Cainníochtú Meathlaithe Néaráite Le Cruinneas agus Éifeachtúlacht Fheabhsaithe i Múnla In Vitro de Ghalar Parkinson Cuid 1

Teibí

Tá baint ag meathlú neurite le céimeanna luath neamhoird neurodegenerative cosúil le galar Alzheimer, galar Parkinson (PD), agus scléaróis cliathánach amyotrophic. Is éard atá i gceist le modh amháin a úsáidtear go coitianta chun anailís a dhéanamh ar dhíghiniúint néaraigh ná Innéacs Díghiniúna (DI) a ríomh tar éis úsáid a bhaint as uirlis Anailíse Cáithníní ImageJ chun blúirí néaráite i micreagraif de chealla saothraithe a bhrath. Mar sin féin, bíonn roinnt cineálacha earráidí tomhais ag baint le hanailísí DI, féadfaidh siad a bheith am-íditheach le déanamh, agus tá siad teoranta ó thaobh feidhme.

Tagraíonn neurodegeneration d'athruithe a tharlaíonn i néaróin nó timpeall orthu, a d'fhéadfadh cur isteach ar fheidhm chognaíoch an duine, faisnéis, mothúcháin, iompar, etc. Ceapann go leor daoine go bhfuil dlúthbhaint ag neurodegeneration le meath cuimhne, ach b'fhéidir nach bhfuil sé seo amhlaidh.

Ar an gcéad dul síos, ní gá go gciallódh neurodegeneration go dtagann meath ar chuimhne le haois. Is féidir le roinnt daoine cuimhne mhaith a choinneáil agus fiú a bheith in ann fíréantacht a thuiscint. Tá sé seo amhlaidh toisc go mbíonn tionchar ag meascán fachtóirí ar nós aclaíocht, aiste bia agus stíl mhaireachtála ar chuimhne duine.

Ar an dara dul síos, is féidir leis an inchinn daonna naisc néaracha nua a athbhunú agus cuimhní cinn nua a fhoirmiú, ar a dtugtar plasticity. Beag beann ar aois, bíonn an inchinn i gcónaí ag foghlaim agus ag cruthú cuimhní nua. Mar sin, is athrú nádúrtha san inchinn é néar-mheathlú agus ní gá go gciallódh sé sin go dtiocfaidh meath ar chuimhne.

Ar deireadh, is féidir le dearcadh dóchasach feabhas a chur ar chuimhne duine freisin. Is féidir drochthionchar a bheith ag imní agus strus ar an inchinn, rud a fhágann go gcailltear cuimhne. Is féidir le dearcadh dearfach sláinte inchinn a chur chun cinn, agus cuimhne agus cumas cognaíocha a fheabhsú.

Go hachomair, ní gá go gcailltear cuimhne mar thoradh ar néar-mheathlú, agus is féidir le dearcadh dóchasach i leith na beatha cabhrú linn dea-chuimhne agus cumas cognaíocha a choinneáil. Mar sin, ba cheart dúinn dearcadh dóchasach a choinneáil, agus cleachtadh, aiste bia agus bainistíocht stíl mhaireachtála a neartú chun sláinte inchinne agus cuimhne a chothabháil. Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid ár gcuimhne a fheabhsú. Is féidir le Cistanche cuimhne a fheabhsú go suntasach, mar is féidir le Cistanche cothromaíocht na n-neurotransmitters a rialáil freisin, mar shampla leibhéal acetylcholine agus fachtóirí fáis a mhéadú. Tá na substaintí seo an-tábhachtach don chuimhne agus don fhoghlaim. Ina theannta sin, is féidir le feoil sreabhadh fola a fheabhsú freisin agus seachadadh ocsaigine a chur chun cinn, rud a d'fhéadfadh a chinntiú go bhfaigheann an inchinn cothú agus fuinneamh leordhóthanach, rud a fheabhsóidh beogacht agus seasmhacht na hinchinne.

Cliceáil fios bealaí chun feidhm na hinchinne a fheabhsú

Anseo, déanaimid cur síos ar mhodh feabhsaithe chun anailísí DI a dhéanamh. Feabhsaíodh cruinneas na dtomhas trí mhionathrú a dhéanamh ar chritéir roghnúcháin chun blúirí neurite a bhrath, déantáin íomhá agus ábhair neamhnéaracha a bhaint as íomhánna, agus leas iomlán a bhaint as codarsnacht íomhá. Cuireadh feabhsuithe den sórt sin i bhfeidhm i macra ImageJ a chumasaíonn anailís DI go tapa agus go hiomlán uathoibrithe ar íomhánna iolracha. Gnéithe an macra oibríochtaí chun cealla cille a bhaint go huathoibríoch ó mhicreagraif, agus mar sin leathnaítear feidhmiú na n-anailísí DI le húsáid i dturgnaimh a bhaineann le cultúir dhaonta.

Cuirimid torthaí turgnamhacha i láthair a thacaíonn, i gcomparáid leis an ngnáthmhodh, go dtugann an modh anailíse feabhsaithe tomhais le cruinneas méadaithe agus go dteastaíonn i bhfad níos lú ama le déanamh.

