Trí Dhíriú ar Lactate Dehydrogenase A Le Catechin Ath-íogairíonn SNU620/5FU Cealla Ailse Gaistreacha Go 5-Fluorouracil Cuid 1
Mar 23, 2022
Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais
Coimriú:Tarlaíonn frithsheasmhacht in aghaidh teiripí frith-ailse i mbeagnach gach cineál ailse agus bíonn deacracht mhór ann maidir le cóireáil ailse. Cé gurb é 5-fluorouracil (5FU) an rogha chéad líne de theiripe frith-ailse le haghaidh ailse gastrach, tá a éifeachtúlacht teoranta mar gheall ar fhriotaíocht drugaí. Le déanaí, glacadh le meitibileacht athraithe ailse, lena n-áirítear éifeacht Warburg, rogha do glicealú seachas fosfarylation ocsaídiúcháin le haghaidh táirgeadh fuinnimh, mar mheicníocht ríthábhachtach a rialaíonn frithsheasmhacht in aghaidh ceimiteiripe. Mar sin, rinneamar imscrúdú ar mheicníocht mhionsonraithe agus ar a úsáidí féideartha gníomhairí antiglycolytic maidir le feabhas a chur ar fhriotaíocht 5FU ag baint úsáide as línte cealla ailse gastric bunaithe, léirigh SNU620 agus SNU620/5FU.SNU620/5FU, friotaíocht cothúcháin cille ailse gastrach go 5FU, táirgeadh agus léiriú lachtáit i bhfad níos airde. deeinsímí a bhaineann le glicealú, mar shampla lactate dehydrogenase A(LDHA), ná iad siúd de na cealla tuismitheoir SNU620. Chun glicealú a theorannú, scrúdaíomar catechin agus a díorthaigh, a bhfuil aithne orthufrith-athlastachagus táirgí nádúrtha frith-ailse mar gur tuairiscíodh epigallocatechin gallate roimhe seo mar shochtadh ar léiriú LDHA. Bhí an éifeacht coisctheach is airde ag Catechin, an cumaisc is simplí ina measc, ar tháirgeadh lachtáit agus ar ghníomhaíocht LDHA. Ina theannta sin, léirigh an meascán de 5FU agus catechin cíteatocsaineacht breise agus apoptosis idirghabhála speiceas ocsaigin imoibríoch spreagtha (ROS) i gcealla SNU620/5FU. Mar sin, bunaithe ar na torthaí seo, molaimid catechin mar iarrthóir chun druga aidiúvach núíosach a fhorbairt a laghdaíonn an chemoresistance go 5FU trí LDHA a shrianadh.
Eochairfhocail:5-fluaracil;chemoresistant; glicealú; lactate dehydrogenase; catechin
Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh eolais a fháil
1. Réamhrá
Tá dul chun cinn suntasach déanta i gcóireáil ailse gastrach le hathghearradh máinliachta ar an meall príomhúil agus 5-cheimiteiripe comhcheangailte bunaithe ar fluorouracil (5FU), mar epirubicin, cisplatin, agus fluorouracil agus docetaxel, oxaliplatin, agus 5FU[1 ,21 Go dtí seo, tá 5FU, analóg de uracil a bhlocálann sintéis DNA trí chosc a chur ar thymidylate synthase [3], fós ina dhruga ceimiteiripe a úsáidtear go coitianta chun ailse gastrach a chóireáil [1, A4]. Mar sin féin, bhí éifeachtúlacht chliniciúil ceimiteiripe míshásúil mar gheall ar athiompaithe ailse príomhúil nó meiteastatach a bhaineann le frithsheasmhacht in aghaidh drugaí [1,5].
