Stádas Reatha Néarchosanta i nGalar Croí Ó bhroinn Cuid 2

Rinneadh na híomhánna micreascópacha a ríomh ansin trí úsáid a bhaint as bogearraí ImageJ (Institiúidí Náisiúnta Sláinte, Bethesda, MD, SAM). Méadaíodh an comhartha Hsp60 faoi "x".

Is móilín próitéin tábhachtach é Hsp60 a bhfuil ról tábhachtach bitheolaíoch aige i gcorp an duine. Léiríonn taighde le blianta beaga anuas go bhfuil dlúthbhaint ag láithreacht Hsp60 le cuimhne an duine.

Is próitéin chaperone mhóilíneach é Hsp60 a bhfuil baint aige go príomha le fillte próitéin, le dífhoirmiú, le cobhsú, agus le díghrádú. Tá na próisis seo an-tábhachtach le haghaidh meitibileacht gnáth agus feidhm cheallacha an chorp daonna. Ag an am céanna, tá éifeachtaí frithocsaídeacha, frith-athlastacha agus inmunomodulatory ag Hsp60 freisin, agus tá ról mór aige maidir le sláinte an duine agus cothromaíocht an chórais imdhíonachta a chothabháil.

Fuair ​​​​taighde amach go bhfuil ról ríthábhachtach ag Hsp60 i bhfoirmiú agus cothabháil cuimhne. Le linn an phróisis foghlama agus cuimhne, táirgeann cealla inchinn líon mór de mhóilíní Hsp60. Is féidir leis na móilíní seo cealla a chosaint ó chur isteach agus damáiste ón timpeallacht sheachtrach chun dul chun cinn rianúil na foghlama agus na cuimhne a chinntiú. Ina theannta sin, is féidir le Hsp60 difear a dhéanamh freisin ar smaointeoireacht agus iompar an duine trí aistriú comhartha cealla inchinn agus forbairt néaróin a athrú agus tá tionchar dearfach aige ar chognaíocht agus ar fhriotaíocht strus.

Cé gur léirigh ról Hsp60 éifeachtaí dearfacha ar chorp an duine, ní mór do dhaoine a thuiscint freisin go bhféadfadh éifeachtaí diúltacha a bheith ag barraíocht agus easnamh Hsp60 ar shláinte an duine. Dá bhrí sin, ba cheart dúinn meicníocht Hsp60 a iniúchadh agus a staidéar go gníomhach i gcoinníollacha fiseolaíocha agus paiteolaíocha éagsúla an chorp daonna chun tuiscint níos fearr a fháil ar sheasamh agus ar ról Hsp60 i sláinte an duine. Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid cuimhne a fheabhsú, agus is féidir le Cistanche deserticola feabhas mór a chur ar chuimhne, toisc go bhfuil éifeachtaí frithocsaídeacha, frith-athlastacha agus frith-aosaithe ag Cistanche deserticola, rud a d'fhéadfadh cabhrú le ocsaídiú agus imoibrithe athlastacha san inchinn a laghdú, rud a chosnaíonn an sláinte an néarchóras. Ina theannta sin, is féidir le Cistanche deserticola fás agus deisiú na gcealla néaróige a chur chun cinn, rud a fheabhsaíonn nascacht agus feidhm líonraí néaracha. Is féidir leis na héifeachtaí seo cabhrú le feabhas a chur ar chuimhne, ar chumas foghlama, agus ar luas smaointeoireachta, agus féadfaidh siad cosc ​​​​a chur ar fhorbairt mhífheidhm chognaíoch agus galair neurodegenerative.

Cliceáil Know chun cuimhne gearrthéarmach a fheabhsú

Socraíodh an luach "x" mar seo a leanas: trí chomhartha Hsp60 fillte "x" a dhealú ón gcomhartha DNA miteachondrial sa ghrúpa rialaithe rinne an luach DNA miteachondrial níos lú ná nó cothrom le nialas. Méadaíodh comhartha histone H2B faoi "y".

Socraíodh an luach "y" mar seo a leanas: trí an comhartha histone-H2B fillte "y" a dhealú ón gcomhartha núicléach-DNA sa ghrúpa rialaithe, rinneadh an luach núicléach-DNA níos lú ná a bheith cothrom le nialas. Má éiríonn an comhartha cúlra ard ón iolrú, is féidir codarsnacht na híomhá iolraithe a choigeartú do na coinníollacha céanna sna samplaí go léir.