Ina theannta sin, léirímid áisiúlacht an mhodha chun díghiniúint néaraíoch a imscrúdú i múnla cultúir cille PD trí thurgnamh a dhéanamh a nochtfaidh éifeachtaí c-Jun N-terminal kinase (JNK) ar dhíghiniúint néaraíoch de bharr strus ocsaídiúcháin i gcealla mesencephalic daonna. Féadfar an modh anailíse feabhsaithe seo a úsáid chun léargas nua a fháil ar fhachtóirí atá mar bhunús le meathlú néaraíoch agus dul chun cinn neamhoird néar-mheathlúcháin.

Eochairfhocail:

Degeneration axonal; innéacs díghiniúna; meathlú neurite; neurodegeneration; strus ocsaídiúcháin; galar Parkinson.

Ráiteas Tábhachta

Is imeacht cheallacha é degeneration neurite a bhaineann leis na céimeanna tosaigh d’ilchineálacha neamhoird neurodegenerative. Ní thuigtear go leor fachtóirí móilíneacha a rialaíonn meathlú neurite, agus tá feidhm agus éifeachtúlacht teoranta ag na modhanna atá ann cheana chun staidéar a dhéanamh ar dhíghiniúint néaraíoch. Anseo, sainaithnímid modhnuithe ar nós imeachta a úsáidtear go forleathan chun anailís a dhéanamh ar dhíghiniúint néaraíoch a laghdaíonn earráid tomhais.

Ionchorpraíodh feabhsuithe modheolaíochta den sórt sin i macra ImageJ, rud a d'éascaigh anailís thapa agus iomlán uathoibrithe ar dhíghiniúint néaraíoch ag baint úsáide as tacair mhóra micreagraif. Ag baint úsáide as samhail cultúir cille de ghalar Parkinson (PD), léirímid go n-éascaíonn an macra tomhais díghiniúna néarít níos cruinne agus níos éifeachtaí agus ag an am céanna ag leathnú oiriúnacht an mhodha anailíse do thurgnaimh a bhaineann le cultúir neamhcheangailte.

Réamhrá

Próiseas ceallacha is ea díghiniúint neurite ina dtéann axons nó dendrites faoi mhífheidhm fhorásach agus athruithe moirfeolaíocha, rud a fhágann go gcailltear sláine néaraíoch. Próiseas a chaomhnaítear go héabhlóideach is ea díghiniúint neurite atá ríthábhachtach chun líonraí néaracha a bhunú i gceart le linn fhorbairt an lárchórais néaróg (Neukomm agus Freeman, 2014).

Spreagtar an próiseas freisin, áfach, mar fhreagra ar chineálacha éagsúla díobhála amhail damáiste meicniúil nó nochtadh do dhrugaí a úsáidtear le haghaidh ceimiteiripe (Salvadores et al., 2017). Ina theannta sin, tá baint ag meathlú neurite le dul chun cinn éagsúlacht neamhoird néar-mheathlúcháin a bhaineann le haois, lena n-áirítear galar Alzheimer, galar Parkinson (PD), galar Huntington, agus scléaróis cliathánach amyotrófach.

Is díol spéise é, maidir le gach neamhord néar-mheathlúcháin den sórt sin, go dtugann fianaise carntha le fios gur imeacht lárnach, luathchéime é díghiniúint néaraíoch a thagann roimh bhás néarónach nó roimh theacht chun cinn na hairíonna cliniciúla (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert agus Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). Mar sin, d’fhéadfadh staidéir a dhéanann iniúchadh ar fhachtóirí a rialaíonn an próiseas ceallach seo spriocanna núíosacha a nochtadh chun cóireáil a dhéanamh ar éagsúlacht riochtaí néar-mheathlúcháin.

Tá tábhacht ar leith ag baint le himscrúdú a dhéanamh ar dhíghiniúint neurite chun PD a thuiscint, galar arb é is sainairíonna é carnadh comhiomláin próitéine ina bhfuil a-synuclein, caillteanas forásach néaróin dopaminergic sa substantia nigra pars compacta (SNpc), agus forbairt ar éagsúlacht na hairíonna mótair agus cognaíocha. (Aarsland et al., 2017).

Léiríonn fianaise ó staidéir iarbháis agus íomháithe daonna go bhfuil comhiomláin a-synuclein níos flúirseach i snáithíní néarónacha ná sna ceallacha, agus go dtarlaíonn díghrádú axons dopaminergic níos mó ná caillteanas néaróin dopaminergic sa SNpc le linn na tréimhse as a dtagann tús cliniciúil. (Tagliaferro agus de Búrca, 2016).

Cé nach dtuigtear go hiomlán na hidirghníomhaíochtaí móilíneacha a chuireann le meath forásach néaráití dopaminergacha, léiríonn fianaise le déanaí gur féidir le meathlú néaraíoch a bheith idirghabhála trí imeachtaí atá neamhspleách ar easghluaiseachtaí comharthaíochta atá mar bhunús le bás néaránach (Fukui, 2016; Geden agus Deshmukh, 2016). Mar sin, tá staidéir a dhéanann meastóireacht dhíreach ar bhuntaca fiseolaíocha díghiniúna néaraíoch ríthábhachtach d’fhorbairt teiripí a chuireann bac ar dhul chun cinn luath PD.