Is féidir le Cistanche díolúine a fheabhsú
Breathnaítear ar roinnt próisis cheallacha mar phríomh-mheicníochtaí atá mar bhunús le cemoresistance, lena n-áirítear gníomhachtú nó díghníomhú drugaí, deisiú damáiste DNA innealra, modhnuithe ar spriocanna drugaí, díghníomhú cosáin apoptotic, agus autophagy méadaithe [6,7]. Tá ailse ilchineálach agus úsáideann ailsí éagsúla glicealú agus fosfarylation ocsaídiúcháin le haghaidh meitibileacht fuinnimh [8]. Mar sin féin, tuairiscíodh athchlárú meitibileach, go háirithe glicealú aeróbach neamhghnácha, mar phríomh-imreoir i bhforbairt na frithsheasmhachta in aghaidh drugaí ceimiteiripeacha, lena n-áirítear 5FU, in ailse gastrach [9]. Tugtar lachtáit dehydrogenase A (LDHA) agus kinases dehydrogenase pyruvate (PDKanna) mar phríomhrialaitheoirí de ghliocalú aeróbach a tháirgeann lachtáit ó phiriváit[10,11]. Athchóiríonn an meascán de dichloroacetate, inhibitor bunaithe de PDK, íogaireacht i dtreo 5FU [12]. Ina theannta sin, tuairiscíodh LDHA, príomh-einsím a chatalaíonn tiontú pyruvate go lachtáit, mar sprioc féideartha le haghaidh cóireáil ailse gastrach [13,14]. Cuireann Knockdown de léiriú LDHA i gcealla ailse bac ar tumorigenicity trí riospráid mitochondrial a mhéadú agus inmharthanacht cille a laghdú [15]. Laghdaíonn roinnt coscairí LDHA, mar shampla FX11, PSTMB, agus GSK 2837808A, leibhéil ATP agus gineann siad strus ocsaídiúcháin, agus ar deireadh is cúis le bás cille apoptotic [16-18]. Cé gur léirigh staidéar gur thángthas ar chosc ar LDHA ag microRNA-34a an fhriotaíocht do 5FU in ailse drólainne [19], níor thuairiscigh aon staidéar roimhe seo éifeachtaí coscairí géiniteacha nó cógaseolaíochta LDHA ar chemoresistance.
Polyphenols tae glas, lena n-áirítear catechin (CA), epicatechin (EC), gallocatechin(GC), epigallocatechin(EGC), epicatechin-3-gallate (ECG), agus epigallocatechin-3-gallate (EGCG), chun cinn daonna sláinte trí roinnt galair a chosc agus a chóireáil, lena n-áirítear athlasadh, diaibéiteas, galar cardashoithíoch, agus ailse urchóideach [20,21]. I measc polyphenols, feabhsaíonn EGCG chemosensitivity 5FU i ailse cholaireicteach agus cealla carcinoma hepatocellular trí ghníomhachtú cosáin AMPK agus srian a chur ar gas ailse [22,23]. Ina theannta sin, tuairiscíodh go gcuireann EGCG bac ar LDHA trína chuid léirithe a athbhrú sna cealla ailse chíche agus pancreatic [24,25].
Sa staidéar seo, rinneamar hipitéis go bhféadfadh CA a bheith ina iarrthóir ar dhruga aidiúvach chun an fhriotaíocht in aghaidh 5FU a laghdú i gcealla ailse gastrach. Scrúdaíodh gur spreag éifeacht coisctheach CA, agus/nó a chomhcheangal le 5FU, ar ghníomhaíocht LDHA speiceas ocsaigin imoibríoch mitochondrial (ROS) agus bás cille apoptotic i gcealla atá frithsheasmhach in 5FU.
