Déanann Phloretin Néarathlasadh a Shochtadh Trí Ghníomhachtú Nrf2 Uathphagy-idirghabhála i Macrophages

Déan teagmháil le:tina.xiang@wecistanche.com

Teibí

Cúlra: Tá ról déach ag macrophages i neamhoird neuroinflammatory cosúil le scléaróis iolrach (MS). Bíonn baint acu le tosú an loit agus le dul chun cinn ach is féidir leo réiteach naathlasadhagus deisiú fíocháin damáiste. Sa staidéar seo, déanaimid imscrúdú ar cé acu agus conasphloretin, flavonoid atá i láthair go flúirseach in úlla agus sútha talún, íslíonn sé feinitíopa athlastach macrophages agus cuireann sé faoi choisnéar-athlasadh.

Modhanna: Rinneadh measúnú ar athruithe tras-scríofa i macraphages díorthaithe smeara luiche ar nochtadh phloretin trí sheicheamhú RNA ar an mórchóir. Deimhníodh bealaí bunúsacha a bhaineann le hathlasadh, freagairt ar strus ocsaídiúcháin, agus uathphagaíocht trí PCR cainníochtúla, measúnachtaí fluaraiseacha agus ionsúcháin, lucha cnagaireachta fachtóir 2 (Nrf2) fachtóir núicléach erythroid (Nrf2), blot thiar, agus imdhíonfluaraiseacht. Baineadh úsáid as an tsamhail turgnamhach einceifileapaite autoimmune (EAE) chun staidéar a dhéanamh ar thionchar phloretin ar néar-athlasadh in vivo agus meicníochtaí bunúsacha a dhearbhú.

Torthaí: Léirímid go laghdaíonn phloretin feinitíopa athlastach macrophages agus go gcuireann sé néara-athlasadh in EAE faoi chois go suntasach. Déanann Phloretin a éifeacht a idirghabháil trí chonair chomharthaíochta an Nr2 a ghníomhachtú. Cuireadh gníomhachtú Nrf2 i leith gníomhachtú kinase próitéin 5'AMP-gníomhachtaithe (AMPK) de autophagy agus díghrádú próitéin 1 (Keap1) a bhaineann le ECH a bhaineann le ceilpe ina dhiaidh sin.

Conclúidí: Osclaíonn an staidéar seo peirspictíochtaí amach anseo do phloretin mar straitéis theiripeach le haghaidh neamhoird néar-athlastacha ar nós MS.

Clárú trialach: Neamhbhainteach.

Eochairfhocail: Phloretin, Macrophages, Néar-athlasadh, Scléaróis Iolrach, Uathdhíonacht

Cliceáil anseo chun tuilleadh eolais a fhoghlaim

Cúlra

Is sainairíonna iad loit scléaróis iolrach gníomhach (MS) trí láithreacht iomadúlamacraphages[1-5]. Léirigh staidéir luatha go nglacann macrophages feinitíopa pro-athlastach i loit MS, rud a chuireann chun cinnnéar-athlasadh, demyelination, agus néar-mhíghiniúint. Áirítear le feidhmeanna éifeachtóra a chothaíonn galair cur i láthair antaiginí díorthaithe ón néarchóras lárnach (CNS) ar chealla T uath-imoibríocha agus táirgeadh idirghabhálaithe athlastacha amhail cítocíní réamh-athlastacha, speicis ocsaigine imoibríocha (ROS), agus ocsaíd nítreach (NO)[ 6,7]. Le déanaí, fuarthas amach go bhfuil feidhmeanna tairbhiúla ag macrófaigí i loit MS toisc gur féidir leo a bhfeinitíopa a athmhúnlú go ceann a bhaineann go hiondúil le himdhíon-shochtadh agus le deisiú CNS. Is sainairíonna é an feinitíopa cosanta seo ná táirgeadh laghdaithe idirghabhálaithe pro-athlastacha, táirgeadh idirghabhálaithe frith-athlastacha agus fachtóirí fáis, agus gníomhachtú bealaí frith-ocsaídiúcháin ar nós an erythroid fachtóir núicléach 2-conair fachtóir 2(Nrf2) a bhaineann le. [8-14]. Ós rud é go bhfuil stádas athlastach macrophages nasctha le dul chun cinn MS agus le forbairt loit ghníomhacha ainsealacha, meastar gur straitéis geallta é tiomáint macrophages chuig feinitíopa tairbheach chun dul chun cinn MS a theorannú [15].

Tiomáineann comhpháirteanna cothaitheacha feidhm macrophage agus neuroinflammation [16]. Go háirithe, táthar ag admháil níos mó go bhfuil comhdhúile geallta sa teaghlach flavonoids a mbíonn tionchar acu ar bhealaí pataigineacha agus a mhodhnaíonn feinitíopa na gceall imdhíonachta amhail macrophages[17,18]. Tá flavonoids ar cheann de na teaghlaigh fíteasaithe is mó ina bhfuil níos mó ná 8000 comhdhúil feanólacha le bithghníomhaíocht éagsúil. Léiríonn roinnt ball den teaghlach flavonoid éifeachtaí frith-athlastacha agus frith-ocsaídiúcháin ar mhacrophages [19-21]. Is ball de na dihydrochalcóin é an phloretin flavonoid agus tá sé i láthair i dtorthaí a chaitear go coitianta mar úlla agus sútha talún. Is eol go gcuireann Phloretin gnéithe inmunomodulatory i bhfeidhm agus úsáidtear go forleathan é le haghaidh cúram craicinn mar gheall ar a shaintréith frith-ocsaídiúcháin [22-24]. Thairis sin, is inhibitor iompróir glúcóis (GLUT) é phloretin, gné a théann i bhfeidhm ar fheinitíopa na macrophages ós rud é go bhfuil gníomhachtú macrophage á bhreosla ag GLUT [25, 26]. Tríd is tríd, déanann na tréithe seo comhdhúil a bhfuil tuar dóchais inti don phloretin chun feinitíopa macrophages agus néar-athlasadh a mhodhnú. Sa staidéar seo, léirímid go dtiomáineann phloretin macrophages i dtreo feinitíopa nach bhfuil chomh athlastach agus go maolaíonn sé néar-athlasadh sa mhúnla turgnamhach einceifileamóilíteas uath-imdhíonachta (EAE). D’aithin seicheamhú RNA agus turgnaimh fheidhmiúla an cosán Nrf2 mar mhol agus mar thiománaí don fheinitíopa macrophage cosanta seo a tharlódh de bharr phloretin. Fuarthas go raibh gníomhachtú an innealra uathphagy ag brath ar AMPK agus díghrádú Keapl (dá ngairtear p62 anseo feasta) trí mheán (dá ngairtear p62 anseo feasta) a éascaíonn díghrádú proteasomal Nrf2, mar bhonn le gníomhachtú Nrf2 i macraphages. Léiríonn na torthaí seo go bhfuil an poitéinseal ag phloretin a úsáid i straitéisí teiripeacha le haghaidh neamhoird néar-athlastach.