Mar fhreagra ar an bhfianaise go bhfuil ról lárnach ag meathlú neurite i gcur chun cinn neamhoird néar-mheathlúcháin, forbraíodh modhanna éagsúla chun meathlú néaróin a thomhas ag baint úsáide as micreagraif de néaróin saothraithe. Mar shampla, tá iliomad modhanna éagsúla bunaithe chun díghiniúint néaraíoch a thomhas ag baint úsáide as bogearraí chun líon nó fad néaráite laghdaithe a bhrath (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Mar sin féin, ós rud é nach ndéanann modhanna den sórt sin measúnú díreach ar ilroinnt néaráit, is féidir le hiarmhairtí féideartha na hathróige ar eisfhás néarítí léirmhíniú na dtorthaí chun an tionchar a bhíonn ag athróg ar dhíghiniúint néaritis a chinneadh. Tá meathlú néaraíoch tomhaiste ag grúpaí taighde áirithe freisin trí íomhánna de neurites a scóráil go suibiachtúil bunaithe ar ghnéithe moirfeolaíocha agus ar mhéid na hilroinnte dealraitheach (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Mar sin féin, tá an modh malartach seo am-íditheach agus féadfaidh sé earráid imscrúdaitheora a thabhairt isteach.

Is éard atá i gceist le modh amháin a éascaíonn tomhas oibiachtúil agus díreach ar ilroinnt núicrítí ná úsáid a bhaint as algartam Anailíse Cáithníní de ImageJ chun achar na blúirí néaráite i micreagraif de chealla saothraithe a thomhas. Úsáidtear na tomhais chun Innéacs Díghiniúna (DI) a ríomh, scála idir {{0}}.0 agus 1.0 a léiríonn céim na díghiniúna néarachta (Sasaki et al., 2009).

Cé gur féidir anailísí DI a úsáid chun céimeanna éagsúla ilroinnte neurite a bhrath, tá cruinneas na dtomhas teoranta go coitianta ag roinnt foinsí earráide, agus tá cur i bhfeidhm an mhodha teoranta go príomha do chultúir nó cealla a fhástar i ngléasanna micreashreabhach roinne a dhíbirt. Ina theannta sin, bíonn am-íditheach ar anailísí DI nuair a dhéantar iad a eachtarshuíomh go tacair íomhá mhóra. Mar sin, d’fhéachamar leis na teorainneacha seo a shárú tríd an nós imeachta anailíse DI a mhodhnú chun cruinneas agus éifeachtúlacht níos fearr a éascú, agus infheidhmeacht á leathnú ag an am céanna.

Sa staidéar reatha, sainaithnímid roinnt foinsí earráide a bhaineann go minic le hanailísí DI agus tuairiscímid athbhreithnithe modheolaíochta a laghdaíonn na cineálacha éagsúla earráide. Ionchorpraímid na feabhsuithe nós imeachta i macra ImageJ ar a dtugtar Innéacs Díghiniúna Neurite Uathoibrithe (ANDI) chun anailísí DI a uathoibriú go hiomlán ó thacair mhóra íomhánna. Ní theastaíonn ach bogearraí agus comhaid atá foinse oscailte agus atá ar fáil saor in aisce chun Macra ANDI a oibriú. Baineann tomhais a fhaightear trí úsáid a bhaint as ANDI leas as cruinneas méadaithe agus ag laghdú go suntasach an t-am a theastaíonn chun na hanailísí a dhéanamh.

Ina theannta sin, léirímid conas is féidir an modh anailíse nua a chur i bhfeidhm chun tomhas cruinn agus tapa a dhéanamh ar dhíghiniúint néaraíoch i múnla cultúir cille PD a bhaineann le cealla dícheangailte a fhástar gan deighilt. I dteannta a chéile, d’fhéadfadh léargas nua a bheith mar thoradh ar na feabhsuithe modheolaíochta seo ar fhachtóirí atá mar bhonn le próiseas ceallach tábhachtach a bhaineann le néar-mheathlú.

Abhair agus modhanna

Cultúr cille

Bunaíodh cultúir cealla mesencephalic daonna Lund (LUHMES) i sleamhnáin seomra ocht-tobar Lab Tek II atá brataithe le polai-L-ornithine (PLO) agus fibronectin, poly-D-lísín (PDL) agus laminin, na ceithre fhoshraitheanna go léir, nó uimh. foshraitheanna, mar a léirítear. Chun PLO agus fibronectin a chóta, goradh na sleamhnáin thar oíche ag teocht an tseomra le tuaslagán ina raibh 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, catalóg #P3655).

Tar éis nite le huisce steiriúil (Avantor), gor na sleamhnáin le 2 mg/ml fibronectin (Sigma-Aldrich, catalóg #F0895) ar feadh 3 h ag 37 céim . Ansin nite na sleamhnáin le PBS steiriúla (Corning Life Sciences, catalóg #21-040-CV) agus ceadaíodh iad a aer-thriomú. Chun PDL agus lainín a chóta, goraíodh na sleamhnáin ag teocht an tseomra le tuaslagán ina raibh 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, catalóg #P7280) agus lainín 10 mg/ml (Corning, catalóg #354232).

Tar éis gor thar oíche, nite na sleamhnáin le PBS steiriúla agus ceadaíodh iad a aer-thriomú. Chun na ceithre fhoshraith a chóta, rinneadh na nósanna imeachta thuasluaite go seicheamhach. Plátáladh cealla LUHMES (ATCC, RRID: CVCL_B056) sna sleamhnáin seomra brataithe ag na dlúis léirithe sa mheán difreála comhdhéanta de DMEM/F12 (Invitrogen, catalóg #11330057) arna fhorlíonadh le 2 mM glutamine (VWR), Forlíonadh 1% (v/v) N-2, tetracycline 1 mg/ml (Sigma-Aldrich, catalóg #87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutyryladenosine cAMP (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, catalóg #BML-CN125-0100), agus fachtóir néartrófach díorthaithe ó líne chill glial 2 ng/ml (GDNF; R&D Systems, catalóg #212-GD-010).

