CUID Ⅰ: Ról SIK1 in Aistriú Géarghortaithe Duán go Galar Duán Ainsealach
Mar 25, 2022
Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com
Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 & et al.
Cúlra
Gortú duáin géarmhíochaine(AKI), galar coitianta arb é is sainairíonna é laghdú ar an ráta scagacháin glomerular (GFR) agus méadú ar creatiníne serum [1], é a mheas mar fhachtóir riosca d’fhorbairt agus do dhul chun cinn CKD[2,3]. Le déanaí, tá an AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach) tá an t-aistriú anois ar cheann de na háiteanna is mó a bhfuiltear ag déanamh staidéir air ar ghalair duáin. Cé go dtuairiscítear go bhfuil ról ríthábhachtach ag athlasadh, EMT, agus fiobróis i ndul chun cinn AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul [4,5], meicníocht mhóilíneach chruinn AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)níl an t-aistriú soiléir fós.
cistanche galair duáin a chóireáil agus teip duánach a chosc
Kinase Inducible Salann 1(SIK1) ina bhall den teaghlach kinases próitéin AMP-gníomhachtaithe (AMPKs), a imríonn ról lárnach i rialáil meitibileacht, maireachtáil cille, agus fás [6, 7]. Tá sé léirithe ag staidéir go bhfuil cosc ar SIK1(Kinase Inducible Salann 1)cuireann sé EMT chun cinn, as a dtagann aistriú agus metastasis siadaí[8-10]. Thairis sin, tuairiscíodh go SIK1(Kinase Inducible Salann 1)rialaíonn sé go diúltach gníomhachtú spreagtha TLR NF-kB agus léirithe caolaithe de chitocínín pro-athlastacha [11]. Ina theannta sin, léirigh fianaise atá ag teacht chun cinn nasc idir SIK1(Kinase Inducible Salann 1)agus galair duáin [6,12]. Mar shampla, SIK1 a rialáil(Kinase Inducible Salann 1)aisiompaíodh an t-iomadú cealla mesangial ard-spreagtha ag glúcóis, agus carnadh maitrís eischeallach (ECM) trí chosc a chur ar léiriú FN agus PAI-1, a bhfuil baint ag an dá cheann le neamhoird fibrotic, mar glomerulosclerosis [6,13]. Mar sin, tuairimíonn muid go bhfuil SIK1(Kinase Inducible Salann 1)d’fhéadfadh baint a bheith aige le dul chun cinn AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul, arb iad is sainairíonna EMT, athlasadh, agus fiobróis duánach.
Is cosán comharthaíochta casta ardchaomhnaithe é an cosán WNT/ -catenin a rialaíonn próisis bhitheolaíocha éagsúla, mar fhorbairt orgáin, hoiméastáis fíocháin, agus carcanaigineas [14, 15]. Cé go bhfuil sé ciúin sa ghnáth-duáin fásta, faightear go bhfuil sé athghníomhachtaithe i galair duáin éagsúla, lena n-áirítear gortú duáin géarmhíochaine, nephropathy diaibéitis, fiobróis interstitial, agus galair duáin chisteach [16]. Ina theannta sin, tuairiscítear go bhfeabhsaítear fiobróis duánach nuair a dhéantar an cosán WNT/ -catenin a thost, rud a chuireann moill ar dhul chun cinn AKI-CKD.(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)i ngortú spreagtha I/R [17]. Ach cibé acu SIK1(Kinase Inducible Salann 1)páirt a ghlacadh san AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)Tá an t-aistriú trí mhodhnú a dhéanamh ar chonair WNT/ -catenin fós le soiléiriú a thuilleadh.
Léiríonn fianaise atá ag teacht chun cinn go n-imríonn Seilide agus Twistl, na fachtóirí trascríobh EMT, ról tábhachtach i bpataigineas fiobróis duánach[18-20]. Tuairiscíodh gur chuir scriosadh coinníollach Twistl nó Seilide i gcealla epithelial feadánacha cóngaracha bac ar EMT, ag maolú fiobróis idirstitial i fiobróis duánach arna spreagadh go turgnamhach i lucha [21]. Ag cur san áireamh gur móilíní suntasacha iad Seilide agus Twist1 atá suite le sruth ó chosán WNT/ -catenin, rinneamar tuairimíocht go bhféadfadh ról ríthábhachtach a bheith acu freisin i SIK1(Kinase Inducible Salann 1)idirghabháil AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul.
