Cuid Ⅱ: Leithlisiú Treoraithe Dímhalaithe ar Dhéghlicóisídí Nua a Ionadaíodh d’Fhéinilpropanoid Ó Chisteantán Salsa Agus A nGníomhaíocht Chosc ar NÍL Táirgeadh i Macrophage
Mar 04, 2022
Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com
Mhol na comhghaolta COZY de H-2 le H-1a agus H-1b 3-grúpa meitibilbutenyl, fostruchtúr aglycone, agus na comhghaolta HMBC idir H{{ 4}} agus H-5 agus na carbóin oilifineacha, ag kC 120.7 (C-2) agus 136.4 (C-3). Bunaíodh dhá ghné siúcra trí anailís speictrim an NMR agus anailís speictrim HPLC ar an hidrealasáit aigéid, le patrún blúirí MS. Socraíodh gurbh é D-glúcóis agus L-rhamnose an cumraíocht iomlán díobh ag baint úsáide as anailís HPLC ar an hidrolysáit aigéad [17]. Sainmhíníodh na cineálacha siúcra seo mar -glúcós agus a-rhamnose trí thaisigh na bprótóin ainiméireacha a chúpláil. Thaispeáin an speictream 1H-1H COZY comhghaolta seicheamhacha ó H-13 go H-63 agus ó H-133 go H-633 (Fíor 4).
Mhol prótón glúcóis laghdaithe ag kH 4.70 (H-43) ionadaí aicile ar ghlúcós. Ón speictream HMBC, dhaingnigh an comhghaol idir H-43 agus C-9333 suíomh an ionadaí caffeoile. Mhol na comhghaolta HMBC idir H-13 agus C-1 (kC 64.5) agus idir H-33 (kH 3.68) agus C-133 (kC 101.2) suíomhanna gach ionadaí . Dá réir sin, socraíodh struchtúr 6 mar 3-methylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)({24}}O-(E)-caffeoyl- -D- glúcós-piranoside agus cistansalside B ainmnithe.
Cinneadh go raibh foirmle mhóilíneach de C26H38O13 le (móide ) -HR-ESI-QTOF-MS) ag Cistansalside C (12), púdar éagruthach donn, a léirigh buaic ag m/z 581.2213 [M móide Na] móide (calcd .do C26H38O13Na, 581.2205). Mhol ian saintréith ag m/z 163 go raibh ionadaí caffeoile sa struchtúr. Thug na blúirí iain ag m/z 325 agus m/z 471 le fios go raibh aonad rhamnose agus aonad glúcóis ann.
Léirigh comparáid idir speictream an NMR de 12 agus speictream 6 go raibh siad cosúil leis seachas an struchtúr aglycone. I speictream an NMR de 12, breathnaíodh dhá charbón paraifinic ag kC 38.0 (C-2) agus 24.4 (C-3) in ionad dhá charbón olaifíneacha ag kC 12{{16 }}.7 (C6) agus 136.4 (C-3) san aglycone de 6. Aistríodh na grúpaí meitile geirmeacha (kH 0.88) san agglycone de 12 suas an réimse i gcoibhneas le H-4 agus H-5 (kH 1.71 agus 1.63) san agglycone 6 (Tábla 2). Moladh gur grúpa búitile meitile 3- é an aglycone de 12, a dhaingnigh an speictrim 1H agus COZY NMR. Breathnaíodh buaiceanna an ghrúpa búitile meitile 3- ag 3.81 (1H, m, H{-1a), 3.48 (1H, m, H-1b), 1.71 (1H, m , H-3), 1.44 (2H, m, H{-2), agus 0.88 (H{-4, 5).
Athdhearbhaíodh dhá ghné de shiúcra san anailís HPLC ar an hidrolyzáit aigéid agus an anailís speictrim NMR chomh maith le patrún blúirí MS. Sainaithníodh cumraíochtaí absalóideach na siúcraí mar D-glúcóis agus L-rhamnose ag baint úsáide as anailís HPLC ar an hidrolysáit aigéad [17]. Daingníodh taise glúcóis agus taise a-rhamnose trí chúpláil tairisigh na bprótóin ainiméireacha. Thaispeáin an speictream 1H-1H COZY comhghaolta seicheamhacha ó H-13 go H-53, ó H-133 go H-333, agus ó H{{11} } go H-433 (Fíor 4).