Ach amháin i gcás ina gcuirtear a mhalairt in iúl, plástar gach cultúr ag dlús 115,000 cill in aghaidh an tobair. Rinneadh athsholáthar meán toirte 50% gach 48 uair an chloig go dtí cóireáil. Chun sruth géiniteach a chosc, baineadh úsáid as stoic chillín a ritheadh ​​sé huaire nó níos lú le haghaidh gach turgnaimh.

Cheadaigh an Coiste um Chúram agus Úsáid Ainmhithe in Ollscoil Kentucky Thoir nó Ollscoil Achadh an Iúir do thurgnaimh a bhain le cultúir phríomha néaróin báúil. Scaipeadh ganglia ceirbheacsach uachtarach ó lucha an lae iarbhreithe 0–6 C56Bl/6, gortha ag 37 céim i maolán díthiomsaithe einsímeach, agus nite le meáin fáis chun einsímí próitéalaíocha agus triturated a bhaint.

Plátáladh crochta cealla ag dlús 7000 cill in aghaidh an tobair i sleamhnáin ocht dtobar Lab Tek II. Athraíodh na meáin ag lá in vitro (DIV) 1, agus athraíodh na meáin ina dhiaidh sin gach lá eile. Forlíontar na meáin le cytosine arabinofuranoside (Ara-C, Millipore-Sigma) ar DIV1-DIV3 chun fás na gcealla neamh-néarónacha a chosc, agus ina dhiaidh sin baintear Ara-C ó na meáin ar feadh 24 h ar a laghad roimh chóireáil mar a léiríodh. Le haghaidh turgnaimh a rinneadh in Ollscoil East Kentucky a bhaineann le cóireáil sárocsaíd hidrigine, brataíodh na sleamhnáin seomra le 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, catalóg #P3655), 2 mg/ml fibronectin, 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, catalóg #P7280) agus 10 mg/ml laminín (Corning, catalóg #354232) roimh úsáid, agus rinneadh díthiomsú trí 30-nóiméad gor i maolán comhdhéanta de DMEM (ThermoFisher, catalóg #11960- 044) ina raibh 0.025% trypsin (Corning Life Sciences, catalóg #25-053-CI) agus 0.3% collagenase (Worthington Bithcheimiceach, catalóg #LS004176).

Is éard a bhí sna meáin fáis do thurgnaimh dá leithéid DMEM arna fhorlíonadh le séiream bó féatais 10% (Invitrogen, catalóg #26140-079), 2 mM L-glutamine (Corning, catalóg #25-005-CI), agus 40 ng/ml fachtóir fáis nerve (Fisher Scientific, catalóg #13-257-019); Baineadh úsáid as 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) chun cealla neamhneuronal a bhaint.

I gcás turgnaimh a rinneadh in Ollscoil Virginia a bhain le tarraingt siar NGF, plátáladh cealla ar shleamhnáin seomra a bhí brataithe le 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) agus 10 mg/ml laminin (Invitrogen), agus rinneadh díthiomsú trí {{2}nim. gor i maolán comhdhéanta de DMEM/F12 ina bhfuil BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), cineál collagenase 2 (4 mg/ml, Worthington Bithcheimiceach), deoxyribonuclease 1 (Millipore Sigma), agus hyaluronidase (Sigma-Aldrich). Is éard a bhí sna meáin fáis do thurgnaimh den sórt sin DMEM arna fhorlíonadh le séiream bó féatais 10% (Invitrogen), 1 U/ml peinicillin/streiptimícin (Invitrogen), agus 45 ng/ml de NGF (íonaithe ó faireoga salivary); Baineadh úsáid as 10 mM Ara-C chun cealla neamhnéarónacha a bhaint.

Cóireálacha cille

Nochtadh cealla LUHMES difreáilte do na tiúchain shonraithe de {{{0}}hiodrocsadopamine (6-OHDA; Sigma-Aldrich, catalóg #162957) nó tuaslagán feithicle ar a gcúigiú lá sa mheán difreála. Ullmhaíodh stoic de 6- OHDA i PBS fuaraithe ina raibh 0.02% ascorbate (Sigma-Aldrich, catalóg #A5960), agus coinníodh slánchodanna i vials solas-chosanta faoi ghás támh ag 80 céim . Tar éis 24 h de chóireáil, socraíodh na cealla trí gor i PBS ina raibh 4% paraformaildéad (PFA) ar feadh 25 nóiméad ag teocht an tseomra.

Chun ról c-Meitheamh N-críochfort kinase (JNK) i díghiniúint néaraíoch a tharlódh de bharr strus ocsaídiúcháin a chinneadh, rinneadh réamhchóireáil ar chultúir ar feadh 1 h le 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, catalóg #S5567) nó réiteach feithicle roimh athsholáthar iomlán na meán le meáin a bhfuil 7.5 mM 6-OHDA, 7.5 mM 6-OHDA agus 10 mM SP600125, nó réitigh feithicle iontu. Ullmhaíodh stoic SP600125 tríd an inhibitor a thuaslagadh i dimethylsulfoxide steiriúil (DMSO), agus stóráiltear slánchodanna reoite i vials cosanta solais a líonadh le gás támh ag 20 céim . Rinneadh cóireálacha ionas nach raibh cealla níos mó ná 0.1% DMSO.

