin-His or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h posttransfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. c, d HEK293 cells were cotransfected with IRF7-Myc, TRAF6-HA, and WT-ubiquitinHis or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. All the immunoprecipitates and input with anti-Myc, anti-Flag, anti-HA, and anti Tubulin Abs. All experiments were performed in at least three independent experiments. e Model detailing the roles of calpain2a in TRAF6-mediated signaling pathways. Upon LPS and virus, TRAF6 could be activated, homo-oligomerization and auto-ubiquitination. BECN1, ECSIT, IRF7, and IRF3 are ubiquitinated by TRAF6 and trigger the activation of downstream signals. calpain2a as a negative regulator targets TRAF6 to inhibit TRAF6-mediated signaling pathways.


Coscann Fíor 9 calpain2a uileláithreacht trí mheán TRAF ar IRF7 agus IRF3. b Comhthraschuireadh cealla HEK293 le IRF3-Myc, TRAF6-HA, agus WTubiquitin-His nó K63O-ubiquitin-His (ina gcoimeádtar ach lísín 63) mar aon le calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc -Bratach nó veicteoir folamh. Tar éis iaraistriú 24 h, rinneadh na cealla a líseáil agus a íonú le Ni-NTA agarose. c, d comhthraschuireadh cealla HEK293 le IRF7-Myc, TRAF{6-HA, agus WT-ubiquitinHis nó K63O-ubiquitin-His (ina gcoimeádtar ach lísín 63) mar aon le calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-Bratach nó veicteoir folamh. Tar éis 24 h tar éis aistrithe, rinneadh na cealla a líseáil agus a íonú le Ni-NTA agarose. Gach imdhíonprecipitates agus ionchur le frith-Myc, frith-Bratach, frith-HA, agus frith Tubulin ABS. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí thurgnamh neamhspleách ar a laghad. r Samhail ina sonraítear róil caipitilin2a i gconair chomharthaíochta trí mheán TRAF. Ar LPS agus víreas, d'fhéadfaí TRAF6 a ghníomhachtú, homo-oligomerization agus auto-ubiquitination. Tá BECN1, ECSIT, IRF7, agus IRF3 uileláithreach ag TRAF6 agus spreagann siad gníomhachtú comharthaí le sruth. Díríonn calpain2a mar rialtóir diúltach ar TRAF6 chun cosáin chomharthaíochta idirghabhálaithe TRAF a chosc.

Tagairtí

1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Aitheantas pataigin agus díolúine dúchasach. Cill 124, 783–801 (2006).

2. Takeuchi, O. & Akira, S. Gabhdóirí aitheantais patrún agus athlasadh. Cill 140, 805–820 (2010).

3. Wu, J. & Chen, ZJ Braiteadh imdhíonachta dúchasach agus comharthaíocht aigéid núicléacha cítosólacha. Annú. Ath. Immunol. 32, 461–488 (2014).

4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Gabhdóirí cosúil le dola. Curr. Biol. 21, R488–R493 (2011).

5. Schlee, M. Braiteoirí máistir RNA pataigineach - RIG-Is maith liom gabhdóirí. Imdhíonbhitheolaíocht 218, 1322–1335 (2013).

6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, próitéiní KS NLR: baill dhílis den díolúine dúchasach agus idirghabhálaithe galair athlastacha. J. Leucoc. Biol. 83, 13–30 (2008).

7. Akira, S. & Hemmi, H. Aitheantas patrúin móilíneacha a bhaineann le pataigin ag an teaghlach TLR. Imdhíonól. Lett. 85, 85–95 (2003).

8. Kawai, T. & Akira, S. Ról na ngabhdóirí aitheanta patrún san imdhíonacht dhúchasach: nuashonrú ar ghabhdóirí cosúil le Dola. Nát. Imdhíonól. 11, 373–384 (2010).

9. Kawagoe, T. et al. Rialú seicheamhach ar fhreagraí receptor-spleách ar nós Dola ag IRAK1 agus IRAK2. Nát. Imdhíonól. 9, 684–691 (2008).

10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4 − gníomhaí NF-kappaB roinnte i díolúine dúchasach agus faighte. Treochtaí Imdhíonachta. 27, 566–572 (2006).

