Spreagann Ionduchtú Imdhíonachta Imeallach oilte sa Phaincréas Gníomhaíocht Frith-mheall Chun Dul Chun Cinn Ailse Paincréasach a Rialú Cuid 2

Plé

Cé go raibh an gháinneáil ar -glúcán tréithrithe roimhe seo, níor tuairiscíodh sain-trópachas -glúcáin go dtí an briseán37 roimhe seo37. Léirímid gur féidir le -glúcán cáithníneach trácht go díreach isteach sa briseán agus is féidir é a fhagaicítí freisin ag macrophages a théann isteach sa briseán ansin. Níl an caidreamh idir an cuas peritoneal agus an briseán sainmhínithe go maith, agus d'aithin staidéir a bhaineann le pathophysiology pancreatitis géarmhíochaine (AP) go bhfuil macrophages peritoneal ina phríomh-ranníocóirí don fhreagra athlastach in AP, rud a thacaíonn le nasc idir an peritoneum. agus an briseán38.

Léiríonn ár sonraí íomháithe go deimhin gur macraifítí peritoneal a dhéanann trácht go príomha ar an briseán chuig an briseán le lipéad iseatóp fagaicíotóis. Thug staidéir ar ghortú ae tacaíocht bhreise don mhúnla seo d’idirmhalartú dinimiciúil cealla idir an cuas peritoneal agus na horgáin soladacha atá neamhspleách ar an gcúrsaíocht 39. Le chéile tugann sé seo le tuiscint go bhfuil leibhéal bunúsach de mhalartú cille imdhíonachta idir an briseán fiú i gcoinníollacha homeostatacha. agus cuas peritoneal ar féidir a shaothrú i suíomh cáithníneach -glúcán.

Is cuid thábhachtach de chóras imdhíonachta dúchasach an chorp daonna iad Macrophages agus tá feidhmeanna cumhachtacha acu maidir le baictéir agus substaintí eachtracha a aithint, a phagocytizing agus a bhaint. Periodontitis, galar tógálach ainsealach arb iad is sainairíonna athlasadh gingival agus caillteanas cnámh alveolar, is é an príomhchúis le caillteanas fiacail i ndaoine fásta. Tá sé soiléir anois gurb é freagairt imdhíonachta an óstaigh ar ionfhabhtú ba chúis le scrios fíocháin periodontitis, agus tá ról tábhachtach ag macrophages, mar chuid thábhachtach de fhreagra imdhíonachta an óstaigh, maidir le tarlú agus forbairt athlasadh.

Dá bhrí sin, ní mór dúinn díolúine a fheabhsú inár saol laethúil. Inár dtaighde, fuaireamar amach gur féidir le Cistanche díolúine a fheabhsú. Nuair a chuirtear Cistanche isteach in uisce fiuchphointe chun tae Cistanche a dhéanamh, agus é a ól 1-2 uair sa lá is féidir feabhas a chur ar fheidhm imdhíonachta an chomhlachta toisc go bhfuil comhábhair ghníomhacha ann, mar shampla polaisiúicrídí, flavonoids, alcalóidigh, etc., ar féidir leo feabhas a chur ar an gcóras imdhíonachta. feidhm imdhíonachta an chomhlachta. Ag an am céanna, is féidir díolúine a fheabhsú trí Cistanche a chur le anraith nó leite, uair nó dhó sa tseachtain.

Cliceáil chun eolas a fháil ar tháirge cistanche íon

Cé go ndearna an staidéar seo imscrúdú ar WGP cáithníneach -glúcán, d'fhéadfadh sé a bheith suimiúil freisin imscrúdú a dhéanamh an léiríonn -glúcán giosta intuaslagtha intuaslagtha meicníocht trópaiceach agus comharthaíochta laistigh den briseán. Is eol go ndéanann -glúcáin cháithníneach comhartha go díreach trí Dectin-1, agus meastar go bhfeidhmíonn -glúcáin intuaslagtha trí chonair spleách CR chun a n-airíonna frith-meall a fheidhmiú40,41. Léirigh staidéar amháin go raibh gáinneáil chuig an fhuil imeallach agus APCanna sa pheireitéin, sa spleen agus sa smior mar thoradh ar riaradh IP de ghlúcán intuaslagtha, rud a thugann le fios go bhféadfadh cumas comhchosúil díolúine oilte a ghníomhachtú in ainneoin na meicníochtaí comharthaíochta móilíneacha éagsúla42. Mar sin féin, ós rud é go léiríonn ár gcuid sonraí go bhfuil an gháinneáil seo ag brath ar Dectin-1, ní fhéadfaidh ach glúcán cáithníneach gáinneáil dhíreach chuig an briseán a léiriú trí cháithníneach agus intuaslagtha araon a d'fhéadfadh meicníochtaí díolúine oilte a thionscnamh.

Ina theannta sin, léiríonn staidéir roimhe seo arb iad is sainairíonna iad gáinneáil glúcáin intuaslagtha infhéitheach gáinneáil chuig an spleen, na duáin agus an ae, cé nach luann trópaiceas chuig an briseán43. Toisc nár ceapadh go raibh an briseán ina sprioc gáinneála glúcáin roimhe seo ní léir an ndearnadh staidéar ar an briseán riamh nó nach dtarlaíonn gáinneáil pancreatach.

Ba cheart go dtabharfadh staidéir amach anseo aghaidh ar bhithdháileadh glúcáin intuaslagtha agus cáithníneach ar bhealaí éagsúla riaracháin.

-Tá tionchar ilfhachtóiriúil ag gáinneáil ghlúcáin chuig an briseán ar na daonraí imdhíonachta laistigh den briseán. Ar an gcéad dul síos, bíonn tionchar díreach ag teacht an ghlúcáin go dtí an briseán ar na daonraí de mhacrophages cónaitheach M2 imdhíon-shochtadh atá i láthair laistigh den briseán arb eol dóibh a bheith tábhachtach chun siadaí briseán a chur chun cinn. Léirigh sonraí CyTOF agus scRNA-Seq imithe beagnach iomlán den daonra macrafagaí cónaitheach 7 lá tar éis riarachán WGP. Is díol spéise é go dtagann cealú an daonra macrophage cónaitheach go díreach le cuma chómhalartach de dhaonra macrophage Ly6Clo. Tá marcóirí feinitíopacha cosúil leis an daonra cónaitheach ar an daonra macrophage Ly6Clo seo, cé go sceabhach níos mó i dtreo feinitíopa M1.

Is dócha mar sin go dtiocfaidh macrófaigí cónaitheacha i dteagmháil le -glúcán a rinne gáinneáil chuig an briseán agus déantar na cealla seo a athpholarú, dá bhrí sin ag glacadh le feinitíopa ceallacha éagsúla a chruthaíonn cnuasach uathúil mar thoradh air. Ar an dara dul síos, is é an toradh a bhíonn ar theacht na glúcáin go dtí an briseán ná comharthaíocht receptor chemokine/chemokine aimplithe a earcaíonn Ly6CHi pro-inflammatory macrophages díorthaithe monocyte ón imeall go dtí an briseán. Fiche ceithre huaire an chloig tar éis WGP a riar, faightear amach go méadaítear leibhéil CCL2 i lísáití pancreatacha iomlána faoi 30-huaire. Dá réir sin, léirímid go bhfuil an sní isteach ceallach láidir -spleách ar ghlúcán chuig an briseán ag brath ar CCR2.

Cé go ndírímid ar dhinimic na hurrann myeloid mar gheall ar an tábhacht a breathnaíodh a bhaineann le comharthaíocht CCR2/CCL2, bhí feabhsú tosaigh suimiúil ar bhraisle 11 ar an 3ú lá agus ansin imithe ar ceal faoin lá 7 tar éis cóireála WGP. Ba shaintréith é Braisle 11 mar ILC2anna bunaithe ar shloinneadh roinnt marcóirí ar nós KLRG1, IL-5, IL-13, agus ICOS. Is eol gur cealla fadtéarmacha fíocháin-chónaitheacha iad ILC2anna44. Tá sé léirithe ag staidéir le déanaí go spreagann gníomhachtú ILC2anna áitiúla le haláraim a bhaineann go sonrach le fíocháin a n-iomadú, a n-imirce nód lymph, agus scaipeadh fola. Tá sé léirithe go dtéann ILC2anna ó roinnt fíocháin, mar an gut agus an scamhóg, isteach san fhuil trí easbhrúite ó na fíocháin suaite seo agus go n-imíonn siad go fíocháin eile ar nós an ae44-46.

D'fhéadfadh meicníocht den sórt sin míniú a thabhairt ar an méadú tosaigh agus ansin ar imithe ILC2anna sa briseán. Ós rud é go bhfuil baint ag ILC2anna le déanaí le freagairt siadaí pancreatacha ar imdhíonteiripe47, tá gá le tuilleadh taighde a imscrúdaíonn tionchar WGP agus tús le himdhíonacht oilte ar dhaonra ILC2 na briseán.

Cé go bhfuil sé tábhachtach ann féin sní isteach de chealla imdhíonachta pro-inflammatory chuig an briseán a thionscnamh, is é an CCR2 móide Ly6CHi daonraí macrophage díorthaithe monocyte ó na gnéithe taispeána imeallacha den díolúine oilte a iompraíonn na himpleachtaí is tábhachtaí mar ionduchtú níl díolúine oilte imeallach sa briseán tréithrithe fós. Tá baint ag an imdhíonacht oilte spreagtha seo freisin le hathchlárú meitibileach agus eipigineach.

Cé gur eol go bhfuil CCR2 ina ghabhdóir tábhachtach in earcú monocytes, is é seo an chéad léiriú freisin go bhfuil comharthaíocht CCR2 ar mhonaicítí riachtanach chun díolúine oilte imeallach a bhunú. Tugtar faoi deara go bhfuil CCR2 móide monocytes/macrophages nasctha le meatastasis siadaí agus dul chun cinn48,49. Mar sin féin, tugann ár sonraí le fios go n-imríonn earcaíocht CCR2 athchláraithe, oilte chomh maith le monaicítí/macrophages éifeachtaí frith-meall láidir.

Léirítear é seo go díreach inár dturgnamh admix nuair a léirigh lucha a fuair CCR2 móide cealla myeloid ó lucha oilte WGP ualach siadaí laghdaithe go suntasach i gcomparáid le lucha a fuair cealla myeloid CCR ón luch oilte céanna.