Cóireáladh cultúir phríomha néaróin báúil ar DIV5. I gcás turgnaimh a bhaineann le díghiniúint néaróideach arna tharlú ag sárocsaíd hidrigine, nochtadh na saothráin do shárocsaíd hidrigine 500 mM (Sigma-Aldrich, catalóg #H1009-100ML) nó tuaslagán feithicle ina raibh uisce steiriúil (Cytiva, catalóg #SH30529.02) ar feadh 24 h.

I gcás turgnaimh a bhain le tarraingt siar NGF, fuair cultúir SCG ceachtar athchur meáin le meáin fáis nó cuireadh faoi réir díothachta NGF iad. Rinneadh cultúir SCG a bhaint de NGF a rinsiú trí huaire le meáin fáis saor ó NGF agus ansin goraíodh iad i meáin fáis saor ó NGF ar feadh 80 h gan athruithe sna meáin. Tar éis cóireála, socraíodh na cealla trí gor i 4% PFA i PBS ar feadh 30 nóiméad, agus ina dhiaidh sin baineadh an PFA trí sruthlú le PBS.

Micreascópacht staining agus fluaraiseachta

Le haghaidh turgnaimh le cealla LUHMES, chomh maith leis na turgnaimh a bhain le néaróin báúil a cóireáladh le sárocsaíd hidrigine, rinneadh tréscaoilteacht ar shleamhnáin ocht dtobar ina raibh cealla fosaithe le 0.1% Triton X-100 i PBS agus cuireadh bac orthu le haghaidh 1 h le 10% gnáthshéiream gabhar i PBS ina bhfuil 0.1% Triton X-100. Ansin goradh na sleamhnáin le príomh-antasubstaint a bhí sonrach do b I tubulin (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) i dtuaslagán blocála ag 4 chéim thar oíche. Ina dhiaidh sin, nite na sleamhnáin le PBS, gortha le antasubstaint thánaisteach i dteannta le Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) ar feadh 90 nóiméad ag teocht an tseomra, agus cuireadh faoi réir nite breise.

I gcás turgnaimh a bhain le staining tyrosine hydroxylase (TH), cuireadh na sleamhnáin faoi gor breise i PBS ina raibh 10% gnáthshéiream gabhar, 0.1% Triton X-100, antashubstaint sonrach do TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) ag 4 céim thar oíche. Ansin nite na sleamhnáin le PBS, gortha iad le hantasubstaint thánaisteach i dteannta Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889), agus cuireadh faoi réir nite breise PBS.

Tar éis lipéadú imdhíon-lipéadaithe do b III-tubulin nó TH a thabhairt chun críche, goradh sleamhnáin le 5 mg/ml 49, 69-diamidino-2-phenylindole (DAPI; catalóg #D9542) i PBS ar feadh 5 nóiméad. Ansin nite na sleamhnáin le PBS, agus gléasadh na clúdaigh chlúdaigh le meán gléasta Fluoromount G (Southern Biotech, catalóg #0100-01).

I gcás turgnaimh a bhain le néaróin báúil a bhí faoi réir tarraingt siar NGF, cuireadh bac ar na sleamhnáin ar feadh 1 h trí gor ag teocht an tseomra i maolán ina raibh 5% de ghnáthshéiream gabhar (Teicneolaíochtaí Beatha) agus 0.0005% Triton X-100 i PBS, agus ina dhiaidh sin goir i dtuaslagán antashubstainte príomhúil ina bhfuil frith-luch Tuj1 (1:1000, Covance) thar oíche ag 4 céim . Ina dhiaidh sin, rinsíodh na sleamhnáin le PBS, goraíodh iad ar feadh 1 h in IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) agus 0.1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) i maolán blocála, faoi réir rinsí breise PBS, agus ceadaíodh iad. a thriomú. Suiteáladh na sleamhnáin le Fluoromount-G (Southern Biotech, catalóg #0100-01) agus stóráiltear iad ag teocht an tseomra.

Rinneadh sleamhnáin ina raibh cealla LUHMES a léirshamhlú le 20 cuspóir de Chóras Mhicreascóip Inbhéartaithe Ti-U Nikon Eclipse II le foinse solais LED de chuid Lumencor Mira 4-Cainéal LED. 1280 1024-Gabhadh íomhánna picteilín le Ceamara CCD 5 MP Nikon DSQi1Mc agus NIS Elements 3.22.15 (Tóg 738). Ach amháin i gcás ina gcuirtear a mhalairt in iúl, gabhadh gach íomhá codarsnachta céimnigh ag baint úsáide as socruithe déine solais agus am nochta a tháirg meándéine cúlra de 165 in 8-íomhánna giotán.

Chun scáthú cúlra nó neamhréireachtaí eile a laghdú, roimh gach seisiún micreascópachta, gabhadh íomhá de tobar folamh agus úsáideadh é le haghaidh ceartú cúlra le linn íomháú cille LUHMES. Rinneadh íomhánna ina raibh néaróin báúil a saothraíodh in Ollscoil Kentucky Thoir nó Ollscoil Achadh an Iúir ag úsáid córas micreascóp Zeiss LSM 800 nó córas micreascóp Zeiss LSM 980, faoi seach. Gabhadh íomhánna ag formhéadú 20 agus taifeach 1024 1024 ag baint úsáide as bogearraí Zen (Carl Zeiss Microscopy).

