Staidéar Cainníochtúil Próitéamach Nochtann Conair Fibrinogen i nGalar ae Ilchisteach
Nov 21, 2023
Coimriú:(1) Cúlra: Is grúpa ilchineálach de neamhoird ó bhroinn é galar ae polycystic (PLD) arb iad is sainairíonna dilatation ducht bile agus forbairt cyst díorthaithe ó cholangiocytes. Mar sin féin, níl an mheicníocht cystogenesis anaithnid faoi láthair agus tá an chóireáil PLD teoranta do thrasphlandú ae. Tá gá le cineálacha cur chuige teiripeacha úra agus éifeachtacha. Sa chomhthéacs seo, tá sé mar phríomhaidhm ag an obair atá ann faoi láthair bealaí nua móilíneacha a aimsiú, chomh maith le spriocanna teiripeacha nua, a bhfuil baint acu leis an bpróiseas hepatic cystogenesis. (2) Modhanna: Rinneadh próitéamaíocht chainníochtúil bunaithe ar theicneolaíocht SWATH– MS ag déanamh comparáide idir próitéamaí hepatic deCineál Fiáinagus aenna tsóiteáin/ilchisteacha in agalar duáin polycystic(PKD) múnla murine (Pkd1cond/cond; Tam-Cre−/+). (3) Torthaí: D’aithníomar roinnt próitéiní a athraíodh go flúirseach, le uas-rialachán nó íosrialáil scoite faoi dhó agus ceann coigeartaithe.p-luach a bhaineann go suntasach le cystogenesis hepatic. Ansin, rinneamar saibhriú agus anailís próitéine-próitéin ag aithint braisle dírithe ar fhibrinogens hepatic. Ar deireadh, rinne RT-qPCR rogha spriocanna a bhailíochtú,Blotáil an Iarthair,agus imdhíonhistochemistry, ag aimsiú comhghaol ard le sonraí próitéamaíocha cainníochtúla agus ag bailíochtú an choimpléasc fibrinogen. (4) Conclúidí: D'aithin an obair seo cosán móilíneach nua i ngalar ae cisteach, ag leagan béime ar an gcoimpléasc fibrinogen mar sprioc teiripeach nua féideartha do PLD.
Eochairfhocail:PLD; SWATH; próitéamaíocht chainníochtúil; spriocanna teiripeacha
1. Réamhrá
Galar ae polycystic(PLD) grúpa ilchineálach de neamhoird ó bhroinn arb iad is sainairíonna dilatation ducht bile agus forbairt cyst díorthaithe ó cholangiocytes (cealla epithelial ó dhucht bile). Na cysts iomadúla scaipeadh agus dul chun cinn ar fud an parenchyma ae cur isteach ar a fheidhm [1]. Faightear PLDanna le hoidhreacht i bhfoirm cheannasach nó chúlaitheach agus is féidir leo tarlú ina n-aonar (galar ae polycystic scoitenóPLD) nó, níos coitianta, mar anléiriú seach-duánachde uathsomalgalar duáin polycystic ceannasach do dhaoine fásta(PKD) [2]. Igalar duáin polycystic ceannasach autosomal(ADPKD), ~ 85% de na hothair a fhorbairt cysts ae ar fud an parenchyma hepatic agus is féidir a dhéine raon ó roinnt cysts go cystogenesis hepatic trom [3,4]. Idir an dá linn, igalar duáin polycystic cúlaitheach autosomal(ARPKD), d’fhéadfadh cysts ae a fhorbairt, ach is é an príomh-choimpléasc hepatic ná athmhúnlú lochtach ar an pláta ductal le fiobróis hepatic ó bhroinn [5,6]. I gcás an dá, is é PLD an príomh-léiriú extrarenal agus éilíonn sé bainistíocht agus cóireáil chliniciúil [2,5]. Is é an príomhchur chuige cliniciúil d’othair