Feabhsaíonn Díriú ar Chaipitín B Le Cycloastragenol Díolúine Frithtumóra de Chealla CD8 T Trí Dhíghrádú MHC-I a Chosc Cuid 1

Teibí

CúlraIs fachtóirí tábhachtacha iad caillteanas antaiginí siadaí agus ídiú cealla CD8 T de bharr an chosáin PD-1/PD-L1 maidir le héalú imdhíonachta siadaí. Le blianta beaga anuas, tá taighde méadaithe ar leigheas traidisiúnta na Síne i gcóireáil siadaí. Fuarthas amach go bhfuil feidhmeanna antiviral, antiaging, anti-inflammatory, agus feidhmeanna eile ag Cycloastragenol (CAG), móilín gníomhach éifeachtach in Astragalus membranaceus. Mar sin féin, níl a éifeacht antitumor agus meicníocht soiléir.

Is féidir le glycoside cistanche méadú freisin ar ghníomhaíocht SOD i bhfíocháin chroí agus ae, agus laghdaítear go mór an t-ábhar lipofuscin agus MDA i ngach fíocháin, ag scavening go héifeachtach fréamhacha ocsaigine imoibríocha éagsúla (OH-, H₂O₂, etc.) agus a chosaint i gcoinne damáiste DNA a dhéantar. ag OH-radacach. Tá cumas láidir scavenging fréamhacha saor in aisce ag gliocóisídí cistanche feinileatánóideach, cumas laghdaithe níos airde ná vitimín C, feabhas a chur ar ghníomhaíocht SOD i bhfionraí sperm, laghdaigh ábhar MDA, agus tá éifeacht chosanta áirithe acu ar fheidhm membrane sperm. Is féidir le polaisiúicrídí cistanche feabhas a chur ar ghníomhaíocht SOD agus GSH-Px in erythrocytes agus fíocháin scamhóg lucha senescent turgnamhacha de bharr D-galactós, chomh maith le hábhar MDA agus collagen sa scamhóg agus plasma a laghdú, agus ábhar elastin a mhéadú. éifeacht scavenging maith ar DPPH, fadú am hypoxia i lucha senescent, feabhas a chur ar ghníomhaíocht SOD i serum, agus moill a chur ar dhíghiniúint fiseolaíoch na scamhóg i lucha senescent turgnamhach Le díghiniúint moirfeolaíoch cheallacha, tá sé léirithe ag turgnaimh go bhfuil an cumas frithocsaídeach maith ag Cistanche. agus tá an cumas aige a bheith ina dhruga chun galair aosaithe craicinn a chosc agus a chóireáil. Ag an am céanna, tá cumas suntasach ag echinacoside i Cistanche fréamhacha saor in aisce DPPH a scavening agus tá an cumas aige speicis ocsaigine imoibríocha a scaveneáil agus cosc ​​a chur ar dhíghrádú collagen saor ó radacach saor in aisce, agus tá éifeacht mhaith deisiúcháin aige freisin ar damáiste anion radacach saor ó thymine.

Cliceáil ar buntáistí agus míbhuntáistí cistanche

【Le haghaidh tuilleadh eolais:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

ModhannaImscrúdaíodh éifeacht antitumor CAG i múnlaí siadaí MC38 agus CT26 trasphlandaithe luch. Rinneadh anailís bhreise ar éifeacht frith-tumor CAG trí sheicheamh il-omics aonchealla. Baineadh úsáid as teicneolaíocht phróifílithe inrochtaineachta a fhreagraíonn do spriocanna chun an spriocphróitéin CAG a aimsiú. Ina dhiaidh sin, rinneadh iniúchadh ar mheicníocht antitumor CAG ag baint úsáide as micreascópacht chomhfhócasach, imdhíon-réamhshamhlú, agus aistriú plasmidí mutant. Ar deireadh, rinneadh imscrúdú ar chomhéifeacht frith-tumor antasubstaintí CAG agus PD{{-1 i lucha nó orgánaigh.

TorthaíFuaireamar amach gur chuir CAG bac go héifeachtach ar fhás siadaí in vivo. Léirigh ár n-atlas il-omics aonchealla gur chuir CAG cur i láthair antaiginí dromchla cille meall chun cinn agus go raibh feidhm maraithe feabhsaithe CD8 móide cealla T mar shaintréith aige. Go meicniúil, bhí CAG ceangailte lena sprioc-phróitéin cathepsin B, rud a chuir bac ansin ar dhíghrádú lysosomal na mór-choimpléasc histo-chomhoiriúnachta I (MHC-I) agus a chuir comhiomlán n MHC-I chun cinn go dtí an membrane cille, ag treisiú réamhstáisiún an antigen meall. . Idir an dá linn, chuir an teaglaim de CAG le hantasubstaint PD-1 go héifeachtach le marú siadaí CD8 marú siadaí móide cealla T i lucha xenograft agus orgánaigh ailse cholaireicteach. Conclúid Thuairiscigh ár gcuid sonraí don chéad uair go dtugann íosrialáil cathepsin B imdhíonacht frith-tumor agus dátaí caiteachais ar mheicníocht antitumor an táirge CAG nádúrtha.