De réir mar a thaispeánaimid go bhfuil imdhíonacht oilte imeallach bunaithe sa briseán, iarraimid an bhféadfadh cealla meall nó a bhfachtóirí secreted na cealla seo a athghníomhú. Léiríodh go spreagfaí freagairt oilte go bríomhar nuair a nochtaítear cealla mialóideacha pancreatacha in vivo WGP-oilte do mheáin siadaí. Tá Kalafati et al. léirigh le déanaí go bhfuil ról ag granulocytes i meicníochtaí oilte frith-meall atá tiomáinte ag imdhíonacht21, áfach, ag cur san áireamh a n-úsáid samhlacha subcutaneous ailse, is é an staidéar a thuairiscítear faoi láthair ar an gcéad dul síos a thugann le tuiscint gur féidir cealla myeloid in orgán ar leith a oiliúint chun freagairt go díreach do. cealla meall an orgáin chéanna sin.

Tá sé bunaithe go maith go bhfuil cealla myeloid in ann cealla meall a mharú go díreach trí mheicníochtaí fagaicíotóis agus táirgeadh ROS50-54, agus anseo léirímid go rialaíonn oiliúint WGP go suntasach feidhmiúlachtaí díreacha frith-meall fagaicíotóis feabhsaithe na gcealla meall agus cíteatocsaineacht ROS-mheánach chun cealla meall.

Ina theannta sin, cé go n-aibhsímid gur féidir le meáin oiriúnaithe siadaí cealla myeloid oilte a athghníomhú, sainaithnímid freisin fachtóir sonrach, MIF, sna meáin oiriúnaithe siadaí atá páirteach sa ghníomhachtú seo. Tugann na sonraí seo le fios go bhféadfadh ionduchtú díolúine oilte a bheith rannpháirteach i meicníochtaí faireachais imdhíonachta siadaí. Mar shampla, sna céimeanna tosaigh d'fhorbairt siadaí, cuireann siadaí fachtóirí intuaslagtha ar fáil a fhéadfaidh cealla dúchasacha oilte a ath-spreagadh as a dtiocfaidh díothú na gcealla meall seo.

Ansin aistrímid an tuiscint seo ar fhéidearthacht frith-meall na gcealla dúchasacha myeloid oilte a théann isteach sa briseán go samhlacha ortatopacha de PDAC, áit a bhfeicimid laghdú suntasach ar ualach siadaí agus méadú ar mharthanas na lucha mar gheall ar riar amháin de. WGP. Léirímid freisin gurb iad na cealla atá freagrach as rialú siadaí go príomha CCR2 móide cealla díorthaithe myeloid. I gcodarsnacht le samhlacha molta eile um rialú siadaí ar dealraitheach go bhfuil siad tiomáinte go hiomlán ag ionduchtú díolúine lár-oilte sa BM21, ina ionad sin, sa tsamhail seo gáinneáil luath WGP chuig an briseán agus táirgeadh CCL2 mar thoradh air sa briseán earcaigh oilte. CCR2 móide cealla myeloid ón imeall atá freagrach go príomha as na héifeachtaí frith-meall. Déanann gáinneáil WGP go díreach chuig an briseán macraí cosúil le fíochán-chónaitheach M a athpholarú i dtreo maicreaphages cosúil le M a d'fhéadfadh srian a chur le dul chun cinn siadaí freisin.

Cé go raibh an laghdú meall a breathnaíodh i lucha ionchlannaithe le siadaí KPC a bhí measctha le CCR2 móide cealla oilte suntasach, ní raibh sé chomh buailte agus a bhí i lucha a tugadh IP WGP dóibh. Tacaíonn sé seo go bhfuil dhá ghné ag éifeachtaí frith-meall IP WGP; Oibríonn earcú CCR2 móide cealla mieloid frith-meall oilte chuig an briseán agus athpholarú macraí cónaithe pro-tumorigenic le chéile chun freagairtí dúchasacha frith-meall a fháil as a dtagann laghdú ar ualach siadaí i múnlaí PDAC.

Tugaimid faoi deara freisin léiriú ard MHCII ar na monocyte/macrophages oilte seo, a bhfuil ról acu, is dócha, i bpróiseáil antaigin siadaí agus i gcumarsáid le T-chealla chun freagairtí imdhíonacha oiriúnaitheacha a fháil i gcoinne an siadaí. Is díol spéise é, cé gur dheimhnigh muid nach bhfuil na meicníochtaí frith-meall seo ag brath ar fhreagraí imdhíonachta oiriúnaitheacha, thugamar faoi deara méadú suntasach ar CD8 móide T-chealla i láthair laistigh de CCR2 móide siadaí ad-mheasctha. Ina theannta sin, ós rud é gur tugadh faoi deara go raibh leibhéil arda PD-L1 ar taispeáint ag cealla myeloid sna siadaí agus go raibh an chuma air go raibh CCR2 móide cealla oilte sa briseán ag earcú CD8 móide T-chealla, rinneamar réasúnaíocht go bhféadfadh WGP éifeachtaí an fhrith-chealla a neartú. -PD-L1 teiripe.

De réir na litríochta, ní raibh aon tairbhe mharthanaigh ag teiripe frith-PD-L1 mAb amháin agus rinneadh sineirgíocht ar an gcomhcheangal de WGP agus frith-PD-L1 chun torthaí marthanais níos fearr a bhaint amach ná mar a bhí WGP amháin55. Tugann sé seo le tuiscint go bhféadfadh cealla imdhíonachta dúchasacha oilte cealla imdhíonachta oiriúnaitheacha a ghníomhachtú sa TME, áfach, is dócha go gcaithfidh éifeachtaí comhréire frith-PD-L1 an micrea-thimpeallacht imdhíonachta a shárú a thuilleadh. Rud atá tábhachtach, in ainneoin marthanacht feabhsaithe, ghéill na lucha go léir don siad sa deireadh, agus mar sin tá gá le himscrúduithe amach anseo ar bharrfheabhsú na cóireála seo i dtéarmaí dosála agus líon na gcóireálacha.

Tá ról ríthábhachtach ag cealla myeloid imdhíon-bhrú i gcruthú an TME imdhíon-bhrú i PDAC. Anseo, léirímid cumas na cealla myeloid seo a chur i mbun socrú PDAC trí imdhíonacht dhúchasach oilte a ionduchtú sa briseán.

Rud atá tábhachtach, léirímid freisin go gcuireann an cumas chun imdhíonacht oilte a thionscnamh sa briseán éifeachtaí teiripeacha imdhíonteiripe cosúil le teiripe imshuí imdhíon-seicphointí frith-PD-L1. Agus infheidhmeacht chliniciúil bhreise á tabhairt ar iasacht do na torthaí seo, léirímid freisin gur féidir le hionduchtú díolúine oilte sa suíomh aidiúvach méid siadaí a laghdú agus maireachtáil a fhadú. Leagann na torthaí seo béim ar an bpoitéinseal a bhaineann le húsáid -glucan chun díriú go teiripeach ar chealla myeloid laistigh den TME agus aibhsíonn siad go bhféadfadh ról iarmhartach a bheith ag ionduchtú díolúine oilte imeallach sa briseán in athchlárú TME suppressive PDAC a d'fhéadfadh síneadh a chur le saol na n-othar. diagnóisíodh leis an malignancy marfach seo.

Modhanna

Ráiteas eiticiúil.

Rinneadh na turgnaimh go léir a bhain le hainmhithe de réir na dtreoirlínte eiticiúla a leag Coiste um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Institiúideach Ollscoil Louisville síos. Rinneadh turgnaimh de réir na bprótacal ceadaithe 19471 agus 19536.

lucha.

Baineadh úsáid as lucha fireanna agus baineanna idir sé agus ocht seachtaine d'aois i ngach turgnamh. Ceannaíodh lucha de chineál fiáin (WT) C57BL/6 J ó Shaotharlann Jackson (Bar Harbor, ME, SAM) nó tógadh iad i saoráid ainmhithe saor ó phataiginí (SPF) atá sainiúil ag Ollscoil Louisville. Rinneadh cur síos ar lucha C57BL/6 Dectin-1 knockout (Dectin-1 -/ -) roimhe seo56. Ceannaíodh lucha cnagála domhanda CCR2 ó Jackson Laboratory. Sholáthair an Dr Jonathan Warawa lucha Albino C57BL/6 in Ollscoil Louisville. Ceannaíodh lucha NOD/SCID/IL2r Null (NSG) ó Shaotharlann Jackson. Ní mó ná 2000 mm3 an t-uasmhéid siadaí a cheadaigh an IUCAC. Rinneadh monatóireacht laethúil ar lucha le haghaidh fás siadaí agus euthanized nuair a sháraigh an t-ualach meall an méid teoranta. Coinníodh lucha ar thimthriall 12-h dorcha/éadrom ag teocht an tseomra le taise rialaithe (thart ar 55 faoin gcéad ).

Cuireadh gach ainmhí i saoráid bhacainn agus níor úsáideadh ach lucha sláintiúla le haghaidh turgnamh. Bhí gach lucha 6 seachtaine d’aois ar a laghad buailte linn, agus rinneadh gach turgnamh a bhain le hainmhithe de réir na ndlíthe ábhartha agus na dtreoirlínte institiúideacha go léir a chuir an Áis Tógála Creimirí (RRF) ar fáil agus a cheadaigh an Coiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe (IACUC). de chuid Ollscoil Louisville.

Ullmhú -glúcán.

Chuir Biothera -glúcán cáithníneach an-íonghlanta ar fáil i bhfoirm cáithníní glúcáin iomláin (WGP) scoite ó Saccharomyces cerevisiae. Roimh úsáid, rinneadh WGP a sonicated go réidh ar feadh 15 s, dhá uair ag baint úsáide as Qsonica Q55-110 Q55 Sonicator (Cole-Parmer) chun a chinntiú go raibh comhiomláin briste suas.

DTAF-WGP a ullmhú agus a úsáid.

Meascadh DTAF (Sigma-Aldrich) ag 2 mg/mL le fionraí de 20 mg/mL WGP i maolán bóráit (pH 10.8). Goradh é seo ag teocht an tseomra ar feadh 8 h le meascadh leanúnach. Tar éis goir, lártheifneoiríodh an WGP agus nite le DPBS fuar steiriúil saor ó endotoxin (Sigma-Aldrich) cúig huaire nó go dtí nach raibh DTAF infheicthe ag an bhfeitheoir a thuilleadh. Coigeartaíodh an tiúchan go 10 mg/mL sa DPBS saor ó endotoxin le haghaidh stórála. Tá thart ar 1 mg den DTAF-WGP tar éis IP a instealladh isteach C57BL/6 agus Dectin-1 -/ - baineadh lucha agus orgáin 3 lá ina dhiaidh sin.