Modhanna

Antasubstaintí agus imoibrithe ceimiceacha

Phloretin(Sigma Aldrich) a thuaslagadh i 50 mM KOH go dtí tuaslagán stoic 15 mM agus é a stóráil ag -20 céim . Rinneadh tuilleadh caolúcháin i meán RPMI1640 (Gibco). Le cóireáil in vivo, tuaslagadh phloretin in 1 N NaOH, agus ina dhiaidh sin athchoigeartaíodh an pH go 7.2 le 1 N HCL, agus caolaíodh an tuaslagán a thuilleadh in uisce fiseolaíoch chun tiúchan 50 mg/kg a fháil. Cuireadh BML-275 (1 μM, Biteicneolaíocht Santa Cruz) leis 1 h roimh chóireáil phloretin chun gníomhachtú AMPK a chosc. Cuireadh Bafilomycin A1 (BAF, 0.1 μM, InvivoGen) leis 2 h roimh bhailiú chun bac a chur ar chomhleá autophagosomes agus lísisóm. Baineadh úsáid as Lipopolysaccharide (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) chun cealla a spreagadh le haghaidh feinitíopáil athlastach. Úsáideadh Phorbol 12-aicéatáit 13-mirístáit 13-(PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) chun táirgeadh ROS a spreagadh. Úsáideadh na hantasubstaintí seo a leanas le haghaidh blot an iarthair: frith-luch, - -actin (1:10,000; sc-47778, Santa Cruz Biteicneolaíocht), luch frith-GAPDH (1:{{29) }}; AB_2537659, Invitrogen), coinín frith-AMPK (1: 1000; 5831S, Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille), coinín frith-fosfarylated AMPK (1: 1000; 2535S, Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille), coinín frith-LC3 (1:1000; L7543, Sigma-Aldrich), coinín frith-p62(1:1000; 23214, Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille). Baineadh úsáid as na hantasubstaintí seo a leanas le haghaidh imdhíonfhluaraiseacht: francach frith-CD3(1:150; MCA500G, Bith-Rad), francach frith-F4/80(1:100; MCA497G, Bith-Rad), coinín frith-LC3(1:1000) ;L7543, Sigma-Aldrich), coinín frith-p62 (1:500; 23214, Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille), coinín anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), coinín frith-TMEM119(1 :100, ab209064, Abcam). Ceannaíodh antasubstaintí tánaisteacha cuí ó Invitrogen.

lucha

Ceannaíodh lucha de chineál fiáin (WT) C57BL/6JOlaHsd ó Envigo. Tugadh aiste bia rialta d’ainmhithe agus coinníodh iad i saoráid ainmhithe na hInstitiúide um Thaighde Bithleighis in Ollscoil Hasselt. Rinneadh na turgnaimh go léir de réir threoirlínte na n-institiúidí agus d'fhormheas coiste eiticiúil turgnaimh ainmhithe Ollscoil Hasselt iad.

Cultúr cille

Díorthaítear smearamacraphages(BMDManna) a leithlisiú ó lucha WT agus Nrf2 (KO) C57BL/6JOlaHsd, a ceannaíodh ó Envigo agus a chuir an RIEN BRC ar fáil de réir MTA don Ollamh S. Kerdine-Römer faoi seach [27,28]. Fuarthas BMDManna mar a thuairiscítear roimhe seo [29]. I mbeagán focal, saothraíodh cealla smeara tibial agus femoral ó 12-lucha seachtaine WT agus Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd i 10-phlátaí Petri cm ag tiúchan 10 × 106 cill/ pláta, i meán RPMI1640 arna fhorlíonadh le séiream lao féatais 10 faoin gcéad (FCS, Gibco), 50U/ml peinicillin (Invitro-gen), streiptimícíní 50 U/ml (Invitrogen), agus 15 faoin gcéad L929-meán coinníollaithe (LCM). ). Tar éis difreáil a dhéanamh, scoiteadh BMDManna ag 37 céim le EDTA 10 mM i PBS (Gibco) agus saothraíodh iad (0.5 × 10 cealla céime / ml) i RPM1640 arna fhorlíonadh le 10 faoin gcéad FCS, peinicillin 50U / ml, streiptimícin 50U / ml agus 5 faoin gcéad LCM ( 37 céim C,5 faoin gcéad CO2).Bhí cultúir Microglia scoite amach ó inchinn laonna iarbhreithe P1-3 C57BL/6/OlaHsd. Tar éis an gas inchinn, an plexus choroid, agus na meninges a bhaint, bhí na brains dissociated go meicniúil agus einsímeach díleáite ar feadh 15 nóiméad le 1 × trypsin (Gibco) ag 37 céim . Ina dhiaidh sin, síolaíodh an fionraí cille i DMEM meán ard-glúcóis (Sigma) arna fhorlíonadh le 30 faoin gcéad LCM, 10 faoin gcéad FCS, peinicillin 50U/ml, agus streiptimícin 50U/ml i bhfleascáin chultúir T75. Dhá go 3 lá ina dhiaidh sin, rinneadh meánathrú iomlán. Croitheadh ​​cultúir mheasctha glial (230rpm,3h, 37 céim) tar éis 6-7 lá chun cultúir íon microglia a fháil.