RÉAMHRÁ

Tá ailse chalaireicteach ar cheann de na hailse is coitianta ar fud an domhain. Tá a ráta minicíochta agus an ráta básmhaireachta i measc na dtrí cinn is airde, ag bagairt go mór ar shaol an duine agus ar shláinte.1 Áirítear le modhanna cóireála coitianta máinliacht ceimiteiripe agus radaiteiripe, drugaí spriocdhírithe, agus imdhíonteiripe.2–4 Mar sin féin, taispeánann cealla ailse caillteanas antaiginí dromchla agus sainráite de ghnáth. leibhéil arda de mhóilíní bac chun éalú ó faireachas na cealla imdhíonachta. Mar sin, chun an fhadhb a bhaineann le héalú imdhíonachta meall a réiteach, d'fhorbair taighdeoirí coscairí seicphointe imdhíonachta agus teiripe neoantigen chun cosc ​​a chur ar chumhdach na gcealla ailse chuig cealla imdhíonachta. níor cuireadh feabhas suntasach ar chealla. Mar sin, tá sé thar a bheith tábhachtach teacht ar dhrugaí ar féidir leo cur i láthair e-antiginí dromchla siadaí a chur chun cinn. Braitheann aithint cealla ailse trí chealla cíteatocsaineacha CD8 móide T ar chonair an choimpléasc histo-chomhoiriúnachta TCR/CD3/mór (MHC-I). Faigheann TCR an antaigin atá i láthair ag an gcill dendritic/próitéin membrane cille ailse CI agus tarchuireann sé an comhartha chun CD3 a nascadh go docht, a shíneann níos doimhne ansin isteach sa chíteaplasma.9 10 Ag an am céanna, nuair a ghníomhaítear comhartha CD28/ B7 , is féidir cealla CD8 móide T a chomhghníomhú chun cealla ailse a aithint agus a mharú.11 Fuair ​​​​staidéir le déanaí, i bpróiseas dul chun cinn meall, go laghdaítear comhiomlánú MHC-I ar dhromchla cealla ailse mar thoradh ar lysosomes, rud nach bhfuil go héifeachtach. antaiginí láithreacha.12 13 Thuairiscigh Liu et al gur féidir le cosc ​​PCSK9 cosc ​​a chur ar dhíghrádú MHC-I i líseasóim agus cur ar chumas MHC-I filleadh ar an gcillscannán chun antaiginí a chur i láthair.12 Dá bhrí sin, an fheidhm léirithe antaiginí a athbhunú de MHC-I thar a bheith tábhachtach chun éalú imdhíonachta siadaí a bhlocáil.

Tá méadú tagtha ar líon na staidéar a fuarthas amach go bhfuil ionchais iontacha ag baint le cur i bhfeidhm móilíní gníomhacha de leigheas traidisiúnta Síneach n idirghabháil fhrithtumóra.14 15 Is móilín gníomhach éifeachtach é Cycloastragenol (CAG) n Astragalus membranaceus, a bhfuil frithvíreasach, antibacterial, frith-. athlastach, agus éifeachtaí cógaseolaíochta eile, ach is annamh a thuairiscítear a éifeacht antitumor.16–19 Sa staidéar seo, fuaireamar amach gur chuir CAG bac ar fhás siadaí tran anted siadaí ailse drólainne Ba é a bhí i gceist leis an meicníocht go príomha ná díghrádú MHC-I a chosc, arna idirghabháil ag cathepsin B (CTSB), cur i láthair antigen cealla ailse a chur chun cinn, agus ansin feabhas a chur ar chumas marú cealla CD8 móide T.

ABHAIR AGUS MODHANNA

Antasubstaintí agus imoibrithe

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 faoin gcéad). Antasubstaintí CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), Actin (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ), agus Trealamh Braite Imdhíon-aisticeimice frith-luiche/coinín (Cat#PK10006) ceannaíodh ó Proteintech. Antasubstaintí H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), agus CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) ó Santa Cruz Biotechnology. Ceannaíodh Antibody of Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB{_2620142 ) ó Cell Signaling Technology. Ceannaíodh antasubstaint de Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) ó Abcam. Antasubstaintí citeiméadrachta sreafa de CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) agus CD{ {31}}Ceannaíodh PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) ó BD Bioscience. Ceannaíodh antashubstaint cíteiméadrachta sreafa de Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575 ) ó BioLegend. antasubstaintí cíteaiméadrachta sreafa de NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) agus IFN- -PE (Cat#12-7311-81), RRID :AB_466192) ó Thermo Fisher Scientific. Ceannaíodh meán DMEM (Cat#{01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122), agus Séiream Buaibheach Féatais (Cat#C04001-500) ó Biological Industries. Ceannaíodh séiream gabhar (Cat#88RNG001) agus trealamh measúnaithe próitéin Pierce BCA (Cat#23225) ó Thermo Fisher Scientific. Na antasubstaintí PD frith-dhaonna-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) agus frith-luch PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) ceannaíodh ó chill Bio X. Ceannaíodh Trealamh Díthiomsaithe Fíocháin Mheall MACS (Cat#130-095-929) ó Miltenyi Biotec.

Cultúr cille

Coinníodh línte cille ailse drólainne luiche MC38 agus CT26 inár saotharlann.20 Fuarthas na línte l ailse drólainne daonna HCT-116 ó Bhailiúchán Cineál Cultúir Acadamh Eolaíochtaí na Síne (Shanghai, an tSín). Saothraíodh na cealla MC38, CT26, agus HCT-116 i meán DMEM ina raibh 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais agus 1 faoin gcéad peinicillin/streiptimícin ag 37 céim i gorlann 5 faoin gcéad CO2.

Turgnamh meall trasphlandúcháin

Ceannaíodh lucha baineann C57BL/6JGpt, sé seachtaine d’aois, lucha BALB/c, agus lucha nude BALB/,c ó GemPharmatech (Nanjing, an tSín). Rinneadh cealla ailse MC38 nó CT26 (1 × 106) a ionaclú go subcutaneously isteach i ngach luch. Ar fhásann an meall go 100 mm3, roinneadh an mic go randamach i ngrúpa seile maolánach fosfáit (PBS) (m.sh., uair amháin sa lá) agus sa ghrúpa CAG (m.sh., 50mg/kg uair amháin sa lá). Rinneadh toirteanna meall a chinneadh trí thomhas caliper ag baint úsáide as an bhfoirmle V=fad×width2 /2. Nuair a shroich toirt meall na lucha grúpa PBS 1000 mm3, tógadh meall na lucha amach, tógadh grianghraf agus meá.