Ullmhú an 89Zr-WGP.

Measctha WGP (100 mg) le DeferoxamineSCN (2.7 mg, i 0.8 ml DMSO) agus ar fionraí i maolán carbónáit sóidiam 10 ml (0.1 M, pH 9.4) thar oíche ag teocht an tseomra sa dorchadas le croitheadh ​​​​milis. Ansin nite an WGP lipéadaithe Deferoxamine le huisce DI (10 × 40 mL), agus meascadh 30 mg de WGP lipéadaithe Deferoxamine le 3 mCi de 89Zr oxalate i maolán Tris•HCl 2 ml (0.5 M, pH 7.5), agus gor ansin ag 37 oC ar feadh 60 nóiméad agus é a chroitheadh. Rinneadh an 89Zr-WGP a lártheifneoiriú ansin agus nite le 3 ml de PBS steiriúla. Rinneadh radaighníomhaíocht 89Zr-WGP a thomhas le calabróir dáileoige agus úsáideadh é le haghaidh staidéir in vitro agus in vivo.

Bithdháileadh agus scanadh PET/CT ag úsáid 89Zr-WGP.

Rinneadh íomháú tomagrafaíocht astaithe Positron (PET)/tomagrafaíocht ríofa (CT) i C57BL/6 agus Dectin-1 -/ - lucha 48 h tar éis instealladh IP de 1 mg de 89Zr-WGP íon nó instealladh de 1 × 106 peritoneal macrophages a bhí comhshaothraithe le 25 ug/ml de 89Zr-WGP ar feadh 2 h agus ansin nite go réidh chun barrachas 89Zr-WGP a bhaint. Scanadh na lucha ar feadh 15 nóiméad le Siemens R4 MicroPET agus 10 nóiméad de scanadh CT ina dhiaidh sin. Baineadh úsáid as bogearraí Siemens IAW chun an comhartha PET a fháil agus a athchruthú, agus úsáideadh bogearraí Siemens IRW chun na sonraí íomháithe a chumasc agus a anailísiú.

Ag deireadh an staidéir íomháithe, rinneadh lucha a eothánú, agus baineadh orgáin leasa. Le haghaidh bithdháilte, bailíodh 50 ul d'fhuil imeallach ag baint úsáide as teicníc fuilithe retro-bulbar. Baineadh an inchinn, croí, scamhóga, ae, spleen, duáin, briseán, stéig mhór, stéig bheag, boilg, femur, píosa craiceann ó thaobh na lucha, agus an muscle rectus femoris, a mheá, agus a chur i a. 2470 Treoraí cuntar gáma uathoibríoch (PerkinElmer) chun radaighníomhaíocht gach fíocháin a thomhas. Ríomhadh na luachanna CPM ag baint úsáide as bogearraí Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Próiseáil pancreatach.

Tar éis eotanúcháin, baineadh an briseán luiche agus gearradh go réidh i bpíosaí níos lú ag baint úsáide as siosúr steiriúla. Cuireadh ar fionraí iad i bhfeadán 15 ml i meán iomlán (RPMI) le maolán díleá 1X comhdhéanta de 300 U/ml collagenase I, 60 U/ml Hyaluronidase, agus 80 U/ml DNase (Sigma). Cuireadh iad seo i gorlann rothlach ag 37 céim le 5 faoin gcéad CO2 ar feadh 15-20 nóiméad. Múchadh an maolán díleá ansin le RPMI 1640 iomlán oighearfhuar agus nite. Cuireadh cealla trí scagaire ciseán níolón steiriúil 40 µm agus baineadh píosaí beaga fíocháin nach raibh díleáite ag baint úsáide as stopallán steiriúil steallaire chun fionraí aonchealla a ghiniúint. Má chonacthas go raibh líon suntasach cealla fola dearga (RBCanna) sa sampla, rinneadh lysis RBC trí 2 ml de 10x ACK steiriúil (Thermo Fisher Scientific) a chur leis.

Riarachán WGP in vivo.

Tugadh dáileog amháin intraperitoneal 1 mg de WGP sonicated réidh, coirníní polaistiréin 3 μm (Sigma-Aldrich), nó 3 μm micreasféar fluaraiseacha (Polysciences) do lucha (gach 1 mg in 200 ul de PBS steiriúla) nó 200 ul de PBS steiriúla ar lá 0. Le haghaidh staidéir díolúine oilte go hiondúil, 7 lá tar éis an dáileog IP tosaigh, eotanaíodh lucha ag baint úsáide as CO2, agus baineadh agus próiseáladh an briseán mar aon le fíocháin spéise eile. Maidir le staidéir toirtmheasctha, seachadadh 0.5, 1, agus 2 mg de WGP IP i 200 uL de PBS steiriúla. Le haghaidh staidéir toirtmheasctha ama, rinneadh lucha a instealladh le 1 mg de WGP, agus baineadh an briseán tar éis 24 h, 48 h, 3, 7, 10, 16, agus 30 lá ina dhiaidh sin.

Athspreagadh ex vivo.

Chun feinitíopa oilte cealla aonnúicléacha i lucha a chóireáiltear le WGP nó PBS ex vivo a mheas, tar éis an briseán a phróiseáil, rinneadh fionraí cille pancreatach a phlátáil i 24 pláta tobair agus iad a spreagadh le LPS (10 ng/ml), an comhshamhail ó KPC saothraithe agus Pan02. cealla (40 faoin gcéad ), agus MIF athchuingreach (rMIF)(10 ng/ml). Ba bhronntanas flaithiúil é MIF ón Dr. Robert Mitchell in Ollscoil Louisville agus cuireadh in iúl é, íonghlanadh agus athfhillteadh é mar a thuairiscítear roimhe seo57. Saothraíodh cealla i DMEM agus goraíodh iad ag 37 céim le 5 faoin gcéad CO2 ar feadh 5-6 h i láthair 1X brefeldin A (BioLegend). Baineadh na cealla ansin le scraper cille, nite, millte, agus ansin dhaite le haghaidh léiriú cítocine intracellular.

Oiliúint in vitro agus measúnacht athbheochana.

Plátáladh macrophages peritoneal nó CD11b móide cealla sórtáilte ó briseán luiche i 24-pláta tobair ar feadh 2 h ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO2 chun cealla a cheangal leis na plátaí, agus ina dhiaidh sin bhí na cealla ar snámh go réidh asúite. Rinneadh na cealla ceangailte a ní go réidh le PBS steiriúla agus ansin cuireadh ar fionraí arís iad i 1 ml de DMEM comhdhéanta de 10 faoin gcéad FBS agus 1 faoin gcéad peinicillin / streiptimícin.

Le haghaidh oiliúint tosaigh na gceall, cuireadh 25 ug/ml de WGP cáithníneach, 25 ug/ml de choirníní micrea-cháithníní polaistiréine 3 μm (Sigma-Aldrich), nó 100 ul de PBS leis an tobar cuí agus gor iad ar feadh 24 h. Tar éis 24 h, nitear na toibreacha go réidh chun an spreagadh tosaigh a bhaint agus cuireadh DMEM úr leis agus goraíodh cealla le 5 faoin gcéad CO2 ag 37 céim ar feadh 7 lá. Tar éis 7 lá, rinneadh na meáin a asú, agus cuireadh meáin úra ina n-ionad, agus rinneadh cealla a athspreagadh le LPS (100 ng/mL), comhshamhail de chealla KPC nó Pan02 (40 faoin gcéad), nó PBS mar rialú. Ceithre huaire an chloig is fiche tar éis an spreagadh, baineadh na sútha talún agus úsáideadh iad in ELISA le haghaidh TNF- agus IL-6.

Meáin meall-oiriúnaithe.

Bhí thart ar 1 × 106 cealla KPC nó Pan02 saothraithe i pláta sé-tobar i 4 mL de DMEM iomlán ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO2. Tar éis 3 lá, rinneadh na súnáin a bhaint agus a stóráil ag −80 céim i slánchodanna lena n-úsáid mar mheán riochtaithe siadaí. Mar rialú, próiseáladh briseán luch C57BL/6 isteach i bhfionraí aon chillín agus saothraíodh 1 × 106 de na cealla seo i bpláta sé tobar i 4 mL de DMEM iomlán agus ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO2, agus bailíodh supernatants freisin tar éis 3 lá. Mar rialú, próiseáladh an briseán de lucha naive isteach i bhfionraí aonchealla agus plátáilte i bpláta sé tobar ar feadh 1 lá. Nite cealla neamhghreamaitheacha ar shiúl agus saothraíodh na cealla seo ansin ar feadh 3 lá agus baineadh an súthach.

Fáil macrophages peritoneal.

Rinneadh eotánú ar lucha agus cuireadh 5 ml de RPMI steiriúil isteach sa pheireatóin trí úsáid a bhaint as 25-steallaire tomhsaireachta. Rinneadh massage ar an bolg chun na macrophages peritoneal a shaoradh. Rinneadh incis bheag agus baineadh úsáid as pípéad aistrithe chun an crochadh a bhaint. Ansin nite an cuas peritoneal arís agus arís eile le RPMI fuar agus millíní cealla ag 458 × g.

Cíteiméadracht sreafa.

Cuireadh bac ar fhionraí aonchealla i PBS le 1 faoin gcéad FBS le Bloc Fc murine (frith-CD16/CD32) ag 4 céim ar feadh 15 nóiméad. Ba iad antasubstaintí lipéadaithe fluairochróim le haghaidh inmharthanachta (APC/Cy7) agus marcóirí dromchla CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend), agus CCR2 (Córais T&D). úsáidtear. Tá achoimre ar an bhfaisnéis a bhaineann le gach sreabhadh Abs i dTábla Forlíontach 3. Tar éis 30 nóiméad goir sa dorchadas ag 4 céim , nite cealla le PBS fuar agus scagadh trí scagaire mogalra 40 µm. Fuarthas na samplaí trí úsáid a bhaint as cíteaiméadar FACSCanto II (BD Biosciences) agus rinneadh anailís orthu ag baint úsáide as bogearraí FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Baineadh úsáid as bogearraí FACSDiva leagan 6 in FACSCanto chun na sonraí go léir a fháil.

staining intracellular le haghaidh léiriú cytokines.