Deimhníodh staid na gcomhábhar trí anailís HMBC. I speictream HMBC, tá na comhghaolta idir H-13 agus C-1 (kC 67.2), idir H-33 (kH 3.68) agus C-133 (kC 101.2) agus idir Braitheadh H-43 (kH 4.70) agus C-9333 (kC 165.7). Dá bhrí sin, socraíodh gurb é struchtúr 12 ná 3-meitil bhúitile-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)({25}}O-(E)-caffeoyl- -D-glúcós-piranoside agus ainmnithe cistansalside C.
Cinneadh go raibh foirmle mhóilíneach de C31H38O14 ag Cistansalside D (17), púdar donn éagruthach, ag an modh dearfach ardtaifigh ESI-QTOF-MS, a léirigh buaic ian adduct ag m/z 657.2147 [M móide Na] móide (calcd. le haghaidh C31H38O14Na, 657.2154). Iain blúirí lena n-áirítear [M móide H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] móide ian ag m/z 147, a [M móide H x Aglycone x Rha] móide ian ag m/z 351 agus a [M móide H x Aglycone] Braitheadh ian móide ag m/z 497 freisin. Thug ian saintréith ag m/z 147 le fios go raibh ionadaí cúmaróil i láthair ina struchtúr. Thug na blúirí iain ag m/z 351 agus m/z 497 le fios go raibh aonad rhamnose agus aonad glúcóis in ionad aicéitil ann.
Taobh na Cósta óluibh cistanche
Léirigh an speictream 13C-NMR láithreacht 31 adamh carbóin. Breathnaíodh dhá phrótón ainiméireacha ag kH 4.61 (1H, m, H-13) agus 4.60 (1H, s, H{{1{0}}) sna speictrim 1H agus HSQC . Léirigh an speictream 1H-NMR láithreacht grúpa meitile ag 1.97 (3H, s, aicéitil-CH3), tras-oilifin ag kH 7.55 (1H, d, J=15.9 Hz, H{{ 25}}) agus 6.34 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8333) agus dhá fháinne beinséine para-ionadaithe ag kH 7.53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) agus 6.79 (2H, d, J=6.9 Hz, H-2333, 6333)/ kH 6.98 (2H, d, J {{5 0}}.0 Hz, H-2, 6) agus 6.65 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) (Tábla 2) . Ó speictream NMR HMBC, na comhghaolta idir carbónáit charbóin ag kc 165.5 (C-9333) agus H-8333 agus idir H-2333, 6333, agus C-7333 (kc 145.4) grúpa (E)-couaroyl a mholadh. Dheimhnigh comhghaol HMBC idir buaic prótón meitile agus carbón carbónil ag kc 169.0 láithreacht grúpa aicéitil.
Moladh 4-grúpa hidroxyphenyl bunaithe ar chomhghaolta HMBC idir H-3, 5, agus carbón aramatacha ceathartha ag kC 155.6 (C-4) agus 128.6 (C-1) . Deimhníodh grúpa eitile hiodrocsaileáite ag na comharthaí COZY NMR ag kH 2.66 (2H, t, J=6.1 Hz, H{-7), 3.90 (1H, m, H{-8a ) agus 3.54 (1H, m, H-8b). Mhol na comhghaolta HMBC idir H-7 agus C-1 (kC 128.6) agus C-2, 6 (kC 129.7) 4-grúpa hidroxyphenylethyl, mar fhostruchtúr aglycone.
Athdheimhníodh dhá ghné siúcra, a moladh ó phatrún blúirí MS, ag anailís HPLC ar an hidrolysáit aigéid agus speictrim NMR. Rinneadh soiléiriú ar D-glúcóis agus L-rhamnose ag baint úsáide as anailís HPLC ar an hidrolysáit aigéad [17]. Bunaíodh tais-glúcóis agus taise a-rhamnose trí chúpláil tairisigh na bprótóin ainiméireacha. Thaispeáin an speictream 1H-1H COZY comhghaolta seicheamhacha ó H-13 go H-53 agus ó H-133 go H-633 (Fíor 4).