11. Kawai, T. & Akira, S. TLR comharthaíochta. Difríocht Bás Cille. 13, 816–825 (2006).

12. Deng, L. et al. Teastaíonn coimpléasc einsím comhchuingeach ubiquitin dimeric agus slabhra polyubiquitin uathúil chun coimpléasc kinase IkappaB a ghníomhachtú ag TRAF6. Cill 103, 351–361 (2000).

13. Ninomiya-Tsuji, J. et al. Is féidir leis an kinase TAK1 an NIK-I kappaB chomh maith leis an easghluaiseachta kinase MAP sa chonair chomharthaíochta IL-1 a ghníomhachtú. Nádúr 398, 252–256 (1999).

14. Takaesu, G. et al. Déanann TAB2, próitéin oiriúntóra nua, gníomhachtú TAK1 MAPKKK a idirghabháil trí TAK1 a nascadh le TRAF6 sa chonair aistrithe comhartha IL-1. Mol. cill. 5, 649–658 (2000).

15. Traslonnú idirghabhálaithe Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm ar TRAF6 agus TAB2 san idirleukin-1-gníomhachtú spreagtha NF-kappa BJ Biol. Ceimic. 276, 41661–41667 (2001).

16. Ceann, Q. et al. Idirghníomhú agus maolú E2 i struchtúr criostail TRAF6. Nát. Struchtúr. Mol. Biol. 16, 658–666 (2009).

17. Wang, C. et al. Is kinase ubiquitin-spleách de MKK agus IKK é TAK1. Nádúr 412, 346–351 (2001).

18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF Cell feidhm chineál-sonrach TAK1 i comharthaíocht imdhíonachta dúchasach. Treochtaí Imdhíonachta. 34, 307–316 (2013).

19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW & Cohen, P. Casadh gan choinne ar ghníomhachtú IKKbeta: Cuireann TAK1 tús le IKKbeta lena ghníomhachtú trí uathphosphorylation. Bithcheimic. J. 461, 531–537 (2014).

20. Emmerich, CH et al. Coimpléasc canónach IKK a ghníomhachtú ag slabhraí ubiquitin hibrideacha nasctha K63/M1-. Proc. Natl Acad. Sci.110, 15247–15252 (2013).

21. Kawai, T. et al. Tá idirghníomh díreach IRF7 le MyD88 agus TRAF6 i gceist le hionduchtú interferon-alfa trí ghabhdóirí cosúil le Dola. Nát. Imdhíonól. 5, 1061–1068 (2004).

22. Kitagawa, Y. et al. Cuireann víreas parainfluenza daonna de chineál 2 V cosc ​​ar uibítíniúchán TRAF de IRF7 chun ionduchtú interferon cleithiúnaí TLR{7- agus TLR9- a chosc. J. Víreas. 87, 7966–7976 (2013).

23. Kawai, T. et al. IPS-1, cuibheoir a spreagann ionduchtú interferon cineál I trí mheán RIG-I- agus Mda. Nát. Imdhíonól. 6, 981–988 (2005).

24. Zust, R. et al. Soláthraíonn Ribose 2'-O-methylation síniú móilíneach chun idirdhealú a dhéanamh idir mRNA féin agus neamh-féin ag brath ar an braiteoir RNA Mda5. Nát. Imdhíonól. 12, 137–143 (2011).

25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ Aithint agus tréithriú MAVS, próitéin comharthaíochta frithvíreasacha mitochondrial a ghníomhaíonn NF kappaB agus IRF 3. Cill 122, 669-682 (2005).

26. Xu, LG et al. Is próitéin oiriúnaithe é VISA a theastaíonn le haghaidh comharthaíocht béite IFN a spreagtar le víreas. Mol. cill. 19, 727–740 (2005).

27. Yoshida, R. et al. Tá ról lárnach ag TRAF6 agus MEKK1 i gcosán frithvíreasach héileaáis cosúil le RIG-I. J. Biol. Ceimic. 283, 36211–36220 (2008).

28. Liu, S. et al. Earcaíonn MAVS il-ligáis ubiquitin E3 chun cascáidí comharthaíochta frithvíreasacha a ghníomhachtú. Elife 2, e00785 (2013).

29. Ivashkiv, LB & Donlin, LT Rialachán de chineál I freagraí interferon. Nát. Ath. Immunol. 14, 36–49 (2014).

30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. Meicníocht aistrithe ubiquitin arna chur chun cinn ag TRAF6. Proc. Natl Acad. Sci. 115, 1783–1788 (2018).