Tar éis spreagtha, rinneadh na cealla a dhathú do na marcóirí dromchla inmhianaithe mar a thuairiscítear thuas. Ansin nite na cealla le PBS fuar, agus cuireadh 500 ul de mhaolán fosaithe (Biolegend) leis na feadáin, é a vortexed go hachomair, agus gortha sa dorchadas ag teocht an tseomra ar feadh 20 nóiméad. Cuireadh thart ar 1 ml de mhaolán Permeabilization (Biolegend) leis ansin agus lártheifneoiríodh samplaí ag 458 × g ar feadh 5 nóiméad ag 4 céim agus nigh amháin eile ina dhiaidh sin ag baint úsáide as 1 ml de mhaolán tréscaoilteachta. Athchóiríodh cealla i 200 ul de mhaolán tréscaoilteachta agus dathaíodh cealla le antasubstaintí in aghaidh TNF- , Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6, agus IFN nó an rialú isitíopa faoi seach thar oíche ag 4 céim . Ansin nite, scagadh cealla, agus fuarthas sonraí ag baint úsáide as cíteaiméadar sreafa.

Aonrú FACS CD11b móide macrophages le haghaidh oiliúna in vitro.

Próiseáladh an briseán isteach i bhfionraí aoncheallacha mar a thuairiscítear thuas. Nite cealla le 1 ml de PBS, agus gortha le bloc Fc ar feadh 10 nóiméad ag 4 céim agus ina dhiaidh sin staining le lí inmharthanachta (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5), agus CD11b móide (APC) ar feadh 30 nóiméad ag 4 céim . Níodh cealla le PBS agus cuireadh ar fionraí arís iad i Maolán Rith MACS fuar (Miltenyi Biotech). Rinneadh ViabilityCD45 móide CD11b móide cealla a shórtáil trí úsáid a bhaint as FACS Aria III (BD Biosciences). Bailíodh cealla i 50 faoin gcéad FBS, 40 faoin gcéad PBS, agus 10 faoin gcéad HEPES (Corning). Tar éis iad a shórtáil, nitear na cealla le PBS agus ansin plátáilte iad le haghaidh oiliúna in vitro, mar a thuairiscítear thuas.

ELISA.

Rinneadh anailís ar sháitheoirí ó chealla oilte in vitro mar aon le caighdeáin ag baint úsáide as trealamh murine TNF- agus IL-6 ELISA (BioLegend). Rinneadh an mheasúnacht de réir threoracha an mhonaróra agus rinneadh na coinníollacha go léir i dtrí chóip. Baineadh úsáid freisin as trealamh ELISA do chórais rMIF (T agus D) de réir threoracha an déantóra chun rMIF a chainníochtú i meáin siadaí Pan02 agus KPC agus an súthach ó chealla pancreatacha saothraithe neamhchóireáilte. Chun modhnuithe histone a chainníochtú, ceannaíodh feisteáin ELISA (trealamh cainníochtaithe trí-mheitil histone H3K4, trealamh cainníochtaithe Aicéitil-histone H3K27, trealamh cainníochtaithe trí-mheitile H3K27, agus trealamh cainníochtaithe iomlán histone H3) ó EpiGentek agus rinneadh measúnachtaí bunaithe ar thástálacha an mhonaróra. treoracha. Rinneadh Lactate a thomhas le L-Lactate assay Kit I (Eton Bioscience).

Anailís blot an Iarthair.

Scaradh CD11b móide cealla ó lucha PBS-insteallta nó WGP-instealladh (24 h) ag baint úsáide as miocróibíní CD11b (Miltenyi Biotech). Baineadh Histone de réir threoir an mhonaróra (Active Motif, Inc.), agus socraíodh tiúchan próitéine ag baint úsáide as cainníochtú Bradford. Scaradh próitéiní histone le glóthacha Tris-HCl 15 faoin gcéad SDS-PAGE agus aistríodh iad chuig seicní PVDF (Millipore). Cuireadh bac ar an scannán le 5 faoin gcéad BSA ag teocht an tseomra ar feadh 1 h agus gor é thar oíche ag 4 céim le antasubstaintí bunscoile lena n-áirítear tri-meitil-histone H3 (lys4) coinín mAb, aicéitil-histone H3 (lys27) XP Coinín mAb, trí-meitil -histone H3 (Lys27) Coinín mAb, agus histone H3 XP coinín mAb (Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille), gortha ansin le HRP-chomhchuingeach antasubstaintí tánaisteacha (GE Healthcare) ag teocht an tseomra ar feadh 1 h. Forbraíodh an scannán le Amersham ECL Prime Western Blotting Braite Imoibrí (GE Healthcare) agus braitheadh ​​é trí Phróiseálaí Scannán Leighis (Konica Minolta Medical & Graphic). Kaleidoscope Próitéin Precision Plus Baineadh úsáid as Caighdeáin Phróitéin Daingnithe mar mharcóir caighdeánach próitéine (Bith-Rad).

qRT-PCR.

Tar éis CD11b móide cealla a leithlisiú ón briseán luiche i lucha WGP-chóireáilte agus neamhchóireáilte, sábháladh cealla i TRIzol. Rinneadh RNAanna a leithlisiú agus tras-scríofa droim ar ais ag baint úsáide as an aimpliú TaqMan Reverse Trascription Reagents (qRTPCR) ag baint úsáide as an gcóras braite aon-dath RT-PCR Bio-Rad MyiQ. Go hachomair, méadaíodh cDNA i meascán imoibrithe 25 ul a bhí comhdhéanta de shár-mheascán SYBR Green PCR (Bio-Rad), 100 ng de theimpléad DNA comhlántach, agus primers roghnaithe (200 nM) ag baint úsáide as na coinníollacha rothaíochta molta.

H móide E.

Seacht lá tar éis instealladh le coirníní PBS/micrea-cháithníní nó WGP, baineadh an pancreata agus socraíodh é i 4 faoin gcéad formalin ar feadh 1 seachtaine agus ina dhiaidh sin leabaithe i pairifín de réir nósanna imeachta caighdeánacha. Gearradh fíocháin leabaithe pairifín i gcodanna tiubh 5 mm agus dhaite le hematoxylin agus eosin (H & E) le haghaidh anailíse moirfeolaíoch.

Tomhas amaláis serum.

Tomhaiseadh serum amylase Murine ag baint úsáide as an Trealamh Measúnachta Gníomhaíochta Amylase (Millipore Sigma) agus úsáideadh é de réir threoracha an mhonaróra. I mbeagán focal, instealladh lucha le WGP agus 7 lá ina dhiaidh sin, bailíodh fuil ó lucha ag baint úsáide as teicníc fuilithe retro-bulbar. Úsáideadh na samplaí seo chun serum amaláis a mheas.

Ídiú T-chealla in vivo.

ídíodh T-chealla ag baint úsáide as mAb frith-CD4 amháin, antiCD8 mAb amháin, nó frith-CD4 agus frith-CD8 mAbs le chéile. Rinneadh antasubstaintí intí. Sa nós imeachta ídiú seo, rinne lucha IP a instealladh le WGP ar an gcéad lá agus cuireadh IP orthu freisin le 200 µg de na mAbs ar an lá 1 agus ar an 4ú lá le linn na tréimhse cóireála. Eotanaíodh lucha ar an lá 7. (CD4 clón GK1.5, CD8 clón 53-6.72). Deimhníodh éifeachtúlacht ídiú ar lá 7.

In vivo ídiú cealla NK.

Laghdaíodh cealla NK tríd an instealladh intraperitoneal de 100 µg de PK136 mAb (Arna tháirgeadh i saotharlann an Dr Jun Yan in Ollscoil Louisville) ar laethanta −1 agus 5 le linn na tréimhse cóireála. Instealladh WGP ar an lá 0 agus eotanaíodh ainmhithe lá 7 agus rinneadh measúnú ar éifeachtúlacht ídiú na gcealla NK trí fhíocháin pancreatacha a sileadh le haghaidh NK1.1.

Ídiú Ly6G.

Laghdaíodh neodrófilí trí 300 µg de frith-Ly6G mAb (Bio X Cell) nó rialú isitíopa Rat IgG2a (Bio X Cell) a instealladh ag laethanta −1, 2, agus 6 le linn cóireála. Chuir thart ar 1 mg de WGP instealladh IP ar lá 1. Rinneadh lucha a eotanú ar an lá 7 agus rinneadh measúnú ar an briseán le haghaidh éifeachtúlacht ídiú. Sa meall, cuireadh lucha múnla instealladh le 300 µg de frith-Ly6G mAb nó rialú isotype Rat IgG2a ar laethanta −2, 4, 10, agus 16. Tugadh WGP do lucha ar lá 0 agus ionchlannaíodh iad le siadaí pancreatacha KPC orthotopic ar an lá. 7. Eotanaíodh lucha ar an 21ú lá agus dathaíodh fíocháin pancreatacha le Ly6G chun éifeachtúlacht ídiú granulocyte a mheas ag an am sin.

Ullmhúchán samplach CyTOF mais cytometry.

Ceannaíodh antasubstaintí mais-chítiméadrachta ó Fluidigm nó cruthaíodh iad go hinmheánach trí antasubstaintí íonaithe atá ar fáil go tráchtála a chomhchuingeach leis an iseatóp miotail chuí ag baint úsáide as feisteáin MaxPar X8 Polymer nó MCP9 Polymer (Fluidigm). Próiseáladh samplaí pancreatacha ó thrí lucha PBS agus trí 7-lá WGP isteach i dtuaslagán aonchealla agus rinneadh spreagadh ex vivo mar a thuairiscítear thuas. Scríobadh cealla go réidh ó na plátaí ag baint úsáide as scraper cealla steiriúla, nite le PBS, agus cuireadh isteach i bhfeadán saothraithe steiriúil iad. Baineadh úsáid as thart ar 2 × 106 cealla in aghaidh an tsampla. Rinneadh na cealla a dhaite den chéad uair le haghaidh inmharthanachta le 5 uM cisplatin (Fluidigm) i RPMI 1640 gan serum ar feadh 5 nóiméad ag RT. Ansin nite cealla le RPMI 1640 ina raibh 10 faoin gcéad FBS ar feadh 5 nóiméad ag 300 × g. Rinneadh na cealla a dhathú leis na hantasubstaintí dromchla ar feadh 30 nóiméad ag RT agus nite faoi dhó le maolán staining Maxpar Cell (Fluidigm).

Le haghaidh staining ar cytokines intracellular, socraíodh cealla ansin le 1 ml de 1X Maxpar Fix I maolán ar feadh 30 nóiméad ag RT agus ansin nite faoi dhó le 2 mL de 1X Maxpar Perm-S maolán ar feadh 5 nóiméad ag 800 × g. Ansin cuireadh an manglam cíteaplasmach/rúnda antashubstainte leis agus gor é leis na cealla ar feadh 30 nóiméad ag RT. Tar éis goir, nite cealla le 1 ml de mhaolán 1X Maxpar Perm-S ar feadh 5 nóiméad ag 800 × g agus blotted go réidh chun an leacht ar fad a bhaint as an bhfeadán.