Ón speictream 1H-NMR, mhol an t-athrú íosraoin de H{-23 (kH 4.69) agus H-43 (kH 4.8{0) an suíomh ionadach aicile ar ghlúcós. Deimhníodh na naisc idir glúcós agus dhá ghrúpa aicile ag comhghaolta HMBC idir H-43 (kH 4.80) agus C{-9333 agus idir H-23 agus carbónil charbóin de ghrúpa aicéitile (kC 169.0). ). Thug comhghaolta HMBC idir H-33 (kH 3.95) agus C-1333 agus idir H-8 agus C-13 suíomhanna aglycone agus rhamnose. Dá réir sin, sannadh struchtúr 17 mar 4-hydroxyphenylethyl-2-O-aicéitil-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- couaroyl- -D-glucopyranoside agus cistansalside ainmnithe D.
Rinneadh Cistansalside E (18) a leithlisiú mar phúdar donn éagruthach. Cinneadh a fhoirmle mhóilíneach a bheith C31H38O14 ag 13C-NMR sonraí agus an modh dearfach buaic ardtaifigh ESI-QTOF-MS ag m/z 657.2166 [M móide Na] móide (calcd. le haghaidh C31H38O14Na, 657.2154). Ina theannta sin, braitheadh iain blúirí lena n-áirítear ian caffeoile ag m/z 163, [M móide H x Aglycone x Rha] móide ian ag m/z 367 agus ian [M móide H x Aglycone] ag m/z 513. Thug na hiain blúirí le fios go raibh aonad rhamnose agus aonad glúcóis in ionad aicéitil ann.
Mhol an speictream 1H-NMR go mbeadh dhá phrótón ainméireacha i láthair ag kH 4.63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) agus 4.60 (1H, s, H-133 ) agus dhá phrótón glúcóis aicile-ionadaithe ag kH 4.71 (1H, dd, J=8.9, 8.2 Hz, H-23) agus 4.81 (1H, dd, J=9.7 , 9.5 Hz, H-43). Mhol an speictream 1H agus HMBC go mbeadh grúpa aicéitil ag kH 1.94 (3H, s, aicéitil-CH3), agus (E)-caiféile ag kH 7.48 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7333), 7.02 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2333), 6.98 (1H, dd, J=8.1, 1.6 Hz, H-6333), 6.76 (1H,d, J=8.1 Hz, H-5333) agus 6.21 (1H, d, J=15.9 Hz, H{ {67}}) agus fáinne beinséine mona-ionadaithe ag kH 7.29 (2H, m, H-3, 5), 7.21 (2H, m, H-2, 6) agus 7.20 (1H, m, H-4) (Tábla 2). Mhol comhghaolta HMBC idir H-7 (2H, kH 2.80, m) agus C-1 (kC 138.8) agus idir H-7 agus C grúpa feinilmheitile, fostruchtúr aglycone. -2, 6 (kC 128.9) agus na comharthaí COZY NMR de H-7 le H-8a (1H, kH 3.99, m) agus H-8b (1H, kH 3.63, m).
Athdhearbhaíodh dhá ghné de shiúcra ag an anailís HPLC ar an hidrolysáit aigéid agus anailís speictrim NMR. Soilsíodh cumraíochtaí absalóideacha na siúcraí trí úsáid a bhaint as anailís HPLC ar an hidrealásáit aigéid, a deimhníodh gur D-glúcóis agus L-rhamnose [17] iad. Bunaíodh -glúcóis taise agus -rhamnose taise trí chúpláil tairisigh na prótóin ainiméireacha. Thaispeáin an speictream 1H-1H COZY comhghaolta seicheamhacha ó H-13 go H-53, ó H-133 go H-233, agus ó H{{11} } go H-333 (Fíor 4).
Ó speictream HMBC, déantar na comhghaolta idir H{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{1112}{112}}12}}}}} comhghaolta) agus C-8 (kC 69.4), idir H-23 agus carbónil charbóin de ghrúpa aicéitil (kC 169.1), idir Dheimhnigh H-33 (kH 3.95) agus C-133 (kC 102.0) agus idir H-43 (kH 4.81) agus C-9333 (kC 165.6) suíomh na n-ionadaí i an struchtúr. Mar sin, socraíodh gurb é struchtúr 18 ná feinileitil-2-O-aicéitil-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranoside agus ainmnithe cistansalside E.