31. Boone, DL et al. Tá an einsím modhnaithe ubiquitin A20 ag teastáil chun freagraí gabhdóirí cosúil le Dola a fhoirceannadh. Nát. Imdhíonól. 5, 1052–1060 (2004).

32. Kovalenko, A. et al. Déanann an suppressor meall CYLD rialáil diúltach ar chomharthaíocht NF kappaB trí dhí-fhístiú. Nádúr 424, 801–805 (2003).

33. Sé, X. et al. Rialaíonn USP2a gníomhachtú NF kappaB béite-spreagtha agus víreas-spreagtha IL{-1trí TRAF6 a dhíchaipitliú. J. Mol. Cill Biol. 5, 39–47 (2013).

34. Xiao, N. et al. Díríonn protease 4 (USP4) a bhaineann go sonrach le Ubiquitin 4 (USP4) le TRAF2 agus TRAF6 le haghaidh dí-ubiquitin agus cuireann sé cosc ​​ar imirce cille ailse de bharr TNFalpha. Bithcheimic. J. 441, 979–986 (2012).

35. Tá Yasunaga, J., Lín, FC, Lu, X. & Jeang, KT Ubiquitin-shonrach peptidase 20 dírithe ar TRAF6 agus víreas leoicéime cealla T daonna cineál 1 cánach chun comharthaíocht NF-kappaB a rialáil go diúltach. J. Víreas. 85, 6212–6219 (2011).

36. Rialaíonn Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O gníomhachtú NF-kappaB trí idirghabháil TRAF trí chosc a chur ar ilchumhacht TRAF6. Cill Res. 23, 366–377 (2013).

37. Wi, SM et al. TAK1-Tá ról lárnach ag coimpléasc ECSIT-TRAF6 sa chomhartha TLR4 chun NF-kappaB a ghníomhachtú. J. Biol. Ceimic. 289, 35205–35214 (2014).

38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY Mar thoradh ar chosc ar ghníomhaíocht ubiquitin-ligase TRAF6 ag PRDX1 cuirtear cosc ​​ar ghníomhachtú NFKB agus ar ghníomhachtú autophagy. Útphagy 14, 1347–1358 (2018).

39. Jiao, S. et al. Cuireann an kinase MST4 teorainn le freagraí athlastacha trí phosphorylation díreach ar an adapter TRAF6. Nát. Imdhíonól. 16, 246–257 (2015).

40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 agus Calpain-2: Ceann agus Yang na Plaistigh Shionaptach agus Néar-mheathghiniúna. Treochtaí Neurosci. 39, 235–245 (2016).

41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Imirce cille a rialáil: déanann calpains an gearradh. J. Cill Sci. 118, 3829–3838 (2005).

42. Katsube, M. et al. Rialú Calpain-idirghabhála ar na conairí comharthaíochta sainiúla agus imirce cille i neodrófail daonna. J. Leucoc. Biol. 84, 255–263 (2008).

43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Éifeachtaí coiscthe caipitilin ar dhíghrádú alfa IkB tar éis gníomhachtú PBMCanna: sainaithint na suíomhanna scoilteachta calpain. Neurochem. Res. 29, 1443–1451 (2004).

44. Tompa, P. et al. Ar na deitéarmanaint seicheamhach de scoilteachta calpain. J. Biol. Ceimic. 279, 20775–20785 (2004).

45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL Sainiúlacht tsubstráit peptide do mu-calpain a chinneadh trí chur chuige peptide leabharlann-bhunaithe: an tábhacht a bhaineann le hidirghníomhaíochtaí taobh primed. J. Biol. Ceimic. 280, 40632–40641 (2005).

46. ​​DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Tuar scoilteachta Calpain ag baint úsáide as foghlaim eithne iolrach. PLoS a hAon. 6, e19035 (2011).

47. Rialaíonn Shi, CS & Kehrl, JH TRAF6 agus A20 63-uithláithriú nasctha Beclin-1 lísín chun uathphagaireacht spreagtha TLR a rialú. Sci. Comhartha. 3, ra42 (2010).