Mar sin, sa staidéar seo, bhí sé mar aidhm againn ról agus meicníocht SIK1(Kinase Inducible Salann 1) in AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul, a sholáthróidh sprioc theiripeach nua do chosc agus cóireáil chliniciúil ar fhiobróis duánach agus a sholáthróidh bealach nua chun moill a chur ar dhul chun cinn AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul.
cistanche cóireáil galair duáin
abhair agus modhanna
Othair agus samplaí fíocháin
D'fhormheas Coiste Eitice Taighde Cliniciúil Ospidéal Cúige Shandong Cleamhnaithe le hOllscoil Shandong an staidéar. Bailíodh samplaí duán daonna ó othair le AKI(Gortú duáin géarmhíochaine) diagnóisíodh bunaithe ar bithóipse duánach, agus fuarthas na samplaí duánach sna grúpaí rialaithe ó fhíochán para-ailsearach na n-othar a raibh siadaí duáin orthu a ndearnadh resection máinliachta orthu. Caomhnaíodh na samplaí fíocháin i nítrigin leachtach agus shínigh gach othar an toiliú feasach de réir Dhearbhú Heilsincí.
Tógáil AAV9-Sik1(Kinase Inducible Salann 1)
Thóg GENECHEM (Shanghai, an tSín) víreas athchuingreach adeno-ghaolmhar (AAV9-Sik1) agus rialú víreas-diúltach adeno-ghaolmhar (AAV9-NC). AAV athchuingreach9-Cuimsíonn veicteoir víreas adeno-ghaolmhar Sik1 GV467 tionscnóir, réigiún códaithe antashubstainte, réigiún códaithe próitéine fluaraiseachta glas EGFP, agus réigiún códaithe próitéin chlibe 3FLAG. Tá cumas an veicteora AAV9 chun duáin a thrasduchtadh fíoraithe (Comhad breise 1).
Ainmhithe agus modhanna samhaltú
Tá cláir thurgnamhach samhaltaithe agus leantacha ceadaithe ag Coiste um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Ollscoil Shandong. Sholáthair Lárionad Ainmhithe Turgnamhach Ollscoil Shandong lucha C57BL/6 4-6 seachtaine d’aois agus meáchan 15-20 g agus leithdháileadh iad go randamach i 4 ghrúpa: grúpa rialaithe (Rialú), gnáth-lucha arna chóireáil le grúpa AA( AA), lucha AA cóireáilte le AAV{6}}Sik1 group(AAV9-Sik1 móide AA), lucha AA cóireáilte le AAV9-ghrúpa NC (AAV9-NC móide AA) . Instealladh AA (10 mg/kg) do lucha sa ghrúpa AA go hinpeiritónach, agus instealladh PBS do lucha sa ghrúpa rialaithe. Ar an 3ú, 7ú, 14ú, agus 28ú tar éis instealladh AA, bailíodh an fual 24 h de lucha i gcliabhán meitibileach agus stóráladh an súthach ag -20 céim C tar éis lártheifneoraithe. Rinneadh an fhuil a lártheifneoiriú ag 3000r ar feadh 10 nóim, agus rinneadh an forshnáthán a stóráil ag -20 céim .24 h próitéin fual, creatiníne serum (Scr), agus tomhais nítrigine úiré fola (BUN) ag an anailísí uathoibríoch bithcheimiceach. Braith ELSA Serum IL-1 agus TNF-. Ansin, rinneadh na lucha a íobairt agus a mheá. Ina dhiaidh sin bhí na duáin excised agus a mheá. Roinneadh na samplaí duáin go léir ina dhá chuid, ceann acu socraithe i 4 faoin gcéad paraformaildéad le haghaidh staining histological, agus an ceann eile a stóráil faoi-80 céim le haghaidh PCR fíor-ama agus blotaí Thiar a bhrath.
