Leithlisiú Ullmhúcháin agus Íonú Ceithre Chomhdhúil ó Chistíní Deserticola YC Ma Trí Chrómatagrafaíocht Frith-Reatha Ardluais

1. Réamhrá

Cistanches deserticolaYC Ma, speiceas deCistéisea bhaineann leis anOrobanchaceaeteaghlaigh, is maith ar a dtugtar Leigheas Sínis Traidisiúnta chun cóireáil a dhéanamh ar easnamh duáin, infertility baineann, leocorrhea galrach, neurapraxia, agus constipation senile [1]. Is planda seadánacha é a dháileadh go forleathan in iarthuaisceart na Síne. Go dtí seo, roinnt comhdhúile, lena n-áiríteargliocóisídí feinileatánóideach (PhGs), iridoids, agus lignans scoite amach ón speiceas seo [2]. Tuairiscíodh go bhfuil gníomhaíochtaí frithocsaídeacha, hepatoprotective agus neuroprotective ag cuid de na PhGanna [3-6]. Mar sin féin, tá nós imeachta leithlisithe agus íonúcháin PhG deacair agus Tógann am. Thairis sin, ní hamháin go n-úsáideann modhanna crómatagrafacha iolracha clasaiceacha méid mór tuaslagóirí orgánacha ach tugann siad aisghabháil sampla níos ísle freisin. Cuireann crómatagrafaíocht fhrithshrutha ardluais (HSCCC), teicníocht chromatagrafaíochta deighilte leachtach-leachtach saor ó thacaíocht, aisghabháil samplach den scoth ar fáil i gcomparáid le roinnt modhanna traidisiúnta agus baineadh úsáid as go forleathan chun táirgí nádúrtha éagsúla a scaradh agus a íonú [7–9]. . Cé go bhfuil roinnt PhG íonaithe óCistéiseghéineas agus cinn eile de réir HSCCC [10–14], níor thuairiscigh aon pháipéar íonú acteóisíd, isoacteoside, syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside agus 2'-acetylacteoside i gcóras déphasic amháin.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sa pháipéar seo, tuairiscímid modh simplí chun ceithre PhG ó C. deserticola a dheighilt agus a íonú. Mar fhocal scoir, fuarthas 30.9 mg acteoside, 13.0 mg isoacteoside, 12.5 mg de syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside agus 7.2 mg de 2'-acetylacteoside i scaradh aon-chéim. ó 297 mg de chodán le íonachtaí de 99%, 95%, 99%, agus 98%, faoi seach. Bhí tréithe a struchtúir bunaithe ar shonraí speictreach 1 H- agus 13C-NMR agus speictream HR-MS. Tá struchtúir na gceithre PhG a aithníodh san imscrúdú seo léirithe i bhFíor 1.

2. Torthaí agus Plé

2.1. Anailís HPLC ar an Sliocht Amh

Rinne HPLC-UV anailís ar an gcodán saibhrithe comhábhar den sliocht n-butanol ó C. deserticola. Ba é an colún a úsáideadh ná Accurasil C18 (250 mm × 4.6 mm, id 5 μm) (Ionstraimí Eolaíoch Thermo-Fisher, cathair, stát abbrev, SAM), ba é meatánól-uisce an chéim shoghluaiste (30:70, v/v). Ba é an ráta sreafa ná 1 mL/nóim. Socraíodh tonnfhad an bhrathadóra ag 254 nm. Taispeántar an crómatagram HPLC i bhFíor 2. Comhfhreagraíonn beanna 1 go 4 d'aicéatóisíd (1), isoacteoside (2), syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside (3) agus 2'-acetylacteoside (4), faoi seach .