Rinneadh an chuid is mó de na hionadaithe tras-cinnamoile a isiméiriú chuig an cis-isoform in vitro. Tuairiscíodh go ndéanann solas díorthaigh aigéad tras-cinnamic a thiontú ina cis-isoformanna [18,19]. Breathnaíodh ar chothromaíocht chomhshó tras-cis na n-ionadaí cinnamoyl go gcoimeádtar thart ar 70 faoin gcéad de na haonránaigh san tras-isoform. Maidir le prótóin olefin na foirme cis, buaiceanna ag thart ar 6.90 ppm(d, J=12~13 Hz, H-7333) agus 5.80 ppm (d, J=12~13 Hz, Bhí H-8333) inshannta sa speictream 1H-NMR, ach bhí buaicphointí ag thart ar 7.55 ppm (d, J=15.8 Hz, H{-7333) agus 6.40 ppm (d, J { Breathnaíodh {28}}.8 Hz, H-8333)le haghaidh claochlaithe [20]. Sa speictream 1H-NMR de mheascáin tras-cis, breathnaíodh buaiceanna do dhá phrótón ollaic (H-7333 agus H{-8333) sa chóimheas 7:3 (trans:cis). Bhí beanna 13C-NMR den fhoirm cis cosúil le buaiceanna an chlaochlaithe.
Comhábhair éifeachtacha ón gcistanche: acteosídí
Rinneadh tástáil ar na haonráití go léir le haghaidh a n-éifeachtaí coisctheacha ar tháirgeadh NÍL spreagtha ag LPS in RAW
Rinneadh tástáil ar na haonráití go léir le haghaidh a n-éifeachtaí coisctheacha ar tháirgeadh NÍL spreagtha ag LPS i gcealla RAW 264.7. Baineadh úsáid as Dexamethasone mar rialtán dearfach agus ba é a IC50 ná 7.0 uM. As na comhdhúile a tástáladh, comhdhúile 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{{{{0). Thaispeáin 24}}}} o 4.0 uM) agus 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) gníomhaíochtaí coisctheacha measartha ar shintéis do-induchtaithe NO, agus bhí na comhdhúile eile neamhghníomhach sa mheasúnacht seo (IC50 luachanna> 100 uM). Chun a fhíorú an raibh cíteatocsaineacht ag na comhdhúile seo, tomhaiseadh inmharthanacht na gceall trí úsáid a bhaint as measúnacht MTT. Mar thoradh air sin, níor léirigh aon cheann acu cíteatocsaineacht shuntasach (Fíor Forlíontach S6-1). Roghnaíodh na ceithre chomhdhúil seo chun meastóireacht a dhéanamh ar a ngníomhaíocht choisctheach i gcoinne an chosáin NF-λB i gcealla RAW 264.7 spreagtha ag LPS. Spreagadh cealla RAW 264.7 le LPS fosfar I入B agus NF-入B (p65) tar éis 0.5 h goir. Laghdaíodh fosfarylation NF-入 B (lch 65) go suntasach trí réamhchóireáil le comhdhúile 11, 13 agus 18 mar a léirítear in anailís blot an iarthair (Fíor 5). Mar sin, d'fhéadfadh comhdhúile 11, 13 agus 18 éifeachtaí frith-athlastacha a imirt trí chosc ar NF-入B i macrophages.
Fíor 5 .Éifeacht ceithre chomhdhúil ar fhosfarylation I入B agus NF-入B (p65) i gcealla RAW 264.7 spreagtha ag LPS. (A) Rinneadh na blotaí thiar i LPS agus i gcealla RAW 264.7 cóireáilte le samplaí; (B, C) Rinneadh na comharthaí imdhíonta a chainníochtú trí úsáid a bhaint as bogearraí anailísí Móilíneach/Dlúsiméadracht PC (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Tuairiscítear anailís densitometric ar isfhoirmeacha fosfarlaithe. NF- 入 B i gcill RAW 264.7 normalaithe go dtí an t-ábhar -actin.