Seicheamhú RNA

Rinneadh réamhchóireáil ar chealla le phloretin (50 μM) ar feadh 20 h agus LPS-spreagtha (100 ng / ml) ar feadh 6 h. Rinneadh lysis cille ag baint úsáide as imoibrí Qiazol Lysis (Qiagen). Baineadh RNA as cealla ag baint úsáide as an trealamh mion RNeasy (Qiagen). Phróiseáil an Genomics Core Leuven (An Bheilg) samplaí ansin. Rinneadh ullmhúchán leabharlainne le trealamh QuantSeq Lexogen chun leabharlanna oiriúnacha Illumina a ghiniúint. Cuireadh leabharlanna in ord seicheamhaithe ar chóras seicheamhaithe Illumina HiSeq4000. Rinneadh ailíniú feasach ar splice le STAR v2.6.1b[30]. Rinneadh cainníochtú léamha in aghaidh na géine le HT-seq Count v2.7.14. Rinneadh anailís ar shloinneadh difreálach ar chomhaireamh le pacáiste Bithsheoltóra DESeq2 bunaithe ar R (Fondúireacht R don Ríomhaireacht Staitistiúil, Vín, an Ostair). Roghnaíodh liosta de ghéinte a cuireadh in iúl go difreálach ag ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Trascríobh droim ar ais cainníochtúil PCR

Rinneadh réamhchóireáil ar chealla le phloretin （50 μM) ar feadh 20 h agus spreag LPS (100 ng/ml) ar feadh 6 h. Rinneadh Lysis trí úsáid a bhaint as imoibrí Qiazol Lysis (Qiagen). Baineadh RNA ag baint úsáide as an trealamh mion RNeasy (Qiagen). Cinneadh tiúchan agus cáilíocht RNA le speictreafótaiméadar Nana-titim (Isogen Life Science). Rinneadh sintéis cDNA ag baint úsáide as Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) de réir threoracha an déantóra. Rinneadh qPCR ar chóras PCR Fíor-Ama StepOne-Plus (Bithchórais Fheidhmeach) ag baint úsáide as meascán glas SYBR ina bhfuil 1 × SYBR glas (Bithchórais Fheidhmeach), 0.3 μM primers (Teicneolaíochtaí Comhtháite DNA), 12.5ng cDNA agus uisce saor ó núicléas Baineadh úsáid as an modh comparáideach Ct chun slonn géine a chainníochtú.Gnáthaíodh sonraí go dtí na géinte tagartha is cobhsaí cyclin A agus hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1. Tá seichimh primer ar fáil ach iad a iarraidh.

Cinneadh speiceas ocsaigin imoibríoch

Rinneadh réamhchóireáil ar chealla le phloretin (50 uM) ar feadh 2 h. Ina dhiaidh sin, spreagadh cealla le PMA (15 min, 100 ng / ml) agus tomhaiseadh táirgeadh ROS ag baint úsáide as an diacetate fluaraiseacha 2',7'-dichlorodihydrofluorescein ag 10 μM i PBS ar feadh 30 min. Rinneadh an fhluaraiseacht a thomhas ag baint úsáide as an léitheoir micreaphláta optamach FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, an Ghearmáin) (excitation: 495 nm, astaíocht: 529 nm).

Tomhais ocsaíd nítreach

Rinneadh réamhchóireáil ar chealla le phloretin (50 μM) ar feadh 2 h. Ina dhiaidh sin, spreagadh cealla le LPS (24 h, 100 ng / ml). Rinneadh monatóireacht indíreach ar NÍL ag baint úsáide as trealamh tomhais nítríte imoibrí Griess (Abcam). Go hachomair, imoibríonn níotráit le sulfánilimíd agus N-(1-naftail)dé-hidraclóiríd eitiléine-dé-aimín chun dath bándearg azo a tháirgeadh. Rinneadh ionsúchán an díorthach azo seo a thomhas ansin ag 540 nm ag baint úsáide as léitheoir micreaphláta (iMark, Bio-Rad).

blot an iarthair

Cóireáladh cealla le phloretin (5{{10}} μM) agus LPS (100 ng/ml) ar feadh 1 h nó 24 h chun gníomhachtú AMPK nó p62, LC3, agus leibhéil próitéin Keapl faoi seach a chinneadh. Rinneadh cealla a liostáil trí úsáid a bhaint as RIPA-maolán (150 mM NaCl, 1 faoin gcéad Triton X-100, 0.5 faoin gcéad deocsaicioláit sóidiam, 1 faoin gcéad SDS, 50 mM Tris), agus scartha trí leictreafóiréis glóthach polyacrylamide sulfáit dodecyl sóidiam. Aistríodh glóthacha go membrane PVDF (VWR) agus cuireadh bac ar bhlotaí le haghaidh 1 h in 5 faoin gcéad albaimin séiream buaibheach i saline maolánach Tris ina raibh 0.1 faoin gcéad Tween-20(TBS-T). Scrúdaíodh membrane le antasubstaintí príomhúla thar oíche ag 4 "C, nite le TBS-T, agus gortha leis an antasubstainte tánaisteach comhfhreagrach horseradish lipéadaithe peroxidase ar feadh 1 h ag teocht an tseomra (RT). Braitheadh ​​comharthaí imdhíonghníomhacha le cemiluminescence feabhsaithe (ECL Plus,). Thermo Fisher) ag baint úsáide as an Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences) Cinneadh dlús na mbannaí ag baint úsáide as ImageJ.