2.2. Roghnú Córas Tuaslagóirí Dhá Phas

Braitheann scaradh rathúil HSCCC go mór ar roghnú córas tuaslagóra dhá phas oiriúnach, roghnaíodh an córas tuaslagóir dhá chéim de réir luachanna comhéifeachta deighilte (K) de gach comhpháirt sprice agus ba cheart go mbeadh an raon K optamaithe ó {{ 2}}.5 go 2.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN DÍOLÚINE A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sa turgnamh, taispeántar na luachanna K do chomhpháirteanna sprice de roinnt córas tuaslagóirí dhá phas i dTábla 1 (cé go raibh na torthaí beagán níos airde do bhuaic 4, léirithe a bheith inghlactha). Ina measc, thug aicéatáit eitile–n-butanol–eatánól-uisce (40:6:6:50, v/v/v/v) comhéifeachtaí deighilte oiriúnacha do na sprioc-chomhdhúile. Faoi dheireadh, baineadh úsáid as an gcóras tuaslagóra comhdhéanta d’aicéatáit eitile–n-butanol– uisce-eatánól (40:6:6:50, v/v/v/v) chun ceithre chomhdhúil de C. deserticola a leithlisiú agus a íonú, mar a thaispeántar in Fíor 3. Mar a léirítear i bhFíor 2, léirigh anailís HPLC ar gach codán HSCCC go raibh ceithre PhG íona (acteoside, 99%; isoacteoside, 95%; syringalide A 3′- -L-rhamnopyranoside 99% agus 2′- d’fhéadfaí aicéitilacteoside 98%) a fháil ón gcodán amh.

3. Turgnamhach

3.1. Fearas An HSCCC

Ba é an trealamh a úsáideadh sa staidéar seo ná córas crómatagrafaíocht fhrithshrutha ardluais TBE (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, China) le trí cholún deighilte corna ilchisealacha ullmhaithe i sraith (trastomhas as feadán=2.6 mm, toirt iomlán=300 mL) agus lúb samplach 2{{10}} mL. Ba é 5 cm an ga réabhlóide nó an fad idir ais an tsealbhóra agus ais lárnach an lártheifneora (R), agus bhí an luach éagsúil ó 0.5 ag an teirminéal inmheánach go 0.8 ag an teirminéal seachtrach (=r/R, áit a raibh Is é r an fad ón gcorna go dtí seafta an tsealbhóra). Baineadh úsáid as feidhmchlár cúrsaíochta teocht tairiseach HX 105 (Cuideachta Ionstraim Beijing Changliu Lab, Beijing, an tSín) chun teocht a rialú sa turgnamh. Bhí córas HSCCC feistithe le samhail-chaidéal sreafa tairiseach brú lár-TBP, samhail-bhrath TBP{-2000 ag feidhmiú ag 254 nm, agus samhail-stáisiún oibre V4.0 (Ionstraim Bithcheimice Jinda). Cuideachta, Shanghai, An tSín).

Ba é an trealamh crómatagrafaíocht leachtach ardfheidhmíochta (HPLC) a úsáideadh córas Agilent 1200 atá comhdhéanta de chaidéal dénártha G1312A, autosampler G1329A, brathadóir tonnfhad athraitheach G1314A (VWD), urrann colún teirmeastat G1316A, stáisiún oibre G1379B degassessler agus G1379B. . Baineadh úsáid as alltech 3300 ELSD chun na híonachtaí a bhrath. Úsáideadh speictriméadar Agilent 6520 Q-TOF agus Bruker AVANCE III 500-NMR le haghaidh sainaithint struchtúrach na gcomhdhúile. Tomhaiseadh speictream 1 H agus 13C-NMR (ag 500 agus 125 MHz, faoi seach) ag teocht an tseomra (22 céim /295.1 K).

3.2. Imoibrithe agus Ábhair

Bhí aicéatáit eitile, n-butanol, agus eatánól grád anailíseach agus meatánól grád HPLC. Ceannaíodh na tuaslagóirí go léir ó Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, an tSín). Baineadh úsáid as uisce Milli-Q (18.2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, SAM) do gach réiteach agus caolú. Bailíodh an rhizome de C. deserticola ó Chúige Istigh Mhongóil, Daon-Phoblacht na Síne, i mí an Mheithimh 2009. D'aithin an tOllamh Lijuan Zhang an gléasra, agus taisceadh eiseamal dearbhán (Uimh. 20091001) inár saotharlann.