3. Ábhair agus Modhanna
3.1. Turgnamh Ginearálta Nós imeachta
Rinneadh rothlaithe optúla a thomhas le polaraiméadar digiteach Jasco P-2000 (Jasco, Tóiceo, an tSeapáin). Taifeadadh speictrim UV ar speictriméadar Chirascan móide Ciorclán Dichroism (Chirascan, APL, UK). Taifeadadh speictrim IR ag baint úsáide as speictreafótaiméadar Jasco FT/IR-4200. Rinneadh mais-speictriméadracht ceathairphollaigh-ama-eitilte ianaithe leictrispré ardtaifigh (HR-ESI-qTOF-MS) ar Q-TOF LC/MS Agilent 6530 Cruinn-Aifreann atá feistithe le sraith Infinity Agilent 1260 (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA), agus ba é an colún a úsáideadh ná colún Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4.6 mm, 5 um). Baineadh úsáid as Bogearraí Stáisiún Oibre MassHunter chun sonraí a fháil.
Fuarthas speictream NMR 1D (1H agus 13C) agus 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) le Jeol LA 300 (Jeol, Tóiceo, an tSeapáin), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 agus Bruker AVANCE 800 speictriméadar HD in éineacht le crióprób (Bruker, Ettlingen, an Ghearmáin). Úsáideadh DMSO-d6 (Saotharlanna Iseatóp Cambridge, In Cistanche Andover, MA, SAM) mar thuaslagóir NMR agus beanna tagartha (kH 2.50 agus kC 39.5). Rinneadh crómatagrafaíocht colún (CC) trí úsáid a bhaint as Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, an tSualainn) nó glóthach shilice Kieselgel 60 (40–63 um, 230–400 mogalra, Airt. 9385; Merck, Darmstadt); , An Ghearmáin). Rinneadh crómatagrafaíocht tanaí-chiseal (TLC) ar phlátaí glóthach shilice F254 Kieselgel 60 réamh-brataithe (Airt. 5715; Merck). Braitheadh spotaí ar TLC agus úsáid á baint as lampa UV ag 254 nm agus 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, an Fhrainc). Rinneadh crómatagrafaíocht leachta meánbhrú (MPLC) ar cholún splanc shilice RediSep 120 g (Isco, Lincoln, NE, USA) agus glóthach shilice Kiesegel 60 (40-63 um, 230-400 mogalra, Art. 9385; Merck) ag baint úsáide as a Compánach combiflash (Isco). Ba é an córas crómatagrafaíocht leachtach ardbhrú (HPLC) ná Gilson HPLC atá feistithe le caidéal Gilson 321 agus brathadóir UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, SAM), ag baint úsáide as colúin ODS leath-ullmhaithe (Luna 5 um C18 (2) ). 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, SAM; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, An Ghearmáin; Inno C018 colún 12 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, An Chóiré). Córas comhghuaillíochta Waters 2695 a bhí sa chóras anailíseach RP-HPLC le brathadóir Photodiode Array (PDA) a996 (Waters Corp, Baile na nGallóglach, MA, SAM), agus ba é colún Hypersil™ BDS C18 an colún a úsáideadh (130 Å, id 150: 4.6). mm, 5 um, Thermo Scientific™). Ceannaíodh aigéad formach ó Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, An Chóiré). Ceannaíodh tuaslagóirí de ghrád HPLC ó Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, An Chóiré). Ceannaíodh H2SO4, Na2CO3, agus tuaslagóirí den chéad ghrád le haghaidh eastóscadh, codánúchán agus leithlisiú ó Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, An Chóiré). Ceannaíodh hidreaclóiríd eistir meitile L- agus D-cistéin agus o-toililisothiocianáit ó Tokyo Chemical Industry (Tóiceo, an tSeapáin).
3.2. Gléasra Ábhar
Na plandaí iomlána desalsa ciste, a bailíodh ón Shinjang Uyghur, a allmhairiú trí Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, An Chóiré). D'aithin an tOllamh Dr Jehyun Lee (Ollscoil Dongguk, Seoul, an Chóiré) iad. Cuireadh an t-eiseamal dearbhán (SNUPH2016-03) i dtaisce i nGairdín Luibhe na bPlandaí Íocshláinte, Coláiste na Cógaisíochta, Ollscoil Náisiúnta Seoul.
3.3. Eastóscadh agus Leithlis
Na plandaí iomlána triomaithe desalsa ciste(5.7 kg) a chopped agus a bhaintear trí huaire le MeOH (20 L) ag teocht an tseomra le sonication ar feadh 99 min. Tar éis an tuaslagóir a bhaint i bhfolús, cuireadh an sliocht amh (1.35 kg) ar fionraí i H2O (5 L), agus ansin é a dheighilt le EtOAc (5 L). Rinneadh an t-iarmhar EtOac (55.3 g) a dheighilt ina 16 chodán (E01-16) ar chromatagrafaíocht glóthach shilice eluting le CHCl3/MeOH (50:1–0:1, córas céim-ghrádán).