Baineadh úsáid as íomhá staining dsDNA, lúide an íomhá choigeartaithe de Hsp60 iolraithe agus histone H2B, le haghaidh anailíse ina dhiaidh sin. Ag baint úsáide as an bhfeidhm "Coigeartaigh-Tairseach", rinneadh na híomhánna seo a dhénárdú. Roghnaigh muid dsDNA puncta sa raon méide ó 2 go 20 µm2 (ciorcalacht0.1–1.0), agus rinneadh iad a chomhaireamh ag baint úsáide as an bhfeidhm “Analyze-Analyze Particles”.

2.3. Micreascópacht Leictreonaic

Lá amháin roimh aistriú, plátáladh cealla HeLa ag dlús 600 cill/µL. Cuireadh léiriú géinte spéise ina thost i gcealla HeLa ag baint úsáide as Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) i Lipofectamine RNAiMAX Transfection Imoibrí (ThermoFisher Scientific) de réir an treoracha an mhonaróra (le tiúchan RNA deiridh de 10 nM).

Ceithre lá tar éis cnag síos siRNA, cuireadh cealla faoi shocrú. Socraíodh samplaí cill-chultúr le 2% PFA agus 2% glutaraldehyde i 0.1 M fosfáitbuffer, pH 7.4, ag 37 ◦C, ansin curtha i 4 ◦C cuisneoir ar feadh 32 nóiméad. Socraíodh na samplaí i 2% glútaraildéad i 0.1 M maolán fosfáite thar oíche ag 4 ◦C. Nite na samplaí trí huaire le maolán fosfáite 0.1M ar feadh 30 nóiméad agus iar-seasta le 2% osmiumtetroxide i maolán fosfáite 0.1 M ag 4 ◦C ar feadh 1 h.

Díhiodráitíodh réitigh eatánóil neamhghrádaithe díhiodráitithe, aistríodh iad go roisín (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tóiceo, an tSeapáin), agus polaiméiríodh iad ag 60 ◦C ar feadh 48 h. Gearradh na roisíní polaiméirithe i gcodanna ultratana 70-nms le scian diamanta ag baint úsáide as ultramicrotome (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, an Ghearmáin) agus ansin cuireadh iad ar ghreillí copair.

Bhí na hailt dhaite le aicéatáit úráinil 2% ag RT ar feadh 15 nóiméad agus nite le huisce driogtha, agus ina dhiaidh sin staining tánaisteach le tuaslagán staining luaidhe (Sigma-Aldrich, Tóiceo, an tSeapáin) ag RT ar feadh 3 nóiméad.

Breathnaíodh na greillí faoi mhicreascóp leictreoin tarchuir (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tóiceo, an tSeapáin) ag voltas luasghéaraithe 80 kV (inchinn zebrafish) nó 100 kV (cill), agus taifeadadh íomhánna ag baint úsáide as ceamara gléas luchta-chúpláilte (CCD) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Micreascópacht Imdhíonleictreon

Bhí na samplaí ar na dioscaí óir reoite i própán leachtach ag −175 ◦C. Tar éis na samplaí a reoite, cuireadh aigéad tannic 1% in eatánól agus 2% uisce driogtha ag −80 ◦C ina ionad ar feadh 24 uair an chloig.

Coinníodh na samplaí ansin ag −20 ◦C ar feadh 4 uaire, agus ina dhiaidh sin gor ag 4 ◦C ar feadh 1 uair. Ansin, díhiodráitíodh na samplaí in eatánól ainhidriúil3 ar feadh 30 nóiméad. gach uair, agus insíothlú ina dhiaidh sin le meascán 50:50 de eatánól agus roisín (CD bán: London Roisín Co. Ltd., Berkshire, RA) ag 4 ◦C ar feadh 1 uair. Aistríodh na samplaí chuig roisín úr 100% agus goraíodh iad ag 4 ◦C ar feadh 30 nóiméad, agus rinneadh an próiseas seo arís agus arís eile trí huaire.