Anailís inmharthanachta cille

Bunaíodh cultúir dhifreáilte LUHMES ar shleamhnáin seomra ocht dtobar Lab Tek II a bhí brataithe mar a léirítear le foshraitheanna éagsúla. Rinneadh athrú meáin 50% gach 48 uair an chloig, agus socraíodh na cealla le 4% PFA i PBS ar an séú lá de dhifreáil. Rinneadh sleamhnáin ina raibh cealla fosaithe a smálú le DAPI, agus gabhadh íomhánna de ruaimniú núicléach le Córas Mhicreascóip Inbhéartaithe Ti-U Nikon Eclipse II agus Ceamara Nikon DS-Fi1 5 MP CCD.

Scóráil imscrúdaitheoir dalláilte na cealla a bheith sláintiúil nó míshláintiúil bunaithe ar chuma na núicléas. Scóráladh cealla le hachar núicléach laghdaithe nó ilroinnt núicléach mar mhíshláintiúil. Scóráladh líon na gceall sláintiúil in aghaidh an íomhá ar a laghad cúig réimse radhairc in aghaidh an choinníll i ngach turgnamh.

Tomhais DI

Rinneadh tomhais traidisiúnta DI trí úsáid a bhaint as pacáiste Fiji Is Just ImageJ (FIJI) ina raibh ImageJ 1.52p trí mhodh a bhaineann le paraiméadair a luadh go forleathan le haghaidh anailíse DI (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin agus Cho, 2020). Rinneadh íomhánna ocht ngiotán de chealla LUHMES difreáilte le tracts axon dea-scartha faoi dhénárú ag baint úsáide as an algartam dénárthaigh réamhshocraithe, le roghanna dénártha cumraithe chun íomhá a tháirgeadh le cealla dubha sa tulra agus cúlra bán.

Baineadh úsáid as an uirlis líníochta saorláimhe chun gach réigiún íomhá a raibh cealla cealla iontu a rianú de láimh, agus aistríodh gach picteilín dubh go bán sna réigiúin rianaithe. Cuireadh an uirlis Tomhais de ImageJ i bhfeidhm chun achar iomlán dubh na n-íomhánna dénártha a thomhas go heisiach le neurites. Cuireadh an uirlis Analyze Particle i bhfeidhm ansin ag baint úsáide as socrú méide de 20–10,000 picteilín agus socrú ciorcaireachta 0.2–1.0 chun blúirí néarachta a bhrath. Roinneadh ansin achar achoimrithe na blúirí néarít go léir ar an limistéar iomlán dubh chun DI na híomhá a ríomh.

I gcás turgnaimh a bhaineann le paraiméadair mhéide a bharrfheabhsú chun blúirí néaráite a shainaithint, baineadh úsáid as critéir chiorcláin {{0}}.2–1.00 le haghaidh gach tomhas cáithníní. Fuarthas an breiseán Particle Remover (leagan 20{{10} 4/02/09), arna fhorbairt ag Wayne Rasband, ó https:// imagej.nih.gov/. Nuair a léiríodh, rinneadh an breiseán Remover Particle a chur i bhfeidhm ag baint úsáide as paraiméadair mhéide 0–9 picteilín agus paraiméadair ciorcaireachta 0.0–1.0 chun réada beaga neamhnéaracha a bhaint as íomhánna dénártha a fuarthas ó mhicreagraif codarsnachta céime.

Mar an gcéanna, baineadh úsáid as paraiméadair méide de {{0}}–4 picteilín agus paraiméadair ciorcaireachta de 0–1.0 chun rudaí beaga a bhaint as íomhánna dénártha a fuarthas ó mhicreagraif fhluaraiseachta arb ionann iad agus imdhíonadh tubúin b III. Mura gcuirtear a mhalairt in iúl, roimh anailís DI cuireadh na híomhánna codarsnachta céime go léir faoi fheabhsú codarsnachta trí úsáid a bhaint as ImageJ chun Tábla Cuardaigh (LUT) a chur i bhfeidhm le híosmhéid 90 agus uasmhéid de 205.

Ilroinnt shaorga a thomhas

Socraíodh cultúir ina raibh cealla sláintiúla LUHMES le 4% PFA ar a séú lá difreála agus lipéadaithe imdhíon-lipéadaithe le haghaidh b III-tubulin. Ag baint úsáide as cuspóir 20, gabhadh 1280 1024-micreagraif codarsnachta phas-picteilín agus micreagraif fhluaraiseachta, gach ceann acu ag léiriú réimsí comhionanna radhairc, ó réigiúin a ndearnadh sampláil randamach orthu. Gabhadh deich sraith íomhánna ó naoi gcultúr ar leith.

Baineadh úsáid as ImageJ chun cóipeanna dénártha de na micreagraif codarsnachta céime agus fluaraiseachta bunaidh a ghiniúint, chomh maith le cóipeanna de mhicreagraif codarsnachta pas-chodarsnachta a bhí binarized tar éis feabhsú codarsnachta trí LUT a chur i bhfeidhm le híosmhéid 90 agus uasmhéid de 205. I gcás gach tacair Maidir le híomhánna, d'aithin imscrúdaitheoir dallta réigiún beag, 150 150-picteilín den bhunmhicreagraf codarsnachta pas-chodarsnachta a raibh néaragraf slán agus sláintiúil amháin ann.