3.3. Ullmhú Samplach Amh

Rinneadh gais méithe púdaraithe aer-triomaithe de C. deserticola (1 Kg) a aife faoi dhó le eatánól uiscí (8 L, 60% v/v) ar feadh 2 u gach uair. Galú an sliocht faoi bhrú laghdaithe agus ag teocht 60 céim go dtí galú iomlán an eatánóil. Cuireadh an t-iarmhar ar fionraí in uisce agus baineadh é trí huaire as a chéile le clóraform, aicéatáit eitile, agus n-butanol, rud a thugann 5.16 g de úsc n-butanol tar éis galú go triomacht faoi bhrú laghdaithe. Scaradh an t-eastósc n-bhútanóch ansin ar cholún glóthach shilice (200–300 mogall) ag baint úsáide as elution grádán forásach (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1) chun ocht gcodán a thabhairt. Baineadh úsáid as codán 6 (297 mg) le haghaidh leithlisiú agus scaradh breise HSCCC.

CÓGAIS NÁDÚRTHA CISTANCHE TUBULOSA CÓGAIS CHINEÁLACHA TRAIDISIÚNTA PHGS75% ECH 30% ACHT 12%

3.4. Roghnú na gCóras Dhá Chéim-Tuaslagóir

Roghnaíodh na córais tuaslagóirí dhá chéim de réir chomhéifeacht deighilte (K) de na comhpháirteanna sprice sa chodán de C. deserticola. Socraíodh na luachanna K le hanailís LC mar seo a leanas: Rinneadh méid oiriúnach de phúdar amhshleachta (codán 6) a thuaslagadh sa chéim íochtair den chóras tuaslagóra agus rinne HPLC anailís air. Taifeadadh limistéir na mbuaiceanna mar A1. Ansin cuireadh méid comhionann na céime uachtair leis an réiteach agus measctha go maith chun cothromaíocht deighilte a bhaint amach. Rinne HPLC anailís ar an gcéim íochtair arís ansin. Taifeadadh na buaiclimistéir deiridh mar A2. Ríomhadh na K-luachanna de réir na cothromóide seo a leanas: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Ullmhú Córas Dhá Chéim-Tuaslagóir agus Réiteach Samplach

Sa staidéar seo, baineadh úsáid as an gcóras tuaslagóra dhá chéim comhdhéanta d'aicéatáit eitile–n-butanol– uisce eatánól (40:6:6:50, v/v/v/v) le haghaidh scaradh HSCCC. Cuireadh gach tuaslagóir le tonnadóir deighilte agus rinneadh é a chothromú go críochnúil ag teocht an tseomra. Bhí an chéim uachtair agus an chéim íochtair scartha agus degassed ag sonication ar feadh 30 nóiméad go gairid roimh úsáid. Ullmhaíodh an réiteach samplach trí 297 mg de Chodán 6 a thuaslagadh i 15 ml den chéim íochtair d'aicéatáit eitile-n-butanol-eatánól-uisce (40:6:6:50, v/v/v/v).

3.6. Nós Imeachta Idirscartha HSCCC

Rinneadh HSCCC mar seo a leanas. Líonadh an colún coiled ilchiseal den chéad uair leis an gcéim sheasta orgánach uachtarach. Ansin rinneadh an chéim shoghluaiste uiscí níos ísle a phumpáil isteach i gceann ceann an cholúin ag ráta sreafa de 1.5 mL/nóim, agus ag an am céanna, ritheadh ​​an gaireas HSCCC ag luas réabhlóideach 900 rpm. Tar éis cothromaíocht hidridinimiciúil a bhunú, mar a léirítear le céim shoghluaiste soiléir ag eluting ag an asraon eireaball (thart ar dhá uair an chloig ina dhiaidh sin), cuireadh tuaslagán samplach 15 ml ina raibh 297 mg den sliocht amh (codán 6) tríd an gcomhla insteallta. Rinneadh monatóireacht leanúnach ar eisilteach an cholúin faoi 254 nm. Bailíodh ceithre bhuaicchodán de réir an chrómatagram agus galaithe ansin faoi bhrú laghdaithe. Socraíodh teocht an ghaireas ag 25 céim.