PLD ná a gcuid comharthaí cliniciúla a laghdú. Is é bainistiú deacrachtaí duchta bile an phríomhghné chliniciúil atá le rialú, agus is gnách gurb é an straitéis cóireála deiridh ná trasphlandú ae [7], ós rud é nach bhfuil cóireáil cógaseolaíoch éifeachtach ann do PLD [2,5]. Bhí baint ag bealaí móilíneacha iomadúla leis an ngalar [8], mar shampla secretion sreabhach méadaithe [9,10], iomadú [11], fiobróis [12,13], lochtanna ciliary [14] agus daoine eile [7,8]; ach tá an príomh-mheicníocht ag dul faoi cystogenesis fós le soiléiriú. Tá géarghá le spriocanna teiripeacha féideartha nua a shainaithint. Bhí na staidéir seo go léir bunaithe ar staidéir mhóilíneacha ag baint úsáide as uirlisí móilíneacha clasaiceacha éagsúla: cultúr cille 3D [7,8], immunohistochemistry [7-9,11,12], ELISA [9,11], micreascópacht leictreoin tarchurtha (TEM) [12] , imdhíon-cheimic [11], RT-qPCR (PCR fíor-ama cainníochtúil) [7,8,10,11] agus blot an Iarthair [7,8,10-12]. D’fhéadfadh sé bheith ina bhuntáiste trí theacht ar staidéar galair ó pheirspictíochtaí nua, samhlacha ainmhithe réamhchliniciúla seanbhunaithe, agus leas a bhaint as teicneolaíochtaí nua, maidir le teacht ar mheicníochtaí nua móilíneacha galair chun fionnachtana móilíneacha a aistriú go teiripí nua.
Is í crómatagrafaíocht leachta in éineacht le mais-speictriméadracht i gcomhar (LC-MS/MS) an teicneolaíocht is coitianta a úsáidtear chun próitéamaí galair a thréithriú chomh maith le bithmharcóirí galair féideartha nó scagadh drugaí a aithint [15,16]. Ceadaíonn straitéis atá ag teacht chun cinn darb ainm SWATH–MS (fáil fuinneoige seicheamhach ar gach Speictriméadracht mhaisithe blúirí-ian teoiriciúil) cainníochtú in-atáirgthe, iontaofa, ard-thréchuir le suas le mílte próitéin arna anailísiú in aghaidh an tsampla bhitheolaíoch, agus leis an bhféidearthacht feidhmiú go comhuaineach. líon mór measúnachtaí [16,17]. Maidir leis an teicneolaíocht seo, déantar na samplaí a dhíleá le trypsin agus déantar anailís orthu ag crómatagrafaíocht leacht i dteannta le oibreacha crómatagrafaíochta mais tandem sa mhodh Sealbhaithe Sonraí-Neamhspleách (DIA) [16] (féach Ábhar agus Modhanna). Próitéamaíocht den chéad ghlúin eile Ceadaíonn teicneolaíocht SWATH-MS an próitéamaí a chainníochtú agus difríochtaí i líonmhaireacht próitéine i samplaí agus coinníollacha éagsúla a aithint.
Sa staidéar seo, rinneamar anailís chainníochtúil próitéamaíoch difreálach bunaithe ar theicneolaíocht SWATH-MS i ngalar ae ilchisteach ó shamhlacha ainmhithe mutant. Tuairiscímid liosta próitéiní a bhfuil tábhacht staitistiúil acu maidir le flúirse próitéin difreálach, arb iad is sainairíonna iad anailísí saibhrithe éagsúla agus leigheas sonraí. Ar deireadh, rinneamar na sonraí SWATH a bhailíochtú tríd an gcoimpléasc fibrinogen a aithint agus a aibhsiú mar mheicníocht nua galair agus mar sprioc teiripeach nua féideartha do PLD.
