Comhthionól Tras-scríofa De Novo Bunaithe ar RNA-Seq agus Fionnachtain Géine As Cistanche Deserticola Gas Fleshy-Ⅰ

Cúlra

Is planda seadánacha go hiomlán neamh-fhótasintéiseach é Cistanche deserticola le luach míochaine mór agus déantar é a dháileadh go príomha i bhfásach Iarthuaisceart na Síne. Is tonic ríthábhachtach é a gas méithe triomaithe ileigheas Sínis traidisiúntale rólanna a bhaineann le feabhas a chur ar fheidhm ghnéasach fireann go príomha agus díolúine a neartú, ach is beag staidéar meicníoch a rinneadh go páirteach mar gheall ar an easpa acmhainní géanómaíochta agus tras-traipeolaíoch.

NÁDÚRTHA CISTANCHE TUBULOSA LEIGHIS TRAIDISIÚNTA SÍNEACHA PHGS75% ECH 30% ACHT 12%

Torthaí

Sa staidéar seo, rinneamar seicheamhú domhain tras-scríbhinne i ngas méithe C. deserticola, agus gineadh thart ar 80 milliún léamh ag baint úsáide as seicheamhú péire-deireadh Illumina ar an ardán HiSeq2000. Ag baint úsáide as cóimeálaí na Tríonóide, fuaireamar 95,787 seicheamh tras-scríbhinní le faid tras-scríbhinní ag dul ó 200bp go 15,698bp, le meánfhad 950 bonn agus fad N50 de 1,519 bonn. Aithníodh 63,957 tras-scríbhinn mar a léiríodh go gníomhach le FPKM Níos mó ná nó cothrom le 0.5, inar cuireadh anótáil ar 30,098 tras-scríbhinn le tuairiscí géine nó téarmaí ontology géine trí anailísí cosúlachta seichimh i gcoinne roinnt bunachair shonraí poiblí (Uniprot, NR, agus Nt ag NCBI, agus KEGG) . Ina theannta sin, d'aithníomar príomhghéinte einsíme a bhfuil baint acu le bithshintéis lignin agus gliocóisídí feinileatánóideach (PhGanna) arb eol gurb iad na príomh-chomhábhair ghníomhacha iad. Aithníodh ceithre ghéinte amóinia-lyase feiniolalainín (PAL), an chéad eochair-einsím i biosintéis lignin agus PhG bunaithe ar chomparáid seicheamh agus anailís phylogenetic. Moladh dhá bhealach bithshintéise de PhGanna den chéad uair freisin.

Conclúidí

Ar an iomlán, chríochnaíomar anailís dhomhanda ar an tras-scríbhinn gas méithe C. deserticola ag baint úsáide as teicneolaíocht RNA-seq. Sainaithníodh bailiúchán de ghéinte einsíme a bhaineann le biosintéis lignin agus gliocóisídí feinileatánóideach ó na trasscríbhinní cóimeáilte agus anótáilte, agus rinneadh réamh-mheastachán ar theaghlach géine PAL freisin. Soláthróidh na sonraí seicheamh ón staidéar seo acmhainn luachmhar chun taighde bithshintéise gliocóisídí feinileatánónóide agus staidéir ghéanómacha feidhmiúla a dhéanamh sa phlanda íocshláinte tábhachtach seo.