2. Torthaí
2.1. Tréithe Glycolytic na gCealla Frithsheasmhach in 5FU
Is saintréith de chemoresistance é iomadú feabhsaithe lena n-áirítear cealla ailse 5FU-resistant [26,27]. Ar dtús, dheimhnigh muid an fhriotaíocht do 5FU agus rátaí fáis fadtéarmacha de chealla SNU620 agus SNU620/5FU. Nuair a saothraíodh na cealla seo leis na tiúchain in iúl de 5FU ar feadh 48 h, bhí an dáileog measta ba chúis le cosc fáis 50 faoin gcéad (Gl50) i gcealla SNU620/5FU (100.63 uM) i bhfad níos airde ná an dáileog is cúis le GIso i gcealla SNU620 a thuismitheoirí (28.88 μM). ）（Fíor 1A agus Fíor Forlíontach S1）. Ina theannta sin, bhí rátaí fáis cealla SNU620/5FU níos tapúla ná iad siúd de chealla SNU620 (Fíor 1B agus Fíor Forlíontach S2). Ós rud é go bhféadfadh tréithe cemoresistance agus atá ag fás go tapa a bheith bainteach le hairíonna glycolytic ardaithe i gcealla ailse gastric [28], rinneadh rátaí aigéadaithe extracellular (ECAR) agus rátaí tomhaltais ocsaigine (OCR) a thomhas sa dá chealla i láthair oxamate, rud a bhfuil aithne mhaith air. inhibitor glycolysis, nó nach bhfuil. Léirigh na torthaí go ndearna cealla SNU620/5FU níos mó lachtáit a scaoileadh go suntasach ná mar a bhí secrete ag cealla SNU620 agus go ndearna siad aigéadú ar an meán cultúir ina dhiaidh sin (Fíor 1C agus Fíor Forlíontach S3). Mar sin féin, níor tugadh faoi deara aon athrú suntasach ar OCR idir na cealla seo (Fíor 1D). Tomhaiseadh na leibhéil mRNA agus léirithe próitéine de LDHA. Bhí léiriú LDHA níos airde i gcealla SNU620/5FU ná i gcealla SNU620 (Fíor 1E, F). Ina theannta sin, rinneamar scrúdú ar na leibhéil mRNA agus léirithe próitéine de isitíopaí PDK agus fuarthas amach go raibh iad siúd de PDK2 agus PDK3 níos airde i gcealla SNU620/5FU ná i gcealla SNU620 (Fíor Forlíontach S4A, B). Rinneadh measúnú freisin ar phosphorylation an fho-aonad E1 de pyruvate dehydrogenase (PDHA1), a mhéadaigh PDKanna, agus fuarthas go raibh sé níos airde i gcealla SNU620/5FU ná i gcealla SNU620 (Fíor Forlíontach S4C). oxamate mar inhibitor LDHA chun friotaíocht 5FU a shárú i gcealla SNU620/5FU. Chuir an cumaisc seo bac ar fhás cille i gcealla SNU620 agus SNU620/5FU (Fíor Forlíontach S5). Thairis sin, tá cotreatment le oxamate agus fás cille faoi chois 5FU, i gcomparáid le cóireáil aonair le cealla oxamate nó 5FUin SNU620/5FU (Fíor 1G). Tugann na sonraí seo le fios go léiríonn cealla SNU620/5FU LDHA go mór, agus is féidir le cosc ar ghníomhaíocht LDHA friotaíocht cealla SNU/5FU go 5FU a shárú.
Fíor 1. De réir na dtorthaí, tá tréith glycolytic ardaithe ag cealla resistant fluorouracil (5FU): (A) déileáladh le cealla SNU620 agus SNU620/5FU leis na tiúchain léirithe de 5FU ar feadh 48 h. Rinneadh inmharthanacht na gceall seo a mheas trí mheasúnacht MTT; (B) rinneadh leibhéil fáis de chealla SNU620 agus SNU620/5FU a thomhas gach lá ar feadh 4 lá le measúnacht MTT; (C,D) déileáladh le cealla SNU620 agus SNU620/5FU le oxamate ( 5mM) nó nach ea ar feadh 24 h, agus rinne anailísí Seahorse XF luacháil ar luachanna ECAR agus OCR; (E, F) aimsíodh na habairtí LDHA i gcealla SNU620 agus SNU620/5FU trí qRT-PCR agus anailís blot an Iarthair; (G) Cóireáladh cealla SNU620 agus SNU620/5FU le oxamate (25 mM) agus/nó 5FU (10μM) ar feadh 48h. Taispeántar na torthaí mar mheán ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