Histeolaíocht agus imdhíon-histochemistry
Tar éis iad a shocrú i 4 faoin gcéad paraformaldehyde, bhí na samplaí duáin díhiodráitithe, trédhearcach, leabaithe i pairifín, agus roinnte i slices 4 μm-tiubh. Ina dhiaidh sin, bhí na sleamhnáin dewaxed, hiodráitithe, agus dhaite. Le haghaidh anailís histolaíochta duánach, úsáideadh staining HE, staining PAS, agus staining trichrome Masson de réir threoracha an mhonaróra. Le haghaidh anailíse imdhíon-histochemical, goraíodh rannóga le hantasubstaint phríomhúil i gcoinne SIK1(Kinase Inducible Salann 1)(51045-1-AP, Proteintech, USA), E-cadherin (20874-1-AP, Proteintech, USA), -SMA (ab32575, Abcam, USA), COL1(bs-10423R, Bioss , Beijing, an tSín) ag 4 céim thar oíche. Tar éis gor leis an antashubstaint thánaisteach, cuireadh an DAB leis, agus ina dhiaidh sin frithdhúnadh núicléach le hematocsailín. Ar deireadh, breathnaíodh na híomhánna faoi mhicreascóp (Leica, an Ghearmáin). An céatadán de dhathú dearfach do SIK1(Kinase Inducible Salann 1), E-cadherin, -SMA, agus COLl a thomhas trí úsáid a bhaint as bogearraí cainníochtúla Image-Pro móide 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) [22].
Cultúir agus cóireáil cille
Saothraíodh cealla epithelial feadánacha proximal daonna (HK2) i meán DMEM (Gibco, SAM) arna fhorlíonadh le séiream bó féatais 10 faoin gcéad (FBS) (Gibco, SAM) agus 1 faoin gcéad peinicillin-streptomycin (Sigma, SAM) ag 37 céim C in a. atmaisféar humidified ina bhfuil 5 faoin gcéad CO, . Díscaoileadh aigéad Aristolochic (AA)(Sigma, USA) i DMSO go 1 mg / mL agus déileáladh le cealla leis an tiúchan deiridh ag 10 μmol / L, 20 μmol / L, 40 μmol / L, agus 60 μmol / L, agus caitheadh an méid céanna DMSO leis an ngrúpa rialaithe.
Aistriú veicteora lentiviral agus aistriú siRNA Tógann an shRNA lentiviral sprioc SIK1(Kinase Inducible Salann 1), -catenin agus shRNA scrofa, chomh maith le ró-eisbhrú lentiviral veicteoir do SIK1(Kinase Inducible Salann 1)agus veicteoir rialaithe folamh a thóg Cyagen (Guangzhou, an tSín). Tá na seichimh sprice liostaithe mar seo a leanas: SIKI shRNA:5'-GCGCGTGCATTGATTACTATC-3';
sochair cistanche Desert: cóireáil galair duáin ainsealach
Torthaí
SIK1(Kinase Inducible Salann 1)a íosrialáil in AKI(Gortú duáin géarmhíochaine)
Ag cur san áireamh go bhfuil SIK1(Kinase Inducible Salann 1)Tá ról suntasach aige maidir le gortú duáin, ar dtús bhraitheamar léiriú SIK1(Kinase Inducible Salann 1)i bhfíocháin duáin AKI(Gortú duáin géarmhíochaine)othair agus AKI(Gortú duáin géarmhíochaine)lucha. Léirigh staining immunohistochemistry, ní hamháin in othair ach i lucha, an SIK1(Kinase Inducible Salann 1)tá léiriú na bhfeadán duánach i rialú níos airde ná mar atá in AKI(Gortú duáin géarmhíochaine)grúpa, a thug le fios go bhfuil SIK1(Kinase Inducible Salann 1)a íosrialáil le linn AKI(Gortú duáin géarmhíochaine)(Fig.la,b). Thairis sin, rinneamar smáthú trichrome HE agus Masson chun anailís a dhéanamh ar na hathruithe histeapaiteolaíocha i samplaí duáin AKI.(Gortú duáin géarmhíochaine)othair (Fig. 1c). I gcomparáid le rialú, breathnaíodh staining HE ar chealla epithelial tubular duánach, meathlú folúis, agus éidéime idir-roinne sa ghrúpa AKI. Ina theannta sin, i gcomparáid le rialú, chonacthas dathú trichrome Masson ar chealla feadánacha leacaithe, teorainn scoite scoite, agus línéadaigh feadánacha méadaithe sa ghrúpa AKI. Le chéile, léirigh na torthaí seo go léir go raibh SIK1(Kinase Inducible Salann 1)d'fhéadfadh ról a bheith aige sa ghortú tubular.