3.7. Anailís HPLC agus Aithint Bhuaicchodáin HSCCC

Rinne HPLC-ELSD anailís ar na codáin bhuaic ó HSCCC. Ba é an colún a úsáideadh ná Accurasil C18 (250 mm × 4.6 mm, id 5 μm), agus ba é meatánól-uisce an chéim shoghluaiste (30:70, v/v). Ba é an ráta sreafa ná 1 mL/nóim. Oibríodh ELSD faoi na coinníollacha seo a leanas: Teocht 45 céim , gás 1.6 L / min. Rinneadh sainaithint struchtúrach ar na ceithre bhuaicchodán HSCCC ag speictreascópacht HR-ESI-MS, 1 H, agus 13C-NMR.

3.8. An Aitheantas Struchtúrtha

Codán I: HR-ESI-MS breathnaíodh ag m/z 623.2001 (M−H)−, calcd do C29H35O15, 623.1981. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1.09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 de rhamnose), 2.79 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar- CH2-), 4.37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glúcóis), 5.18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} de rhamnose), 6.27 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7.59 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.1 (6H, aramatach H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131.5 (C-1), 117.2 (C-2), 146.2 (C-3), 144.7 (C-4) ), 116.4 (C-5), 121.3 (C-6), 72.4 (C- ), 36.6 (C- ), 127.7 (Caf-1), 115.3 (Caf{{89) }}), 146.9 (Caf-3), 149.8 (Caf-4), 116.6 (Caf-5), 123.2 (Caf-6), 168.3 (Caf-), 168.3 (Caf-), 114.8 (Caf- ), 148.1 (Caf- ), 104.3 (G-1), 76.1 (Glc-2), 81.7 (Glc-3), 70.5 (Glc-4) ), 76.3 (Glc-5), 62.4 (Glc-6), 103.1 (Rha-1), 72.3 (Rha-2), 72.1 (Rha-3) ), 73.9 (Rha-4), 70.7 (Rha-5), 18.5 (Rha-6). I gcomparáid leis na sonraí a thugtar sa litríocht [17], bhí codán I ag comhfhreagairt le haicéitóisíd.

Codán II: HR-ESI-MS breathnaíodh ag m/z 623.1987 (M−H)−, calcd do C29H35O15, 623.1981. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1.25 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 de rhamnose), 2.78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4.33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glúcóis), 5.17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 de rhamnose), 6.28 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7.56 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0 (6H, H aramatach). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131.5 (C-1), 117.2 (C-2), 146.2 (C-3), 144.7 (C-4) ), 116.5 (C-5), 121.3 (C-6), 72.4 (C- ), 36.7 (C- ), 127.8 (Caf-1), 115.2 (Caf{{89 }}), 146.8 (Caf-3), 149.7 (Caf-4), 116.6 (Caf-5), 123.2 (Caf-6), 169.2 (Caf-), 169.2 (Caf-), 115.0 (Caf- ), 147.3 (Caf- ), 104.5 (G-1), 75.5 (Glc-2), 84.2 (Glc-3), 70.1 (Glc-4) ), 75.7 (Glc-5), 64.7 (Glc-6), 102.8 (Rha-1), 72.4 (Rha-2), 72.4 (Rha-3 ), 74.1 (Rha-4), 70.5 (Rha-5), 17.9 (Rha-6). Bhí na sonraí speictreach 1 H-NMR agus 13C-NMR i gcomhaontú leo siúd de isoacteoside mar a tuairiscíodh sa litríocht [18].