Stóráladh méid an réigiúin agus na comhordanáidí ansin i mbainisteoir an réigiúin leasa (ROI) de ImageJ agus úsáideadh iad chun tomhais DI a dhéanamh i réigiúin ar aon dul le híomhánna dénártha ón tacar íomhá céanna. Rinneadh na tomhais DI trí úsáid a bhaint as an modh traidisiúnta ina raibh paraiméadair mhéid blúirí de 20 -10,000 picteilín. Ós rud é go raibh néaróin slán go heisiach i ngach réigiún a tomhaiseadh, measadh gur blúirí saorga iad aon bhlúirí a braitheadh.

ANDI Macra

Scríobhadh Macra ANDI ag baint úsáide as teanga ImageJ Macro. Tá sraith oibríochtaí sa mhacra a chuireann ar chumas an úsáideora cosáin a roghnú le haghaidh trí eolairí, eolaire amháin ina bhfuil íomhánna de néaróin atá imdhíon-lipéadaithe le haghaidh marcóir néarónach mar b III-tubulin, an dara eolaire ina bhfuil íomhánna comhfhreagracha a thaispeánann staining núicléach, agus an tríú eolaire. ainmnithe chun comhaid toraidh a shábháil. Ríomhtar ansin na limistéir ilroinnte agus na réimsí iomlána neorite de na híomhánna sna heolairí roghnaithe trí shraith oibríochtaí ImageJ. Go hachomair, osclaítear íomhá a thaispeánann lipéadú núicléach, faoi réir feabhsaithe codarsnachta, agus déantar é a dhénártha. Úsáidtear an breiseán remover cáithníní chun déantáin bheaga neamhnúicléacha a bhaint as an íomhá dhénártha, agus tá an íomhá dhénártha faoi réir sraith dilations agus creimeadh.

Osclaítear íomhá chomhfhreagrach de chealla atá imdhíon-lipéadaithe le haghaidh b III-tubulin (nó marcóir néarónach eile) agus cuirtear faoi réir feabhsú codarsnachta. Ansin déantar an íomhá dhénártha a thaispeánann núicléis na gceall méadaithe a dhealú ón íomhá ina bhfuil cealla imdhíon-lipéadaithe le haghaidh b III-tubulin, rud a ghineann íomhá ina bhfuil néaráití amháin. Déantar an íomhá neurite a dhénárú ansin agus baintear na cáithníní idir 0 agus 4 picteilín léi. Ríomhtar limistéar blúirí Neurite tríd an algartam Analyze Particle a chur i bhfeidhm chun cáithníní a thomhas a bhfuil ciorclán idir 0.2 agus 1.0 acu agus méid idir 5 agus 10,0000 picteilín acu. Ríomhtar an t-achar iomlán neurite tríd an uirlis Tomhais a chur i bhfeidhm chun an limistéar iomlán dubh a ríomh. Déantar íomhá a thaispeánann an limistéar neorite dénártha le blúirí aibhsithe a shábháil chuig eolaire arna n-ainmniú ag an úsáideoir, mar aon le comhaid .csv a thuairiscíonn an limistéar ilroinnte néarít agus tomhais iomlán an limistéir néaráit.

I dteannta leis na hoibríochtaí thuasluaite, tá roinnt oibríochtaí breise san áireamh sa mhacra chun tacú le héascaíocht úsáide agus chun teorainn a chur le hearráidí úsáideoirí. Ina measc seo tá feidhmeanna a bhaintear faisnéis scála ó íomhánna agus a chinntíonn go bhfaightear tomhais in aonaid picteilín; socruithe dath ImageJ agus roghanna dénártha a chumrú le haghaidh dealú íomhá cuí agus dénártha; a fhíorú go bhfuil líon comhionann íomhánna sna heolairí roghnaithe d’íomhánna de smálú b III-tubulin agus de ruaimniú DAPI; íomhánna a úsáideadh roimhe seo a dhúnadh chun am próiseála a fheabhsú; torthaí soiléire ó anailísí roimhe seo sula ndéantar anailísí nua; agus cosc ​​a chur ar earráidí a bhaineann le cruthú comhaid .ini le Windows 10.

I gcás turgnaimh a bhain le hanailísí ar néaróin báúil, athbhreithníodh Macra ANDI chun oibríocht a chur i láthair a chuireann bosca dialóige i láthair a chuireann ar chumas an úsáideora an líon uaireanta a chaolófar íomhánna dénártha de núicléis a rialú. Tugadh ANDI v1.1 ar an leagan de ANDI ina bhfuil an t-athbhreithniú seo. Má dhéantar an luach sa bhosca dialóige a athrú go huimhir níos airde méadaítear an méid bainte soma agus laghdaítear méid bainte soma nuair a athraítear an luach go huimhir níos ísle. Is é 12 an luach réamhshocraithe, is é sin líon na dilations a úsáidtear do gach turgnamh a bhaineann le cealla LUHMES. Baineadh úsáid as luach 16 chun réigiúin cille níos mó a bhaint le linn anailísí ar néaróin báúil.