Réamhrá

Géineas domhanda de phlandaí fásaigh ilbhliantúla ón teaghlach Orobanchaceae is ea C. deserticola agus is speiceas go hiomlán neamhfhótasintéiseach é agus de ghnáth fásann planda holoparasitice faoi thalamh. Tá sé parasitized ar fhréamhacha psammophyte Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae), a chónaíonn go príomha i bhfásach agus leath-fásaigh mar gheall ar a lamháltas ard le triomach agus salandacht. Léiríonn C. deserticola friotaíocht láidir ar dhálaí timpeallachta crua agus déantar é a dháileadh go príomha in Iarthuaisceart na Síne, go háirithe i Lár Mhongóil, Gansu, agus Xinjiang. Meastar gur speiceas fiáin atá i mbaol é le blianta beaga anuas mar gheall ar thomhaltas méadaithe ag daoine. Tugtar broomrape an fhásaigh ar C. deserticola ar a dtugtar go minic ginseng fásach agus tá an gas méithe triomaithe in úsáid go forleathan mar tonic atá tábhachtach go traidisiúnta sa tSín agus sa tSeapáin le blianta fada anuas. Taifeadadh ar dtús é i Shen Nong Ben Cao Jing (Foclóir na Síne Materia Medica, 1977) timpeall 1800 bliain ó shin agus breathnaíodh air mar cheann de phríomhfhoinsí anLuibh leighis na Síne Cistanche.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tá raon leathan feidhmeanna míochaine ag na sleachta C. deserticola, go háirithe lena n-úsáid chun feidhm ghnéasach a fheabhsú, tonifying duáin, an t-ae a chosaint, gníomhaíocht aerbhealaigh, feabhas a chur ar chuimhne, inmunomodulatory, gníomhaíocht antioxidative, frith-athlastach, gníomhaíocht antiviral, etc. is iad na príomhchodanna bithghníomhacha de C. deserticola ná gliocóisídí feanileatánóideach (PheGs, PhGs). Go dtí seo, tá níos mó ná 20 gliocóisídí feinileatánóideach scoite amach ó ghas succulentach C.deserticola. Ina measc,acteoside agus echinacosideis dhá phríomhchuid iad a bhfuil gníomhaíochtaí suntasacha cógaseolaíochta acu agus déantar iad a dhoiciméadú mar chaighdeáin cháilíochta C. deserticola i Pharmacopoeia na Síne (eagráin 2005 agus 2010). Is iad na trí chomhpháirt cheimiceacha de PhGanna ná aigéad orgánach, saccharide, agus feinileatánóideach, áfach, ní thuigtear go maith na sonraí a bhaineann le cosáin bithsintéiseach feinileatánóideach i C.deserticola.

In ainneoin tábhacht tráchtála agus íocshláinte C.deserticola, tá sonraí genomic agus tras-sgrìobhaidh an speicis seo an-teoranta. Níl aon ESTanna ar fáil i mbunachar sonraí an NCBI agus níl an t-eolas iomlán ar ghéanóim don speiceas seo ar fáil go fóill ach amháin i gcás an t-ord géanóim clóraplasta. Cuireann na sonraí trascríobh teoranta bac ar staidéar a dhéanamh ar mheicníochtaí bithsintéiseach PhG. Is féidir le teicneolaíocht RNA-seq seichimh de na codanna sainráite den genome spriocdhírithe a ghiniúint agus géinte a aithint [18] ag baint úsáide as ardáin teicneolaíochta NGS (cosúil le Bithchórais Fheidhmeach SOLiD, Illumina HiSeq, agus Roche 454). Tá sé ag éirí níos coitianta i dtionól transcriptome de novo, ós rud é gur cur chuige éifeachtach ó thaobh costais é a bhfuil ardtaifeach agus raon leathan dinimiciúil aige, go háirithe ós rud é go bhfuil buntáiste aige athscríbhinní íseal-raidhse a iniúchadh. Mar gheall ar na buntáistí éagsúla, tá RNA-seq tarraingteach go sonrach d’orgánaigh neamhmhúnla a bhfuil acmhainní géiniteacha teoranta acu. Mar sin féin, níl aon mhiontaighde ar C. deserticola transcriptome de réir RNA-seq.

Sa staidéar seo, rinneamar seicheamh domhanda ar an tras-scríbhinn gais do C. deserticola ag baint úsáide as an ardán Illumina Hiseq2000 agus fuaireamar sonraí amh 7.9G. Trí chóimeáil agus anótáil, rinneamar na géinte a bhaineann le bithshintéis PhG a aimsiú agus na géinte atá freagrach as bithsintéis iomlán lignin. Ghin ár n-anailís RNA-seq an chéad tras-scríbhinn comhdhearcadh C. deserticola agus thug sé léargais nua ar thuiscint chuimsitheach ar luach míochaine C. deserticola. Ina theannta sin, is féidir an modh a ndéantar cur síos air anseo a chur i bhfeidhm go forleathan ar thras-scríbhinní próifíle chun éascú a dhéanamh ar fhionnachtain géinte a bhfuil baint acu le conairí bithsintéise comhpháirte míochaine ar leith i ngléasra míochaine eile a bhfuil acmhainní géanómaíochta an-teoranta aige.