Cuireadh E08 (611.7 mg) faoi chrómatagrafaíocht leachta mheánbhrúite glóthach shilice (25 g) agus é eluithe le CHCl3/MeOH (18:1–0:1, córas céim-ghrádán) agus thug sé 11 chodán (E08a-k). Ó E08g, íonaíodh comhdhúile 13 (0.7 mg) agus 18 (0.6 mg) ag baint úsáide as colún Luna 5 um HPLC agus elution isocratic le 28 faoin gcéad aq. MeCN. íonú HPLC (Hypersil GOLD, 25 faoin gcéad aq. MeCN) de E08h (138.5 mg) comhdhúile arna gcur ar fáil 7 (10.6 mg), 8 (17.2 mg), 14 (13.4 mg) agus 17 (4.9 mg).
Glanadh tuilleadh E09 (1.15 g) ar cholún shilice-MPLC (2{0 g) le eluting le CHCl3/MeOH (1{0:1–0:1, céim- córas grádáin) chun 11 fo-chodán (E09a-k) a thabhairt. Cuireadh E09e (398.7 mg) faoi Sephadex LH-20 (MeOH) agus fuarthas ocht bhfo-chodán (E09e1-8). Glanadh E09e6 ina dhiaidh sin ag baint úsáide as colún Hypersil GOLD HPLC (22 faoin gcéad aq. MeCN) chun cumaisc 11 (0.4 mg) a úsáid. Ó E09e7, rinneadh comhdhúil 5 (0.6 mg) a íonghlanadh ag eluction isocratic ó cholún Luna 5 um HPLC le 40 faoin gcéad aq. MeOH.
Rinneadh E10 (1.2{0 g) a dheighilt ina naoi gcodán (E1{0ai) ar cholún Sephadex LH-20 eluting le MeOH. Ó E10g (147.5 mg), rinneadh comhdhúile 4 (13.4 mg), 9 (8.0 mg) agus 15 (5.0 mg) a leithlisiú ag scaradh HPLC (Inno, 23 faoin gcéad aq. MeCN). Rinneadh codán E10h (470.0 mg) a íonú ar cholún Hypersil GOLD ag elution isocratic (40 faoin gcéad aq. MeOH) chun comhdhúile 1 (3.8 mg), 10 (42.1 mg) agus 16 (3.0 mg) a tháirgeadh.
Cuireadh E11 (2.96 g) faoi Sephadex LH-20 eluting le MeOH chun naoi gcodán (E11a-i) a thabhairt. Bhí scartha E11e ag Sep-Pak cartúis C18 eluting céim ar chéim le 10 faoin gcéad , 20 faoin gcéad , 30 faoin gcéad , 50 faoin gcéad agus 100 faoin gcéad aq . MeOH chun seacht gcodán (E11e1-7) a thabhairt, agus Luna 5 um HPLC (28 faoin gcéad aq. MeCN) ina dhiaidh sin chun comhdhúile 3 (3.4 mg), 6 (1.4 mg) agus 12 (1.2 mg) a thabhairt.
Cuireadh E12 (19.0 g) faoi shilice MPLC (120 g) ag baint úsáide as córas céim-ghrádán CHCl3/MeOH chun sé chodán (18:1–{{{0:1) a thabhairt , E12a-f). Rinneadh crómatagrafaíocht ar E12f ar cholún Sephadex LH-20 (MeOH), rud a thugann seacht gcodán (E12f1-7). íonú HPLC (Hypersil GOLD, 25 faoin gcéad aq. MeCN) de E12f7 cumaisc 2 (3.3 mg). Ba iad na tuaslagóirí go léir a úsáideadh le haghaidh HPLC ná 0.05 faoin gcéad maolán aigéad formach. Ba é an ráta sreafa coitianta do chrómatagrafaíocht HPLC agus MPLC ná 3 agus 40 mL/nóiméad, faoi seach.
3.4.Characterization
Cistansalside A (5): púdar éagruthach donn; [ |20 x33.7 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3.18); IR (néata) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; Sonraí 1H-NMR (800 MHz) agus 13C-NMR(200 MHz), féach Tábla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M móide Na] móide 645.2146 (calc. le haghaidh C30H38O14Na, 645.2154).