Imdhíonfluaraiseacht

Aerthriomaíodh crió-ghearrthacha chorda an dromlaigh agus socraíodh iad in aicéatón fuar-oighear ar feadh 10 nóiméad ag - 20 céim . Saothraíodh BMDManna na Luiche ar shleamhnáin clúdaigh gloine agus socraíodh iad i meatánól fuar-oighear ar feadh 10 nóiméad ag-20 céim . Cuireadh bac ar ailt agus BMDManna ar feadh 30 nóiméad ag baint úsáide as bloc próitéin Dako (Agi-lent). Ina dhiaidh sin, goradh iad thar oíche ag 4″C le hantasubstaintí príomhúla, nite, agus gortha iad leis na antasubstaintí tánaisteacha cuí ar feadh 1 h ag RT. Tógadh íomhánna d’fhíochán chorda an dromlaigh ag baint úsáide as micreascóp Nikon Eclipse 80i (cuspóir 10 ×) agus NIS Bogearraí Elements BR 3.10 (Nikon). Glacadh íomhánna de BMDManna daite le haghaidh p62, LC3 agus Keapl ag baint úsáide as micreascóp comhfhócasach Zeiss LSM 880 agus ceartaíodh Airyscan iad (63× oibiachtúil).P62-agus LC3- Rinneadh puncta dearfach a chinneadh trí anailís puncta leath-uathoibríoch imageJ I mbeagán focal, tar éis an íomhá a dhéanamh dénártha agus na cealla a roghnú de láimh, rinneadh anailís ar puncta de réir na cille. ].Tá na híomhánna a thaispeántar sna figiúirí feabhsaithe go digiteach.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, socrú teiripeach). Rinneadh lucha a mheá agus a scóráil go laethúil le haghaidh comharthaí néareolaíocha an ghalair de réir threoir scórála EAE luch an déantóra:0:gan comharthaí cliniciúla,0.5:bíonn barr an eireabaill limp, 1: eireaball limp , 1.5: eireaball limp agus cosc ​​ar na cosa deiridh 2: eireaball ghlan agus laige na gcosa deiridh, 2.5: eireaball glan agus na cosa deiridh a tharraingt,3: eireaball glan agus pairilis iomlán na gcosa deiridh, 3.5: eireaball ghlan agus pairilis iomlán na huillinne níl na cosa agus an luch in ann é féin a cheartú nuair a chuirtear ar a thaobh,4: pairilis an scairt, 5: bás ag EAE.

Anailís staitistiúil

Baineadh úsáid as GraphPad Prism chun anailís staitistiúil a dhéanamh ar na sonraí, a léirítear mar mheán ±sem D'Agostino agus baineadh úsáid as tástáil normáltachta omnibus Pear-son chun tástáil le haghaidh gnáth-dháileacháin. Baineadh úsáid as tástáil t Mic Léinn dhá eireaball gan phéire (le ceartúchán Welch más gá) le haghaidh sonraí gnáthdháilte. Baineadh úsáid as anailís Mann-Whitney le haghaidh sonraí nár éirigh leo sna luachanna normalachta test.p-values<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Torthaí

Athruithe trascríobh a bhaineann le cóireáil phloretin ar macrophages

Chun éifeachtaí frith-athlastacha féideartha a bhunú agus meicníochtaí bunúsacha cóireála phloretin ar mhacrophages a aithint, rinneamar seicheamhú RNA mórchóir (Fig. 1 forlíontach). Thaispeáin anailís conair ar mhacrophages gníomhachtaithe arna gcóireáil le phloretin go raibh ró-ionadaíocht ar ghéinte léirithe go difreálach i gconairí canónacha a bhaineann leathlasadh, mar iNOS(z-scór:-2.449), gabhdóir cosúil le dola (z-scór:-2.236), comharthaíocht interferon (z-scór:- 2), agus cosán freagartha géarchéime (z-scór:- 1.633)(Fíor 1A, B). Cosúil le hanailís conairí canónacha, thuar anailís in aghaidh an tsrutha ar na sonraí RNA-seq gur laghdaigh phloretin gníomhachtú príomhrialtóirí trascríobh pro-athlastacha ar nós IRF7 (z-scór: 2.229), IRF1(z-scór:-2. 025)agus STAT1(z-scór:-2.022)(Fíor 1d). In aice le cosáin pro-athlastacha macrophage a íosrialáil, léirigh anailís RNA-seq ar mhacrophages cóireáilte le phloretin, i measc bealaí eile, gur ghníomhaigh phloretin an cosán Nrf2 (z-scór: 1.897), is léir ó uasrialáil Nrf{{2-a bhaineann leis). géinte amhail mafG agus seachfhreastalaí (Fíor 1A, C). Níos mó fós, aithníodh Nrf2(NFE2L2) mar an rialtóir trascríobh in aghaidh an tsrutha is gníomhaí (z-scór: 2.801), agus aithníodh rialáil leibhéil ROS mar cheann de na feidhmeanna bitheolaíocha is uasrialaithe i BMDManna arna gcóireáil le phloretin (z-scór: 2.008 (Fíor 1d, E). I dteannta a chéile, léiríonn torthaí go ngníomhaíonn phloretin Nrf2 agus go gcuireann sé feinitíopa athlastach macrophages faoi chois.

Rialaíonn cosán Nrf2 feinitíopa na macrófaigí cóireáilte le phloretin

Ansin, rinneamar éifeacht frith-athlastach phloretin a bhailíochtú agus chinneamar an modhnaítear feinitíopa athlastach macrophages trí ghníomhú ar Nrf2. Breathnaíodh leibhéil ROS laghdaithe i BMDManna WT cóireáilte le phloretin spreagtha le PMA (Fíor 2A). Ina theannta sin, chonacthas laghdú NÍL leibhéil táirgeachta agus mRNA de ghéinte pro-inflammatory NOS2, I-6, COX2 agus I-12 i BMDManna WT cóireáilte le phloretin spreagtha le LPS(Fíor 2B, C).In. maidir le ról ríthábhachtach Nrf2 maidir le feinitíopa nach bhfuil chomh athlastach a aslú, léiríonn ár gcuid sonraí go ngníomhaíonn phloretin géinte freagartha Nrf HO1 agus NQO1 in WT ach nach bhfuil Nrf2 KO BMDMs spreagtha le LPS (Fíor 2D). Ina theannta sin, laghdaigh cóireáil phloretin táirgeadh ROS in WT ach ní i BMDManna Nrf2 KO (Fíor 2E). Seachas freagairtí frith-ocsaídiúcháin a rialú, tuairiscítear go gcuireann Nrf2 feinitíopa athlastach macrophages faoi chois [12]. Chun tacú leis an dara ceann, ní raibh phloretin in ann léiriú géinte pro-athlastach NOS2, IL-6, COX2 a laghdú. , agus IL-12 i Nrf gníomhachtaithe{2-BMDManna easnamhacha (Fíor 2F). San iomlán, tugann na torthaí seo le fios go dtiomáineann Nrf2 an t-aistriú feinitíopa athlastach de macrophages trí mheán phloretin.

Cuireann Phloretin gníomhachtú AMPK chun cinn

Is inhibitor GLUT dea-shainithe é Phloretin agus léiríonn staidéir le déanaí an tábhacht a bhaineann le glacadh glúcóis GLUT-idirghabhála le haghaidh gníomhachtú macrophage [26,32]. Mar sin, chinneamar an bhféadfadh phloretin an braiteoir fuinnimh AMPK a ghníomhachtú, a ghníomhaítear ar leibhéil ísle fuinnimh/glúcóis. Léiríonn ár dtorthaí go mbíonn fosfar agus gníomhachtú AMPK mar thoradh ar chóireáil phloretin (Fíor 3A, B). Ina theannta sin, cuireann cur leis an gcosc AMPK BML-275 cosc ​​den chuid is mó ar ghníomhachtú AMPK i BMDManna atá cóireáilte le phloretin (Fíor 3A, B). Níos mó fós, léiríonn ár dtorthaí go bhfuil gníomhachtú AMPK riachtanach do phloretin chun táirgeadh ROS a chosc, mar a léirítear ag leibhéil ROS níos airde i BMDManna a chóireáiltear le coscairí phloretin agus AMPK i gcomparáid le BMDManna a chóireáiltear le phloretin amháin (Fig.3C). San iomlán, tugann ár gcuid sonraí le fios go bhfuil gníomhachtú AMPK spreagtha phloretin ríthábhachtach chun macrophages a thiomáint i dtreo feinitíopa nach bhfuil chomh athlastach.

Spreagann Phloretin autophagy ar bhealach atá ag brath ar AMPK

Ós rud é go bhfuil baint ag gníomhachtú AMPK le gníomhachtú próisis catabólacha mar fhreagra ar dhíothacht cothaitheach [33], rinneamar imscrúdú ar an gcéad dul síos an féidir le phloretin autophagy a ghníomhachtú. Próiseas catabólach caomhnaithe is ea an t-uathphagy a chothaítear ar an ocras agus ar fhreagraí eile ar an strus, a chothaíonn díghrádú líseasómach lasta infhéitheach arna fhorlámhú i bhfeithiclí ar a dtugtar uathphagosomes. Thuar anailís RNA-seq autophagy mar cheann de na próisis bhitheolaíocha iartheachtacha a thaispeánann gníomhaíocht mhéadaithe i BMDManna cóireáilte le phloretin (z-scór: 0.779)(Fíor 4A). Ina theannta sin, léirigh anailís imdhíon-cheimiceach ar BMDManna cóireáilte le phloretin agus an t-inhibitor autophagy bafilomycin Al carnadh méadaithe de na marcóirí uathphagy MAP1LC3/LC3 (slabhra solais próitéin 1 micrea-ghaolmhar 3) agus p62 i gcomparáid le bafilomycin A1-BMDManna cóireáilte (Fig. 4B-D), rud a léiríonn flosc méadaithe autophagic ar chóireáil phloretin [34]. Ar ionduchtú autophagy, aistrítear LC3 ón bhfoirm LC3I go dtí an fhoirm lipidated LC3I, a chomhghaolú le líon na n-uathphagosomes. Ag teacht leis seo, rinneadh leibhéil próitéine níos airde LC3II agus p62 a chinneadh i BMDManna spreagtha phloretin le blot an iarthair (Fíor 4E, F). Is díol spéise é gur cuireadh cosc ​​ar an méadú seo ar ph62 agus LC3II ag phloretin trí chóireáil a dhéanamh ar BMDManna leis an gcoiscín AMPK BML-275(Fig.4E-F). I dteannta a chéile, léiríonn ár sonraí go spreagann phloretin autophagy ar bhealach atá ag brath ar AMPK.

Gníomhaíonn Phloretin an cosán Nrf2 trí dhíghrádú Keap1 trí dhíghrádú uathphagy

Léiríonn ár sonraí go ngníomhaíonn phloretin Nrf2 agus spreagann sé autophagy i macrophages. Suimiúil go leor, is féidir leis an receptor autophagy p62 dul san iomaíocht le Nrf2 le haghaidh ceangailteach le Keapl, an t-adapter a éascaíonn ubiquitination agus díghrádú Nrf2 faoi ghnáthchoinníollacha. Mar sin cuirfidh an díthiomsú p62-idirghabhála seo de Keap1/Nrf2 cosc ​​ar dhíghrádú Nrf2 agus ar deireadh beidh gníomhachtú Nrf2 mar thoradh air [35]. Ar an gcúis seo, chinneamar an gcuireann phloretin idirghníomhaíocht p62/Keapl chun cinn, rud a ghníomhaíonn cosán Nrf2. Anseo, léirímid go ngníomhaíonn phloretin an cosán Nrf2 trí dhíghrádú Keapl trí mheán p62- i macrophages. Trí úsáid a bhaint as micreascópacht comhfhócasach Airyscan ardtaifigh in éineacht le hanailís colocalization, léirímid go spreagann phloretin idirghníomhaíocht p62 agus Keapl, mar atá léirithe ag luach méadaithe na bparaiméadar colocalization (comhéifeacht Pearson) i BMDManna cóireáilte le phloretin (Fíor 5A). , B). Thairis sin, léiríonn ár dtorthaí go bhfuil leibhéil próitéine níos ísle Keapl i láthair i BMDManna cóireáilte le phloretin, ag deimhniú díghrádú Keapl (Fíor 5C). Chun a dheimhniú go bhfuil an díghrádú ag brath ar autophagy, chuireamar an t-inhibitor autophagy bafilomycin A1 le phloretin-cóireáilte. BMDManna. Suimiúil go leor, aisiompaíodh an laghdú seo ar Keapl trí chóireáil bafilomycin Al (Fig. 5C). Deimhníodh na torthaí seo le blot an iarthair, ag taispeáint laghdú ar leibhéil próitéin Keapl i BMDManna cóireáilte le phloretin a bhí cosc ​​​​ar bafilomycin A1 (Fíor 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), laghdaigh phloretin déine an ghalair (Fíor 6 B). Comhthreomhar le déine galair laghdaithe in ainmhithe cóireáilte le phloretin le léiriú laghdaithe de ghéinte athlastacha MHCI,

CD86, Uimhreacha2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 agus CXCL2 sa chorda dhromlaigh (Fíor 6C). Ina theannta sin, fuarthas méid laghdaithe F4/80tcells i gcorda dromlaigh ainmhithe cóireáilte le phloretin (Fig.6E, F). Ós rud é go gcuireann macrophages F4/80* agus F4/80* araon le néar-athlasadh, léirigh anailís níos doimhne gur laghdaigh phloretin méid F480 móide TMEMl go suntasach19-

macraphages i lucha EAE (Fíor fhorlíontach 2 DF) cé gur breathnaíodh treocht neamhshuntasach i dtreo laghdaithe F480 móide TMEMl19 móide microglia. Ag teacht leis an toradh seo, chuir phloretin cosc ​​ar tháirgeadh idirghabhálaithe athlastacha i microglia ach ní raibh an cosc ​​seo chomh soiléir i gcomparáid le macrophages (Fíor fhorlíontach 2 AC). Tugann na torthaí seo le fios go bhfuil feabhas ar EAE ag phloretin bunaithe ar mhacrophage den chuid is mó. Chomh maith le léiriú na ngéinte athlastacha a laghdú, mhéadaigh phloretin léiriú fachtóirí frith-athlastacha agus néaratrófacha, ie IL-4, CNTF, agus IGF-1 i gcorda dhromlaigh ainmhithe EAE(Fíor 6D). ). Tugann na torthaí seo le fios go láidir go laghdaíonn phloretin déine an ghalair EAE trí mhacraifítí a thiomáint i dtreo feinitíopa réitithe galair. Ag teacht lenár dtorthaí in vitro roimhe seo, bhraitheamar freisin comhartha Nrf2 ardaithe i CNS ainmhithe EAE cóireáilte le phloretin mar atá léirithe ag léiriú mRNA méadaithe Nrf2 agus a spriocanna iartheachtacha NQO1 agus GPX1 (Fíor 6G). San iomlán, léiríonn na sonraí seo go gcuireann phloretin néar-athlasadh faoi chois i suíomh próifiolacsach agus teiripeach araon. Ina theannta sin, léiríonn ár dtorthaí go bhféadfadh phloretin néar-athlasadh a laghdú trí ghnéithe athlastacha macrophages a shochtadh trí ghníomhachtú Nrf2.

Plé

Sa staidéar seo, léirímid go dtiomáineann phloretin macrophages i dtreo feinitíopa nach bhfuil chomh athlastach céanna ar bhealach atá ag brath ar Nrf. Fuarthas amach go raibh gníomhachtú uathphagy ag brath ar AMPK agus díghrádú Keapl ina dhiaidh sin mar bhunús le gníomhachtú Nrf2 ag phloretin. Ina theannta sin, deimhnímid éifeachtaí frith-athlastacha phloretin i múnla EAE ina laghdaítear déine an ghalair agus a mhaolaíonn sé atá ag brath ar mhacrophage.néar-athlasadh.

Léirímid go gcuireann phloretin feinitíopa athlastach macrophages faoi chois. Tá sé seo ag teacht le torthaí Wei-Tien Chang et al. a léirigh go bhfuil gnéithe frith-athlastacha ag phloretin i líne cille macrophage [36]. Léirímid go bhfuil ionduchtú an aistrithe feinitíopa seo ag brath ar Nrf2. Is máistir-rialtóir é Nrf2 ar fhreagraí frithocsaídeacha agus is eol go ndéanann a ghníomhachtú macrophages a thiomáint i dtreo feinitíopa frith-athlastach [1l, 12, 37]. Chomh maith leis sin, shainigh roinnt staidéar go maolaíonn gníomhachtú Nrf2 neuroinflammation agus neurodegeneration i neamhoird CNS [{{10) }}]. Mar sin féin, cé go léiríonn ár dtorthaí go bhfuil Nrf2 mar bhunús leis an aistriú feinitíopa de mhacrophages cóireáilte le phloretin, léirigh sonraí seicheamhaithe RNA, i measc gníomhachtú Nrf2, go raibh cosáin eile uasrialaithe. Go háirithe, tá an upregulation ar an cosán PPAR suimiúil mar gheall ar a ghnéithe frith-athlastacha agus tras-caint le Nrf2 [{-]. Ina theannta sin, ós rud é gur coscóir GLUT dea-shainithe é phloretin agus gur imeacht meitibileach ríthábhachtach é aistriú chuig glicealú do ghníomhachtú macrophage, d'fhéadfadh athruithe feinitíopa a bheith mar thoradh ar éifeachtaí meitibileach díreacha phloretin ar na hiompróirí glúcóis seo [46,47]. Tá gá le tuilleadh taighde chun ábharthacht PPAR i ngníomh Nrf2 arna spreagadh ag phloretin a shainiú agus cé chomh mór agus a bhíonn tionchar ag athruithe meitibileach díreacha ar imdhíon-mhodúchán de bharr phloretin. Tríd is tríd, léiríonn ár dtorthaí go soiléir go bhfuil ról fíor-riachtanach ag gníomhachtú Nrf2 sa lasc feinitíopa trí mheán phloretin.

Léiríonn ár dtorthaí go ndéantar gníomhachtú AMPK a idirghabháil le gníomhachtú Nrf2 le phloretin. Tá ról ríthábhachtach ag AMPK maidir le hoiméastáis fuinnimh cheallacha a athbhunú i gcás strusanna a ídíonn ATP agus mar thoradh ar chóimheas ADP: ATP méadaithe, mar sin ag aistriú ar bhealaí catabólacha malartacha a ghineann ATP, agus ag casadh as cosáin anabalacha a itheann ATP [48]. Dá réir sin, is coscaire GLUT seanbhunaithe é phloretin agus íslíonn sé leibhéil glúcóis cheallacha [49-51]. Léiríodh i roinnt staidéar go n-eascraíonn gníomhachtú AMPK i macrófaigí feinitíopa imdhíon-shochtadh, rud a chomhthacaíonn ár dtorthaí a thaispeánann go bhfuil gníomhachtú AMPK riachtanach chun phloretin chun athlasadh a ísliú[52,53]. Tá ár sonraí comhsheasmhach freisin le staidéir roimhe seo inar léiríodh phloretin chun AMPK a ghníomhachtú i gcineálacha cille eile lena n-áirítear adipocytes agus cealla endothelial [50, 54-56]. Féadfaidh Phloretin AMPK a ghníomhachtú go hindíreach trí AMP a mhéadú agus leibhéil ATP a ísliú, ós rud é go spreagann AMP agus ATP gníomhachtú AMPK go allosterically nó a chuireann bac ar ghníomhachtú AMPK, faoi seach [48, 57]. Mar sin féin, is féidir le CaMKK , atá ina kinase in aghaidh an tsrutha de AMPK, gníomhachtú AMPK a chur chun cinn mar fhreagra ar leibhéil mhéadaithe Ca2 móide cheallacha gan aon athrú ar leibhéil AMP/ATP [58]. Ina theannta sin, i bhfianaise líonra leathan na hidirghníomhaíochta idir AMPK agus cosáin suas agus iartheachtacha, tá gá le tuilleadh taighde chun an mheicníocht bhunúsach de ghníomhachtú AMPK de bharr phloretin a shoiléiriú.

Tugann ár sonraí le fios go spreagann gníomhachtú AMPK trí phloretin autophagy i macrophages. Mar a luadh thuas, is próiseas féin-chosanta é gníomhachtú AMPK a bhfuil sé mar aidhm aige cothromaíocht fuinnimh na cille a athbhunú [48]. Cé nár léirigh aon staidéar riamh go raibh phloretin in ann feinitíopa macrophages a spreagadh trí autophagy a chur chun cinn, léirigh roinnt staidéir mar sin féin éifeacht phloretin ar bhealaí autophagy i gcealla ailse agus heipitocytes [59-61]. Thairis sin, léiríonn staidéir éagsúla gur féidir le próisis catabólacha anuas de ghníomhachtú AMPK autophagy a ghníomhachtú [60, 62,63]. Is díol spéise é, mar fhreagra ar ocras glúcóis, go ndéantar uathphagaíocht AMPK-idirghabhála trí fhosfarylation an thionscnóra autophagy allmhairithe unc-51 cosúil le autophagy a ghníomhaíonn kinase [64,65]. Maidir leis seo, déanaimid tuairimíocht go spreagann AMPK uathphagy chun ATP a athbhunú ó chomhpháirteanna ceallacha mar fhreagra ar ídiú glúcóis de bharr phloretin. Mar sin féin, is féidir leis an ocras glúcóis autophagy a ghníomhachtú ar bhealach neamhspleách AMPK [66-68]. Dá bhrí sin, tá gá le níos mó taighde chun a chinneadh an dtarlaíonn gníomhachtú autophagy ag phloretin go páirteach neamhspleách ar AMPK freisin.

Léirigh staidéir le déanaí an tábhacht a bhaineann le autophagy chun an feinitíopa feidhmiúil macrophage a thiomáint. Sa chomhthéacs seo, tá nasc go háirithe idir dírialú na n-uathphagy i macrophages agus tosú an Atherosclerosis agus galair néareolaíocha [69-72]. Anseo, soláthraímid nasc idir cóireáil phloretin, ionduchtú autophagy, agus gníomhachtú Nrf2 trína thaispeáint go gcuireann phloretin gníomhachtú Nrf2 chun cinn trí dhíghrádú Keap1 trí mheán p{4}}. Go dtí le déanaí, measadh go raibh méadú ar ph62 puncta mar chomhartha de laghdú ar autophagy mar go bhfuil p62 díghrádaithe in autophagosomes ar ghníomhachtú autophagy [34]. Maidir leis seo, tá carnadh p62 nasctha le mífheidhmiú autophagy i loit atherosclerotic [73]. Mar sin féin, tugadh dúshlán don nóisean seo le blianta beaga anuas agus meastar anois go bhfuil gá le p62 chun autophagosomes a fhoirmiú agus go bhféadfadh méadú ar leibhéil p62 i gcomhthráth le méadú ar LC3Il puncta a bheith ina chomhartha ar ionduchtú autophagy [74]. Mar sin, mar aon le cumas phloretin AMPK a ghníomhachtú agus a ról aitheanta i ngníomhú autophagy, tugann ár dtorthaí le fios go bhfuil carnadh P62 agus LC3 ar chóireáil bafilomycin A1 i macrófagáin spreagtha phloretin mar gheall ar fhlosc uathoibríoch méadaithe agus ní mar gheall ar lagú. uathphaigí. Suimiúil go leor, Lee Y et al. léirigh le déanaí, seachas Nrf2 a ghníomhachtú, go bhfuil baint ag p62 ceangailteach le Keapl freisin le foirmiú autophagosome, rud a thugann le tuiscint go bhfuil gníomhachtú autophagy trí mheán phloretin ceangailte go díreach le gníomhaíocht p62 méadaithe ar thaobh amháin, ach freisin le níos mó idirghníomhaíochta Keapl-p62 ar an láimh eile [ 75]. Is cuibheoir é Keapl do ligáis ubiquitin atá bunaithe ar Cullin a fhoirmíonn homadimer le Nrf2 ag coinníollacha hoiméastatacha, rud a chuireann ubiquitin Nrf2 agus díghrádú próitéasómach chun cinn [76]. Mar thoradh ar chur isteach ar choimpléasc Keapl-Nrf2 déantar Nrf2 a chobhsú agus a aistriú chuig an núicléas [77, 78]. Tá sé doiciméadaithe go maith go dtarlaíonn cur isteach ar an gcoimpléasc seo trí mhodhnú a dhéanamh ar iarmhair cistéin Keapl trí mhóilíní leictreafaileacha, trí idirghníomhú díreach móilíní beaga le Keapl, nó trí dhíghrádú Keapl trí mheán p[35]. Molann Ying Y et al. idirghníomhú díreach de phloretin agus Keapl bunaithe ar thurgnaimh in silico, as a leanann gníomhachtú cosán Nrf2 i líne cille cardiomyocyte [79]. Anseo, bhunaíomar meicníocht bhreise a bhaineann le autophagy trína ngníomhaíonn phloretin Nrf2.

Trí úsáid a bhaint as samhail EAE, fuaireamar amach go maolaíonn phloretin néar-athlasadh in vivo. Tugann ár sonraí le fios go láidir go maolaíonn phloretin EAE tríd an bhfreagairt athlastach arna idirghabháil ag macrophages a shochtadh agus an cosán Nrf2 a ghníomhachtú. I múnlaí galair eile, tuairiscíodh freisin go bhfuil phloretin ag feidhmiú gnéithe neuroprotective agus imdhíonachta-modulatory. Go háirithe, fuarthas amach go ngníomhaíonn phloretin cosán Nrf2 san inchinn ar ischemia cheirbreach agus go laghdódh sé carnadh béite amyloid i múnla galar Alzheimer francach [80-84]. D'fhéadfadh tionchar a bheith ag phloretin ar chealla imdhíonachta eile in vivo freisin, toisc go bhfuarthas go gcuireann an cumaisc seo bac ar ghníomhachtú cille T agus dendritic in vitro [85, 86]. Ós rud é nach bhfuil néar-athlasadh i múnla EAE ag brath go hiomlán ar mhacrophage, bheadh ​​sé spéisiúil a shainiú cé chomh mór is atá an laghdú ar néar-athlasadh idirghabhála ag cealla imdhíonachta eile. Maidir leis seo, cé go dtugann ár sonraí le fios go bhfuil maolú EAE á thiomáint go príomha ag macrophages agus nach bhfuil sé ag brath níos lú ar mhodhnú microglia, tá gá le turgnaimh bhreise chun a fháil amach cé chomh mór agus a théann an phloretin i bhfeidhm ar mhicroglia i ngalar néar-athlastach. Tríd is tríd, léiríonn ár dtorthaí go laghdaíonn phloretin néar-athlasadh trí thionchar a dhéanamh ar fheinitíopa macrophages, rud a léiríonn acmhainneacht theiripeach phloretin le haghaidh neamhoird néar-athlastacha.

Conclúidí

Léiríonn ár staidéar gur oibreán inmunomodulatory cumhachtach é phloretin a mhodhnaíonn airíonna athlastacha macrophages i neamhoird néara-athlastacha. Bunaíodh an cosán Nrf2 a ghníomhachtú, arna idirghabháil ag gníomhachtú uathphagy atá ag brath ar AMPK agus díghrádú Keapl ina dhiaidh sin, chun an t-aistriú feinitíopa seo a thiomáint. Mar sin, is oibreán nádúrtha tuar dóchais inti é phloretin is féidir a úsáid chun an t-ualach athlastach a bhaineann le galair néar-athlastacha amhail MS a laghdú.

Tagairtí

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY, et al. Maolaíonn Dihydromyricetin foirmiú cúrcheall trí LXRalpha-ABCA1/ABCG1-eisilteach colaistéaról spleách i macrophages. Cógaiseoir Bithmhíochaine. 2018; 101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q, et al. Spreagann anthocyanins eisreabhadh colaistéaróil ó mhacrophages peritoneal luch: ról an ghabhdóra iomadúcháin sárocsaídithe {gáma}-gadóir X ae {alfa}- cosán ABCA1. J Biol Ceimic. 2005; 280(44):36792–801. https://doi.org/10.1 074/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Feabhsaíonn Quercetin slonn ABCA1 agus eisreabhadh colaistéaról trí chosán spleách i macraphages. J lipid Res. 2012; 53(9): 1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Fiseolaíocht na fagaicítí foamy i scléaróis iolrach. Cumann Neuropathol Acta. 2018; 6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Fo-thacair Macrophage agus microglia i scléaróis iolrach. Gníomhartha Neuropathol. 2014; 128(2): 191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Scléaróis iolrach: meicníochtaí agus imdhíonteiripe. Néaróin. 2018; 97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j néaróin.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, et al. Déanann Stearoyl-CoA desaturase-1 dochar d’airíonna leigheasacha na macrófaigí agus na micriglia san inchinn. J Cait Med. 2020; 217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Modhnaíonn macrophages Myelin-phagocytosing iomadú cille T uath-imoibríoch. J Néar-athlasadh. 2011; 8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA, et al. Déanann lipidí díorthaithe Myelin gníomhaíocht macrophage a mhodhnú trí ghníomhachtú gabhdóra X ae. PLoS a hAon. 2012; 7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ iris.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T, et al. Athraíonn Myelin feinitíopa athlastach macrophages trí PPARanna a ghníomhachtú. Cumann Neuropathol Acta. 2013; 1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.