Ábhair agus Modhanna

Bailiúchán ábhar plandaí

Bailíodh an gas úr succulent do C. deserticola ag céim na tochailte ó bhunáit phlandaí i BayanHot City of Alxa League i Lár Mhongóil in iarthuaisceart na Síne. Fuarthas an cead bailithe ó úinéir (Grúpa HongKui CongRong) an bonn plandaí. Cuireadh an t-eiseamal dearbhán i dtaisce sa Chroíshaoráid Ghéanómaíochta ag Institiúid Géanómaíochta Beijing, Acadamh Eolaíochtaí na Síne. Tar éis a ghlanadh, gearradh na fíocháin gas súiteacha i bpíosaí beaga agus reoitear iad láithreach i nítrigine leachtach, agus ansin iad a stóráil ag céim -80 go dtí go ndéanfar próiseáil bhreise orthu.

eastóscadh RNA, tógáil leabharlainne cDNA, agus seicheamhú Illumina

Baineadh RNA iomlán as an gas succulent ag baint úsáide as TRIzol Imoibrí (Invitrogen Inc., California, SAM) de réir threoracha an mhonaróra. Cóireáladh na samplaí mar thoradh air sin le DNase I chun aon DNA géanómach a bhaint. Rinneadh RNAanna eastósctha a chainníochtú trí úsáid a bhaint as bithanailíseoir Agilent 21{{00 (Agilent Technologies) agus seiceáladh iad le haghaidh sláine trí úsáid a bhaint as leictreafóiréis glóthach agairóis dínádúraithe le staining bróimíde eitidiam. Baineadh úsáid as samplaí RNA le cóimheasa A260/A280 idir 1.9 agus 2.1, cóimheasa RNA 28S:18S níos airde ná 1.0, agus uimhreacha sláine RNA (RINs) -8.5 in anailísí ina dhiaidh sin.

Gineadh na leabharlanna RNA-seq ag baint úsáide as Trealamh Ullmhúcháin Samplach RNA Illumina Truseq. Rinneadh Poly(A)+ RNA a leithlisiú ó RNA iomlán ag baint úsáide as coirníní Dynal ligo(dT)25 de réir threoracha an déantóra. Tar éis íonú, cuireadh maolán ilroinnte leis chun an mRNA a bhriseadh ina blúirí gearra. Rinneadh cDNA den chéad snáithe a shintéisiú agus na blúirí gearra seo á n-úsáid mar theimpléid, in éineacht le SuperScript III reverse transcriptase agus primer heicseamair randamach N6. Ansin rinneadh cDNA dara snáithe a shintéisiú ag baint úsáide as maolán, dNTPs, RNaseH, agus DNA polymerase I. Rinneadh an cDNA dhá-shnáithe mar thoradh air a dheisiú deiridh ag baint úsáide as T4 DNA polymerase, DNA polymerase I fragment Klenow, agus T4 polynucleotide kinase, agus ligated go cuibheoirí ag baint úsáide as ligáis DNA T4. Glanadh blúirí oiriúntóra-ligated ag baint úsáide as trealamh eastósctha QiaQuick PCR agus eluted le maolán EB. Tar éis anailís a dhéanamh ag baint úsáide as leictreafóiréis glóthach agarose, roghnaíodh blúirí oiriúnacha mar theimpléid le haghaidh aimpliú PCR. Rinneadh seicheamhú na leabharlainne cDNA mar thoradh air le córas Illumina HiSeq 2000.