Cistansalside B (6): púdar éagruthach donn; [ |20 x72.9 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Uasmhéid nm (log e) 333 (3.32); IR (néata) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-NMR (500 MHz) agus 13C-NMR (125 MHz)sonraí, féach Tábla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M móide Na] móide 579.2054 (calc. le haghaidh C26H36O13Na, 579.2048).
Cistansalside C (12): púdar éagruthach donn; [ |20 x61.6 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3.25); IR (néata) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; Sonraí 1H-NMR (800 MHz) agus 13C-NMR (200 MHz), féach Tábla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M móide Na] móide 581.2213 (calc. le haghaidh C26H38O13Na, 581.2205).
Cistansalside D (17): púdar éagruthach donn; [ |20 x51.1 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3.53), 315 (3.52); IR (néata) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; Sonraí 1H-NMR(400 MHz) agus 13C-NMR (75 MHz), féach Tábla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M móide Na] móide 657.2147 (calc. le haghaidh C31H38O14Na, 657.2154).
Cistansalside E (18): púdar éagruthach donn; [ |20 x59.2 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Uasmhéid nm (log e) 336 (3.22); IR (néata) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; Sonraí 1H-NMR (800 MHz) agus 13C-NMR(200 MHz), féach Tábla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M móide Na] móide 657.2166 (calc. le haghaidh C31H38O14Na, 657.2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Anailís
Rinneadh anailís mais-speictriméadrachta crómatagrafaíochta ar chóras LC sraith Infinity Agilent 126 (Agilent Technologies, Inc., USA). Colún SFCpak Crest C18T-5 a bhí sa cholún anailíse (id 15{{1{0}} : 4.6 mm, 5 um, Jasco, an tSeapáin). Is éard a bhí sa chéim shoghluaiste ná {{31}.1 faoin gcéad (v/v) aigéad formach i MeCN (A) agus uisce (B) ag baint úsáide as elution grádán 0–35 nóim (23 faoin gcéad A), 35–45 nóim ( 23-28 faoin gcéad A), 45-75 nóim (28 faoin gcéad A) agus 75-80 nóim (90 faoin gcéad A). Coinníodh an ráta sreafa ag 0.3 mL/nóiméad. Tomhaiseadh an ionsúchán ag 320 nm. Ba iad seo a leanas coinníollacha na foinse ESI: ráta sreafa an gháis a thriomú (N2), 10 L/nóiméad; teocht an gháis a thriomú, 350 céim; nebulizer, 30 psig; ráta sreafa gáis sheath, 12.0 L/nóim; teocht an gháis sheath, 350 céim; ribeach, 4000 V; sciméir, 60 V; octapole RF, 750 V; voltas blúirí, 180 V; mód dearfach. Oibríodh an córas faoi bhogearraí stáisiúin oibre Masshunter. Socraíodh an raon mais ag m/z 50–1000.
3.6.Aigéad Hidrealú
Rinneadh comhdhúile a hidrealú le 1 N H2SO4 (100 uL) a théamh le dabhach uisce ag 90 céim ar feadh 2 h, ansin neodraithe le tuaslagán uiscí sáithithe Na2CO3. Tar éis na réitigh a thriomú faoi shruth N2, díscaoileadh na táirgí agus na siúcraí caighdeánacha (D-Glc, L-Glc, L-Rha) i pyridine (100 uL) ina bhfuil hidreaclóiríd eistir meitile L-cysteine (0.5 mg). Díscaoileadh sampla L-rhamnose i pyridine (100 uL) ina raibh hidreaclóiríd eistir meitile D-cysteine (0.5 mg). Tar éis sin, téitear iad ag 60 céim le haghaidh 1 h. Déileáladh leis na réitigh le 1 uL (1.11 mg) de o-tolylisothiocyanate, a théitear arís ag 60 céim ar feadh 1 h. Rinneadh anailís dhíreach ar gach meascán deiridh ag RP-HPLC anailíseach (colún Hypersil™ BDS C18, 17 faoin gcéad aq. MeCN, 0.8 mL/nóim, 40 nóim, 35 céim ). Bhí tR na buaicphointe ag 21.9 agus 40.4 min ag an am céanna leis an díorthach thiocarbamoyl thiazolidine de D-glúcóis agus L-rhamnose, faoi seach.