Aistríodh na samplaí go roisín úr 100% agus polaiméiríodh iad ag 50 ◦CO/N. Roinneadh na roisíní polaiméirithe ultra-tanaí ag 90 nm witha diamond scian ag baint úsáide as ultramicrotome (Ultracut UCT; Leica), agus cuireadh na hailt ar ghreillí nicil. Goradh na heangacha le antashubstaint frith-dsDNA (35I9 DNA)(1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) i 1% BSA/PBS ag 4 ◦CO/N, agus ina dhiaidh sin na sruthlaithe sin le 1% BSA/PBS ar feadh 1 nóiméad an ceann.

Goradh ina dhiaidh sin iad leis na hantashubstaintí comhchuingeacha seo comhchuingeach le {{{0}}nm cáithníní óir (polachlónalantantasubstaint frith-luiche gabhar IgG) ar feadh 2 uair ag RT. Tar éis sruthlú le PBS, cuireadh na greillí i maolán 2% glutaraldehydein 0.1 M cacodylate.

Ina dhiaidh sin, triomaíodh na greillí agus ansin dathaíodh iad le aicéatáit úráinil 2% ar feadh 15 nóiméad agus le tuaslagán stain luaidhe (Sigma-Aldrich) ag RT ar feadh 3 nóiméad. Breathnaíodh na greillí trí mhicreascóp leictreoin tarchurtha (JEM-1400). móide; JEOLLtd.) ag voltas luasghéaraithe 100 kV. Fuarthas íomhánna digiteacha le ceamara CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Torthaí

3.1. Laghdú TFAM nó GBA Spreagann Méadú ar DNA Mitochondrial Ectopic

Ar dtús, léirigh muid sampla de bhrath cytoplasmicDNA díorthaithe mitochondria i gcealla HeLa inar leagadh an próitéin TFAM síos le siRNA (Fíor 1A). Is príomhfhachtóir trascríobh mitochondrial é TFAM agus feidhmíonn sé freisin i macasamhlú agus deisiú mitochondrialDNA [20] .

Tuairiscítear go bhfuil polymorphisms seicheamhacha sa ghéine seo bainteach le galar Parkinson [21,22]. Tar éis 3 lá de bhriseadh próitéin TFAM, aimsíodh go leor poncanna DNA le snáithe dúbailte i gcíteaplasma na gcealla HeLa.

Is marcóirí dearfacha iad histones do DNA de bhunadh núicléach sa chíteaplasma, agus marcóirí diúltacha do DNA miteachondrial agus DNA de bhunadh miteachondrial sa chíteaplasma [23]. Ina theannta sin, níor chomhlonnaigh cuid de na poncanna DNA cíteaplasmacha, ectópacha seo le Hsp60, marcóir don mhaitrís miteachondrial, rud a thugann le fios go raibh cónaí orthu lasmuigh de na mitochondria (Fíor 1B, C).

Léirigh micreascópacht leictreon freisin gur sceitheadh ​​​​an DNA ectopic ó na mitochondria (Fíor 2A, B). Go hachomair, ba é an méadú ar DNAdots ectopic sa cíteaplasma ag TFAM knockdown mar gheall ar sceitheadh ​​​​DNA mitochondrial ó na mitochondria.Second, léirigh muid sampla eile de bhrath DNA cíteaplasma díorthaithe mitochondria i gcealla HeLa inar leagadh próitéin GBA síos ag siRNA. (Fíor 1A).

Is é GBA an géine cúiseach do ghalar Gaucher, ach tá sóchán heitrisigeach GBA freisin ina fhachtóir riosca do ghalar Parkinson [24]. Braitheadh ​​go leor poncanna DNA dúbailte-snáithe i gcíteaplasma na gcealla HeLa tar éis 3 lá de bhualadh próitéin GBA. Comhlonnaíodh poncanna SomeDNA le histones, rud a thugann le tuiscint gur DNA de bhunadh núicléach a bhí iontu.

Ní raibh poncanna DNA eile comhlonnaithe le histones, rud a thugann le tuiscint nach DNA de bhunadh núicléach a bhí iontu ach DNA díorthaithe ó mhiotochondria (Fíor 1D). Go hachomair, ba é an méadú ar phoncanna DNA ectopic sa cíteaplasma de bharr cnagadh GBA ar a laghad go páirteach mar gheall ar sceitheadh ​​DNA miteachondrial ó na miteachondria.

For more information:1950477648nn@gmail.com