2. Ábhair agus Modhanna
2.1. Múnla Murine
Sa staidéar seo, d’úsáideamar samhail ainmhí coinníollach murine Pkd1, an C57/BL6 k Pkd1cond/cond; Tam-Cre [18,19]. Úsáideadh samhail Cre- luiche mar Chineálacha Fiáin (WT), agus an Cre+ mar Mutant (KO). Deimhníodh géinitíopaí le PCR caighdeánach, tar éis na coinníollacha agus na primers a thuairiscítear [18]. Bhí scriosadh Pkd1 i gcónaí ag laethanta iarbhreithe 10 agus 11 (lch 10 agus p11) le instealladh intraperitoneal amháin de tamoxifen (10 mg / 40 g) (Sigma®, St. Louis, MO, SAM Uimh. T5648), caolaithe in ola arbhar (Sigma–Aldrich®, St. Louis, MO, SAM Uimh. C8267), an dá lá i máthair na mbruscar a tharlódh. Eotanaíodh na hainmhithe ag an lá iarbhreithe 30 (lch 30). Bhunaigh daoine aonair éagsúla na grúpaí agus eagraíodh iad go randamach (randamachú) ag coinneáil cóimheas 1:1 idir fireannaigh agus baineannaigh i ngach grúpa. Baineadh úsáid as tréithe anatamaíocha chun gnéas na n-ainmhithe a aithint. Bhí na lucha lonnaithe i saoráid saor ó phataigin (SPF) ag coinníollacha bunaithe Ollscoil Santiago.
2.2. Eastóscadh Próitéin agus Díleá
Ag an bpointe íobairt p30, rinneadh na haenacha díscartha a stóráil ag −80 ◦C. Rinneadh an t-ae iomlán a mheilt i nítrigin leachtach ag baint úsáide as moirtéal leachtach nítrigine-fhuaraithe (DD Biolab®, Barcelona, an Spáinn Uimh. 088763), le leath de na fíocháin sannta d'eastóscadh próitéine agus an leath eile d'eastóscadh RNA. Ullmhaíodh sleachta próitéine le maolán lísí RIPA (10 Mm TRIS, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% TRITON X-100 agus 1% deocsaicolate sóidiam). Cuireadh coscóirí protease agus fosfatase 1% (Sigma® No. P8340 y No. P0044) leis freisin. Chuaigh an lysate fíocháin seo faoi phróiseas lártheifneoraithe (ar feadh 30 nóiméad ag 4 ◦C agus 14,000 rpm). Ansin rinneadh an comhshnámhán a mheabhrú agus a chainníochtú ag measúnacht phróitéin Bradford (Bio-Rad® Uimh. 5000001). Comhchruinníodh aliquots próitéin (100 µg) i mbanda aonair i leictreafóiréis glóthach dodecyl sulfate-polyacrylamide 10% (SDSPAGE), gearrtha agus curtha isteach le haghaidh díleá láimhe mar a thuairiscítear roimhe seo [20]. Ar deireadh, díscaoileadh na peptídí a bhaintear in aigéad formach 0.1% le haghaidh tuilleadh anailíse.
2.3. Próitéamaíocht
2.3.1. DDA-Sonraí
Anailís Cleithiúnach Rinneadh anailís ar 4 µL de gach sampla (os cionn 4 µg próitéine) trí chur chuige sealbhaithe sonraí-spleách gunna gráin (DDA) trí mhicrea-LC-MS/MS. Scaradh na samplaí le córas micrea-LC Ekspert nLC425 (Eksigen®, Baile Átha Cliath, CA, SAM) ag baint úsáide as colún gaiste YMC-TRIART C18 le méid cáithníní 3 mm agus 120 Å méid pore (YMC Technologies, Teknokroma, Barcelona, an Spáinn) agus colún Chrom XP C{{10}} mm × 0.30 mm, méid na gcáithníní 3 mm agus méid pore 120 Å (Eksigen® (b) ag ráta sreafa 10 µL/nóim. Ba iad na tuaslagóirí a úsáideadh ná tuaslagóir A (uisce, 0.1% aigéad formach) agus tuaslagóir B (ACN, aigéad formach 0.1%). Bhí an grádán ó 5% go 95% B ar feadh 30 min, 5 min ag 90% B agus, ar deireadh, 5 min eile ag 5% B le haghaidh cothromaíochta colún, ar feadh tréimhse iomlán 40 min. Ba é an mais-speictriméadar cúpláilte ná mais-speictriméadar ceathairphoill-TOF hibrideach, 6600 (SCIEX®, Framingham, MA, SAM) a oibríonn le córas fála sonraí-spleách i mód ian dearfach. Ag baint úsáide as an mais-speictriméadar, rinneadh scanadh suirbhé 250 ms ag 400 go 1250 m/z agus ina dhiaidh sin rinneadh turgnaimh MS/MS ag 100 go 1500 m/z (25 ms d'am fála) ar feadh timthriall iomlán ama de 2.8 s. Cuireadh réamhtheachtaithe ilroinnte leis an liosta eisiamh dinimiciúil ar feadh 15 s, fágadh aon ian le lucht +1 as an áireamh san anailís MS/MS. Comhcheanglaíodh agus rinneadh cuardach MS ar chomhaid agus ar bhunachair shonraí trí úsáid a bhaint as bogearraí ProteinPilot v.5.0.1. (SCIEX®, Framingham, MA, SAM) ag baint úsáide as bunachar sonraí luch-sonrach UniProt Swiss-Prot. Is gá alkylation cistéin iodoacetamide a shonrú mar mhodhnú seasta agus díleá trypsin. Socraíodh an ráta fionnachtana bréagach (FDR) go 1 le haghaidh peptídí agus próitéiní le scór muiníne níos mó ná 99% [21].