2.2. Déanann CA Gníomhaíocht LDHA a Shochtadh
Rinneadh anailís ar tháirgeadh lachtáit le CA agus a díorthaigh, lena n-áirítear EC, GC, EGC, agus EGCG, i gcealla SNU620 / 5FU. I gcomparáid leis na díorthaigh seo, laghdaigh CA táirgeadh lachtáit ar bhealach níos éifeachtaí (Fíor 2A). Ina theannta sin, in vitro, deimhníodh mar a deir an ghníomhaíocht LDHA, agus léirigh CA éifeacht coisctheach níos láidre ar ghníomhaíocht LDHA ná iad siúd dá díorthaigh (Fíor 2B). Rinneadh éifeachtaí coisctheacha CA ar ghníomhaíochtaí LDHA in vitro agus LDHB a thomhas ar bhealach dáileog-spleách. Chuir CA bac ar ghníomhaíocht LDHA gan cur isteach ar ghníomhaíocht LDHB (Fíor 2C, D). Ina theannta sin, rinneadh gníomhaíochtaí LDHA agus LDHB a thomhas le EGCG, arb eol go gcuireann sé bac ar ghníomhaíocht LDHA, agus fuarthas amach gur laghdaíodh dáileog-spleách (Fíor Forlíontach S6A, B). Ina theannta sin, rinneadh meastóireacht ar ghníomhaíochtaí LDHA intracellular agus LDHB leis na tiúchain léirithe CA i gcealla SNU620/5FU. Chuir CA bac ar ghníomhaíocht LDHA ar bhealach dáileog-spleách ar thorthaí in vitro ach ní ar ghníomhaíocht LDHB (Fíor 2E, F). Rinneadh leibhéil léirithe próitéin p-PDHA1, PDK2, PDK3, agus LDHA a thomhas freisin i gcealla SNU620 / 5FU tar éis cóireáil CA (Fíor Forlíontach S7), agus thugamar faoi deara nach raibh tionchar ag an gcóireáil seo orthu siúd. Tugann na torthaí seo le fios go rialaíonn CA gníomhaíocht LDHA gan cur isteach ar a léiriú.
2.3. Modh Gníomhaíochta um Chosc ar LDHA ag an ÚD
Chun anailís a dhéanamh ar mheicníocht choiscthe ghníomhaíocht LDHA ar CA agus a díorthaigh, rinneamar samhaltú móilíneach ar an idirghníomhaíocht cheangailteach idir LDHA athchuingreach daonna agus CA (Fíor 3A,B). Léirigh na torthaí go bhféadfadh CA idirghníomhú le hiarmhair T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192, agus T247 de LDHA. Ina measc, tá R105, S136, agus R168 ríthábhachtach chun foshraitheanna (piriúváit) a cheangal. Mar sin, ghlacamar leis go bhféadfadh CA cur isteach ar na suíomhanna ceangailteach don tsubstráit. Os a choinne sin, tá EGCG ceangailte le LDHA trí shuíomh eile. Chun modh gníomhaíochta an choisc LDHA ag CA a fhíorú tuilleadh, deimhníodh ceapacha Michaelis-Menten agus Lineweaver-Burk le tiúchain éagsúla pyruvate agus CA. Méadaíodh gníomhaíocht LDHA ar bhealach pyruvate ag brath ar dháileog. Mar sin féin, aisiompaíodh é mar gheall ar mhéadú CA. Mar sin, léirigh torthaí ceapacha Michaelis-Menten agus Lineweaver-Burk go bhfuil an CA ina choscóir neamhiomaíoch ar LDHA (Fíor 3C, D). Chomh maith leis sin, léirigh sonraí calraiméadrachta toirtmheasctha isiteirmeach (ITC) go bhfuil CA ceangailte go fisiciúil le LDHA trí Kd. luach 197 uM (Fíor Forlíontach S8). Soláthraíonn na torthaí seo léargais go gcuireann CA gníomhaíocht LDHA faoi chois trí shuíomh ceangailteach foshraitheanna LDHA a cheangal.