Díthiomsú aonchealla ón luch le haghaidh RNA/ATACseq aonchealla

Rinneadh siadaí soladacha ó lucha a dhíleá trí úsáid a bhaint as Kit Dissociation Tumor chun cealla aonchealla a fháil. Aonchealla Aonchealla le tiúchan de 1000 cill/1000 cill lódáilte ar an rialtóir cróimiam 10 × géanóm ceall aonchealla ag leanúint phrótacal an mhonaróra 10 × géanómaíocht. Meascadh imoibrithe trascríobh droim ar ais, coirníní glóthacha barrachóidithe, agus ola deighilte leis na cealla le haghaidh gen chun coirníní glóthacha a ghiniúint in eibleachtaí (GEM) le haghaidh tras-scríobh droim ar ais. réamhphróiseáil sonraí scRNA-seq agus rialú cu.

Bunaithe ar ghéanóm tagartha luiche GRCm38 (mm10), an phíblíne CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) chun RNA aonchealla a phróiseáil sonraí seicheamh le haghaidh gach turgnaimh (GSE197229). Rinneadh maitrísí slonn géine digiteacha a zed in R (V.4.0.4) ag baint úsáide as an bpacáiste Seurat (V.4.0.0).21 Roimh anailís dBeforem, rinneadh cealla a scagadh de réir uimhir UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Réamhphróiseáil sonraí SeaTac-seq agus rialú cáilíochta

Rinne maoir cille-at (V.2.0.{5}}) sonraí cille aonair ATAC-seq (GSE197229) a réamhphróiseáil leis an líne ordaithe comhairimh. Chun sonraí scATAC-seq a phróiseáil agus a anailísiú ina dhiaidh sin, d'úsáideamar an pacáiste ArchR (V.1.{8}}.1). comhad saigheada leis an bhfeidhm cre ArrowFiles leis na paraiméadair réamhshocraithe. Ansin, d'úsáideamar an fheidhm filterDoublets chun na doublets féideartha a scriosadh agus chruthaigh muid tionscadal ArchR ag baint úsáide as feidhm ArchRProject le paraiméadair réamhshocraithe. D'úsáideamar an pacáiste Harmony ansin chun an éifeacht bhaisc a bhaint leis an bhfeidhm addHarmony. Le haghaidh leabú aonchealla, roghnaigh muid an oibiacht laghdaitheDims le chéile agus d’úsáideamar an fheidhm addTSNE leis an bparaiméadar ‘perplexity=30’ le haghaidh léirshamhlú.

Anailís chomhtháite ar shonraí siRNA-seq agus scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Chun cruinneas na dtuartha a fheabhsú chun an dá thacar sonraí a chomhtháthú ar bhealach níos fearr, rinneamar na sonraí scATAC-seq agus scRNA-seq a chomhtháthú arís agus úsáid á baint as an modh 'comhtháthú srianta'. Go hachomair, rinneamar anótáil ar na sonraí scATAC-seq le cineálacha cealla bunaithe ar scóir ghéine scATAC-seq. Ansin, chruthaíomar liosta srianta sa chaoi is nár ríomhadh cosúlacht slonn géine ach amháin sa chineál cille céanna do scATAC-seq agus scRNA-seq araon. Nocht braisliú gan mhaoirseacht le t-SNE 13 bhraisle fo-chealla, a bhí anótáilte ag marcóirí aitheanta nó tuartha i dTábla forlíontach ar líne 1.

Trajectory lineage pseudotime

Tátalaíodh conair líneachta cille na gcealla ailse trí phacáiste Monocle2 (V.2.18.0) R a úsáid.26 Foghlaimíonn monaicítí an máistirghraf sainráite ó shonraí géanóm aonchealla trí Leabú Graf Aisiompaithe chun cealla a shórtáil, rud a réitíonn casta. próisis bhitheolaíocha go láidir agus go cruinn.27 D'úsáideamar an fheidhm ''differentialGeneTest'' chun DEG a dhíorthú ó gach braisle, agus tar éis trajectory na cille a thógáil, bhraitheamar na géinte a léiríodh go difreálach san am bréige. Rinneadh na géin bhréagacha ar fad a léirshamhlú ag feidhm na léarscáile teasa plota agus réad CellDataSet á ghlacadh. Gintear ceapacha conaire líneachta agus cuair slonn míne bunaithe ar CellDataSet ag _cill_trajectory agus plota_géinte_i_pseudotime, faoi seach.28

Glaonna ar athrú uimhir chóip aonchealla

Chun cealla urchóideacha a aithint a bhfuil éagsúlachtaí uimhreacha cóipe crómasómacha clónacha ar mhórscála acu (CNV), d’úsáideamar an pacáiste inferCNV R chun próifílí géiniteacha gach cille a thátal bunaithe ar mheánléiriú tacair géine móra i ngach réigiún crómasómach den ghéanóm meall i gcomparáid le gnáthchealla.29 Ar bhonn sampla-ar-sampla, úsáideadh na cealla imdhíonachta mar thagairt do CNVanna a mheas sna cealla a bhaineann le hailse.