Fíor.1 Rinneadh íosrialú ar SIK1 in AKI(Gortú duáin géarmhíochaine).Íomhánna staining imdhíon-histochemical ionadaíocha de SIK1 i Rialú agus AKI(Gortú duáin géarmhíochaine)othair. Barra scála=50 μm. Léirigh an graf an anailís chainníochtúil ar SIK1 i ranna daite imdhíonhistochemically.b Íomhánna staining imdhíon-histochemical ionadaíocha de SIK1 i Rialú agus AKI(Gortú duáin géarmhíochaine)lucha. Barra scála=50 μm. Thaispeáin an graf an anailís chainníochtúil ar SIK1 i gcodanna le daite imdhíonhistochemically. c Íomhánna ionadaíocha de HE agus staining trichrome Masson i bhfíocháin duáin AKI(Gortú duáin géarmhíochaine)othair. Barra scála=10 μm. Taispeántar sonraí mar mheán±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1(Kinase Inducible Salann 1)a íosrialáil in AKI-CKD arna spreagadh ag AA(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)lucha trasdula
Chun samhail lucha de AKI-CKD a fháil(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)aistriú, instealladh againn AA intraperitoneally isteach i lucha. I gcomparáid le rialú, léirigh na lucha a ndearnadh cóireáil orthu le AA táirgeadh méadaithe fachtóirí athlastacha, EMT, agus fiobróis duánach (Fíor 2a-d). Ina theannta sin, an t-innéacs duáin, serum Scr, BUN, agus 24 h próitéin urinary-feabhsaithe ar chóireáil AA (Fig. 2e). Ina theannta sin, lagaigh AA struchtúr duánach, rud a d'fhág atrophy cealla epithelial tubular duánach, méadú aoil, agus méid éagsúil de sil-leagan snáithíní collaigine i tubulointerstitium (Fig.2f). Thug gach ceann thuas le fios go raibh an AKI-CKD spreagtha ag AA(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)Bunaíodh múnla aistrithe go rathúil. Ról SIK1 a fhiosrú(Kinase Inducible Salann 1)in AKI-CKD AA-spreagtha(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach) trasdul, rinneamar measúnú ar a léiriú sna samplaí de duáin lucha ghann le AA. Fuaireamar SIK1(Kinase Inducible Salann 1)agus p-SIK1(Kinase Inducible Salann 1)(Thr182)laghdú ar bhealach a bhí ag brath ar am tar éis instealladh AA (Fig.2g), a léiríonn ról féideartha do SIK1(Kinase Inducible Salann 1)i rialáil AKI-CKD AA-spreagtha(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul.
Fíor.2 Rinneadh íosrialú ar SIK1 in AKI-CKD arna spreagadh ag AA(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)lucha trasdula.anailís ELISA ar IL-1 , agus léiriú TNF i ngrúpaí éagsúla lucha. b blot an iarthair agus anailís PCR fíor-ama ar mharcóirí athlasadh agus fiobróis (Caspase1/p20/p10, FN agus COL1); c blot an Iarthair agus anailís PCR fíor-ama ar mharcóirí EMT (E-cadherin, Vimentin, agus -SMA). d Íomhánna staining imdhíonhistochemical ionadaíocha de E-cadherin i ngrúpaí éagsúla lucha. Barra scála=50 μm. Léirigh an graf an anailís chainníochtúil ar E-cadherin i ranna daite imdhíonhistochemically. e An t-innéacs duáin, Scr, BUN, agus leibhéil próitéin fual 24 h i ngrúpaí éagsúla lucha. f Scáthán histeolaíoch ionadaíoch (HE, PAS, agus staining trichrome Masson) d'fhíocháin na nduán i ngrúpaí éagsúla lucha. Barra scála=50 μm. g Anailís blot an Iarthair ar leibhéil próitéin SIK1 agus p-SIK (Thr182) i lucha C57BL/6. Taispeántar sonraí mar mheán±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Ró-léiriú SIK1(Kinase Inducible Salann 1)maolaithe AKI-CKD AA-spreagtha(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul
Chun feidhm SIK1 a shonrú(Kinase Inducible Salann 1)in AKI-CKD AA-spreagtha(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul, chuireamar AAV9-SikI isteach i vein eireaball na lucha chun SIK1 a ró-shíneadh(Kinase Inducible Salann 1). Fuaireamar amach tar éis dúinn a bheith instealladh le AAV9-Sik1, gur tháinig feabhas suntasach ar mhífheidhm duánach AA-spreagtha, mar is léir ó leibhéil laghdaithe an innéacs duán, Scr, BUN, agus próitéin fuail 24 h (Fig.3a). Thug PCR fíor-ama le fios go raibh AAV9-Sik1(Kinase Inducible Salann 1)freagra athlastach faoiseamh AA-spreagtha (Fíor 3b). Ina theannta sin, tá AAV9-Sik1(Kinase Inducible Salann 1)feabhas suntasach ar an damáiste histeapaiteolaíoch a tharlódh de bharr AA(Fig.3c). Ina theannta sin, thug torthaí staining imdhíon-histochemical le tuiscint go ndéanfaí AAV9-Sik1(Kinase Inducible Salann 1)fiobróis idirstitial maolaithe agus EMT i bpróiseas AKI-CKD AA-spreagtha(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul (Fig.3d). Ar an iomlán, léirigh na torthaí seo go raibh SIK1(Kinase Inducible Salann 1)bhí ról cosantach aige in AKI-CKD arna spreagadh ag AA(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul.
sochair sláinte cistanche: feabhas a chur ar fheidhm na duáin
SIK1(Kinase Inducible Salann 1)a íosrialáil i gcealla HK2 a bhfuil cóireáil AA orthu Tá sé léirithe ag líon mór staidéar go bhfuil tubule cóngarach na duán ar cheann de na príomhspriocanna díobhála in AKI(Gortú duáin géarmhíochaine), agus féadfaidh gortú tubule cóngarach ról tábhachtach pathophysiologic a imirt i bhforbairt AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul. Chun measúnú breise a dhéanamh an bhfuil SIK1(Kinase Inducible Salann 1)a íosrialáil in vitro, dhíríomar ar chealla HK2 sa staidéar seo. Trí thástálacha CCK8 a dhéanamh, roghnaímid 10 μmol/L AA mar an tiúchan is fearr le haghaidh turgnaimh ina dhiaidh sin (Comhad breise 2). Go comhsheasmhach, léirigh cóireáil AA méadú ar athlasadh, EMT, agus fiobróis i gcealla HK2 (Fíor 4a-c), ag moladh gortú cealla HK2 AA-spreagtha in vitro. Ina dhiaidh sin, scrúdaíomar leibhéil próitéine SIK1(Kinase Inducible Salann 1)agus tháinig laghdú suntasach ar SIK1(Kinase Inducible Salann 1)agus p-SIK1(Thr182) i gcealla HK2 i láthair AA (Fíor 4d). Ina theannta sin, bhraitheamar suíomh SIK1(Kinase Inducible Salann 1)próitéin i gcealla HK2 roimh agus tar éis nochtadh do AA trí staining Immunofluorescence. Sna cealla neamhspreagtha, SIK1(Kinase Inducible Salann 1)breathnaíodh sa núicléas agus sa chiteaplasma araon. Nuair a dhéantar cóireáil le AA, cuirtear SIK1 in iúl(Kinase Inducible Salann 1)laghdaíodh agus an SIK1(Kinase Inducible Salann 1)braitheadh de réir a chéile sa núicléas (Comhad breise 3). Le chéile, léirigh na torthaí seo go raibh baint ag SIK1 le gortú cealla HK2 de bharr AA.