Athscríbhinní de thionól nua agus cainníochtú slonn géine

Glanadh léamha amh a gineadh ón seicheamhú trí na seichimh oiriúntóra a bhaint (ATCTCGTATGCCGTC) ag baint úsáide as modh intí. Ansin rinneamar dianphróiseas scagtha ar chaighdeán íseal. Ar an gcéad dul síos, dhéanfaí boinn le scór cáilíochta phred níos ísle ná 20 a bhearradh ó dheireadh 3' an tseichimh, go dtí go n-imreodh siad isteach i mbonn amháin le cáilíocht níos airde (Níos mó ná nó cothrom le 20). Dá mbeadh an fad léite níos giorra ná 50bp, chuirfí i leataobh é. Ar an dara dul síos, déanfar léamha a scagadh tuilleadh de réir an chritéir go bhfuil scóir ardcháilíochta ag 70% de na boinn in aon léamh amháin (Níos mó ná nó cothrom le 20). Ar an tríú dul síos, níor úsáideadh ach léamha péireáilte le haghaidh tuilleadh cruinnithe. Rinneadh cóimeáil tras-scríbhinne de novo ag baint úsáide as eisiúint Choláiste na Tríonóide_20130216 [30] a chuimsigh trí mhodúl bogearraí as a chéile: Inchworm, Chrysalis, agus Butterfly. Socraíodh na paraiméadair tionóil mar seo thíos:-seqType fq-JM 300G -min_contig_fad 200-CPU 20-inchworm_cpu {{21} }bflyCPU 20.

Chun flúirse na tras-scríbhinní a chainníochtú, rinneadh na léitheanna péireáilte seicheamhaithe a athailíniú leis na tras-scríbhinní a cuireadh le chéile trí úsáid a bhaint as script i gColáiste na Tríonóide. Úsáideadh léamha léarscáilithe le haghaidh cainníochtú ag bogearraí RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization). Léiríodh flúirse géine nó isoform ag an blúire in aghaidh an chileagraim de luach tras-scríofa in aghaidh gach milliún blúirí de luach mapáilte (FPKM), sainmhíníodh na tras-scríbhinní sin le luach FPKM cothrom le nó níos mó ná 0.05 mar a cuireadh in iúl.

Anótáil feidhme na n-athscríbhinní sainráite

Níl aon tacair anótála géine de C. deserticola ann ach amháin i gcás an ghéanóim chloroplasta [1]. Rinneamar anótáil ar na tras-scríbhinní sainráite trí iad a chur i gcomparáid le tacair sonraí nuashonraithe Genbank Nt, Genbank Nr, agus TAIR10_ pep_20101214_le chéile trí úsáid a bhaint as an gclár BLAST (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

Ontology Géine agus anótáil conaire KEGG De réir seichimh ailíniú cosúlachta le bunachar sonraí Uniprot (fuarthas anótáil Gene Ontology (GO) ar na tras-scríbhinní uile a cuireadh le chéile trí úsáid a bhaint as comhad comhlachais a íoslódáladh ó (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/) bunachair shonraí/GO/goa/UNIPROT/gene_comhlachas goa_uniprot.gz). Catagóirí CC, BP, agus MF ar leithligh.

Sannadh faisnéis chosáin KEGG do gach seicheamh próitéine tuartha ag baint úsáide as an uirlis ar líne KAAS (Freastalaí Anótála Uathoibríoch KEGG) [34]. Cuireadh seichimh i bhformáid fasta isteach chuig iarratas KAAS, agus íoslódáladh na comhaid a d’eascair as an bhfaisnéis ar fad faoi chosáin a bhain le C. deserticola stem transcriptome. Baineadh úsáid as 13 thacar sonraí géine orgánaigh phlanda i KEGG le haghaidh nótaí ag baint úsáide as an modh BBH (déthreoracha is fearr a bhuaileadh).