Chun antaiginí núicléacha a stainiú, cuireadh cealla ar fionraí ansin i 1 ml de mhaolán staining antigen núicléach 1X Maxpar ar feadh 30 nóiméad ag RT. Cuireadh an manglam antaiginí núicléach leis ansin agus gor é ar feadh 30 nóiméad ag RT. Níodh cealla faoi dhó ar feadh 5 nóiméad ag 800 × g le 2 ml de mhaolán Tréscaoilteachta Staining Antigen Núicléach. Ar deireadh, socraíodh cealla le formaildéad 1.6 faoin gcéad ar feadh 10 nóiméad ag RT, ansin gortha thar oíche i 125 nM de IntercalatorIridium (Fluidigm) ag 4 céim .

Fáil sonraí CyTOF.

Nuair a bhí na cealla réidh lena bhfáil, nite samplaí faoi dhó le Maolán Staining Cille (Fluidigm) agus coinníodh ar oighear iad agus iad ag fanacht le héadáil. Go díreach roimh an éadáil, cuireadh cealla ar fionraí i dtuaslagán 1:9 de Réiteach Faighte Ceall: coirníní calabraithe eilimint EQ 4 (Fluidigm). Baineadh úsáid as córas Helios CyTOF, agus tar éis nósanna imeachta cuí tosaithe agus tiúnta, ritheadh ​​samplaí ag ráta níos lú ná nó cothrom le 500 imeacht/soicind suas go 300,000 imeacht. Ag baint úsáide as bogearraí CyTOF, normalaíodh comhaid FCS. Comhaid FCS agus bhí na comhaid sin réidh ansin le haghaidh anailíse sonraí.

Anailís sonraí CyTOF.

Rinneadh anailís ar shonraí CyTOF ag baint úsáide as FlowJo, pacáiste bogearraí CytoBank58, agus sreabhadh oibre CyTOF59 a chuimsíonn sraith pacáistí atá ar fáil in R (r-project. org)60-63. Le haghaidh anailíse a rinneadh laistigh de shreabhadh oibre CyTOF, úsáideadh comhaid spáis oibre FlowJo a onnmhairíodh ó Flow Workspace agus CytoML61.

Seicheamhú RNA: eastóscadh agus leithlisiú RNA.

Seacht lá tar éis PBS nó WGP IP a riaradh, baineadh pancreata, próiseáladh isteach i bhfionraí cille amháin é, dhaite le haghaidh inmharthanachta, CD45, agus CD11b, agus sórtáladh iad ag baint úsáide as FACS Aria III. Ullmhaíodh samplaí faoi thrí do gach grúpa turgnamhach. Nuair a bhí na cealla myeloid seo scoite amach, nite cealla 2x le PBS fuar oighear agus ansin lysed le Trizol (Invitrogen). Baineadh RNAanna ag baint úsáide as Kit RNAeasy QIAGEN (QIAGEN).

Seiceáladh an RNA scoite le haghaidh sláine ag baint úsáide as an gcóras Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) agus cainníochtaithe ag baint úsáide as measúnacht fluairiméadrach Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Ullmhaíodh leabharlanna mRNA-Seq saibhrithe Poly-A tar éis prótacal caighdeánach trealamh mRNASeq Universal Plus (Tecan Genomics, Redwood City, CA) ag baint úsáide as 10 ng den RNA iomlán.

Ceanglaíodh na samplaí go léir le cuibheoirí Illumina agus rinneadh barrachód aonair orthu. Deimhníodh easpa dimers cuibheoirí agus méid comhsheasmhach leabharlainne de ~300 bp trí úsáid a bhaint as Agilent Bioanalyzer 2100. Rinneadh measúnú ar chomhchruinniú agus ar iompar seicheamhaithe na leabharlainne faoi spíc-isteach caighdeánach PhIX ag baint úsáide as cill sreafa seicheamhaithe Nano MiSeq ó Illumina. Lódáltar 1.8 pm de na leabharlanna comhthiomsaithe le 1 faoin gcéad PhiX spike-in ar thimthriall amháin NextSeq 500/{8}} sraith sreafa seicheamhaithe Kit Ard-Aschuir v2 agus seicheamh é ar an seicheamhóir Illumina NextSeq 500 ag díriú ar 60 M 1x75 bp léamh in aghaidh an tsampla.

Seicheamhú RNA.

Ullmhaíodh leabharlanna ag baint úsáide as an trealamh mRNA-seq Universal Plus le cainníochtú leabharlainne NuQuant® (NuGen). Scaipeadh na sé shampla thar cheithre líne seicheamhaithe in aon rith amháin. Íoslódáladh na 24 comhad seicheamhaithe amh aondeireadh (.fastq)64 ó BaseSpace65 ag Illumina chuig an bhfreastalaí KBRIN le haghaidh anailíse. Baineadh úsáid as FastQC (leagan 0.10.1)66 maidir le rialú cáilíochta (QC) na sonraí seichimh amh. Rinneadh na seichimh a ailíniú le géanóm tagartha luiche mm10 ag baint úsáide as STAR (leagan 2.6)67, ag giniúint comhaid ailínithe i bhformáid bam. Rinneadh léiriú difreálach ar thrascríbhinní códaithe próitéine ENSEMBL ag baint úsáide as DESeq268,69. Fuarthas amháirimh ó na comhaid formáide bama a ailíníodh le STAR ag baint úsáide as HTSeq (leagan 0.10.0)70. Rinneadh na hamháirimh a normalú trí úsáid a bhaint as modh Slonn Loga Choibhneasta (RLE) agus ansin scagadh iad chun géinte a eisiamh le níos lú ná deich n-áireamh ar fud na samplaí71. Taisceadh sonraí RNA-seq le haontachas GEO GSE187464.

Seicheamh RNA: anailís saibhrithe tacair géine.

Baineadh úsáid as anailís saibhrithe tacair ghéin (GSEA) chun bitheolaíocht na ngéinte a chuimsíonn coinníollacha WGP vs PBS agus a ndifríochtaí a shainiú tuilleadh72. Fuarthas tacair ghéinte ón mBunachar Sonraí um Shínithe Móilíneacha (MSigDB) le haghaidh próisis bhitheolaíocha Ontology Géine (GO) agus conairí Reactome. I gcás gach tacair géine, rinneadh gach láthair géine tástáladh i gcomparáid le lucha rialaithe cóireáilte WGP vs PBS a shórtáil ón tábhacht is airde go dtí an tábhacht is ísle ag baint úsáide as luachanna p. Ligeann an cur chuige seo géinte suas agus síosrialaithe an-suntasach a áireamh laistigh de gach sraith géine, cur chuige a léiríonn níos cruinne na coinníollacha i gconair bhitheolaíoch. Don anailís seo, leanann tábla de na tacair saibhrithe le plota saibhrithe a thaispeánann próifíl an scór saibhrithe (ES) agus suíomh na mball tacair géine ar an liosta céim-ordaithe.

Seicheamh aonchealla: aonrú cealla aonair agus seicheamhú RNA.

Sórtáladh cealla beo CD45 móide ó pancreata luiche, nite, agus athchuireadh i 1x PBS (saor ó chailciam agus maignéisiam) ina raibh 0.04 faoin gcéad BSA. Gabhadh cealla aonair agus tógadh leabharlanna cDNA barrachóidithe ag baint úsáide as Kit Imoibrí Aoncheall 3ʹ Cróimiam Next GEM (v3.1, Géanóm 10X) agus an Rialaitheoir Cróimiam, de réir threoracha an mhonaróra. Rinneadh leabharlanna a chomhthiomsú agus a chur in ord trí úsáid a bhaint as cumraíocht 28 bp × 8 bp × 125 bp le haghaidh innéacs read1 × i7 x read2 ar an Illumina NextSeq 500 leis an timthriall NextSeq 500 /550 150 Ard-Aschur Kit v2.5 (20024907).

Ós rud é seicheamhú cille: próifíliú slonn géine.

Rinneadh comhaid Bcl a dhí-iolrú ina gcomhaid fastq ag baint úsáide as bogearraí CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Ba é líon iomlán na léamha seicheamhaithe ná 506,913,062. Bhí na léamha ar ardchaighdeán mar a chinn FastQC66. Tomhaiseadh comhaireamh géine trí úsáid a bhaint as "count" CellRanger, ag baint úsáide as an genome tagartha cille-mm10-3.0.0 le haghaidh lucha. Gineadh maitrís chomhairimh do gach sampla agus sampla comhiomlánaithe amháin agus socraíodh líon na gceall ag súil le 5000.

Baineadh úsáid as na sonraí comhairimh amh a chinn CellRanger mar ionchur do phíblíne anailíse saincheaptha i R a úsáideann éagsúlacht uirlisí anailíse aonchealla bunaithe ar Seurat. Taispeánann an plota glúine (Fíor Forlíontach 7b) graf a thaispeánann na háirimh UMI rangaithe do gach barrachód cille le haghaidh sonraí comhiomlánaithe thar na trí ghrúpa. Seasann cealla os cionn an phointe infhillte do dhúbailtí féideartha agus seasann iad siúd faoi bhun na glúine do chealla cúlra. Rinneadh anailís ar bhearta rialaithe cáilíochta cille ag baint úsáide as Seurat v373, agus baineadh barrachóid cille leis na tréithe seo a leanas as an anailís: comhaireamh íseal (cealla cúlra féideartha) le gearradh FDR de 0.01 ón bhfeidhm DropletUtils74 "emptyDrops", comhaireamh ard (cealla doublet féideartha) le níos mó comhaireamh ná an pointe infhillte plota glúine, ábhar mitochondrial níos mó ná 30 faoin gcéad agus ábhar ribosomal níos mó ná 40 faoin gcéad . Rinneadh géine (gnéithe) a scagadh tuilleadh chun aitheantóirí géine scortha agus géinte nár cuireadh in iúl i dhá chill ar a laghad a bhaint. Féach Fíor Forlíontach 7a, b le haghaidh líon tosaigh agus scagtha na mbarrachóid agus na ngéinte cille.

normalaíodh na sonraí slonn ag baint úsáide as SCTtransform75 áit ar aischéimníodh géinte timthriall cille, ábhar ribosómach, agus ábhar miteachondrial. Cnuasaíodh na cealla ansin agus rinneadh laghdú ar thoise trí úsáid a bhaint as UMAP76. Sannadh ainmneacha braisle tosaigh ag baint úsáide as teicníc scórála saibhrithe modhnaithe GSVA77,78. I gcás gach ceann de na braislí seo, aithníodh na géinte marcála barr. Cinneadh géinte arna léiriú go difreálach ag baint úsáide as Seurat73 agus MAST79 i gcomparáid le gach braisle le gach braisle eile (gach comparáid péirewise). taisceadh sonraí scRNA-seq le haontachas GEO GSE187464.