Fíor 3 Maolaíodh róléiriú SIK1 ar AKI-CKD AA-spreagtha(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul.a. An t-innéacs duáin, Scr, BUN, agus 24 h leibhéil próitéin urinary i ngrúpaí éagsúla de lucha. b Anailís PCR fíor-ama ar leibhéil mRNA Caspase 1, agus IL-1 i ngrúpaí éagsúla lucha. c Baineadh úsáid as staining trichrome HE, PAS, agus Masson chun measúnú a dhéanamh ar athruithe histeolaíocha agus ar mhéid na fiobróis tubulointerstitial. Barra scála=50 µm. d Íomhánna staining imdhíon-histochemical ionadaíocha de phróitéin E-cadherin, -SMA, agus COLI i ngrúpaí éagsúla lucha. Barra scála=50 µm. Léirigh na graif an anailís chainníochtúil ar E-cadherin, -SMA, agus COL1 i ranna daite imdhíonhistochemically. Taispeántar sonraí mar mheán ± sd *P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
sliocht cistanche: feabhas a chur ar fheidhm duánach
Ró-léiriú SIK1(Kinase Inducible Salann 1)gortú cealla HK2 feabhsaithe AA-spreagtha
Chun ról SIK1 a shoiléiriú tuilleadh(Kinase Inducible Salann 1)i gortú cealla HK2 spreagtha ag AA, rinneamar línte cille a rialaíonn SIK1 go cobhsaí(Kinase Inducible Salann 1)trí ionfhabhtú lentivirus ar chealla HK2 (Comhad breise 4). Mar thoradh ar ró-eisiúint SIK1 tháinig méadú suntasach ar E-cadherin agus ar athbhrú Caspasel/p20/p10, Vimentin, COLI, agus Fspl i gcomparáid leis na cealla rialaithe spreagtha le AA amháin (Fíor 4e, f). Ina theannta sin, ró-léiriú SIK1(Kinase Inducible Salann 1)bac ar chumas imirce na gceall HK2 a tharlódh AA (Fíor 4g). Le chéile, léirigh na torthaí seo go bhfuil SIK1(Kinase Inducible Salann 1)bhí sé cosanta i gcoinne díobhála AA-spreagtha i gcealla HK2.
Fig.4 Rinneadh íosrialáil ar SIK1 i gcealla HK2 a raibh cóireáil AA orthu agus d'fheabhsaigh ró-léiriú SIK1 gortú cealla HK2 AA-spreagtha.a. Brath ELISA ar leibhéil IL{{0}} agus TNF- i gcomharthach cealla HK2 cóireáilte le 10 μmol/L AA ar feadh 0 h, 24 h, 48 h, agus 72 h. b Anailís blot an Iarthair ar leibhéil próitéin Caspase 1/p20/p10, E-cadherin, ZO-1, Vimentin, agus -SMA i gcealla HK2 cóireáilte le 10 μmol/L AA ar feadh 0 h, 24 h, 48 h, agus 72 h, leis an éifeacht is mó tar éis 72 h de chóireáil. Baineadh úsáid as -actin mar rialú. c Anailís PCR fíor-ama ar tháscairí fiobróis luatha (COLI, PAI-1, agus MMP9) leibhéil mRNA i gcealla HK2 cóireáilte le 10 μmol/L AA ar feadh 72 h. d Anailís blot an Iarthair ar leibhéil p-SIK1(Thr182) agus SIK1 i gcealla HK2 cóireáilte le 10 μmol/L AA ar feadh 0 h, 24 h, 48 h, agus 72 h. e Anailís blot an Iarthair ar Caspase1/p20/p10, E-cadherin, Vimentin, Fsp1, agus COL1 i gcealla HK2 a bhfuil cóireáil orthu le veicteoir SIK1 (veicteora ró-eisbhrú lentiviral SIK1) i láthair 10 µmol/L AA nó cóireáilte le 10 µmol /L AA amháin ar feadh 72 h. f Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha de E-cadherin agus Vimentin i gcealla HK2. Barra scála=50 μm. g Torthaí aistrithe ionadaíocha cealla HK2. Barra scála=50 μm. Taispeántar sonraí mar mheán±sd *P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
sliocht cistanche deserticola: cóireáil galair duáin
SIK1(Kinase Inducible Salann 1)cosán rialaithe comharthaíochta WNT/ -catenin in vivo agus in vitro
Ag cur san áireamh an ról ríthábhachtach atá ag cosán WNT/ -catenin in AKI-CKD(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)trasdul, rinneamar iniúchadh ar cibé acu an bhfuil SIK1(Kinase Inducible Salann 1)rialaíodh cosán WNT/ -catenin. In vivo turgnaimh, thugamar faoi deara go ró-léiriú SIK1(Kinase Inducible Salann 1)chuir sé bac ar leibhéil próitéine WNT1, p- -catenin (Y654), agus -catanin núicléach in AKI-CKD arna spreagadh ag AA(Gortú duáin géarmhíochaine i galar duáin ainsealach)lucha (Fig.5a). Chun iniúchadh breise a dhéanamh an bhfuil SIK1(Kinase Inducible Salann 1)rialaíodh an cosán WNT/ -catenin in vitro, chuireamar slonn SIK1 ina thost(Kinase Inducible Salann 1)ag shRNA i gcealla HK2 (Comhad breise 5). Ag teacht leis na torthaí in vivo, tháinig méadú suntasach ar leibhéil mRNA - catenin, TCF4, agus LEF1 (Fig.5b) de bharr tosta SIK1. Ina theannta sin, leagadh síos SIK1(Kinase Inducible Salann 1)mhéadaigh siad na leibhéil phróitéin -catenin agus p- -catenin(Y654)(Fíor 5c). Ina theannta sin, an knockdown de SIK1(Kinase Inducible Salann 1)chuir sé traslonnú núicléach -catenin chun cinn (Fíor 5d). I dteannta a chéile, mhol na sonraí seo go ndéanfaí SIK1(Kinase Inducible Salann 1)rialaíodh cosán WNT/ -catenin in vivo agus in vitro.