48. Loo, YM & Gale, M. Comharthaíocht Imdhíonachta ag Gabhdóirí cosúil le RIG-I. Díolúine 34, 680–692 (2011).

49. Ling, T. et al. Cuireann TARBP2 bac ar ghníomhachtú IRF7 trí uileláithreacht nasctha TRAF de IRF7 a shochtadh. Mol. Imdhíonól. 109, 116–125 (2019).

50. Zhou, Z. et al. Rialaíonn Zebrafish otud6b freagairtí frithvíreasacha go diúltach trí uileláithreacht K63-nasctha irf3 agus irf7 a shochtadh. J. Imdhíon. 207, 244–256 (2021).

51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. Ról TRAF6 in aistriú comhartha agus freagairt imdhíonachta. Miocróib Infect. 6, 1333–1338 (2004).

52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, droichead móilíneach a chuimsíonn díolúine oiriúnaitheach, díolúine dúchasach, agus osteoimdhíoneolaíocht. Bioessays 25, 1096–1105 (2003).

53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: struchtúir, feidhmeanna, meicníochtaí. Bithchim. Bithfhis. Acht. 1695, 55–72 (2004).

54. Slabhraí Pickart, CM & Fushman, D. Polyubiquitin: comharthaí polaiméire próitéine. Curr. Tuairim. Ceimic. Biol. 8, 610–616 (2004).

55. Lamothe, B. et al. Is chinntitheach ríthábhachtach de ghníomhachtú I kappa B kinase é an Lys atá sainiúil don láithreán(-63-receptor fachtóir neacróis siadaí nasctha fachtóir gaolmhar 6 auto-ubiquitination). J. Biol. Ceimic. 282, 4102–4112 (2007).

56. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Tumor neacróis fachtóir-alfa-inducible próitéolaíocht IkappaBalpha idirghabháil ag cytosolic m-calpain. Meicníocht atá comhthreomhar leis an gcosán ubiquitin-proteasome do ghníomhachtú fachtóir núicléach-kappa B. J. Biol. Ceimic. 274, 787–794 (1999).

57. Chu, Q. et al. Feabhsaíonn Ciorclán Ardchaomhnaithe RNA circRasGEF1B Imdhíonacht Frithvíreasach trí MiR-21-3p/MITA Conair i veirteabraigh Íochtaracha a Rialáil. J. Víreas. 95, e02145–20 (2021).

58. Tugann Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a aslú uathphagy chun comharthaíocht NF-kappaB agus apoptosis a bhlocáil chun ionfhabhtú Vibrio harveyi a éascú. iEolaíocht 26, 106105 (2023).

59. Sepulcre, MP et al. Aithint agus comharthaíocht lipopolysaccharide (LPS) a éabhlóid: ní aithníonn iasc TLR4 LPS agus rialaíonn sé gníomhachtú NF kappaB go diúltach. J. Imdhíon. 182, 1836–1845 (2009).

60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. Rialaíonn an noncoding fada RNA NARL freagairtí imdhíonachta trí íosrialáil NOD1 microRNA-idirghabhála in iasc teleost. J. Biol. Ceimic. 296, 100414 (2021).

61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Imlitir Exon-Intron RNA circRNF217 Cothaíonn Imdhíonacht Dhúchais agus Gníomhaíocht Fhrithbhaictéarach in Éisc Teileost trí miR-130-3p a Laghdú Feidhm. J. Imdhíon. 208, 1099–1114 (2022).

62. Déanann Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Rhabdovirus-inducible microRNA-210 freagairt imdhíonachta dúchasach frithvíreasach a mhodhnú trí dhíriú ar STING/MITA in iasc. J. Imdhíon. 201, 982–994 (2018).

63. Bi, D. et al. Aitheantas do Lipopolysaccharide agus Gníomhachtú NF-kappaB ag Braiteoir Cytosolic NOD1 in Éisc Teleost. Tosaigh. Imdhíonól. 9, 1413 (2018).

64. Déanann Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 agus IRF8 Comharthaíocht NF-kappaB a rialáil trí Dhíriú ar MyD88 in Éisc Teleost. Tosaigh. Imdhíonól. 11, 606 (2020).

65. Cuireann Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k cosc ​​ar chomharthaíocht NF-kappaB trí dhíriú ar MyD88 le haghaidh díghrádaithe uathphagacha trí mheán ATG in iasc teileost. J. Biol. Ceimic. 298, 101730 (2022).

B’fhéidir gur mhaith leat freisin