Is foinse oscailte é Macra ANDI agus tá sé ar fáil saor in aisce le húsáid nó le modhnú tríd an URL seo a leanas: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Fíoraíodh oibriú cruinn ANDI trí úsáid a bhaint as ríomhairí pearsanta iolracha ar a bhfuil córas oibriúcháin Windows 10. Tá tacar íomhá ina bhfuil cultúir chill LUHMES a thaispeánann céimeanna éagsúla díghiniúna néaráite ar fáil freisin ag an seoladh gréasáin thuasluaite agus is féidir é a úsáid chun imscrúdú a dhéanamh ar fheidhmiú cruinn an mhacra ag cineálacha eile ríomhairí. Soláthraíonn an seoladh gréasáin rochtain freisin ar phrótacal a chuireann síos ar conas an macra a úsáid.

Meastacháin ama

Chun an t-am a theastaíonn chun tomhais DI a dhéanamh de láimh a mheas, ba cheart micreagraif codarsnachta phasacha a thaispeánann cealla LUHMES a cóireáladh le tuaslagán feithicle, 2.5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA, nó 7.5 mM 6-Cuireadh OHDA faoi réir scórála DI trí úsáid a bhaint as modhanna a bhí bunaithe cheana (Kraemer et al., 2014). Cuireadh feabhsú codarsnachta agus binarization ar gach íomhá. Baineadh úsáid as an uirlis saorláimhe de ImageJ ansin chun gach cille a léirítear a bhaint de na híomhánna dénártha go digiteach. Baineadh úsáid as an uirlis Analyze Particle chun blúirí a thomhas le ciorclán idir 0.2 agus 1.0 agus méid idir 20 agus 10,000 picteilín, agus úsáideadh an uirlis Tomhais chun an t-achar néarít iomlán a chinneadh.

Aistríodh luachanna faoi limistéar ilroinnte neurite agus limistéar iomlán néarít chuig scarbhileog i Microsoft Excel, agus úsáideadh oibríocht matamaitice in Excel chun na scóir DI a ríomh. Tar éis íomhá a oscailt le ImageJ, tomhaiseadh an t-am a theastaíonn chun gach ceann de na nósanna imeachta seo a dhéanamh de láimh. Ríomhadh meán-amanna anailíse ó 36 íomhá iomlán. Fuarthas na híomhánna ó naoi n-ullmhúchán neamhspleách cultúir cille, agus rinneadh anailísí ag baint úsáide as íomhá amháin in aghaidh an choinníoll cóireála ó gach ullmhúchán cultúir cille. Chun luas na dtomhas DI a dhéantar ag baint úsáide as Macra ANDI a chinneadh, baineadh úsáid as na tacair íomhá céanna chun an t-am a theastaíonn chun an macra a oscailt in ImageJ a chinneadh, na hoibríochtaí macra a rith, na sonraí a aistriú chuig scarbhileog Excel, agus an DI a ríomh.

Staitisticí

Cuirtear comparáidí cainníochtúla i láthair mar cheapacha bosca agus guairneáin, áit a seasann an lárlíne don airmheán, síneann boscaí go dtí an 25ú agus 75ú peircintíl, agus léiríonn guairneáin an 5ú agus an 95ú peircintíl. Cuireadh modhanna i gcomparáid go staitistiúil i GraphPad Prism 9.1.2 trí bhearta arís agus arís eile ANOVA le comparáidí post hoc ag baint úsáide as ceartúchán Sidák. Tástáladh normalacht do shonraí cainníochtúla ag baint úsáide as an tástáil Shapiro-Wilk in IBM SPSS 26.

Nuair a sháraigh an toimhde na normáltachta (Figs. 1 C, 3D), rinneadh comparáidí grúpa tríd an tástáil Friedman nonparametric le tástáil Dunn a dhéantar le haghaidh post hoc comparáidí. Léirítear anailísí comhghaolmhara mar scatterplots agus áirítear leo línte an oiriúnaithe is fearr. Rinneadh anailís ar chaidrimh den sórt sin trí leas a bhaint as comhghaolú nóiméad táirge Pearson nó r Spearman nuair a sáraíodh toimhde na normáltachta. Rinneadh normalacht na n-iarmharach le haghaidh anailíse comhghaolmhaireachta a mheas trí iniúchadh amhairc ar na ceapacha QQ comhfhreagracha.

Cuireadh comhéifeachtaí comhghaolaithe nóiméad táirge Pearson i gcomparáid lena chéile trí úsáid a bhaint as z-tástáil asymptotic Steiger (Steiger, 1980; Lee and Preacher, 2013). Ní raibh aon asluiteach as an áireamh. Glacadh le tábhacht staitistiúil ag lch, 0.05. Slánaítear luachanna P go dtí ceithre ionad dheachúlacha agus tuairiscítear iad tríd an bpríomhthéacs. Tuairiscítear freisin méideanna éifeacht agus eatraimh muiníne 95% le haghaidh anailísí paraiméadracha, agus déantar cur síos ar mhéideanna na n-éifeachtaí tríd an bpríomhthéacs agus na heatraimh muiníne atá liostaithe i dTábla 1.

Infhaighteacht sonraí

Roinnfear sonraí breise faoin alt seo ar iarratas réasúnach.

Inrochtaineacht cód

Tá an cód/bogearraí a bhfuil cur síos orthu sa pháipéar ar fáil saor in aisce ar líne ag https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Tá an cód ar fáil mar Shonraí Breisithe 1 .

For more information:1950477648nn@gmail.com