Fíor.5 Rialaíonn SIK1 an cosán WNT/ -catenin in vivo agus in vitro.a. Anailís blot an iarthair ar SIK1, WNT1,p- -catenin (Y654), agus leibhéil próitéin núicléach -catenin i ngrúpaí éagsúla lucha. b Anailís PCR fíor-ama ar -catenin, TCF4 agusLEF1 i HK2cells cóireáilte le SIK1 shRNA nó Scramble shRNA. c Anailís blot an Iarthair - catenin, agus p- -catenin(Y654) i gcealla HK2 cóireáilte le SIK1 shRNA nó Scramble shRNA.d Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha de -catenin i gcealla HK2. Barra scála=50 um. Taispeántar sonraí as meán±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Tá cosán comharthaíochta WNT/ -catenin i gceist le gortú cealla HK2 AA-spreagtha
Chun iniúchadh a dhéanamh ar cibé an raibh ról ag cosán WNT/ -catenin i ghortú cealla HK2 AA-spreagtha, rinneamar tástáil ar na leibhéil slonn WNT1, núicléach -catenin, agus p - - catenin (Y654) tar éis cóireála AA. Léirigh torthaí blot an Iarthair gur tháinig méadú suntasach ar WNT1, núicléach -catenin, agus p- -catenin(Y654) tar éis spreagadh AA (Comhad breise 6a). Thairis sin, léirigh staining imdhíonfhluaraiseachta traslonnú núicléach -catenin (Comhad breise 6b), rud a thugann le tuiscint gur féidir le spreagadh AA cosán comharthaíochta WNT/ -catenin a ghníomhachtú. Ag cur san áireamh gurb é -catenin an chomhpháirt lárnach den chosán WNT/ -catenin, ní fheadar an rialaíonn rialáil -catenin gortú cealla HK2 arna spreagadh ag AA. Mar sin, leag muid síos go seasta - catenin ag lentivirus shRNA i gcealla HK2 (Comhad breise 6c). Agus thugamar faoi deara gur chuir -catenin cnag síos lagaithe ar an slonn Caspasel, IL-1 , Vimentin, PAI-1 , agus MMP9 a tharlódh le AA agus chuir sé slonn E-cadherin chun cinn (Fig.6a, b). Thairis sin, léirigh -catenin cealla shRNA spreagtha le AA imirce laghdaithe go suntasach i gcomparáid leis na cealla rialaithe - catenin spreagtha le AA amháin (Fig.6c). Nuair a chuirtear le chéile iad, thug na torthaí seo le fios go raibh baint ag an gcosán WNT/ -catenin le gortú cealla HK2 de bharr AA.