Anailís ar shaibhriú

Rinneadh anailísí anótáil KEGG agus anótáil trí úsáid a bhaint as an bpacáiste R clusterProfiler (V.3.11.1) le paraiméadair PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10, agus MaxGSSize=500.20 Cuireadh anailís saibhrithe tacair géine (GSEA) i bhfeidhm ag baint úsáide as 50 tacar géine sainmharc (h.all.V.7.4.symbols. gmt) chun saibhriú suntasach a shainaithint conairí feidhmiúla trí bhogearraí GSEA (V.4.1.0), le critéir scagtha de luach P ainmniúil<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Anailís chainníochtúil PCR fíor-ama

Síolaíodh cealla MC38 agus HCT-116 i bplátaí sé thobar ar feadh 6 huaire agus ansin cóireáilte le CAG ar feadh 24 uair eile. Níodh na cealla trí huaire le PBS fuar, agus lártheifneoiríodh iad ag 180g ar feadh 5 nóiméad ag 4 chéim . Ag an am céanna, tar éis an fíochán meall a mheilt. Baineadh RNA iomlán as cealla MC38, HCT-116, agus fíochán siadaí ag baint úsáide as an imoibrí TRIzol, de réir threoracha an mhonaróra. Ba é 20µL toirt an imoibrithe ina raibh: 1µg RNA, 5µL 5×Hiscript III qRT SuperMix, agus RNase Free dH2 O. Cuireadh an cDNA faoi réir PCR cainníochtúil, le toirt imoibrithe de 10µL le 1µL cDNA, 5µL qPCR meascán, µL µ5M. (Ar Aghaidh agus Droim ar Ais), agus 3.25µL dH2 saor ó RNase O. Rinne GenScript Biotech Corporation (Nanjing, an tSín) na primers a shintéisiú de réir na sraitheanna seo a leanas (tábla forlíontach ar líne 2).

Fionnachtain sprice trí chur chuige próifílithe inrochtaineachta a fhreagraíonn do spriocanna

Rinneadh an scagadh ar phróitéiní ceangailteacha CAG mar a thuairiscítear roimhe seo.31 32 Go hachomair, úsáideadh an cur chuige próifílithe inrochtaineachta a fhreagraíonn do sprioc (TRAP) chun na próitéiní ceangailteacha do CAG i milieu na gcealla a fháil amach trí mhonatóireacht a dhéanamh ar lísín de bharr rannpháirtíocht ligand athruithe inrochtaineachta ar leibhéal proteome. Go hachomair, déileáladh le dhá mias cealla le 10µM CAG agus démheitiol-sulfocsaíd (DMSO), faoi seach. Tar éis 1-uair an chloig goir, tréscaoiltear cealla le maolán M-PER (Thermo Scientific) agus rinneadh na lísáití dá bharr a lipéadú go comhfhiúsach trí fhormaildéad agus coimpléasc piridín bóréin a lipéadaíonn go sonrach iarmhair lísín próitéineach ag teocht an tseomra le haghaidh próifíliú inrochtaineachta. . Ansin, deascadh na lysates le tuaslagóir orgánach, agus rinneadh na millíní a bailíodh a aththuaslagadh i úiré 8mol/L, arna laghdú ag dithiothreitol (DTT) ag 56 céim ar feadh 30 nóiméad, agus ina dhiaidh sin alcaileacht ag baint úsáide as iodoacetamide (IAA) sa dorchadas ar feadh 30 nóiméad. Cuireadh méid cuí de thuaslagán DTT leis arís chun freagairt le farasbarr IAA. Ina dhiaidh sin, caolaíodh an proteome le tuaslagán décharbónáite amóiniam go dtí go sroicheann an tiúchan deiridh úiré 1mol/L. Díshalannaíodh na díleácha próitéine a bailíodh ar cholúin C18 HLB (Waters, Baile na nGallóglach, Massachusetts, SAM), agus triomaíodh agus athdhéanta na peiptídí saibhrithe i dtuaslagán uiscí aigéad formach (FA) 0.1 faoin gcéad. Fostaíodh córas AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Uiscí) chun anailís a dhéanamh ar na samplaí le haghaidh próifíliú cainníochtúil ar na hathruithe inrochtaineachta lísín mar fhreagra ar cheangal CAG le haghaidh fionnachtain sprice. Baineadh úsáid as fáil spleáchas sonraí sa mhodh dearfach chun sonraí a fháil. Rinneadh anailís sonraí ag baint úsáide as PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Ceanada). Go sonrach, roghnaíodh cys alkylation mar mhodhnú seasta, agus socraíodh ocsaídiú methionine agus dimethylation lysine, a baineadh amach trí lipéadú TRAP, mar mhodhnuithe athraitheacha. Go hachomair, sannadh peiptídí ina bhfuil démheitiolachán TRAP-spreagtha agus a léirigh athruithe suntasacha le gor CAG mar pheiptídí a fhreagraíonn do sprioc. Léiríonn an cóimheas idir raidhse gach peptide lipéadaithe TRAP méid an athraithe inrochtaineachta agus baineann sé go dlúth le cleamhnas ceangailteach ligand. Rinneadh t-tástáil an dalta chun a fháil amach an bhfuil suntasacht staitistiúil ag baint leis na hathruithe inrochtaineachta braite ar pheptídí lipéadaithe. Luach p idirghrúpa (lch<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Cultúr orgánach

Is é Chongqing Kingbiotech a rinne na horgánaigh ailse chalaireicteach daonna a thógáil agus a shaothrú.33 Mionghearradh samplaí fíocháin othar a fuarthas ag an oibríocht mháinliachta i bpíosaí chomh beag agus ab fhéidir le siosúr steiriúla. Meascadh na píosaí fíocháin go maith le Matrigel (Corning, Cat # 356231) ag an gcóimheas thart ar 1:4 ar oighear. Thagair an phróiseáil ina dhiaidh sin do phrótacail fhoilsithe. Go hachomair, síolaíodh na píosaí-fionraí Matrigel go tapa sa phláta multiwell chun braoiníní leathsféarúla a fhoirmiú agus aistríodh iad go dtí 37 céim ar feadh 15-20min, rud a ligeann do na braoiníní a bheith soladach. Cuireadh an méid cuí meán cultúir (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​le gach tobar, agus d'athraigh an meán gach 2-4 lá.