Aithint braislí ginte le scRNA-Seq.

Aicmíodh braislí neamh-díorthaithe myeloid go ginearálta mar B-chealla (MS4A1), cealla plasma (SDC1), CD8 móide T-chealla (CD3e, C8a), CD4 móide T-chealla (CD3e, CD4), cealla T-rialaithe (T). -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), δ T-chealla (CD3e, TRGC1, TRGC2,IL7Ra) agus cealla imdhíonachta de chineál 2 (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg, GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS agus Rxrg)80–82. Aithníodh neodrófilí trí léiriú MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8, agus ADAM8, cé go bhféadfadh sé a bheith gannionadaíoch sna hanailísí seo mar gheall ar a n-ábhar íseal RNA agus leibhéil arda RNases intreacha83. Aithníodh cealla dendritic traidisiúnta (cDCanna) trí léiriú ITGAX agus ITGAE agus d’aithin ITGAX agus Siglech DCanna plasmacytoid (pDCanna).

Aicmiú braislí myeloid ó scRNA-Seq.

Chuir Braisle 5 ITGAMINtADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- in iúl agus níor léirigh sé TNFAIP2, rud a thugann le fios gur macrophages cónaitheacha na cealla seo. Chuir braisle10 in iúl ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Chuir cnuasaigh 3 agus 4 in iúl ITGAMInt ADGRE1Int Lyz2Hi H{2-Ab1Int Ly6C2Hi, a thugann le tuiscint gur fo-thacair de mhonaicítí/macrophages insíothlaithe iad an dá cheann, cé gur úsáideadh na géinte feabhsaithe athlastacha a chuirtear in iúl i mbraisle 3 chun braisle 3 a aithint mar monocyte insíothlaithe athlastacha / macrophage. .

Measúnachtaí phagocytosis.

Baineadh an briseán de lucha instealladh PBS/micrea-cháithníní agus lucha in vivo oilte WGP 7 lá tar éis an insteallta agus próiseáladh iad mar a thuairiscítear roimhe seo isteach i bhfionraí cille aonair. Nigh thart ar 2 × 106 le caoluithe HEPES 50x i RPMI 1640 agus ansin goraíodh iad i 100 μL den réiteach seo ar feadh 1 h ag 37 céim chun na cealla a ghníomhachtú. Cuireann an Invitrogen Green S chun cinn.

Úsáideadh Aureus BioParticlesTM Phagocytosis Kit for Flow cytometry (Thermo Fisher Scientific) de réir threoracha an mhonaróra. Cuireadh thart ar 100 μL de na cáithníní athdhéanta nó 1 × 106 GFP móide cealla meall KPC leis na cealla pancreatacha gníomhachtaithe agus gor iad ar feadh 1 h ag 37 céim. Rinneadh samplaí a vortexed go réidh gach 15 nóiméad. Cuireadh stop leis an imoibriú trí 1 ml de PBS fuar a chur leis. Goradh samplaí le Fc Block ar feadh 10 nóiméad ag 4 céim , daite le haghaidh inmharthanachta, CD45, CD11b, agus F4/80 ar feadh 30 nóiméad ag 4 céim , agus ansin rinneadh anailís orthu ag baint úsáide as BD FACSCanto. Le haghaidh anailíse, tar éis geata a dhéanamh ar chealla beo agus CD45, socraíodh go raibh na cealla a d'fhluaraisíodh sa chainéal FITC ina phagocytic.

Measúnacht cíteatocsaineachta.

Baineadh an briseán ó lucha cóireáilte WGP agus PBS agus leithlisíodh na daonraí CD11b móide trí úsáid a bhaint as CD11b maighnéadach móide MicroBeads (Miltenyi Biotec) agus Deighilteoir autoMACS Pro (Miltenyi Biotec). Ansin nite agus comhairíodh cealla íonaithe CD11b móide, agus plátáladh iad seo ag cóimheas siadaí 1:20: cealla éifeachtóra i 96-phláta tobair. Reáchtáladh na samplaí turgnamhacha go léir i dtrí chóip. Tar éis na cealla CD11b móide a phlátáil, cuireadh coscóirí ROS N-acetyl-Lcysteine ​​(NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 μM, Sigma-Aldrich), nó DFO (50 μM, Pharmacopoeia Eorpach) le ceann amháin. sraith de chealla díorthaithe PBS agus WGP ar feadh 1 h sula gcuirtear 5000 KPC in iúl luciferase móide cealla meall pancreatacha chuig gach tobar. Tar éis 24 h, de chomhchultúr, lártheifneoiríodh na plátaí agus meascadh 20 µL den chomhchultúr le 100 µL d’imoibrí Luciferase Assay (Promega). Rinneadh gníomhaíocht Luciferase a thomhaistear san ollnóva a chomhghaolú le cealla meall a maraíodh ag na cealla éifeachtóra agus a tomhaiseadh trí úsáid a bhaint as luminometer (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Baineadh an comhartha spontáineach luciferase ó chealla meall plátáilte ó thomhas an t-suíochán. Léirítear luachanna Luciferase mar Aonaid Solais Choibhneasta (RLUanna).

Samhlacha meall in vivo ailse pancreatach.

Líne cille KPC ar chúlra C57BL/6 díorthaithe ón LSL-KrasG12D/ móide ; LSL-Trp53R172H/ móide ; Ceannaíodh samhail luiche Pdx1-Cre (KPC) ó Ximbi. Baineadh úsáid as na cealla seo agus cealla Pan02 a bhí ina bhronntanas flaithiúil ón Dr. Yong Lu ag Ollscoil Wake Forest i múnla ortópach d'ailse pancreatach. Bhí líne KPC a aistríodh le GFP agus luciferase (KPCGFP móide Luc plus ) ina ranníocaíocht fhial freisin ón Dr. Michael Dwinell ag Coláiste Leighis Wisconsin. Baineadh úsáid as na cealla seo go heisiach i lucha albino C57BL/6.

Le haghaidh ionchlannú siadaí, rinneadh ainéistéisiú ar lucha ag baint úsáide as isoflurane, agus ullmhaíodh bolg na lucha le betadine agus draped ar bhealach steiriúil. Rinneadh laparotomy meánlíne 2 cm ag baint úsáide as teicníc aiseipteach le huirlisí steiriúla. Tar éis laparotomy, rinneadh an briseán, agus an spleen a sheachtrú. Cuireadh cealla meall ar fionraí i PBS fuar oighir agus meascadh iad i gcóimheas 1:1 le maitrís membrane íoslaigh Matrigel (Corning). 0.1 × 10Instealladhaíodh 6 chealla meall i 50 uL den tuaslagán PBS-matrigel isteach in eireaball na briseán ag baint úsáide as 30-steallaire inslin tomhsaireachta. Léirigh foirmiú mboilgeog beag ionchlannú rathúil. Dúnadh an peritoneum trí úsáid a bhaint as uaim brataithe aigéad polyglycolic braided absorbable 5/0 agus dúnadh an craiceann ag baint úsáide as síoda braided non-absorbable uaim 5/ 0. (CP Leighis). Riaradh buprenorphine do bhainistiú pian suas go dtí 72 h tar éis máinliachta agus rinneadh monatóireacht ar lucha.

Íomháú in vivo.

Instealladh IP do lucha a ionchlannaíodh go orthotopically le GFP móide Luciferase móide cealla meall KPC le 150 mg/kg de mheáchan coirp ag 100 µL de XenoLight D-Luciferin-K móide Foshraith Bithluminescent Salt (PerkinElmer). Tar éis 10 nóiméad, rinneadh lucha a ainéistéisiú le isoflurane agus cuireadh iad taobh istigh d'Íomhánóir Fótóin Biospace Lab, arb é atá i gceist le modhúlacht optúil in vivo leibhéal íseal-éadrom tiomnaithe d'íomháú bithluminescent agus fluaraiseacha. Tógadh íomhánna de lucha agus úsáideadh iad chun méid agus fás siadaí a thomhas.

Múnla meall admixture.

Cuireadh oiliúint ar lucha le 1 mg de WGP agus 7 lá ina dhiaidh sin rinneadh na daonraí CD11b móide CCR2 móide agus CD11b móide CCR2 - a shórtáil agus a mheascadh 1:1 le cealla meall KPC 1 × 105 cealla meall. Ionchlannaíodh cealla go orthotopically i lucha WT agus 3 seachtaine ina dhiaidh sin rinneadh lucha a eotanú agus rinneadh measúnú ar mhéid siadaí.

Teiripe teaglaim le frith-PD-L1 mAb.

Cóireáladh lucha C57BL/6 le WGP ar lá −7 agus ionchlannaíodh iad le siadaí pancreatacha ortatopacha KPC ar an lá 0. Cóireáladh lucha le 200 µg de rialú isitíopa frith-luiche frith-PD-L1 mAb (Bio X Cell) nó Rat IgG2b (Bio X Cell) ar laethanta 3, 7, agus 11. Rinneadh monatóireacht ar lucha ansin le haghaidh marthanais.

WGP mar chóireáil.

Ionchlannaíodh lucha C57BL/6 le siadaí pancreatacha ortatopacha KPC ag an lá 0 agus ar laethanta 4 agus 11 tugadh 1 mg de IP WGP nó PBS do lucha. Rinneadh monatóireacht ansin ar lucha chun maireachtáil.

Anailís staitistiúil.

Rinneadh na torthaí go léir a athdhéanamh ar a laghad trí huaire neamhspleácha chun a fhíorú mura sonraítear a mhalairt. Léirítear torthaí ionadaíocha. Léirítear na torthaí mar mheán ± SEM. Rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as t-thástáil dhá earr an Mhic Léinn nó U-thástáil Mann-Whitney. Rinneadh comparáidí ilghrúpaí trí úsáid a bhaint as ANOVA aontreo nó dhá threo agus rinneadh tástálacha comparáide iolracha Tukey ina dhiaidh sin. Rinneadh anailísí comhghaoil ​​trí úsáid a bhaint as comhéifeacht comhghaoil ​​Pearson (gnáthdháileadh). Socraíodh tábhacht staitistiúil ag p < 0.05. Rinneadh na hanailísí staitistiúla go léir ag baint úsáide as Leagan Bogearraí GraphPad Prism 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Achoimre tuairiscithe.