Fíor.6 Tá baint ag cosán comharthaíochta WNT/B-catenin le gortú HK2cells AA-spreagtha.Cóireáladh cealla HK2 le B-catenin shRNA nó Scramble shRNA i láthair anailís PCR 10 umol/LAA.real-ama ar Caspase1.L-1BE-cadherin.Vimentin, PA/-1.agus Leibhéil mRNA MMP9 i gcealla HK2. b Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha de E-cadherin agus Vimentin i HK2cells. Barra scála=50 um.c Torthaí aistrithe ionadaíocha cealla HK2. Barra scála=50 um. Taispeántar sonraí mar mheán±sd*P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Tá conair chomharthaíochta WNT/ -catenin ag teastáil le haghaidh SIK1(Kinase Inducible Salann 1)gortú cealla HK2 idirghabhála de bharr AA
Chun staidéar a dhéanamh an bhfuil SIK1(Kinase Inducible Salann 1)gortú cealla HK2 rialaithe AA-spreagtha tríd an gcosán comharthaíochta WNT/ -catenin, -laghdaíodh -catenin tuilleadh i SIK1(Kinase Inducible Salann 1)cnag síos cealla HK2. I gcomparáid le cealla leagain SIK1, laghdaíodh leibhéil mRNA Caspasel, COLl, agus Vimentin, agus na leibhéil mRNA de E-cadherin (Fíor 7a). Bhí torthaí blot West-ern comhsheasmhach le PCR fíor-ama, ag taispeáint tosta - catenin agus SIK1 aisiompú an íosrialú E-cadherin, upregulation Caspasel/p20/p10 agus Vimentin tharlódh ag SIK1(Kinase Inducible Salann 1)cnag anuas (Fig. 7b).
I dteannta a chéile, léirigh na torthaí seo gur chuir cosc ar -catenin freagra athlastach droim ar ais, EMT, agus dul chun cinn fiobróis arna idirghabháil ag SIK1(Kinase Inducible Salann 1)leagadh síos, a léiríonn go láidir go raibh conair WNT/ - catenin ag teastáil le haghaidh SIK1(Kinase Inducible Salann 1)gortú cealla HK2 idirghabhála de bharr AA.
Fíor.7 Tá conair WNT/ -catenin ag teastáil le haghaidh gortú cealla HK2 idirghabhála SIK1 arna spreagadh ag AA.Rinneadh cealla HK-2 a chomh-aistrithe le SIK1 agus B-catenin shRNA nó aistríodh iad le SIK1 nó -catenin shRNA ina n-aonar, agus ansin cóireáilte le 10 umol/L AA le haghaidh anailíse PCR fíor-ama 72 ha ar Caspase1, COL1. E-cadherin, agus Vimentin abairt. b. Anailís blot an iarthair ar Caspase1/p20/p10, E-cadherin, agus Vimentin expression.Taispeántar sonraí mar mheán±sd*P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Ról Twist1 i gortú cealla HK2 AA-spreagtha
Ag gníomhú mar EMT-TFs, is féidir le Twistl EMT agus fiobróis duáin a chur chun cinn. Sa staidéar seo, fuaireamar amach gur chuir AA léiriú próitéine agus mRNA Seilide agus Twist1 chun cinn agus chuir knockdown -catenin bac ar léiriú Seilide agus Twist1 a tharlódh ag AA(Fig.8a), rud a léiríonn Seilide agus Twist1 atá suite i sruth an tsrutha de -catenin agus d’imir sé. ról i gortú cealla HK2 AA-spreagtha. Chun ár hipitéis a fhíorú, leagamar Twist1 le siRNA (Comhad breise 7) agus rinneamar PCR fíor-ama agus anailís blot an Iarthair. De réir mar a bhíothas ag súil leis, i gcomparáid le cealla rialaithe spreagtha le AA amháin, laghdaíodh léiriú Vimentin, agus COLI agus méadaíodh ZO-1 i gcealla siRNA Twist1 i láthair AA, rud a thugann le tuiscint gur mhaolaigh ciúnas Twist1 tarlú EMT. agus dul chun cinn fiobróis duánach arna spreagadh ag AA (Fíor 8b agus c).
Fíor.8 Ról Twist i gortú cealla HK2 arna spreagadh ag AA.blot an Iarthair agus anailís PCR fíor-ama ar leibhéil Seilide agus Twist1 i gcealla HK2. b Anailís PCR fíor-ama ar leibhéil Twist1, COL1, ZO-1, agus Vimentin i gcealla HK2 cóireáilte le Twist1 siRNA nó NC siRNA.c. Anailís blot an Iarthair ar leibhéil Twist1, ZO-1, agus vimentin i gcealla HK2 cóireáilte le Twist1 siRNA nó NC siRNA. Taispeántar sonraí mar mheán±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">