NÁDÚRTHA CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE Sliocht PHGS75% ECH 30% ACHT 12%

Anailís RT-qPCR

Tar éis díleá le DNase I, rinneadh thart ar 5ug den RNA iomlán a thiontú ina cDNA den chéad snáithe tríd an imoibriú tras-trascríobh droim ar ais le primers oligo(dT)15 agus Córas Trascríobh Droim ar ais GoScript (Promega). Ansin caolaíodh na táirgí cDNA 10-huaire le huisce dí-ianaithe saor ó núicléas sular úsáideadh iad mar theimpléad i PCR fíor-ama. Méadaíodh cDNAanna sonracha ag an gcóras GoTaq 2-Step RT-qPCR (Promega) in imleabhar 20 ul. Rinneadh aimpliú PCR ag an teocht annealing de 60 céim leis an gCóras Braite PCR 7500 Fíor-Ama (Bithchórais Fheidhmeach) de réir threoracha an mhonaróra. Ríomhadh flúirse tras-scríbhinní coibhneasta trí mhodh na tairsí timthrialla comparáideacha le géine "comp10579_c0" mar chaighdeán inmheánach, ag baint úsáide as bogearraí 7500 Manager.

Dearadh péirí primer do RT-PCR bunaithe ar bhogearraí ar líne (http://primer3.ut.ee/) agus tá siad liostaithe i Tacar Sonraí S1.

Torthaí

Seicheamhú RNA agus cóimeáil tras-scríbhinne de novo de ghas méithe C. deserticola

Baineadh úsáid fhorleathan as gas C. deserticola mar tonic atá tábhachtach go traidisiúnta sa tSín agus sa tSeapáin le blianta fada anuas. Chun forbhreathnú domhanda a fháil ar léiriú géine i ngas méithe C. deserticola, bhailigh muid samplaí de ghais C. deserticola den bhunús plandaí céanna in 2013 agus 2014, faoi seach. Baineadh RNAanna iomlána agus íonaíodh polyA+ RNAs chun leabharlanna RNA-seq péireáilte a thógáil. Fuarthas 79,433,734 agus 86,019,176 léamh deiridh péire a fhreagraíonn do bheagnach 8 billiún agus fuarthas 8.6 billiún bonn den seicheamh trí úsáid a bhaint as seicheamh Illumina HiSeq 2000

ardán i 2013-bliain agus 2014-shamplaí bliana (Tábla 1). Tar éis seichimh oiriúntóra a bhaint agus léamha ar chaighdeán íseal a scagadh (féach ar na sonraí sna Modhanna), baineadh úsáid as 64,831,040 léamh péire ardcháilíochta sa sampla 2013-bliana le haghaidh cóimeála de novo transcriptome. Ag baint úsáide as cóimeálaí seicheamh Choláiste na Tríonóide [30], gineadh 51,719 géinte agus 95,787 seicheamh tras-scríbhinní le fad tras-scríbhinní idir 200 bp agus 15,698 bp. Is é meánfhad na n-athscríbhinní cóimeáilte ná 950 bonn agus is é 1,519 bonn fad an N50. Léirigh líon na dtrascríbhinní i faid éagsúla go raibh 57.32% de na tras-scríbhinní le chéile thart ar 500 bp nó níos faide (Fíor 1A). Mapáladh léitheanna péire ardcháilíochta sa sampla 2014-bliana chuig an tras-scríbhinn a cuireadh le chéile. Ina theannta sin, fuaireamar amach go raibh éagsúlacht idir an uimhir tras-scríbhinní do gach géine cóimeáilte agus 69% de ghéinte le isoform amháin sainráite agus léirigh 31% de ghéinte dhá thras-scríbhinn nó níos mó (Fíor 1B).