2.3.2. Giniúint na dTagairtí
Leabharlann Speictrim Rinneadh an leabharlann speictreach trí mhodh DDA mar a thuairiscítear thuas, ach in ionad gach sampla neamhspleách, rinneadh linn de gach grúpa le 4 µL de gach sampla (os cionn 4 µg próitéine) á rith chun próitéin níos ionadaí a fháil. sainaithint sa leabharlann speictreach. Seoladh gach comhad amh le chéile i mbunachar sonraí Uniprot chun an leabharlann speictreach a fháil ag baint úsáide as na coinníollacha píolótach próitéine a luadh sa chuid roimhe seo.
2.3.3. Cainníochtú de réir SWATH agus Anailís Sonraí
Rinneadh an éadáil SWATH-MS ag baint úsáide as modh DIA. D’úsáideamar 4 ghrúpa le 4 mhacasamhlú bhitheolaíocha in aghaidh an ghrúpa agus 3 mhacasamhlú theicniúla in aghaidh an tsampla (féach Tábla S1 le haghaidh tuilleadh sonraí). Rinneadh anailís ar na fíocháin agus, i ngach cás, cuireadh i gcomparáid iad i gcoinníollacha Cineál Fiáin (ó Pkd1cond/cond; Tam-Cre− mouse) agus Mutant (ó Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ mouse). Ritheadh 4 µg de phróitéin in aghaidh an tsampla agus macasamhla teicniúla ag baint úsáide as modh SWATH. I gcás gach sraith samplaí, rinneadh leithead na 100 fuinneog athróg a bharrfheabhsú de réir an dlús ianach a fuarthas i ritheann an DDA leabharlainne ag baint úsáide as scarbhileog fuinneoige inathraithe Sciex SWATH. Mar sin, bhí an modh SWATH bunaithe ar thimthriall athrá a chuimsigh éadáil scananna 100TOF MS/MS (400 go 1500 m/z, modh ardíogaireachta, am fála 50 ms) d’fhuinneoga leithlisithe d’athróga réamhtheachtaithe forluiteacha seicheamhacha le leithead. (forluí 1 m/z) a chlúdaíonn an raon maise 400 go 1250 m/z le scanadh TOF MS roimhe seo (400 go 1500 m/z, am fála 50 ms) do gach timthriall. Ba é an t-am timthriall iomlán ná 6.3 s.