Leithlisiú agus cultúr cealla daonna CD8 T

Cuir an méid céanna de ghnáth-salanda le fuil imeallach daoine sláintiúla ina bhfuil antasubstaintí chun an fhuil iomlán a chaolú. Cuir méid áirithe de thuaslagán deighilte le feadán lártheifneoir 15mL, cuir an fhuil iomlán caolaithe go mall ar feadh bhalla an fheadáin go barr an réitigh scaradh, agus lártheifneoir ag 750g ar feadh 20 nóiméad. Tar éis an lártheifneora, bain úsáid as pípéad chun na monocytes sa chiseal lár bán a shú go cúramach isteach i bhfeadán lártheifneoir 15mL, cuir méid áirithe PBS leis chun athfhriotú, lártheifneoir 250g ar feadh 5 nóiméad, agus caith amach an súthaire. Tar éis coirníní maighnéadacha CD8 daonna a chur leis na deascáin chill, rinneadh cealla CD8 T a shórtáil de réir colún sórtála LS. Cuireadh cealla CD8 T leis an pláta bréifneach réamh-brataithe le antasubstaint 5µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578), agus ansin 10ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) agus 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) curtha leis antasubstaintí feidhmiúla saothraithe ar feadh 24 uair.

Coculture

Tar éis na horgánaigh a ghoradh le CAG ar feadh 24 uair an chloig, cuireadh an meán cultúir úr in ionad, agus ansin cuireadh na horgánaigh agus na cealla CD8 T gníomhachtaithe ar fionraí sa fhoirmiú maitrís, ansin cuireadh an fionraí leis an pláta sé-tobar agus cuireadh é sa 37 gorlann céime ar feadh 15 nóiméad, agus ansin cuireadh meán cultúir iomlán saor ó serum 2ml leis ar feadh 24 uair an chloig.

blot an iarthair

Síolaíodh cealla MC38 agus HCT-116 i bplátaí sé thobar ar feadh 6 huaire agus ansin cóireáilte le CAG ar feadh 24 uair eile. Rinneadh na cealla a ní trí huaire le PBS fuar, agus lártheifneoirithe ag 180g ar feadh 5 nóiméad ag 4 céim . Rinneadh an próitéin iomlán a lysed le lysis WB-IP ina raibh 1 faoin gcéad inhibitor protease ar feadh 30 nóiméad ar oighear. Rinneadh measúnú ar phróitéin iomlán ag baint úsáide as trealamh cainníochtaithe próitéin BCA. Scaradh samplaí próitéine le leictreafóiréis glóthach polyacrylamide SDS 10 faoin gcéad -12 faoin gcéad agus aistríodh iad chuig seicní PVDF (fluairíd pholaivinilideéin) ag 350 mA ar feadh 90 nóiméad. Cuireadh bac ar na seicní PVDF le 5 faoin gcéad BSA ar feadh 1 uair an chloig, na stiallacha leis an antashubstaint phríomhúil in iúl thar oíche, agus leis an antasubstaint tánaisteach gortha ar feadh 90 nóiméad ag teocht an tseomra. Ar deireadh, aimsíodh na stiallacha ag baint úsáide as córas tsubstráit chemiluminescent LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, SAM).

Cíteiméadracht sreafa

Tar éis díleá fíocháin meall agus ullmhaíodh an fionraí aonchealla. Rinneadh staining dromchla le hantasubstaintí antaiginí dromchla sa mhaolán FCM (Flow Cytometry) (PBS ina bhfuil 1 faoin gcéad FBS) agus dhaite ar oighear le hantasubstaintí cuí ar feadh 30 nóiméad. Baineadh úsáid as ruaimeanna imoibríocha (eBitheolaíocht) chun cealla marbha a dhíchur. Rinneadh staining cítocine intracellular le tuaslagán fosaithe cille BD / tuaslagán membrane eischeallach, agus socraíodh agus tréscaoilteadh na cealla, agus ansin dhaite iad le antasubstaintí i gcoinne cítocíní i maolán Perm/Wash (BD Bitheolaíochtaí).

plasmid mutant CTSB aistrithe

Síolaíodh cealla HCT-116 i 6-phlátaí toibreacha ar feadh 12 uair agus ansin aistríodh iad le plasmidí tsóiteáin CTSB-WT-EGFP nó CTSB (Y75A, A77V, agus G198A) ar feadh 36 uair an chloig.

Traschur nó ró-léiriú plasmaid CTSB isteach i gcealla MC38 nó cealla HCT-116

Rinneadh cealla MC38 (1 × 106 / tobar) a ionaclú i 6-phlátaí tobair ar feadh 6 huaire, ansin aistríodh iad le RNA trasnaíochta CTSB (seicheamh: Ar Aghaidh-GGACAUAGAUCUACCUGAATT agus Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) ar feadh 48 uair, agus na leibhéil mRNA nó slonn próitéine aimsíodh Ctsb agus H2-k1. Rinneadh cealla HCT-116 (1×106 /tobar) a ionaclú i 6-phlátaí tobair ar feadh 6 huaire, ansin aistríodh iad le trasnaíocht CTSB (seicheamh: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) nó ró-léiriú plasmaid ar feadh 48 uair, agus an mRNA nó braitheadh ​​leibhéil léirithe próitéine CTSB agus HLA-A.