Cainníochtú slonn agus anótáil feidhme na n-athscríbhinní cóimeáilte

Rinneadh raidhse géine nó tras-scríbhinní a chainníochtú trí úsáid a bhaint as an bpacáiste RSEM, ina ndearnadh na léitheanna seicheamhaithe a athailíniú leis na géinte comhchruinnithe nó na seichimh tras-scríbhinní ag baint úsáide as Bowtie, agus úsáideadh na léitheanna léarscáilithe sin le haghaidh cainníochtú. Ríomhadh luach FPKM do gach géine nó tras-scríbhinn, agus ar deireadh, shainaithníomar 63,957 agus 52,857 tras-scríbhinní arna gcur in iúl go gníomhach (luach FPKM Níos mó ná nó cothrom le 0.5) i samplaí gas méithe C. deserticola in 2{{17} }13 agus 2014, faoi seach. Léiríodh 44,776 tras-scríbhinn (70.01% sa sampla 2013-bliana, 84.71% sa sampla 2014-bliana) go coitianta sa dá mhacasamhlú, agus ba é an comhghaol (comhéifeacht comhghaolaithe Pearson: 0.91979) dá sonraí slonn a thaispeántar i bhFíor S1. Rinneadh na sonraí seicheamhaithe amh a uaslódáil chuig bunachar sonraí SRA an NCBI (uimhreacha aontachais: SRX857402 agus SRX858938). D'úsáideamar géinte sainráite a aithníodh sa sampla 2013-bliana le haghaidh tuilleadh anailíse. Fuarthas faisnéis anótála feidhme do gach tras-scríbhinn sainráite ag baint úsáide as dhá mhodh. Ar an gcéad dul síos, rinne an t-algartam BLAST na hathscríbhinní sainráite go léir a ailíniú le bunachair shonraí seicheamh núicléitíde (GenBank nt) agus seicheamh peiptíde (GenBank nr agus Arabidopsis) ar leithligh. As 63,957 tras-scríbhinní léirithe,

Rinneadh anótáil ar 29,220 (45.7%) agus léirigh siad homaleolaíocht do sheichimh in aon cheann de na trí bhunachar sonraí ábhar le scoite E-value 1e-20. Idir an dá linn, rinneadh na réigiúin chódaithe iarrthóra do gach seicheamh tras-scríofa sainráite a thuar ag baint úsáide as bogearraí TransDecoder, agus úsáideadh na ORFanna is faide do gach tras-scríbhinn do chuardach fearainn Pfam. Mar thoradh air sin, rinneadh anótáil ar 21,358 (33.4%) tras-scríbhinn bunaithe ar bhunachar sonraí Pfam. Ar an iomlán, rinneadh 30,098 (47.1%) tras-scríbhinn a mheaitseáil go suntasach le géinte aitheanta sna bunachair shonraí poiblí tríd an dá mhodh thuas a chomhcheangal. Taispeánadh liosta iomlán na dtras-scríbhinní sainráite agus anótáil feidhme i sonraí forlíontacha (Sonraí S2).

Rinneamar suirbhé ar an 20 tras-scríbhinn is airde sainráite (Tábla 2) a fhreagraíonn do 18.99% de na léamha seicheamhaithe go léir, agus fuaireamar amach gur géinte iad an chuid is mó díobh a fhreagraíonn d’aibitheach

spreagadh strus. Is é Dehydrin (DHNanna), aicme de phróitéiní hidreafaileacha agus teirmeastáblaí struis le líon ard aimínaigéid luchtaithe a bhaineann le teaghlach Grúpa II Embryogenesis Abundant Abundant (LEA) Grúpa II, an ghéin is airde in iúl. Braitheadh ​​trí thras-scríbhinn éagsúla Dehyrin (comp28713_c0_seq1/2/4) mar ard-léirithe i ngasanna méithe a d’fhéadfadh baint a bheith acu le cealla a chosaint ar dhamáiste de bharr strus triomach. Fuarthas go raibh géinte eile a bhaineann le strus cosúil le próitéin turraing teasa, próitéin a bhaineann le pataigin, agus metallothionein in iúl go mór freisin, a d'fhéadfadh a bheith bainteach lena dtimpeallacht marthanais dian. Ina theannta sin, tá roinnt géinte comhdhéanaimh lena n-áirítear géine RNA ribosómach 26S (comp22329_c2_seq1), próitéin auxin-repressed/ suanacht-ghaolmhar (comp20999_c0_seq1), Bhí fachtóir ribosiylation ADP (comp20499_ c0_seq1) an-trascríobh freisin.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN DÍOLÚINE A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%