2.3.4. Anailís Sonraí
Rinneadh na próitéiní go léir sa leabharlann ian a d'aithin ProteinPilot le FDR faoi bhun 1% a chainníochtú ag an modh SWATH. Nuair a fuarthas samplaí aonair, rinne PeakView v.2.2 an t-ailíniú speictreach agus an t-eastóscadh sonraí spriocdhírithe. (SCIEX®, Framingham, MA, SAM) a mheaitseálann an leabharlann speictreach tagartha mar a thuairiscítear thíos [22–26]. Rinneadh na hamanna coinneála de na peiptídí a roghnaíodh do gach próitéin, a athailíniú i ngach rith de réir na peptides iRT a bhí i láthair i ngach sampla agus rinneadh iad a mhaolú feadh na haise lánaimseartha. Gineadh ansin na crómatáin ian eastósctha do gach ian den blúire roghnaithe; Fuarthas na buaic-réimsí do na peptídí trí bhuaic-réimsí na hiain de na blúirí comhfhreagracha a chur leis. ríomh PeakView FDR agus scór do gach peiptíde sannta de réir na gcomhpháirteanna crómatagrafaíochta agus speictrim; níor úsáideadh ach peiptídí le FDR faoi bhun 5% le haghaidh cainníochtú próitéine. Ar an gcaoi chéanna, chun na réimsí le haghaidh cainníochtú próitéine a fháil mar fheidhm de dhéine comhartha, roghnaíodh suas le 10 peptides in aghaidh an phróitéin agus seacht blúirí in aghaidh an pheptíde. Bhí gach peptides roinnte agus modhnaithe eisiata ó phróiseáil. Baineadh úsáid as fuinneoga cúig nóiméad agus leithead 30 ppm chun na crómatagram ian a bhaint.
2.3.5. Anailís Conair Comharthaíochta
Rinneadh anailís fheidhmiúil dhifriúil ag baint úsáide as próitéiní arna gcur in iúl go difreálach chun meastóireacht a dhéanamh ar na gréasáin idirghníomhaíochta is ábhartha, na conairí gaolmhara nó na comhpháirteanna ceallacha agus na próitéiní nó na conairí gaolmhara eile. Úsáideadh uimhreacha aontachais próitéin UniProt (https://www.uniprot.org/, 28 Lúnasa 2021). Cuireadh próitéiní le héagsúlachtaí i raidhse próitéine faoi réir: String® (https://string-db.org/, 25 Deireadh Fómhair 2021) ag baint úsáide as téarmaí Gene Ontology (GO) agus FunRich® (http://funrich.org/index.html , 21 Deireadh Fómhair 2021) chun staidéar a dhéanamh ar ghréasáin próitéine agus ar chomhlachas bitheolaíoch idir próitéiní; agus chuig Reactome® (https://reactome.org/, 25 Deireadh Fómhair 2021) chun staidéar a dhéanamh ar na conairí atá i gceist maidir le nó idirghníomhú le próitéiní atá léirithe go suntasach.
2.4. Histeolaíocht agus Innéacs Cystic a Thomhas
Bhí an lobe is mó d'ae na n-ainmhithe socraithe i bparaformaildéad i gcónaí (tuaslagán maolánach paraformaildéad 4%, pH=7, Labbox No. FORM-D0P-10K) thar oíche ag 4 ◦C. Díhiodráitíodh na haenacha ansin le xiléin agus eatánól agus ar deireadh leabaíodh iad i bpaifín. Bailíodh trasghearrthacha de 4.5 µm. Baineadh úsáid as prótacail chaighdeánacha staining trichrome hematoxylin-eosin (HE) agus Masson.
Le haghaidh cainníochtaithe, tógadh sleamhnáin de ranna fadaimseartha den lobe is mó den ae i gcónaí mar íomhánna ionadaíocha, agus, ar a laghad sé rannóg dhifriúla in aghaidh an ainmhí, léirshamhlaithe faoi mhicreascóp Olympus BX51 ceangailte le Ceamara Olympus DP70, baineadh úsáid as chun an t-ae a chainníochtú. innéacs chisteach agus roinnt cysts. Ríomhadh cainníochtú an dá pharaiméadar le huirlis bogearraí Aithint Uathoibríoch Cyst ar a dtugtar CystAnalyser (https://citius.usc.es/transferencia/software/cystanalyser, 1 Iúil 2020) mar a thuairiscítear roimhe seo [35].
2.5. Ceimic Chliniciúil
Bailíodh fuil roimh eotanáis, agus fuarthas séiream ag baint úsáide as feadáin Advance BD Vacutainer SST II. Rinneadh serum alanine transaminase (ALT) agus phosphatase alcaileach (ALP) a thomhas ag baint úsáide as Córas Ceimic ADVIA 2400 (Siemens Healthineers, Erlangen, an Ghearmáin).