Teicneolaíocht duga

Íoslódáladh struchtúr 3D CTSB ón mBunachar Sonraí Próitéin (PDB ID: 2iPP), agus rinneadh struchtúir CAG a íoslódáil ó PubChem. Rinneadh an próiseas dugála in Autodock 2 le garbhdhuga ag baint úsáide as algartam análaithe insamhladh agus mionleasú ina dhiaidh sin ag baint úsáide as algartam géiniteach.

Measúnacht ar aistriú teirmeach cheallacha

Síolaíodh na cealla MC38 i bplátaí 10cm thar oíche agus ansin déileáladh leo le CAG nó 0.1 faoin gcéad DMSO ar feadh 2 uair eile. Bailíodh na cealla, nite le PBS fuar, agus lártheifneoiriú ag 180g ar feadh 5 nóiméad. Roinneadh na cealla ansin go cothrom i feadáin lártheifneoirithe (70µL gach feadán) agus téite ar feadh 3min ag an teocht seo a leanas: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, agus 67 céim, fuaraíodh na samplaí ar feadh 3min ag teocht agus coinnithe ansin ar oighear. Ansin, cuireadh na samplaí i gcuisneoir ag −80 céim thar oíche. Leáigh na samplaí ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad agus ansin cuisníodh iad ag −80 céim ar feadh 4 huaire. Ar deireadh, lártheifneoiríodh na samplaí ag 12, 000g ar feadh 25 nóiméad, cuireadh an comhshnaidhm leis an maolán lódála, agus rinne blotting an Iarthair anailís air.

Staining inmunohistochemical

Bhí tumtha rannóga pairifín den fhíochán meall i xiléin ar feadh 20 nóiméad go dewax, agus ansin i 100 faoin gcéad , 75 faoin gcéad , agus 50 faoin gcéad eatánól ar feadh 10min. Tar éis na slisní a dheisiú antaigin le tuaslagán deisiúcháin antigen chiotráite sóidiam, díghníomhaíodh an sárocsaíd hidrigine ingenous le sárocsaíd hidrigine 3 faoin gcéad. Tar éis blocáil le serum gabhar 5 faoin gcéad ar feadh 1 uair an chloig, cuireadh an antashubstaint frith-Ki67 (1:200) leis agus gor thar oíche ag 4 céim . Cuireadh an polaiméir lipéadaithe HRP frith-luiche/coinín (100 µL) leis agus goradh samplaí ag 37 céim ar feadh 30 nóiméad, agus 100 µL de thuaslagán oibre DAB ina dhiaidh sin, agus gor ag teocht an tseomra ar feadh 5 nóiméad. Tar éis 1 nóiméad de staining le hematoxylin, nite samplaí i 50 faoin gcéad, 75 faoin gcéad, agus 100 faoin gcéad eatánól agus xiléin ar feadh 5 nóiméad, agus baineadh úsáid as guma neodrach chun an scannán a shéalú. Breathnaíodh an scannán agus tógadh é faoi mhicreascóp.

Staidrimhanailís

Rinneadh anailís staitistiúil ag baint úsáide as bogearraí GraphPad Prism (V.8.0). Cuirtear na torthaí go léir in iúl mar mheán±SEM de thrí thurgnamh neamhspleácha. Baineadh úsáid as anailís aontreo ar an éagsúlacht agus tástáil post hoc Dunnett ina dhiaidh sin chun na difríochtaí a mheas nuair a bhí níos mó ná dhá ghrúpa ann. Baineadh úsáid as teist an Dalta chun an difríocht shuntasach idir an dá ghrúpa a mheas. Socraíodh tábhacht staitistiúil ag lch<0.05.

TORTHAÍ

Anailís il-omics aonchealla ar CAG a chuireann bac ar fhás ailse drólainne trasphlandaithe i lucha

Chun imscrúdú a dhéanamh an bhfuil éifeacht antitumor ag CAG, rinneamar cealla ailse MC38 a thrasphlandáil isteach i lucha C57BL/6 ar dtús. Thugamar faoi deara gur chuir CAG bac suntasach ar fhás siadaí (figiúr forlíontach ar líne S1A, B). Ina dhiaidh sin, rinneamar cealla CT26 a thrasphlandú isteach i lucha BALB / c agus fuarthas amach go raibh cosc ​​​​ar fhás siadaí ag CAG freisin (figiúr forlíontach ar líne S1C, D).

Chun an mheicníocht shonrach a nochtadh tuilleadh trína gcuireann CAG bac ar fhás siadaí, rinneamar anailís air ag baint úsáide as na teicnící scRNA-seq agus scATAC-seq (figiúr 1A). Roinneamar an daonra cille i gceithre ghrúpa: cealla ailse, fibroblasts, cealla myeloid, agus limficítí (figiúr 1B, figiúr forlíontach ar líne S2A, B). Fuaireamar amach go raibh cealla ailse (52 faoin gcéad) agus fibroblasts (41 faoin gcéad) insíothlaithe go príomha i bhfíocháin siadaí, cé go raibh cealla imdhíonachta freagrach as ach 7 faoin gcéad. Ansin roinneamar cealla ailse in ocht bhfothacar agus fibroblasts i dtrí fho-thacar (figiúr 1C–E). Ina dhiaidh sin, léirigh an anailís saibhrithe ar ghéinte ard-léirithe i ngach daonra cille gur saibhríodh cosáin mhóilíneacha MHC-I i gcealla ailse, mar a bhí comharthaí antitumor cealla T agus cealla NK (figiúr forlíontach ar líne S2C). Ansin, fuarthas ceithre ghrúpa cealla freisin ag baint úsáide as anailís comhtháthú scATAC-seq agus scRNA-seq (figiúr 2D-G). Tar éis na comparáide, fuair muid amach go raibh cealla ailse (cealla C01, C03), cealla CD8 móide T, cealla Spp1 móide TAM, agus fibroblasts (cealla F01 agus F02) le feiceáil i seicheamhú ATAC (figiúr 1F, G), agus a thuilleadh, in iúl go mór. saibhríodh fachtóirí trascríobh sna cealla seo (figiúr 1H). Trí na hanailísí seo, déanaimid tuairimíocht go bhfuil dlúthbhaint ag an gcosc ar fhás siadaí ag CAG le hathruithe sna cealla seo.