Tá tuilleadh faisnéise ar dhearadh taighde ar fáil san Achoimre ar Thuairisciú Taighde Dúlra atá nasctha leis an alt seo.

Infhaighteacht sonraí

Cuirtear sonraí foinseacha ar fáil sa pháipéar seo. Tá sonraí RNASeq ar fáil faoi aontachas GEO GSE187464, agus tá sonraí scRNA-Seq ar fáil faoi aontachas GEO GSE187464 Soláthraítear sonraí foinse sa pháipéar seo.

Faighte: 2 Aibreán 2021; Glactha: 17 Eanáir 2022.

Tagairtí

1. ACS. Fíricí & Fíoracha Ailse, 2020.

2. Rahib, L. et al. Réamh-mheastachán ar mhinicíocht agus ar bhásanna ailse go dtí 2030: an t-ualach gan choinne a bhaineann le hailse thyroid, ae agus briseán sna Stáit Aontaithe. Ailse Res. 74, 2913–2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW & Mahipal, A. Bainistíocht chomhaimseartha ar ailse paincréasach inselectable logánta. Ailsí 10, 24 (2018).

4. Torthaí Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF i mbainistíocht feidhme ailse pancreatach. J. Surg. Oncol. 110, 592–598 (2014).

5. Schizas, D. et al. Imdhíonteiripe le haghaidh ailse pancreatach: nuashonrú 2020. Caitheamh Ailse. 86, 102016 (2020) Ath.

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Coscairí seicphointe in ailse pancreatach. Caitheamh Ailse. Ath. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Coscairí seicphointe imdhíonachta in ailse scamhóg agus meileanóma. Seimineár. Oncol. Altraí. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ Coscairí seicphointe imdhíonachta do charcanóma cille squamous ceann agus muineál: An tírdhreach reatha agus na treoracha don todhchaí. Ceann. Muineál 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. Imdhíonacht anta-tumóra in ailse paincréasach a rialáil agus a mhodhnú. Nat. Imdhíonól. 21, 1152–1159 (2020).

10. Ríoga, RE et al. Triail Chéim 2 ar ghníomhaire aonair Ipilimumab (frith-CTLA-4) le haghaidh adenocarcinoma pancreatach atá chun cinn go háitiúil nó go méadastatach. J. Imdhíonachta. 33, 828–833 (2010).

11. O'Reilly, EM et al. Durvalumab le nó gan tremelimumab d'othair a bhfuil adenocarcinoma ductal pancreatach meatastatach acu: triail chliniciúil randamach chéim 2. JAMA Oncol. 5, 1431–1438 (2019).

12. Weiss, GJ et al. Staidéar Chéim Ib/II ar gemcitabine, nab-paclitaxel, agus pembrolizumab in adenocarcinoma pancreatach meatastatach. Infheistiú. Drugaí Nua 36, ​​96–102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. i Micrea-thimpeallacht Ailse Pancreatach agus Tumor (eagráin Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Líonra Taighde Trasdomhan, 2012).

14. Karamitopoulou, E. Micrea-thimpeallacht meall ailse pancreatach: tá an tírdhreach imdhíonachta faoi stiúir ag gnéithe móilíneacha agus histeapaiteolaíocha. Br. J. Ailse 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarisetty, VG Hypoxia mar bhac ar imdhíonteiripe in adenocarcinoma pancreatach. Clin. Aistrigh. Med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. et al. Tiomáineann RIP1 kinase lamháltas imdhíonachta oiriúnaitheach macrophage-idirghabhála in ailse pancreatach. Cill Ailse 38, 585–590 (2020).

17. Netea, MG et al. Díolúine oilte: clár de chuimhne imdhíonachta dúchasach i sláinte agus galair. Eolaíocht 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. et al. Ionduchtú meitibileach díolúine oilte tríd an gcosán mevalonate. Cill 172, 135–146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. Epigenetics agus díolúine oilte. Frithocsaíd. Comhartha Redox. 29, 1023–1040 (2018).

20. Priem, B. et al. Cuireann teiripe thraenáilte nana-bhitheolaíochta chun cinn fás siadaí faoi chois agus cuireann sí cosc ​​ar sheicphointí. Cill 183, 786–801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. et al. Cuireann oiliúint imdhíonachta dúchasach granulopoiesis gníomhaíocht antitumor chun cinn. Cill 183, 771–785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. Is gné dhílis den díolúine oilte é modhnú progenitors myelopoiesis. Cill 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Díolúine oilte: athchlárú díolúine dúchasach i sláinte agus galair. Annu Rev. Immunol. 39, 667–693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Forbairt agus feidhm macrophages fíocháin-chónaitheacha i lucha. Seimineár. Imdhíonól. 27, 369–378 (2015). 25. Calderon, B. et al. Coinníollacha anatamaíochta an briseán bunús agus airíonna macrophages cónaitheach. J. Cait. Med. 212, 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. Cuireann an fachtóir trascríobh MafB chun cinn polarú M2 frith-athlastach agus eisfhearadh colaistéaról i macrophages. Sci. Rep. 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY et al. Éifeachtaí frith-athlastacha apocynin, inhibitor NADPH oxidase, in athlasadh aerbhealaigh. Imdhíonól. Cill Biol. 90, 441–448 (2012).

28. Liu, M. et al. Fachtóir trascríobh Is seicphointe é c-Maf a ríomhann macraphages in ailse scamhóg. J. Clin. Infheistiú. 130, 2081–2096 (2020).

29. Zimmerman, KA et al. Aithníonn seicheamhú RNA aonchealla sínithe géine macrafage cónaitheach duánach iarrthóra trasna speiceas. J. Am. Soc. Nephrol. 30, 767–781 (2019).

30. Bakos, E. et al. Rialaíonn CCR2 an freagra imdhíonachta trí chomhshó agus feidhm cealla T éifeachtóra agus rialála a mhodhnú. J. Imdhíon. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. Lochtanna in earcaíocht macrophage agus cosaint óstach i lucha nach bhfuil an receptor chemokine CCR2 ann. J. Cait. Med. 186, 1757–1762 (1997).

32. Kuziel, WA et al. Laghdú tromchúiseach ar ghreamaitheacht leukocyte agus extravasation monocyte i lucha easnamhach i receptor chemokine CC 2. Proc. Natl Acad. Sci. Stáit Aontaithe Mheiriceá 94, 12053–12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF comhshó Monocyte le linn athlasadh agus díobháil. Arterioscler. Throm. Vasc. Biol. 37, 35–42 (2017).

34. Funamizu, N. et al. Cothaíonn fachtóir coisctheach imirce Macrophage aistriú epithelial go mesenchymal, feabhsaíonn sé ionsaitheacht siadaí, agus tuarann ​​sé torthaí cliniciúla in adenocarcinoma duchtála pancreatach athchurtha. Int. J. Ailse 132, 785–794 (2013).

35. Denz, A. et al. Is é an toradh a bhíonn ar chosc ar MIF ná gabháil timthriall cille agus apoptosis i gcealla ailse pancreatach. J. Surg. Res. 160, 29–34 (2010).

36. Su, LJ et al. Sárocsaídiú lipid imoibríoch de bharr speiceas ocsaigine in apoptosis, uathphagy, agus ferroptosis. Ocsaíd. Med. Cill Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. Glúcán atá díorthaithe ag giosta in ailse: úsáidí núíosacha de theiripeach traidisiúnta. Int. J. Mol. Sci. 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. Ról riachtanach monocytes agus macrophages i ndul chun cinn pancreatitis géarmhíochaine. Domhanda J. Gastroenterol. 16, 3995–4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. Taiscumar de macrophages cuas aibí is féidir a ionradh go tapa orgáin visceral chun difear a dheisiú fíocháin. Cill 165, 668–678 (2016).

40. Qi, C. et al. Conairí difreálacha a rialaíonn freagairtí imdhíonachta dúchasacha agus oiriúnaitheacha in aghaidh an t-tumóra trí -glúcáin atá díorthaithe ó ghiosta cáithníneach agus intuaslagtha. Fuil 117, 6825–6836 (2011).

41. Goodridge, HS et al. Gníomhachtú an ghabhdóra imdhíonachta dúchasach Dectin-1 ar fhoirmiú 'sionapse fagaicíotach'. Nádúr 472, 471–475 (2011).

42. Masuda, Y. et al. Spreagann riaradh béil na nglúcáin intuaslagtha as Grifola frondosa freagairt imdhíonachta an-fhrith-tumóra sistéamach agus laghdaítear an t-imdhíonacht i lucha a bhfuil siadaí orthu. Int. J. Ailse 133, 108–119 (2013).

43. Rís, PJ et al. Cógaschinéitic fhungach (1-3)-béite-D-glúcáin tar éis riarachán infhéitheach i bhfrancaigh. Int. Imdhíon-pharmacol. 4, 1209–1215 (2004).

44. Huang, Y. et al. Tacaíonn gáinneáil idir-orgánach atá ag brath ar S1P ar chealla dúchasacha lymphoid grúpa 2 le cosaint óstach. Eolaíocht 359, 114–119 (2018).

45. Mathä, L. et al. Nascann imirce de chealla linfóideach dúchasach grúpa cónaitheoirí scamhóg 2 athlasadh ailléirgeach scamhóg agus díolúine ae. Tosaigh. Imdhíonól. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR et al. Eascraíonn cosáin a bhaineann go sonrach le fíocháin ILC2anna gníomhachtaithe chun díolúine de chineál 2 a scaipeadh. J. Cait. Med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. Díolúine frith-meall a chumasú trí ILC2 a scaoileadh saor. Cill Res. 30, 461–462 (2020).

48. Cuireann éagsúlacht Qian, BZ & Pollard, JW Macrophage le dul chun cinn siadaí agus metastasis. Cill 141, 39–51 (2010).

49. Qian, BZ et al. Earcaíonn CCL2 monocytes athlastacha chun metastasis meall cíche a éascú. Nádúr 475, 222–225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK Fagaicíotóis cealla meall ag monaicítí daonna saothraithe i bhfachtóir athchuingreach coilíneachta macrophage. J. Cait. Med. 172, 231–237 (1990).