2.6. Eastóscadh RNA
Rinneadh RNA a leithlisiú mar a thuairiscítear roimhe seo [36] trí úsáid a bhaint as prótacal TRIzol (TRI Imoibrí, Sigma®, St. Louis, MO, SAM, Uimh. T9424), ina raibh clóraform (Sigma® Uimh. C2432) mar ghníomhaire dínádúraithe do na cealla. agus iseapropanol (Sigma® Uimh. 650447) an gníomhaire deascaidh le haghaidh RNA. Caolaíodh an deascán in uisce DEPC (Ambion®, Austin, TX, USA, No. AM9920), ina bhfuil 1% SUPERaseIn RNase Inhibitor (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, Uimh. AM2694).
2.7. PCR Cainníochtúil Fíor-Ama
Cóireáladh micreagram amháin de RNA ae iomlán le DNase I (Invitrogen®, Carlsbad, CA, SAM, Uimh. 18068015). Ansin, rinneadh tras-scríobh droim ar ais le trealamh Córas Sintéise Céad Snáithe SuperScript® III (Invitrogen®, Uimh. 18080051), agus anailís léiriú géine trí PCR fíor-ama cainníochtúil ag baint úsáide as FastStart Universal SYBR GREEN Master (ROX) (Roche® Uimh. 04913914001 ) i gcóras Mx3005P (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA, SAM). Dearadh na primers a úsáideadh don staidéar seo le Primer 3 Plus (http://tiny.cc/pf928y, 11 Márta 2020) agus tá siad bunaithe ar na sraitheanna tagartha cDNA a foilsíodh i mbrabhsálaí genome Ensembl (http://www.ensembl.org /index.html, 11 Márta 2020). Tá na seichimh iomlána de na primers go léir a úsáideadh sa staidéar le fáil i dTábla S2. Baineadh úsáid as an gclár seo a leanas le haghaidh gach imoibrithe PCR iomlán: céim dínádúraithe le 30 s ag 95 ◦C; 45 timthriall de 30 s ag 95 ◦C, 1 nóiméad ag 60 ◦C agus 30 s ag 72 ◦C; ina dhiaidh sin céim fuaraithe. Mar a rinneamar roimhe seo [36], ritheadh gach sampla (n=6 do gach grúpa) i dtrí chóip i ngach turgnamh. Rinneadh anailís ar na torthaí tríd an modh iomlán cainníochtaithe. Mar thoradh air sin, baineadh úsáid as cuar caighdeánach le tiúchain aitheanta sa mheasúnacht agus, ina theannta sin, normalaíodh gach sampla go géine slonn tairiseach. Sa staidéar seo, úsáideadh an ghéin Gapdh (glyceraldehyde-3-fosfáit díhidrigineáis) mar an ghéin choimeáda.
2.8. Blotting an Iarthair
Rinneadh measúnachtaí blotting an Iarthair ar lísáití iomlána ae. Cinneadh an cion próitéine iomlán trí úsáid a bhaint as measúnacht phróitéin Bradford (Bio-Rad®, Hercules, CA, USA, Uimh. 5000001) agus bhí an méid céanna de gach próitéin (20–30 µg) ann. bruite ag 95 ◦C ar feadh 5 min agus scartha i 10% SDS-PAGE faoi choinníollacha laghdaithe. Baineadh úsáid as Dréimire Próitéin PageRulerTM Prestained (Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAM, Uimh. 26616) mar chaighdeán meáchan móilíneach próitéine. Ina dhiaidh sin, aistríodh na próitéiní go seicní nitrocellulose (Bio-Rad® Uimh. 1620115). Chun ceangailteach neamhshonrach a sheachaint, cuireadh bac ar na seicní ar feadh 1 h ag teocht an tseomra ag baint úsáide as réiteach BSA 2.5% (NZYTech®, Lisboa, an Phortaingéil, Uimh. MB046) le haghaidh próitéiní fosfarlaithe, nó Maolán Blocála SuperBlock (Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAM, Uimh. 37515). Ina dhiaidh sin, goradh na seicní thar oíche ag 4◦C le príomhantasubstaintí agus níochán an chéad uair eile i 0.3% Tween-20 i PBS. Ar deireadh, goraíodh na seicní nitrocellulose ar feadh 1 h ag teocht an tseomra leis na hantasubstaintí tánaisteacha atá nasctha le HRP. Forbraíodh comharthaí le trealamh Foshraith Chemiluminescent SuperSignal™ West Pico PLUS (Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAM, Uimh. 34580) nó trealamh Foshraitheanna Blotting an Iarthair PierceTM ECL (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA Uimh. 32109) roimh ré. le hamharcléiriú i gCóras Íomháithe ChemiDoc™ (Bio-Rad®, Hercules, CA, SAM). Rinneadh bannaí próitéine a chainníochtú trí úsáid a bhaint as bogearraí ImageJ® Lab (v 4.0.1, https://imagej. nih.gov/ij/, 26 Márta 2021). Rinneadh leibhéil densitometry próitéine a normalú go próitéiní coimeádta GAPDH nó -ACTIN. Do gach grúpa. Baineadh úsáid as N=6, i ngach turgnamh.