Cuireann Cag cur i láthair antigen cealla meall chun cinn

Chun anailís a dhéanamh ar mheicníocht antitumor CAG, rinneamar anailís ar dhaonra na gcealla meall ar dtús agus roinneamar na cealla ailse in ocht bhfoghrúpa (figiúr 2A, B, figiúr forlíontach ar líne S3A). Léirigh na torthaí, i gcomparáid leis an ngrúpa PBS, gur tháinig laghdú suntasach ar chealla grúpa C05 agus gur tháinig méadú ar chealla grúpa C07 (figiúr 2C). Idir an dá linn, chun cruinneas ár mbraisliú cille meall a fhíorú, rinneamar comparáid idir an CNV de limficítí agus cealla myeloid mar chealla tagartha. Léirigh na torthaí go raibh an CNV de chealla ailse i bhfad níos airde ná sin de chealla imdhíonachta (figiúr forlíontach ar líne S3B). Agus anailís á déanamh ar fho-thacair na gcealla ailse, fuaireamar amach go raibh na géinte freagartha interferon Isg15, Irf7, Ifit3, agus Ifi47 in iúl go mór i ndaonraí cealla C07 agus C08 an ghrúpa CAG i gcomparáid leis an ngrúpa PBS (figiúr forlíontach ar líne S3C). Fuarthas amach san anailís ar dhaonra na gcealla meall go raibh saibhriú suntasach ar bhealaí a bhaineann le cur i láthair antaiginí i ndaonraí cealla iolracha. Mar sin, déanaimid tuairimíocht go bhféadfadh CAG cur i láthair antigen cealla ailse a chur chun cinn chun ról antitumor a imirt (figiúr 2D). Ansin, roghnaigh muid na géinte a bhaineann le cur i láthair antigen agus fuarthas amach go raibh an leibhéal slonn sa ghrúpa CAG i bhfad níos airde ná sin sa ghrúpa PBS (figiúr 2E, figiúr forlíontach ar líne S3D). Fuaireamar amach freisin gur chuir CAG cur i láthair antigen chun cinn i bhfíocháin meall (figiúr 2F, G).

Ansin, d'úsáideamar scATAC-seq chun anailís a dhéanamh ar na cúiseanna sonracha taobh thiar de chur i láthair antaiginí cille meall a chuir CAG chun cinn. Fuaireamar amach gur léirigh daonra na gceall meall go mór na fachtóirí trascríobh Fos, Junb, Jund, Fosb, agus Fosl1 (figiúr 2H, I). Ina dhiaidh sin, thógamar léarscáil den idirghníomhaíocht idir fachtóirí trascríobh agus géinte comhfhreagracha chun a mhíniú gur chuir CAG chun cinn léiriú géinte a bhaineann le léiriú antaiginí cille meall (figiúr 2J). I bhfíocháin siadaí, fuaireamar amach freisin go raibh fachtóirí trascríobh Junb, Fos, Jund, agus Fosb ró-bhrú go suntasach sa ghrúpa PBS faoi chóireáil CAG (figiúr 2K–N, figiúr forlíontach ar líne S3E-I). Go dtí seo, tá sé faighte amach againn gur féidir le CAG léiriú fachtóirí trascríobh géinte a bhaineann le cur i láthair antaigin a chur chun cinn, agus ar an gcaoi sin feabhas a chur ar fheidhm thíolacadh antaiginí cealla ailse. Mar sin féin, níl sé soiléir cén chaoi a bhfreagraíonn na cealla ailse seo do fhreagraí cille imdhíonachta.

Chun an feiniméan trína gcuireann CAG cur i láthair antaiginí cealla ailse chun cinn a nochtadh, rinneamar anailís ruthach chun imscrúdú a dhéanamh ar an gcaoi a n-athraíonn cealla ailse a chéile mar fhreagra ar fhreagraí cealla imdhíonachta. Fuaireamar amach, le himeacht ama, gur chlaochlú cealla ailse C07 go cealla C05, C06, agus C08, agus léirigh saibhriú géine freisin go n-athródh cealla ailse go cur i láthair antaiginí (figiúr 3A-E).