51. Jadus, MR et al. Maraíonn Macrophages cealla meall T9 glioma a bhfuil an isoform membrane de fhachtóir spreagúil coilíneachta macrophage trí chonair atá ag brath ar phagocytosis. J. Imdhíon. 160, 361–368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. Fagaicíotóis cille meall Macrophage-idirghabhála: deis d'idirghabháil nana-mhíochaine. Adv. Feidhm. Mater. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR Feidhm phagocytic na macrophages a bhaineann le meall mar phríomhchinntitheach ar rialú dul chun cinn siadaí: athbhreithniú. J. Imdhíonachta. Ailse 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE Spreagann macrophages murine gníomhachtaithe apoptosis i gcealla meall trí mheicníochtaí neamhspleácha ocsaíde nítreach. Ailse Res. 54, 2462–2467 (1994).

55. Brahmer, JR et al. Sábháilteacht agus gníomhaíocht antashubstaint frith-PD-L1 in othair a bhfuil ard-ailse orthu. N. Béarla. J. Med. 366, 2455–2465 (2012).

56. Saijo, S. et al. Teastaíonn Dectin-1 chun óstach a chosaint i gcoinne Pneumocystis carinii ach ní i gcoinne Candida albicans. Nat. Imdhíonól. 8, 39–46 (2007).

57. Bernhagen, J. et al. Íonú, bithghníomhaíocht, agus anailís struchtúr tánaisteach ar an luch agus fachtóir coisctheach imirce daonna macrophage (MIF). Bithcheimic 33, 14144–14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: ardán anailíse a sholáthar le haghaidh anailíse agus comhoibriú sonraí cíteaiméadrachta pobail. Curr. Barr. Micribhith. Imdhíonól. 377, 127–157 (2014).

59. Nowicka, M. et al. Sreabhadh oibre CyTOF: fionnachtain dhifreálach i dtacar sonraí cíteaiméadrachta ard-thréchuir. F1000Res. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: uirlis fionnachtana ranga le measúnuithe muiníne agus rianú míreanna. Bithfhaisnéisíocht 26, 1572–1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: Bonneagar chun tacair sonraí cíteaiméadrachta geataithe agus neamhghadaithe a léiriú agus a idirghníomhú. Leagan Bithsheoltóra (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML le haghaidh comhroinnt sonraí cíteaiméadrachta tras-ardáin. Cítom. Cuid A: J. Int. Soc. Anal. Cytol. 93, 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD CATALYST: uirlisí anailíse sonraí citoiméadrachta. R pacáiste leagan 1.10.3. HelenaLC/CATALYST (2020).

64. Coileach, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM Formáid comhaid Sanger FASTQ do sheichimh le scóir cháilíochta, agus na leaganacha Solexa/Illumina FASTQ. Aigéid Núicléacha Res. 38, 1767–1771 (2010).

65. Illumina. An lámhleabhar úsáideora le haghaidh baseSpace íoslódáil. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: uirlis rialaithe cáilíochta do shonraí seichimh ard-thréchuir.

67. Dobin, A. et al. STAR: ailíniú RNA-seq ultrafast uilíoch. Bithfhaisnéisíocht 29, 15–21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Meastachán measartha ar fhilleadh agus ar scaipeadh sonraí RNA-seq le DESeq2. Géanóim Biol. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. et al. Anailís géine difreálach agus tras-scríofa ar thurgnaimh RNAseq le TopHat agus Cufflinks. Nat. Prótacal. 7, 562–578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq – creat Python chun oibriú le sonraí seicheamhaithe ard-thréchuir. Bithfhaisnéisíocht 31, 166–169 (2015).

71. Boyle, FÉ et al. GO::TermFinder–bogearraí foinse oscailte chun rochtain a fháil ar fhaisnéis Géine Ontology agus chun téarmaí Ointeolaíochta Géine atá saibhrithe go mór a aimsiú a bhaineann le liosta géinte. Bithfhaisnéisíocht 20, 3710–3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: chiclipéid kyoto de ghéinte agus de ghéanóim. Aigéid Núicléacha Res. 28, 27–30 (2000).

73. Stuart, T. et al. Comhtháthú cuimsitheach sonraí aonchealla. Cill 177, 1888–1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Maroni, JC EmptyDrops: idirdhealú a dhéanamh idir cealla agus braoiníní folamh i sonraí seicheamhaithe RNA aonchealla atá bunaithe ar bhraoiníní. Géanóim Biol. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. Normalú agus cobhsú athraithis sonraí RNA-seq aonchealla ag baint úsáide as aischéimniú déthéarmach diúltach rialta. Géanóim Biol. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. et al. Laghdú toise chun sonraí aonchealla a léirshamhlú ag baint úsáide as UMAP. Nat. Biteicneolaíocht. 37, 38–44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ et al. Meastóireacht ar mhodhanna chun lipéid chineál cille a shannadh do bhraislí cille ó shonraí seicheamhaithe RNA aonchealla. F1000Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: anailís éagsúlachta tacair géine le haghaidh sonraí microarray agus RNA-seq. Bithfhaisnéis BMC. 14, 7 (2013).

79. Finak, G. et al. MAST: creat staitistiúil solúbtha chun athruithe trascríobh a mheas agus chun ilchineálacht a shaintréithe i sonraí seicheamhaithe RNA aonchealla. Géanóim Biol. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. Aithint cealla limfóideacha dúchasacha i sonraí RNA-Seq aonchealla. Imdhíon-ghéineolaíocht 69, 439–450 (2017).

81. Entwistle, LJ et al. Tá feinitíopa dúchasach cille linfóideach grúpa 2 scamhógach sainiúil don chomhthéacs: cinneadh a dhéanamh ar éifeacht brú, suíomh agus spreagthaí. Tosaigh. Imdhíonól. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR et al. Déanann comharthaí fíocháin aitheantas ILC2 a phriontáil le feidhm réamh-mheasta. Nat. Imdhíonól. 19, 1093–1099 (2018).

83. Zilionis, R. et al. Nochtann tras-scríbhinn aonchealla d’ailsí scamhóg daonna agus lucha daonraí mieloid caomhnaithe trasna daoine aonair agus speiceas. Díolúine 50, 1317–1334.e1310 (2019).

Buíochas

Is mian leis na húdair buíochas a ghabháil leis an Dr. Wolfgang Zacharias, an Dr Mei Zhang, agus le Sabine Waigel ó Áis Géanómaíochta an Ionaid Ailse Brown as a gcabhair in RNA-Seq agus scRNASeq. Ba mhaith linn buíochas a ghabháil freisin leis an Dr. Clint Geller as an lámhscríbhinn a léamh profaí. Thacaigh NIH R01CA213990 agus R01AI128818 (JY) leis an obair seo. Thacaigh an NIH P20GM135004 le CD agus CTW i bpáirt. Rinneadh cuid den obair seo le cúnamh ó Shaoráid Ghéanómaíochta UofL, a fhaigheann tacaíocht ó NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), an tIonad Ailse Brown, agus táillí úsáideoirí. Rinneadh CyTOF sa Chroílár Imdhíonachta Feidhmeach le tacaíocht ó NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). Chuir NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) agus NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI) tacaíocht seicheamhaithe agus bithfhaisnéisíochta ar fáil don obair seo. Is iad na húdair amháin atá freagrach as ábhar na hoibre seo agus ní ionann é agus tuairimí oifigiúla an NIH ná na hInstitiúide Náisiúnta um Eolaíochtaí Ginearálta Míochaine (NIGMS).

Ranníocaíochtaí údair

Dhear agus rinne AEG na turgnaimh a rinne anailís ar shonraí, rinne sé léirmhíniú ar thorthaí, agus scríobh sé an lámhscríbhinn. Chuir RS, CD, agus HG le dearadh turgnamhach, sealbhú sonraí, agus anailís sonraí. Chuidigh MRW, XH, agus MZ le sonraí a fháil agus ábhar a ullmhú. Chuir KA agus ECR le hanailís agus léirmhíniú ríomhaireachtúil ar anailísí RNA-Seq agus chuir JHC agus ECR le hanailís agus léirmhíniú ríomhaireachtúil ar anailísí ScRNA-Seq. Chuir DT agus CTW leis an anailís ar shonraí CyTOF. Chuir RAM, H.-gZ, agus YL ábhair leis agus threoraigh siad an tionscadal. Rinne RAM athbhreithniú criticiúil. D'ordaigh JY dearadh turgnamhach agus an staidéar iomlán, rinne sé léirmhíniú ar shonraí, rinne maoirsiú ar thaighde, agus chabhraigh sé le scríobh agus athbhreithniú na lámhscríbhinne.

Leasanna iomaíocha

Ní dhearbhaíonn na húdair aon leasanna iomaíocha.

Eolas breise

Faisnéis bhreise Tá ábhar forlíontach sa leagan ar líne atá ar fáil ag https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

Ba cheart comhfhreagras agus iarratais ar ábhair a sheoladh chuig Jun Yan.

Faisnéis athbhreithnithe piaraí

Gabhann Nature Communications buíochas le George Miller agus leis an athbhreithneoir/na hathbhreithneoirí eile, gan ainm, as an méid a chuir siad leis an athbhreithniú piaraí ar an obair seo. Tá tuairiscí athbhreithneora piaraí ar fáil.

Tá athchlónna agus faisnéis cheada ar fáil ag http://www.nature.com/reprints

Nóta ón bhfoilsitheoir Tá Springer Nature fós neodrach maidir le héilimh dhlínsiúla i léarscáileanna foilsithe agus i gcleamhnachtaí institiúideacha.

Rochtain Oscailte Tá an t-alt seo ceadúnaithe faoi Creative Commons Attribution 4.0 Cheadúnas Idirnáisiúnta, a cheadaíonn úsáid, comhroinnt, oiriúnú, dáileadh agus atáirgeadh in aon mheán nó formáid, chomh fada agus a thugann tú creidmheas cuí don bhunúdar (s) agus an fhoinse, nasc chuig ceadúnas Creative Commons a sholáthar, agus cuir in iúl an ndearnadh athruithe.

Tá na híomhánna nó ábhar tríú páirtí eile san alt seo san áireamh i gceadúnas Creative Commons an ailt mura gcuirtear a mhalairt in iúl i líne creidmheasa an ábhair. Mura bhfuil ábhar san áireamh i gceadúnas Creative Commons an ailt agus mura bhfuil d’úsáid bheartaithe ceadaithe ag rialachán reachtúil nó má sháraíonn tú an úsáid cheadaithe, beidh ort cead a fháil go díreach ó shealbhóir an chóipchirt. Chun féachaint ar chóip den cheadúnas seo.

For more information:1950477648nn@gmail.com