Tá na príomhantasubstaintí seo a leanas á n-úsáid le haghaidh blotting an Iarthair: frith-ANXA2 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA #sc-28385), frith -SAMP (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, SAM, Uimh. sc-393948), frith-FIBB (1:500, Santa Cruz Biotech nology Inc.®, Dallas, TX, SAM, Uimh. sc-271035), frith-FIBA (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, SAM, Uimh. sc-398806), frith-FIBG (1:500 , Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, SAM, Uimh. sc-133157), frith-HAO2 (1:1000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAM, Uimh. (1:1000, Cusabio®, Houston, TX, SAM, Uimh. CSB-RA009232A0HU) agus frith- -ACTIN (1:1000, Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, SAM, Uimh. 8457), mar chomh maith leis an antashubstaint tánaisteach Gabhar frith-Choinín IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAM, Uimh. 31460) nó gabhar frith-luch IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, SAM, Uimh. 31430).
2.9. Imdhíon-cheimic agus Cainníochtú
Maidir le himdhíon-histochemistry, baineadh úsáid as maolán citrate sóidiam pH=6 (Agilent Dako®, Glostrup, an Danmhairg Uimh. S2369) le haghaidh aisghabháil antaigin agus cuireadh bac ar fhíocháin le caolaitheoir antashubstainte (Agilent Dako® Uimh. K8006). Ba é an antashubstaint a úsáideadh le haghaidh anailíse imdhíon-histochemical ná fibrinogen (Agilent Dako® Uimh. A0080), agus an córas braite comhchuingeach HPR don imdhíon-bhraite. Ar deireadh, rinneadh cainníochtú immunohistochemistry trí úsáid a bhaint as an bhfeidhm "Bealaí Scoilte" (cainéal glas) ó bhogearraí Fidsí-ImageJ® ( https://imagej.net/software/fiji/, 13 Deireadh Fómhair 2021). I gcás gach sampla, n Úsáideadh níos mó ná nó cothrom le 6 íomhá.
2. 10. Anailís Staitisticí
Data are presented as means ± SEM for all cases (bar or point plots). First, normal distribution was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. A two-tailed t-test was used to determine the significance of differences between two groups. p < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, ** corresponds to p-values < 0.01 and *** to p-values < 0.001. All datasets were analyzed using GraphPad Prism software (version 9, https://www.graphpad.com/, 13 October 2021). For proteomic studies, a Student's t-test (using MarkerView software, 22 December 2017) was performed to compare the groups in pairs to identify proteins, which were significantly differentially represented using adjusted p-value < 0.05 (multiple correction FDR method) and fold change >2 mar scoite. Rinneadh anailís staitistiúil ilathróg gan maoirsiú agus úsáid á baint as anailís phríomh-chomhpháirte (PCA) chun na sonraí ar fud na samplaí a chur i gcomparáid.
Seirbhís Tacaíochta Wecistanche-An t-onnmhaireoir cistanche is mó sa tSín:
Ríomhphost:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Teil:+86 15292862950
Siopa Le haghaidh Sonraí Breise:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