Codán III: HR-ESI-MS breathnaithe ag m/z 6{{108}}7.2032 (M−H)−, cailcd do C29H35O14, 607.2032. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1.09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 de rhamnose), 2.84 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar- CH2-), 4.37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glúcóis), 5.19 (1H, d, J=1.5 Hz, H{ {35}} de rhamnose), 6.27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7.59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6.6–7.1 (7H, H aramatach). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 130.8 (C-1), 116.2 (C-2), 130.9 (C-3), 156.8 (C-4) ), 130.8 (C-5), 116.2 (C-6), 72.4 (C- ), 36.4 (C- ), 127.8 (Caf-1), 114.8 (Caf{{88) }}), 149.8 (Caf-3), 146.9 (Caf-4), 116.6 (Caf-5), 123.2 (Caf-6), 168.3 (Caf-), 168.3 (Caf-), 115.4 (Caf- ), 148.0 (Caf- ), 104.3 (G-1), 76.3 (Glc-2), 81.7 (Glc-3), 70.4 (Glc-4) ), 76.1 (Glc-5), 62.5 (Glc-6), 103.0 (Rha-1), 72.3 (Rha-2), 72.2 (Rha-3 ), 73.9 (Rha-4), 70.7 (Rha-5), 18.4 (Rha-6). De réir na litríochta [18], bhí codán III ag freagairt do syringalide A 3'{{{- -L-rhamnopyranoside).

Codán IV: HR-ESI-MS breathnaíodh ag m/z 665.21{{20}} (M−H)−, cailcd do C31H37O16, 665.2{087. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1.09 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 de rhamnose), 2.00 (3H, s, OAc), 2.72 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar-CH2-), 4.55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glúcóis), 4.90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 de rhamnose), 6.29 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7.62 (1H, d , J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0 (6H, H aramatach). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131.9 (C-1), 117.3 (C-2), 146.1 (C{-3), 144.7 (C-4) ), 116.4(C-5), 121.4 (C-6), 72.7 (C- ), 36.4 (C- ), 127.7 (Caf-1), 115.4 (Caf{{93) }}), 146.9 (Caf-3), 149.9 (Caf-4), 116.6 (Caf-5), 123.2 (Caf-6), 168.1 (Caf-), 168.1 (Caf-), 114.7 (Caf- ), 148.2 (Caf- ), 101.8 (G-1), 75.3 (Glc-2), 80.3 (Glc-3), 70.8 (Glc-4) ), 76.2 (Glc-5), 62.3 (Glc-6), 103.3 (Rha-1), 72.0 (Rha-2), 71.8 (Rha-3 ), 73.7 (Rha-4), 70.8 (Rha-5), 18.5 (Rha-6), 171.5 (C=O), 20.9 (OAC). Bhí na sonraí speictreach 1 H-NMR agus 13C-NMR ag teacht leo siúd de 2'-acetylacteoside [17].

4. Conclúidí

Bunaíodh modh HSCCC chun acteoside, isoacteoside, syringalide A 3'{{1}L-rhamnopyranoside agus 2'-acetylacteoside ó Cistanches deserticola YC Ma a dheighilt agus a íonú in ullmhúcháin ó Cistanches deserticola YC Ma. Léiríonn an staidéar reatha gur teicníocht an-chumhachtach é HSCCC chun comhpháirteanna bithghníomhacha ó ábhair phlandaí a scaradh agus a íonú in ullmhúcháin. Chomh maith leis sin, is féidir na comhdhúile a leithlisiú ar scála sách mór le íonachta arda agus féadfar iad a úsáid ansin mar shubstaintí tagartha do chrómatagrafaíocht nó staidéir bhithghníomhaíochta. Is teicníocht indéanta, eacnamaíoch agus éifeachtach é an modh chun táirgí nádúrtha casta a leithlisiú go tapa in ullmhúcháin.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN FEIDHM Gnéis A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%