Feabhsaíonn CAG feidhm marú na gceall imdhíonachta

Léiríonn na torthaí seo gur féidir le CAG antaiginí cille meall a chur i láthair, mar sin an gcuirfidh feabhas ar chur i láthair antaigin cille meall le feabhas a chur ar fheidhm imdhíonachta cille? Chun é seo a dhéanamh amach, rinneamar anailís ar limficítí agus cealla myeloid, faoi seach. Léirigh na torthaí gur chuir CAG chun cinn insíothlú cealla CD8 móide T i bhfíocháin meall, agus méadaíodh insíothlú cealla CD8 móide T agus cealla NK freisin, arna bhrath ag cítoiméadracht sreabhadh (figiúr forlíontach ar líne S4A-F). Thugamar faoi deara freisin gur chuir CAG feabhas ar léiriú géinte Ifitm2, Cxcr6, agus S100a6 i gcealla CD8 móide T,

Géinte Fcer1g, Gzmb, AW112010, agus Zfp36i2 i gcealla NK, agus géinte Nfkbia agus Junb i gcealla CD4 móide T (figiúr forlíontach ar líne S4G). Feabhsaíodh go suntasach freisin léiriú Ifng agus Gzmb i gcealla CD8 móide T, mar a aimsíodh cítoiméadracht sreafa (figiúr forlíontach ar líne S4H, I). Ina theannta sin, fuair muid amach, tar éis cóireála CAG, gur tháinig laghdú ar léiriú na ngabhdóirí coisctheacha Lag3, Tigit, agus Havcr2 ar dhromchla cealla CD8 móide T, agus léiriú na géinte Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5, agus Pdcd1, arb iad is sainairíonna iad gníomhachtú cealla CD8 móide T, méadú suntasach (figiúr forlíontach ar líne S4J). Chun a dheimhniú tuilleadh gur fheabhsaigh CAG feidhm maraithe cealla CD8 móide T trí chur i láthair feabhsaithe antaigin siadaí a chur chun cinn, rinneamar cealla CT26 a thrasphlandáil isteach i siadaí trasphlandáilte i lucha nude agus thugamar faoi deara nach bhféadfadh CAG bac a chur go héifeachtach ar fhás siadaí (figiúr forlíontach ar líne S4K-M ).

Ina dhiaidh sin, rinneamar anailís ar chealla myeloid agus fuair muid amach gur mhéadaigh cealla Spp1 móide TAM tar éis cóireála CAG, agus tháinig laghdú ar líon na gcealla C1qc móide TAM agus tháinig méadú ar líon na n-Il1b móide monocytes (figiúr forlíontach ar líne S5A-D). Tar éis cóireáil CAG, bhí cealla Spp1 móide TAM agus C1qc móide TAM níos mó i mbaol claochlú pro-athlastach TAM. Fuarthas amach san anailís saibhrithe gur dhírigh sé go príomha ar Tnf- , Ifn-g, agus ar an gcosán comharthaíochta freagartha athlastacha (figiúr forlíontach ar líne S5E-H). Bunaithe ar na torthaí thuasluaite, tátal againn go bhfeabhsaíonn CAG feidhm aitheantais agus maraithe na gcealla imdhíonachta trí chur i láthair antaiginí a chur chun cinn i gcealla ailse. Mar sin féin, níl sé soiléir conas a rialaítear CAG.

An spriocphróitéin CAG CTSB a aimsiú trí ghaiste

Ansin, déanfaimid imscrúdú ar an spriocphróitéin CAG sonrach a bhfuil ról antitumor aige. Roghnaíomar cealla ailse mar ábhar taighde toisc go bhfuaireamar amach gur féidir le CAG cur i láthair antaiginí cealla ailse a fheabhsú, agus ar an gcaoi sin feabhas a chur ar fheidhm maraithe na gceall imdhíonachta. Rinneamar an díorthach biotin de CAG a shintéisiú ar dtús agus fuaireamar amach nach bhféadfadh ach 3-OH freagairt (figiúr forlíontach ar líne S6A). Rinneamar imscrúdú ansin an gcuireann CAG-biotin chun cinn freisin léiriú géinte a bhaineann le cur i láthair antigen i líne cille meall luch MC38. Léiríonn na torthaí nach raibh tionchar ag CAG-biotin ar shloinneadh géinte H{2-K1, Cd74, agus Anxa1 (figiúr forlíontach ar líne S6B-D).

Mar sin, d'úsáideamar an sprioc-mhodh cuardaigh TRAP roimhe seo sa tsaotharlann.32 Goradh CAG agus DMSO le líne chill MC38 (figiúr 4A). Roghnaigh muid an próitéin a bhfuil FC Níos mó ná nó cothrom le 2 agus ap Níos lú ná nó cothrom le 0.05 mar an spriocphróitéin iarrthóra CAG. Tar éis an phrionsabail go mbeidh éifeachtúlacht íseal lipéadaithe lísín mar thoradh ar cheangal móilíní beaga le próitéiní, roghnaigh muid an CTSB don staidéar (figiúr 4B). Ina dhiaidh sin, d’úsáideamar measúnacht aistrithe teirmeach cheallacha (figiúr 4C) agus teirmeafóiréis microscála (MST) (figiúr 4D) chun an ceangal idir CAG agus CTSB a fhíorú, agus fuaireamar amach gurbh é an cleamhnas idir CAG agus CTSB ná 26.6nM (figiúr 4D). Ina dhiaidh sin, thuar muid na suíomhanna ceangailteach idir CAG agus CTSB de réir struchtúr criostail próitéin CTSB sa leabharlann PDB. Fuaireamar amach go raibh na grúpaí hiodrocsaile ag an dá cheann de CAG agus láithreáin ALA77 agus GLY198 CTSB faoi cheangal ag banna hidrigine, agus na suíomhanna TYR75, PRO76, agus ALA173 de CAG agus CTSB faoi cheangal ag fórsa van der Waals (figiúr 4E) . Chun an suíomh ceangailteach idir CAG agus CTSB a fhíorú, d’aistrigheamar an plasmid mutant de CTSB i gcealla HCT-116. Léiríonn na torthaí go raibh an cleamhnas idir an plasmid mutant ag A77V agus G198A agus CAG na céadta uair níos airde ná sin an plasmid WT (figiúr 4F, G). Sa chéad chuid eile, déanaimid iniúchadh ar an meicníocht shonrach trína n-imríonn CAG ról antitumor trí CTSB.

【Le haghaidh tuilleadh eolais:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】