2.4. Ath-íogairíonn CA Friotaíocht 5FU trí Ghníomhaíocht LDHA a Laghdú
Rinneamar measúnú ar éifeachtaí citotocsaineacha CA ar chealla SNU620 agus SNU620/5FU agus fuaireamar amach gur chuir CA fás sa dá ghrúpa cealla faoi chois (Fíor 4A). Chun a fhíorú go raibh baint ag an gcosc fáis le cosc ar ghníomhaíocht LDHA, cuireadh deireadh le léiriú LDHA le haigéad ribonucleic hairpin gearr (shRNA) le haghaidh LDHA (shLDHA) agus aisghabhadh a léiriú trí aistriú LDHA in iúl plasmid (Figiúr Forlíontach S9A, B). I gcealla SNU620/5FU arna n-aistriú ag shLDHA, níor athraíodh táirgeadh lachtáit agus inmharthanacht na gceall go mór le cóireáil CA, i gcomparáid leo seo de chealla bréige-aistrithe (Fíor 4B, C). Ina theannta sin, bhí éifeacht coisctheach fáis CA. méadú trí aisghabháil slonn LDHA i gcealla LDHA-knockdown SNU620/5FU (Fíor 4D). Ina theannta sin, scrúdaíodh cealla SNU620 agus SNU620/5FU tar éis CA agus 5FU a chóireáil ina n-aonar nó an dá cheann a chomhcheangal. Chuir cóireáil le CA agus 5FU bac suntasach ar fhás cealla SNU620/5FU (Fíor 4E). Ina theannta sin, scrúdaíodh éifeachtaí teaglaim CA agus 5FU i roinnt línte cille eile, mar shampla ailse gastrach an duine AGS, Panic ailse pancreatach-1, MIA PaCa-2, agus cealla ailse drólainne LS174T agus RKO, i gcomparáid le SNU620 agus SNU620/5FUcells. Léirigh an táirgeadh lactate agus léiriú LDHA comhghaol maith lena chéile, agus tá na hairíonna glycolytic seo sách ard i SNU620/5FU, AGS, agus RKO (Fíor Forlíontach S10A, B). Thairis sin, laghdaigh cóireáil teaglaim CA agus 5FU inmharthanacht na gceall go suntasach, i gcomparáid le cóireáil amháin de 5FU i gcealla glycolytic lena n-áirítear AGS agus RKO (Fíor Forlíontach S10C). Mar sin féin, níor chuir cotreatment le CA agus 5FU bac suntasach ar fhás i gcealla SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2, agus LS174T, a léirigh léirithe íseal LDHA. Mhol na torthaí seo go bhféadfadh baint a bheith ag éifeacht íograithe CA go cealla resistant 5FU lena éifeacht coisctheach ar ghníomhaíocht LDHA.
Figiúr 2. Cuireann Catechin(CA) bac ar ghníomhaíocht LDHA ach ní a léiriú: (A) tomhaiseadh táirgeadh lachtáit SNU620/5FU tar éis cóireála le díorthaigh CA (10 μM) ar feadh 24 h; (B) luacháladh gníomhaíocht LDHA in vitro ar chóireáil le díorthaigh CA (10 uM) agus oxamate (20 mM); (C, D) in vitro, rinneadh gníomhaíochtaí LDHA agus LDHB a mheas leis na tiúchain CA a léiríodh; (E, F) déileáladh leis na cealla le tiúchain léirithe CA ar feadh 24h. Rinneadh gníomhaíochtaí LDHA intracellular agus LDHB a thomhas ag baint úsáide as na lysates cille mar fhoinse einsím. Taispeántar na torthaí mar mheán ± SEM. ** lch<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
Fíor 4. Cuireadh bac ar inmharthanacht cille trí chóireáil le catechin (CA) agus 5-fluorouracil (5FU) i gcealla 5FU-resistant:(A) rinneadh measúnú ar inmharthanacht cealla SNU620 agus SNU620/5FU tar éis cóireála leis na tiúchain léirithe de Cóireáladh cealla CA ar feadh 48 h; （B） SNU620/5FU-pLKO.1 agus SNU620/5FU-shLDHA le CA (10 μM） ar feadh 24 h. Tomhaiseadh táirgeadh lachtáit sna meáin chultúir de chealla SNU620/5FU-pLKO.1 agus SNU620/5FU-shLDHA; (C, D) SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA móide EV , agus déileáladh le cealla SNU620/5FU-shLDHA móide LDHA#2 leis na tiúchain in iúl CA ar feadh 48 h. Rinneadh inmharthanacht na cille a thomhas ag baint úsáide as measúnacht MTT; （E） SNU620 agus SNU620/5FU déileáladh le cealla le CA (10 μM) agus / nó 5FU (10μM) ar feadh 48 h. Rinneadh inmharthanacht na gceall seo a thomhas trí mheasúnú MTT. Taispeántar na torthaí mar mheán±SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
Tá an t-alt seo a bhaintear as Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms
