Gliocóisídí Feinileatánóil Ó Cistanche Tubulosa Socht Gníomhú Cille Stellate Hepatic Agus Cosc a chur ar Sheoladh Conairí Comharthaíochta i TGF-01/smad Mar Ghníomhairí Féideartha Fiobróis Fhrith-Hepatic
Mar 05, 2022
Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping Tú, Long Ma, Meitheamh Zhao, Shi-Lei Zhang agus Tao Liu
Coimriú: Cistanche tubulosais leigheas luibhe Sínis traidisiúnta a úsáidtear go forleathan chun díolúine a rialáil agusgliocóisídí feinileatánóideach(CPhGanna) i measc na bpríomhchodanna atá freagrach as an ngníomhaíocht seo. Léirigh staidéir roimhe seo éifeachtaí coisctheacha agus teiripeacha CPhGanna ar fhiobróis hepatach de bharr albaimin séiream buaibheach (BSA) i bhfrancaigh. Ba é aidhm an staidéir éifeacht fiobróis fhrith-hepatic na CPhGanna agus na monaiméirí a mheas.echinacosideagusaicteóistrí chosc a chur ar ghníomhachtú cille stellate hepatic (HSC), bac a chur ar sheoladh bealaí comharthaíochta chun fachtóir fáis-p1 (TGF-p1)/smad a athrú, agus a chinneadh gur gníomhaíocht hepatoprotective in vitro iad. Is léir go raibh cosc ar iomadú HSC tar éis cóireála le CPhGs (100,50 ^ g/mL)/echinacoside (500,250,125 ^g/mL)/acteoside (6, 3 ^ g/mL), le luachanna IC50 de 119.125,520.345 agus 6.999 g/6. mL, faoi seach, sa mheasúnacht MTT. Tiúchan éagsúla de CPhG/echinacoside/aicteóisní raibh aon tionchar aige ar thocsaineacht cheallacha ar HSC de réir tomhais lactate dehydrogenase (LDH). Tiúchan éagsúla de CPhG/echinacoside/aicteóisméadú ar an leibhéal mRNA agus léiriú próitéine smad7 agus laghdaigh na leibhéil mRNA de smad2, smad3 agus an slonn próitéine de smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) i HSC. Go hachomair, léiríonn na torthaí seo go bhfuil CPhGs/echinacoside/aicteóisis féidir leis bac a chur ar sheoladh na gconairí comharthaíochta i TGF-p1/smad, agus bac a chur ar ghníomhachtú HSC, ag moladh goC. tubulosamar sin d’fhéadfadh gur leigheas luibhe féideartha é chun fiobróis ae a chóireáil.
Eochairfhocail: Cistanche tubulosa; gliocóisídí feinileatánól óCistanche(CPHGanna);echinacoside; aicteóis; cealla stellate hepatic (HSC); TGF-p1/smad
1. Réamhrá
éirí iomadúil agus fibrogenic, carnadh ECM ina dhiaidh sin, agus ar deireadh idirdhealú a dhéanamh i gcealla fibrogenic cosúil le miófibreogán. Meastar gurb é fachtóir fáis trasfhoirmithe-.1 (TGF-p 1) an príomh-idirghabhálaí profróigineach. Meicníocht thábhachtach fiobróis hepatic is ea an cosán comharthaíochta a bhaineann le TGF-&1, agus folaíonn sé go príomha comharthaíocht smad-spleách agus smad-neamhspleách, agus meastar go bhfuil an cosán trasduchtúcháin comharthaíochta smad-spleách mar phríomhchainéal comharthaíochta TGF-p1. . Mar sin, féadann imshuí ar chonair chomharthaíochta TGF-p1/smad táirgeadh collaigine a chosc agus fiobróis heipteach a mhaolú ar deireadh thiar, rud a d’fhág go bhfuil an cosán seo ina sprioc thábhachtach i dtaighde ar dhrugaí ar fhiobróis fhrith-hepatic le blianta beaga anuas.
In ainneoin an ardmhinicíochta fiobróis hepatic ar fud an domhain, níl aon teiripe frithshnáithíneach a nglactar leis go ginearálta ar fáil [2-4]. Is díol spéise iad Leigheasra Luibhe Traidisiúnta na Síne (TCHManna) i gcóireáil neamhoird ae mar is féidir roinnt drugaí teiripeacha a úsáid chun fiobróis ae a bhainistiú agus a chosc. Faoi láthair, tá go leor staidéir dírithe ar dhrugaí frith-fibrogenic féideartha a úsáideadh mar TCHManna ar feadh na mílte bliain [5].
Cistanche tubulosa W (teaghlach Orobanchaceae)fa plandaí seadánacha, tá fás go forleathan i réigiún theas na Xinjiang sa tSín [6]. Úsáideann daoine é chun na duáin a fhuinneamh, an fhuil a chothú, na bputóga a mhaolú agus an t-seansacht gan fo-iarsmaí a mhoilliú, agus tá sé liostaithe go hoifigiúil sa Pharmacopoeia Síneach [7]. Tá éagsúlacht de chomhpháirteanna gníomhacha ag C. tubulosa, lena n-áirítear gliocóisídí feinileatánóideach (CPhGs), iridoids, agus polaisiúicrídí. I measc na gcomhpháirteanna gníomhacha iomadúla i C. tubulous, is iad na CPhGanna, a chuireann roinnt bithghníomhaíochtaí i láthair (frithocsaídeach, antifatigue, radioresistance, etc.) príomh-chomhpháirteanna Pie den phlanda seo. Le blianta beaga anuas, tuairiscítear go bhfuil ró-éifeachtaí Hent hepatoprotective ag CPhGis, agus féadann siad fréamhacha crann a scaveneáil, seicní hepatic a chosaint, agus éifeachtaí imdhíonriallaithe, cosc apoptosis, cosc ar léiriú antigen dromchla heipitíteas B (HBs Ag) agus heipitíteas B. e antigen (HBeAg) agus víreas heipitíteas B (HBV) gníomhaíocht macasamhlú DNA, etc. Is é leibhéal DNA HBV an t-innéacs is iontaofa a léiríonn go díreach an ghníomhaíocht macasamhlú víreasach, arb é an príomhfhachtóir chun stair nádúrtha na n-ionfhabhtuithe HBV ainsealacha a chinneadh, monatóireacht a dhéanamh ar éifeacht na teiripe frithvíreasach OP, agus measúnú a dhéanamh ar prognóis ionfhabhtuithe géara agus ainsealacha HBV. Áirítear go príomha ar innéacsanna braite séireolaíochta HBV HBsAg, HBeAg, etc. [8-11]. Mar sin féin, is beag tuairiscí litríochta ar éifeachtaí frith-hepatic fiobróis CPhGanna. Léirigh staidéir roimhe seo éifeachtaí coisctheacha agus teiripeacha CPhGanna ar fhiobróis heipteach de bharr albaimin séiream buaibheach (BSA) i bhfrancaigh, ach níor rinneadh meastóireacht in vitro ar ghníomhaíocht frithshnáithíneach na CPhGanna agus a monaiméirí móra (echinacoside agus acteoside, Fíor 1).
orgánach Cistanche tubulosa
2. Torthaí
2.1. Cinneadh Cainníochtúil ar CPhGanna
CPhGs iC. tubulosago bhfuil gliocóisídí alcóil feinileitile ITwo: taobh echinacoside agus acteo, agus braitheadh anailís HPLC (Fíor 1) go raibh a n-ábhar sna CPhGs 42.71 faoin gcéad 土 0.42 faoin gcéad agus 14.27 faoin gcéad 土 0.18 faoin gcéad , faoi seach.
2.2. Gníomhaíochtaí Coiscthe CPhG, Echinacoside agus Acteoside ar HSC-T6
Chuir CPhGanna, echinacoside agus acteoside (62.5-500 卩g/mL) bac ar inmharthanacht cille HSC ar bhealach a bhraitheann tiúchan. Léirigh CPhGs agus acteoside gníomhaíocht iontach coisctheach ar chealla HSC, agus ba é 119.125 昭/mL agus 6.999 昭/mL faoi seach luachanna coiscthe 50 faoin gcéad ar ghníomhaíocht fáis cille (IC50) agus 6.999 昭/mL. Léirigh Echinacoside gníomhaíocht measartha coisctheach (IC50,520.345 昭/mL; Tábla 1 agus Fíor 2).
2.3. Tocsaineacht Cille CPhG, Echin taobh leis agus Acteorida ar HSC
Déantar lactate dehydrogenase (LDH), einsím cíteaplasmach stoble atá i ngach cill, a ligean ar léas go tapa isteach i gcultúr na gcealla tar éis damáiste a dhéanamh do membrane plasma. Tá comhghaol idir gníomhaíocht einsím sa chultúrlann agus comhréir na n-ealaíon lysed [12]. Mar a léirítear i dTábla 2, nuair a dhéileáiltear le difriúil: tiúchan C PhG, echinacoside agus acteoside, cé gur léirigh gníomhaíocht LDH méadú beag i gcomparáid leis an ngrúpa coirtrol cille, ní raibh an difríocht suntasach go staitistiúil (p> 0.05 ), rud a thugann le fios gur choinnigh an chuid is mó de na seicní cille a n-ionracas, agus nach bhfuil an cosc ar CPhGanna, echinacoside agus aicteóisíd ar HSC mar gheall ar thocsaineacht cheallach neamhshonrach.
2.4. Éifeacht CPhGanna, Echinacoside agus Acteosde ar Iomadú HSC arna Spreagadh ag TGF-^i
Tá iomadú, gníomhachtú agus idirdhealú HSC á rialú ag fachtóirí éagsúla. I measc na bhfachtóirí éagsúla a bhaineann le fiobróis ae, meastar gurb é TGF{{{0}} an ceann is tábhachtaí, toisc go bhféadfaidh sé HSC a ghníomhachtú, difreáil myofibroblast a chur chun cinn, sintéis ECM a mhéadú, agus díghrádú ECM a chosc, agus scaoileadh chemokines agus cytokines baint acu le fiobróis ae [13]. Sa staidéar seo, seachas an grúpa rialaithe, spreagadh HSCanna stáiseanóireachta le TGF-P1 in vitro chun foirmiú fiobróis ae luath a ionsamhlú, agus chun imscrúdú a dhéanamh ar éifeacht CPhGs, echinacoside agus acteoside ar TGF-p1- iomadú HSC spreagtha. Mar a thaispeántar i dTábla 3, i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe, chuir an grúpa TGF-61 chun cinn go mór iomadú HSC (p < 0.01).="" i="" gcomparáid="" leis="" an="" ngrúpa="" tgf-p1,="" tgf-p1="" móide="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf{{18}="" }="" móide="" echinacoside="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf-p1="" móide="" acteoside="" (ta)="" (3.0,="" 6.0="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05)="" go="" suntasach="" bac="" ar="" iomadú="" na="" hscanna="" a="" tharlódh="" tgf-|3="" 1="" go="" céimeanna="">
2.5. Léirithe mRNA smad2)smad3 agus smad7 tar éis idirghabhála CPhGs, ochmacoside agus acteaside ar HSCanna
Is príomhéifeachtóirí iartheachtacha iad Smad3 agus smad2 ar an gcosán comharthaíochta TTGF-p [ 14,15], agus is coscaire ar chomharthaíocht smid é smad7. Go teoiriciúil, is féidir le slonn méadaithe smad7 nó slonn laghdaithe smad2/smad3 bac a chur ar sheoladh na gconairí comharthaíochta i TGF-p 1/smad. Mar a léirítear i bhFíor 3, léirigh anailís chainníochtúil PCR fíor-ama gur léirigh slonn mRNA smad2 agus smad3 leibhéal níos ísle, agus léirigh smad7 leibhéil níos airde sa ghrúpa rialaithe, i gcomparáid leis an ngrúpa TGF-|31. Sa ghrúpa TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), an leibhéal mRNA smad2 (p < 0.{{37="" }}="" 5)="" agus="" smad3="" (p="">< 0.01)="" laghdú="" suntasach="" i="" gcomparáid,="" leis="" an="" ngrúpa="" tgf-pf="" ,="" agus="" bhí="" sé="" fiú="" cosúil="" leis="" an="" ngrúpa="" rialaithe;="" domsa,="" tháinig="" méadú="" suntasach="" ar="" an="" leibhéal="" mrna="" de="" smad7="" sa="" ghrúpa="" tc="" (50,="" 75,100="" 卩g/ml)="" (p="">< 0.05,="" p="">< 0.05,="" p="">< 0.01,="" faoi="" seach).="" ach;="" léirigh="" slonn="" smad7="" treocht="" ardaitheach="" sa="" ghrúpa="" tc="" 25="" 卩g/ml="" i="" gcomparáid="" leis="" an="" ngrúpa="" tgf-p1="" (fíor="">
Idir an dá linn, i gcomparáid leis an ngrúpa TGF-p1, tháinig laghdú suntasach ar léiriú mRNA smad2 agus smad3 san TE (62.5, 125, 250, 500 卩g /mL) grúpa (p < 0.01),="" agus="" na="" slonn="" smad7="" mrna="" méadaithe="" go="" suntasach="" sa="" ghrúpa="" te="" (125,="" 250,500="" 昭/ml)="" (p="">< 0.01)="" (fíor="" 4)="" .="" mar="" an="" gcéanna,="" léirigh="" grúpa="" ta="" (0.75,1.5,="" 3.0,="" 6.0="" ^g/ml)="" an="" treocht="" chéanna="" (fíor="">
2.6. Tionchar CPhGs, Echinacoside, agus Ac)eosids ar T GF-^i/smad Signaling Path in HSC
Braitheann cosán comharthaíochta TGF-p 1/smad ar smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) agus smad7, áit a bhfuil p-smad2, p-smad3 na foirmeacha gníomhachtaithe de smad2 agus smid3. Sa staidéar seo, rinneadh anailís ar leibhéil próitéine omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 agus smad7. Braitheadh anailís blot an Iarthair méaduithe ar leibhéil smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 faoi TGF-p1, agus cosc ar na méaduithe seo ag CPhGanna, ec hinacoside agus acteoside; Idir an dá linn, léirigh anailís blot wesiern leibhéil suas-rialaithe smad7 ag CPhGs, echinacoside agus acteoside. (Figures 6-8).
Mar a léirítear i bhFíor 6, i gcomparáid leis an ngrúpa c on2rol (méadaíodh go suntasach na habairtí próitéine smad2, smad3, p-smad2, p-smad3, agus laghdaíodh léiriú próitéine smad7 sa ghrúpa TGF-p1. Sa TC (25). , 50, 75, 100 昭/mL) grúpaí drugaí, an smad/ (Fíor 6A), p-smad2 (Fíor 6B), smad 3 (Fíor 6C), p -smad3 (Fíor 6D) i bhfad níos ísle ná mar a bhí sa ghrúpa TGF-p1 (卩 <0.01), agus bhí slonn próitéine smad7 (Fíor 6E) níos airde ná sin an ghrúpa TGF-S1 (p <0.01) (Fíor 6).
Ag an am céanna, rinneadh na habairtí ot próitéin smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 agus smad7 a thomhas tar éis idirghabháil echinacoside agus acteoside ar HSC. Mar a léirítear i bhFíoracha 7 agus 8 bhí bac suntasach ar leibhéil slonn próitéine smad2, smad3, p-smad2 agus p-smad3 (p < 0.05="" nó="" p="">< 0.01="" ),="" ardaíodh="" leibhéal="" slonn="" próitéine="" smad7="" (p=""><0.01), i="" gcomparáid="" leis="" an="" ngrúpa="" tgf-="" p="" 1="" (fíoracha="" 7="" agus="">
3. Plé
Tá fiobróis ae ar cheann de na príomhchúiseanna le galracht agus mortlaíocht ar fud an domhain, ach tá roghanna teiripeacha an-teoranta ar fáil don riocht seo, dá bhrí sin, tá sé an-tábhachtach dúinn spriocanna féideartha a lorg le haghaidh idirghabhála teiripeacha chun cosc a chur ar fhorbairt fiobróis ae [] 16]. Le déanaí, fuair taighdeoirí go bhfuil leigheasanna luibhe éagsúla hepatoprotective ar éifeachtaí frith-fibrotic. Tá go leor TCHM cosúil le pills Fufang Biejia Ruangan [17] agus decoction Xiao-chai-hu (shosaiko go dtí an tSeapáin) [18,19] in úsáid go forleathan chun fiobróis hepatic a chóireáil sa tSín, sa Chóiré agus sa tSeapáin ar feadh na mílte bliain. Tá éagsúlacht de chomhpháirteanna gníomhacha ag C. tubulosa lena n-áirítear CPhGanna, iridoids, agus polaisiúicrídí. Mar cheann de bhunanna ábhar éifeachtach C. tubulosa, tá gníomhaíocht hepatoprotective den scoth ag CPhGanna, ach tá faisnéis teoranta faoi éifeachtaí frithshnáithíneacha GPhC agus a chomhdhúile gaolmhara. Sa staidéar seo, rinneamar imscrúdú ar conas a shochtann CPhGs, echinacoside agus aicteóis gníomhaíocht HSC agus bac a chur ar an mbealach comharthaíochta i TGF-p1/snaad mar oibreáin fhéideartha fiobróis fhrith-heipiceach in vitro.
Beidh gníomhachtú HSCanna mar thoradh ar ghortú ae ar aon etiology ar deireadh, a ndéantar trasdhifreáil ar chealla cosúil le myofibroblastán fibrogenic [20]. Is é sin le rá go bhfuil myofibroblasts
díorthaithe ó ghníomhachtú agus iomadú HSCss [21], agus meastar é mar idirghabhálaí foirmiú fiobróis hepatic. Ar an ábhar sin, rinneamar staidéir in vitro chun comparáid a dhéanamh idir rátaí inmharthanachta cealla HSCanna a nochtar do CPhGanna, echinacoside agus acteoside. Léirigh na torthaí go raibh éifeacht coisctheach acteoside ar HSC an ceann is láidre, agus bhí éifeacht na CPhGs níos fearr ná an echinacoside. Chuir CPhGanna, echinacoside agus séiream íocleasaithe aicteóis bac ar iomadú HSC ar bhealach dáileog-spleách.
Is einsím cíteaplasmach é LDH i gcealla beo, agus ní féidir leis dul isteach sa chillscannán faoi ghnáththosca. Nuair a dhéantar damáiste do chealla, méadaíonn an tréscaoilteacht membrane agus scaoiltear LDH chuig an taobh amuigh cille. De ghnáth, is féidir le LDH an méid damáiste cille [{{{0}}] a bhrath. Léirigh an t-imscrúdú nár léirigh gníomhaíocht LDH de CPhGs, echinacoside agus serum íocleasaithe acteoside ach méadú beag i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe cille, agus nach raibh an difríocht suntasach go staitistiúil (p> 0.05), rud a léiríonn gur choinnigh an chuid is mó den membrane cille a sláine. , agus níl cosc ar HSCanna ag CPhGanna, echinacoside agus aicteóisíd mar gheall ar thocsaineacht cheallach neamhshonrach.
Nuair a tharlaíonn gortú ae, is féidir le heipitocytes gníomhachtaithe scaoileadh TGF-pi a ghníomhaíonn HSC-T6 ar a seal, dá bhrí sin, tá caidreamh dlúth ag TGF-pi le fiobróis [25-27]. Sa staidéar seo, d’fhéadfaí breathnú ar CPhGanna, echinacoside agus acteoside mar straitéis mhealltach theiripeach chun iomadú HSC a chosc tar éis HSCanna a spreagadh le wTGF-pi in vitro. Tuairimíd go bhféadfaí CPhGanna, echinacoside agus acteoside a úsáid mar chineál cóireála agus/nó chun fiobróis ae a chosc, agus bac a chur ar fhoirmiú fiobróis an ae go luath. Is próiseas casta de rannpháirtíocht multifactor agus multicell é foirmiú fiobróis hepatic. Sa phróiseas paiteolaíoch seo, is gréasán achrannach iad na hidirghníomhaíochtaí cille-chealla, ceall-cítocíní agus maitrís cille. Sa líonra seo, is féidir forbairt fiobróis hepatic a rialú trí bhealaí agus modhanna comharthaíochta éagsúla. Is gníomhaí clasaiceach de HSC é TGF-pi agus príomh-idirghabhálaí i pathogenesis fiobróis ae [28]. Is féidir le CPhGanna, echinacoside agus acteoside léirithe mRNA agus próitéiní TGF-pi/smad a bhaineann le cosán agus próitéiní i HSCanna a chosc.
Feidhmíonn TGF-pi a éifeachtaí ceallacha tríd an gcosán comharthaíochta smid, agus measadh gur príomh-idirghabhálaí é i bhforbairt fiobróis ae agus athlasadh. Nuair a dhéantar TGF-pi a cheangal leis an receptor TGF-p-cineál II, déanann an receptor cineál II kinase fosphorylates an bhfearann GS den receptor cineál I TGF-p, rud a fhágann go gníomhachtaítear an receptor cineál I [29]. Trí ghníomh p-smad2 agus p-smad3 ag dhá iarmhar serine i móitíf SSXS a gcríochfort C, cuirtear imoibrithe le sruth ón gcosán comharthaíochta smad trí ghníomhachtú gabhdóra cineál I [30]. Cruthaíonn P-smad2 agus p-smad3 coimpléisc oligomeric le smad4, ansin dul isteach sa núicléas agus déanann siad a ngníomhaíocht trascríobh bitheolaíoch. Mar sin, tarchuireann próitéiní smad comharthaí go díreach ón receptor kinase go dtí an núicléas [3i]. Ar an láimh eile, tá smad7 comhcheangailte go daingean le receptor TGF-pi, rud a fhágann nach féidir smad 2/3 a chur i ngníomh chomh maith le cosc ar na cosáin aistrithe comhartha [32]. Is féidir le Smad7 gníomhú chun bac a chur ar p-smad2 agus p-smad3, traslonnú núicléach coimpléisc smad gníomhachtaithe, agus gníomhachtú (CAGA) (9) -MLP-Luc, rud a fhágann go laghdaítear léiriú collagen I agus cosc iomlán ar thrasuíomh comhartha TGF-p. [33,34]. Léirigh ár dtorthaí gur féidir le CPhGanna, echinacoside agus acteoside slonn mRNA smad2 agus smad3 a laghdú, agus slonn mRNA smad7 a mhéadú; bac a chur ar sloinn próitéine smad2, p-smad2, smad3 agus p-smad3, agus slonn próitéin smad7 a uasghrádú, ag tabhairt le tuiscint go bhfuil ról ag CPhGanna, echinacoside agus acteoside freisin chun gníomhachtú HSC a chosc agus mar sin cosc a chur ar fhiobróis hepatic, ag cur béime ar fhrithshnáithíneach a d’fhéadfadh a bheith ann. meicníocht.
Taispeánadh gurbh é acteoside > CPhGs > echinacoside seicheamh éifeachtaí hepatoprotective na dtrí oibreán tástála. Chun na cúiseanna atá leis na difríochtaí sa mheicníocht trína gcosnaíonn CPhGanna, echinacoside agus acteosíd a chosaint ar fhiobróis ae a shoiléiriú tuilleadh, rinneadh anailís ar a struchtúir cheimiceacha. Is cosúil go bhfuil an moiety glycosíde alcóil feinitile ina struchtúr riachtanach don éifeacht hepatoprotective [35]. Is glycosíde dúbailte é Acteoside (C29H36Oi5), agus is triglycoside é echinacoside (C35H46O20), ie, tá glycosíde breise ag echinacoside ina struchtúr i gcomparáid le acteoside, rud a fhágann go dtiocfaidh méadú ar a mhéid spásúil. Tá an hepatoprotective nó cosc ar ghníomhaíocht HSC acteoside níos fearr ná sin de echinacoside, rud a d'fhéadfadh a bheith mar gheall ar bhac stéarach a bheith ann.
ae a chosaint: sliocht cistanche
4. Alt Turgnamhach
4.1. Ceimiceáin agus Imoibrithe
Ceannaíodh TGF-pi ó Peprotech (Rocky Hill, NJ, SAM). Ceannaíodh an líne cille HSC-T6 ó Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd (Wuhan, an tSín). Ceannaíodh Dimethyl sulfoxide (DMSO) ó Sigma Inc. (St. Louis, MO, SAM). Rinne Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, an tSín) priméirí Smad2, smad3 agus smad7 a tháirgeadh. Ceannaíodh trealamh sintéise cDNA céad snáithe Revert Aid ó Thermo Scientific (Shanghai, an tSín). Ceannaíodh trealamh PCR glas Quantifast SYBR ó QIAGEN GmbH (Hilden, an Ghearmáin). ceannaíodh antasubstaint p-smad2 (ser465/467), Smad3 (C67H9) coinín mAb agus p-smad3 (ser423/425) mAb ó Cell Signaling Technology (Boston, MA, SAM). Ceannaíodh antashubstaint Smad7 ó Boster (Wuhan, an tSín). Ceannaíodh antashubstaint pholaclónach Smad2 agus antashubstaint mhonaclónach p-actin ó Proteintech (Wuhan, an tSín). Rinneadh antashubstaint phríomhúil a bhrath trí úsáid a bhaint as tuaslagán Antashubstaint 2 chéim (Alc-Phos. Comhchuingeach, Frith-choine) agus tuaslagán Antashubstaint 2 chéim (Alc-Phos. Comhchuingeach, Frith-luch) a ceannaíodh ó Invitrogen™ (Carlsbad, CA, SAM). Ba ó Institiúid Bithinnealtóireacht Nanjing Jiancheng (Nanjing, an tSín) an trealamh measúnaithe dí-hidrigine lachtáit.
4.2. Ábhar Plandaí
Bailíodh C. tubulosa ó Tulufan, i réigiún uathrialaitheach Xinjiang Uirghur na Síne, i mí na Bealtaine 2006. D'aithin Jiang He, Institiúid Materia Medica Xinjiang, na hábhair planda mar C. tubulosa. Taisceadh eiseamal dearbhán ag Institiúid Materia Medica Xinjiang sa tSín.
4.3. Aonrú agus Íonú CPhGanna agus a Chomhdhúile
Baineadh riosóim thriomaithe agus slisnithe de C. tubulosa (6.0 kg) i ndiaidh a chéile trí huaire faoi aife le 70 faoin gcéad eatánól (4.8 L), agus baineadh an tuaslagóir ansin as na sleachta comhcheangailte go chun an sliocht eatánóil (1.146 kg) a thabhairt. Rinneadh na sleachta eatánóil a íonghlanadh le roisín AB-8 chun an t-eastóscadh amhfheinile-eatánóil gliocóis os cionn (CPhG s) a fháil. Tar éis d a thuaslagadh in uisce, rinneadh an gníomh breise a íonú le crómatagrafaíocht roisín macraporous AB-8 ionsúite ad chun sleasa iomlána glycó eatánóil feanile a fháil ó C. tubulosa (CPhGs, 210 g). Cuireadh CPhGanna i bhfeidhm ar cholún ODS OP{{1{0}} agus rinneadh iad a eluted as a chéile le meascáin de MeOH-H?.(0:1 -^1:0). Comhcheangail Elua tes i gcúig fhochodán de réir iompar TLC ag baint úsáide as an gcóras tuaslagóra CHCh-MeOH-H?.(6:4:0.5). Rinneadh spotaí a léirshamhlú tar éis iad a spraeáil le 1 faoin gcéad FeCih. Rinneadh codáin éagsúla a íonú arís agus arís eile le crómatagrafaíocht colún Sephadex LH{-20 le meatánól mar eluent, agus dhá glycosídí eatánóil feanile scoite amach ó na CPhGs. Deimhníodh a struchtúir mar echinacoside (C35H46O20) agus acteoside (C29H36O15) ag baint úsáide as MS, 1H-, agus MC-NMR [35], a socraíodh íonachtaí a bheith 99.17 faoin gcéad agus 98.92 faoin gcéad, faoi seach, ag UV-HPLC. Léirítear na struchtúir ofechinacoside agus acteoside i bhFíor 9.
4.5. Cinneadh Cainníochtúil ar CPhGanna
Crómatagrafaíocht leachta (HPLC) (LC{{{{{250}}Fostaíodh ionstraim HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, an tSeapáin) chun anailís a dhéanamh ar a bhfuil in echina coside agus cteoside sna CPhGs. Baineadh úsáid as colún Phenomenex Gemini ODS (250 x 4.6 mm, 5|^m) ag 30 céim . Baineadh úsáid as céim shoghluaiste isocratach comhdhéanta d'aigéad aicéiteach meatánól-aicéatrile-1 faoin gcéad (15:10:75, v/v/v) le haghaidh rith 40 nóiméad, ag ráta sreafa 0.6 mL/nóiméad, le UV a bhrath ag 334 nm.
4.6. Cultúr na Cille
Saothraíodh cealla HSC i meán modhnaithe Eagle (Ard-ghlúcóis) Dulbecco (DMEM, Beijing, an tSín) arna fhorlíonadh le 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, SAM), 10 0 peinicillin IU/mL agus 100 ^g/mL streiptimícin (HyClone, Logan, UT, SAM) i gorlann humidithe ag 37 céim le 5 faoin gcéad CO2. Rinneadh na cealla seo a fhoshaothrú go rialta le réiteach trypsin 0.25 faoin gcéad (1x) (HyClone, Logan, UT, USA) agus athraíodh an meán gach 2 lá. Ar dtús, saothraíodh cealla le DMEM ina raibh 10 faoin gcéad FBS ar feadh 48 h. Ansin cuireadh DMEM gan FBS in ionad an mheán chun na cealla a ocras ar feadh 12 uair an chloig. Iomadaíodh na cealla seo ar feadh 48 h agus Tar éis 48 h, bhí ocras ar serum le 0.5 faoin gcéad FBS ar feadh 12 h sular cuireadh 5 ng/mL TGF-&1 leis,
4.7. Luachanna IC50 a chinneadh
Tar éis gor thar oíche i meán ocras ina raibh {{{0}}.5 faoin gcéad FBS, síolaíodh cealla HSC i 96-pláta tobair ag dlús 5 x 104 cill/mL ar feadh 24 h. Cóireáladh cealla HSC le CPhGs, echinacoside agus acteoside ag tiúchan éagsúla (0, 3.90625, 7.8125, 15.625,31.25, 62.5, 125, 250, agus 500 ^ g / mL) ar feadh 48h. Bhí ceithre thobar ag gach tiúchan. Ag deireadh na cóireála, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-il)-2,5-bróimíd défheiniltetrasóiliam] (Sigma; 5 mg/mL) leis agus gor na cealla ar feadh 4 h eile. Cuireadh DMSO (200 rL) le gach tobar tar éis an sárshaothar a bhaint. Tar éis an pláta a chroitheadh ar feadh 10 nóiméad ar shaker, fuarthas na luachanna IC50 tríd an ionsúiteacht a thomhas ag tonnfhad 490 nm ag baint úsáide as ionstraim lipéadaithe einsím (Tagarmharc PLUS, Hercules, CA, SAM), rinneadh an measúnú seo faoi thrí. Ba iad na luachanna IC50 de CPhGs, echinacoside agus acteoside ná 119.125, 520.345 agus 6.999 Rg/mL, faoi seach.
4.8. Na Éifeachtaí Cosc Iomadaithe Ceall agus Inmharthanacht Cille
Nochtadh cealla HSC do thiúchan éagsúla CPhG (25,50,100 Rg/mL), echinacoside (125,250,500 Rg/mL) agus acteóisíd (1.5,3, 6 Rg/mL). Cuireadh tiúchain éagsúla CPhG, echinacoside agus acteoside i bhfeidhm ar an pláta i gceithre tobar as a chéile agus goraíodh iad ar feadh 48 h. Chinn measúnú MTT na héifeachtaí coiscthe iomadú cille agus leibhéal na hinmharthanachta cille (bunaithe ar ghníomhaíocht LDH scaoileadh ó chealla damáiste isteach sa supernatant [36]) a thomhas. Ríomhadh an ráta coiscthe ag baint úsáide as an bhfoirmle seo a leanas [37]:
Ráta toirmisc ( faoin gcéad ) " [1 — (meán-ionsú an ghrúpa turgnamhach/meán-ionsú an ghrúpa rialaithe bhán)] x 100 faoin gcéad
De réir threoir an fheiste,
LDH (U/L) {{0}} (OD tomhais — rialú OD)/(OD caighdeánach — blankOD) x 0.2 mmol/L x 1000
Léirigh ár réamh-staidéar nach raibh tionchar ag CPhGanna, echinacoside agus acteoside ar inmharthanacht na gceall.
4.9. Gníomhaíochtaí Frith-iomadúla ag TGF-^1
Measadh le fada go bhfuil baint ag HSC arna ghníomhachtú ag TGF-p1 le fiobróis ae, agus tá cosc ar fhás HSC molta mar mhodh chun fiobróis ae a chóireáil [36,38]. Cinneadh éifeachtaí frith-iomadúla CPhG, echinacoside agus acteoside ar HSCanna arna ngníomhú ag TGF-p1 le measúnacht MTT [39]. Ag baint úsáide as na nósanna imeachta agus tiúchan drugaí mar a thuairiscítear, an
I measc na ngrúpaí turgnamhacha bhí an grúpa rialaithe, grúpa TGF-pi, TGF-pi agus grúpaí tiúchana éagsúla drugaí. Saothraíodh gach grúpa cille seachas an grúpa rialaithe le DMEM ina raibh 5.0 ng/mL TGF-p1 (gan FBS) ar feadh 24 h. Ríomhadh gníomhaíocht choisctheach ar iomadú cille mar 100 x (ionsú cumaisc chóireáilte — ionsú solais chúlra)/(ionsú samhla — ionsú solais chúlra).
4.10. Trascríobh Droim ar Ais- Imoibriú Slabhra Polymerase (RT-PCR)
Cinneadh an leibhéal slonn mRNA de smad2, smad3 agus smad7 ag PCR fíor-ama. Chun slonn mRNA i gcealla HSC a chinneadh, síolaíodh na cealla (5 x 104 chealla) i bplátaí sé thobar le 3.0 mL DMEM le 10 faoin gcéad FBS agus goraíodh iad thar oíche ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO2. Tar éis na meáin chultúir a athrú go DMEM saor ó shéiream, cuireadh CPhG (100,50,25 卩g/mL), echinacoside (500,250,125 昭/mL) agus acteoside (6, 3,1.5 ^g/mL) leis na toibreacha. Tar éis gor ar feadh 48 h le CPhGanna agus cumadóireachta monaiméir, baineadh RNA iomlán ag baint úsáide as imoibrí TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAM) agus corraithe go bríomhar le clóraform ar feadh 15 s. Tar éis ligean dó seasamh ag teocht an tseomra ar feadh 3 nóiméad, lártheifneoiríodh an lysate ag 12,000 xg ar feadh 15 nóiméad ag 4 céim . Cuireadh deascadh RNA sa chéim uiscí le isopropanol, agus aistríodh an chéim uiscí uachtarach chuig feadán microcentrifuge nua. Bhí deascadh RNA trí eatánól 0.75 faoin gcéad a chur leis, tar éis an fheadáin microcentrifuge agus lártheifneoiriú ag 12,000 xg ag 4 céim ar feadh níos mó ná 5 nóiméad. Baineadh an sútha talún agus triomaíodh an RNA ag teocht an tseomra ar feadh 5-10 nóiméid. Dearadh na primers (Sangon) ag baint úsáide as Baisc Primer 3, agus tá siad liostaithe i dTábla 4. normalaíodh na torthaí go dtí mRNA na géine coimeádta p-actin mar rialú inmheánach agus cuirtear i láthair iad mar leibhéil mRNA coibhneasta. Rinneadh frithghníomhartha le 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM primer pair, 8.5 uisce driogtha, agus 2.5 rl cDNA.
Rinneadh gach imoibriú slabhra polaiméire faoi na coinníollacha seo a leanas: 95 céim ar feadh 3 nóiméad, ansin 40 timthriall de 10 s ag 95 céim, 30 s ag 55 céim, agus 10 s ag 55 céim -95 céim le síneadh, agus ina dhiaidh sin tomhas fluaraiseachta amháin. Cuireadh síos ar na torthaí deiridh leis na luachanna coibhneasta (2_AACt). Ba é iQ5 Real Time PCR Braite System a rinne an ríomh agus an anailís.
4.11. Anailís Blot an Iarthair
Ullmhaíodh sleachta cille iomlána ag baint úsáide as maolán Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) le 1 faoin gcéad coscaire protease Halt agus 1 faoin gcéad mhanglaim inhibitor Halt phosphatase (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Úsáideadh an próitéin iomlán chun smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 agus smad7 a bhrath. Rinneadh an tiúchan próitéine a thomhas agus a chainníochtú le modh Bradford. Scaradh próitéin (10-30 Rg) ar fhoirmiú SDS-PAGE 10 faoin gcéad agus aistríodh go seicní fluairíde polaivinileideéin (PVDF) (Millipore, Boston, MA, SAM). Cuireadh bac ar membranes ar feadh 1h ag teocht an tseomra le 5 faoin gcéad albaimine serum bó, agus na hantasubstaintí príomhúla (antashubstaint pholaclónach smad2, antasubstaint p-smad2, mAb coinín smad3 agus mAb coinín p-smad3, caolú 1:1000; coinín mAb de smad7, 1). :200 caolú, antashubstaint mhonaclónach p-actin, caolú 1:5000) gor ag 4 céim thar oíche. An Alk-Phos comhfhreagrach. goraíodh antasubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha ag teocht an tseomra. Ar deireadh, nite na seicní trí huaire le saline 1 x Tris-HCl le 0.1 faoin gcéad Tween 20, agus scanadh agus léirshamhlú comharthaí ag Córas Íomhá GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, SAM). Rinneadh anailís densitometric ar phróitéiní leasa agus normalaíodh é go p-actin ag bogearraí GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). Baineadh úsáid as p-actin mar an rialú inmheánach.
4.12. Anailís staitistiúil
Cuireadh sonraí in iúl mar mhodh 土 diall caighdeánach (SD). Rinneadh anailís staitistiúil ag baint úsáide as bogearraí SPSS 16.0 (Ollscoil Leighis Xinjiang). Baineadh úsáid as anailís bhrabúis chun luachanna IC50 a anailísiú. Ríomhadh tábhacht na difríochta trí thástáil ANOVA aontreo, agus measadh go raibh luachanna le p < 0.05="" suntasach="" ó="" thaobh="">
5. Conclúidí
Mar fhocal scoir, léiríonn CPhGanna ó C. tubulosa agus a chomhpháirteanna echinacoside agus acteoside éifeachtaí suntasacha frithshnáithíneacha. Ina measc, is é gníomhaíocht acteoside an ceann is cumhachtaí, agus tá gníomhaíocht na CPhG idir an dá chomhdhúil. D’fhéadfadh bac ar ghníomhachtú comharthaíochta TGF-p1/Smad a bheith mar an mheicníocht bhunúsach trína gcosnaíonn CPhGanna in aghaidh galar ae ainsealach a bhaineann le fiobróis, agus is iad echinacoside agus aicteóisíd an bonn ábhair frithshnáithíneach éifeachtach de C. tubulosa.
Buíochas:Thacaigh Fondúireacht Náisiúnta Eolaíochta Nádúrtha na Síne (81260624) leis an taighde seo. Ba mhaith leis na húdair buíochas ó chroí a ghabháil leis an Ollamh Tao Liu as feabhas a chur ar an scríbhneoireacht sa pháipéar seo.
Ranníocaíochtaí Údair:Ceapadh agus dhear TL, JZ, S.-PY, LM agus S.-LZ na turgnaimh. Rinne S.-PY, TL agus JZ anailís ar na sonraí. Scríobh S.-PY agus JZ an lámhscríbhinn. Rinne TL, LM agus JZ athbhreithniú ar an lámhscríbhinn. Léigh na húdair go léir an lámhscríbhinn deiridh agus d'fhaomh siad.
Coinbhleachtaí Leasa:Ní dhearbhaíonn na húdair aon choinbhleacht leasa.
Tagairtí
1. Subramoniam, A. ; Pushpangadan, P. Forbairt fítea-leigheas do ghalair ae. J. Pharmacol Ind. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Meicníochtaí galair: Meicníochtaí fiobróis hepatic agus impleachtaí teiripeacha. Nat. Clin. Cleachtadh. Hepatol Gastroenterol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Rolla, FJ; Boyles, J. ; Bissell, DM Lipicítí hepatic: Na príomhchealla a tháirgeann collaigine i ngnáth-ae francach. Proc. Natl. Acad. Sci. SAM 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Fiobróis hepatic a aisiompú一Fíoras nó fantaisíocht? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Meicníocht na fiobróis hepatic agus na cineálacha cur chuige teiripeacha féideartha a thuiscint. Araib J. Gastroenterol. 2012, 18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Peadar, H.; Fitheach; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. I Flora na Síne, 23ú heag.; Coiste Eagarthóireachta Flora na Síne: Acadamh Eolaíochtaí na Síne, Beijing, an tSín, 2013; lch. 1-16.
7. Coimisiún Pharmacopoeia na Síne d'Aireacht Sláintíochta Daon-Phoblacht na Síne. Pharmacopoeia na Síne; Cuid 1; Teach Foilsitheoireachta an Tionscail Cheimiceach: Beijing, an tSín, 2010; lch. 126.
8. Li, J. ; Huang, D.; He, L. Éifeacht roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) ar thocsaineacht atáirgthe i lucha a tharlódh de bharr glicóisíd Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Traidisiún. smig. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y . ; Liao, J. ; Tang, Y. ; Zhang, P.; Tan, C. ; NIH.; Wu, X. ; Li, N.; Coscairí comhiomlánaithe Jia, X. ACE agus pláitíní ó Tamarix hohenackeri Bunge (plandaí óstach Herba Cistanches) ag fás i Xinjiang. Pharmacogn. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B. ; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Feabhsú colitis dextran sulfáit sóidiam-spreagtha i lucha ag sliocht echinacoside-saibhrithe de Cistanche tubulosa. Phytother. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Spreagann Ko, KM Herba Cistanches rothaíocht redox cheallacha glutathione trí speicis ocsaigine imoibríocha a ghintear ó riospráid mitochondrial i cardiomyocytes H9c2. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Máirtín, A. ; Clynes, M. Aigéad fosfatase: Críochphointe le haghaidh tástálacha tocsaineachta in vitro. Cill Vitro. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gambó, A.; Déanann Rojkind, M. TGF-01 slonn maitrís metalloproteinase-13 a mhodhnú i gcealla stellate hepatic trí mheicníochtaí casta a bhaineann le p38MAPK, PI3-kinase, AKT, agus p70S6k. Táim. J. Fisiol. Fisiol ae Gastrointtest. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J. ; Tang, SY; Nguyen, D.; Rialaíonn Alliston, T. Load foirmiú cnámh agus léiriú Sclerostin trí mheicníocht atá ag brath ar TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J. ; Prunier, C. ; Fearann, N. ; Lallemand, F. ; Maoile, A. ; Comhlachaíonn Atfi, A. C-Meitheamh leis an Sciála oncoprotein agus cuireann sé gníomhaíocht trascríobh Smad2 faoi chois. J. Biol. Ceimic. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N. ; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; sé, M.; Scott, C.; et al. Geataí ciorcad géanómaíoch gabhdóir Vitimín D/SMAD freagairt hepatic snáithíneach. Cill 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Éifeachtaí Pills Fufang Biejia Ruangan ar fiobróis hepatic in vivo agus in vitro. Domhanda J. Gastroenterol. 2013, 19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I. ; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T. ; Okita, K. Méadaíonn leigheas luibhe Sho-saiko-to (TJ-9) miotalloproteinases maitrís slonn (MMPanna) le léiriú laghdaithe ar choscóir fíocháin metalloproteinases (TIMPanna) i gcill stellate francach. Sci Saol. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M. ; Chen, J.; Tsai, C. ; Wang, W. ; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY Ról TGF-01 agus cítocíní i modhnú fiobróis ae ag Sho-saiko-to i múnla ligated ducht francach/s bile. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, marcóirí bithcheimiceacha CE, comhpháirteanna seachcheallacha i fiobróis ae agus cirrhosis. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Cong, D. ; Zheng, S.; Lu, Y. Foinse agus ról na myofibroblasts i fiobróis ae. smig. Cógaslann. Tarbh. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Máirtín Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Múnla ischemia-reperfusion i gcorda an dromlaigh francaigh: staidéar ar inmharthanacht cille agus comharthaí apoptosis. Int. J. Clin. Cait. Paitól. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H. ; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Tocsaineacht nanacháithníní agus forbhreathnú ar shamhlacha turgnamhacha reatha.... An Iaráin Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