3.7. cill Cultúr
Fuarthas macrophages Murine, RAW 264.7, ó Institiúid Taighde na Cóiré um Bitheolaíocht agus Biteicneolaíocht (Daejeon, An Chóiré), agus fásadh i meán RPMI ina raibh 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais agus 100 U/ml peinicillin/streiptimícin sulfáit. Goradh cealla in atmaisféar tais 5 faoin gcéad CO2 ag 37 céim .
3.8.Drugaí agus Ceimiceáin
Ceannaíodh RPMI, peinicillin agus streptomycin ó HyClone (Logan, UT, SAM). Ceannaíodh albaimin séiream buaibheach agus LPS ó Sigma (St. Louis, MO, SAM).
3.9.Táirgeadh NÍL a Thomhas
Rinneadh an tiúchan nítrít sa mheán cultúir a thomhas mar tháscaire ar tháirgeadh NÍL de réir imoibriú Griess. Síolaíodh na cealla ag 2: 105 chealla/tobar i 96-plátaí saothraithe tobair. Tar éis na cealla RAW 264.7 a réamh-chothú ar feadh 18 h, rinneadh na cealla a réamhchóireáil le comhdhúile (50 uM, 10 uM, 5 uM, nó 1 uM) agus spreagadh iad le LPS (500 ng/mL) ar feadh 24 h. Comhdhúile tástála tuaslagtha i DMSO. Déileáladh le cealla freisin le 0.05 faoin gcéad DMSO mar rialú feithicle. Saothraíodh cealla RAW 264.7 (2: 105 cill/tobar) i 96-plátaí tobair ag baint úsáide as RPMI gan feanól dearg agus réamhchóireáilte le samplaí ar feadh 0.5 h. Ba chúis le táirgeadh ceallach NÍL trí thiúchan deiridh LPS 500 ng/mL agus gor 24 h a chur leis. Tar éis goir, rinneadh 100 uL de mheáin choinníollach a mheascadh leis an méid céanna imoibrí Griess agus goraíodh é ar feadh 15 nóiméad. Rinneadh ionsúchán an mheascáin ag 540 nm a thomhas le léitheoir microplate ELISA (Tagarmharc, Saotharlanna Bith-Rad, Richmond, CA, SAM). Rinneadh comparáid idir na luachanna a fuarthas agus na tiúchain chaighdeánacha nítrít sóidiam a tuaslagadh in RPMI, agus ríomhadh na tiúchain nítrít sna meáin choinníollacha de chealla samplacha cóireáilte.
3.10.3-(4,5-Dimethylthiazol-2-il)-2,5-Bróimíd défheiniltetrasóiliam (MTT) Measúnú le haghaidh Inmharthanachta Cille
Síolaíodh cealla isteach i {{0}plátaí toibreacha ag dlús 5:104 cill/tobar agus goraíodh iad le meáin saor ó shéiream i láthair samplaí. Comhdhúile tástála tuaslagtha i DMSO. Déileáladh le cealla freisin le 0.05 faoin gcéad DMSO mar rialú feithicle. Tar éis goir ar feadh 24 h, cuireadh 10 ul MTT (5 mg/mL i saline) leis agus leanadh leis an gor ar feadh 4 h eile. Tiontaíonn dehydrogenase succinate mitochondrial i gcealla beo MTT go criostail formazan infheicthe le linn goir. Rinneadh na criostail formazan a thuaslagadh ansin i sulfocsaíd démheitile agus tomhaiseadh an t-ionsúcht ag 540 nm ag baint úsáide as léitheoir micreaphláta measúnaithe imdhíon-ionsorbent einsím-nasctha (ELISA) (Tagarmharc, Saotharlanna Bith-Rad). Ríomhadh inmharthanacht choibhneasta cille i gcomparáid le hionsú an ghrúpa rialaithe neamhchóireáilte. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí chóip.
3.11.Anailís Immunoblot
Rinneadh measúnú ar léiriú próitéine trí bhlotáil an iarthair de réir nósanna imeachta caighdeánacha. Go hachomair, saothraíodh cealla RAW264.7 i miasa saothraithe 6{{2{0}} mm (2: 1{06/mL), agus ina dhiaidh sin réamhchóireáil 50 uM de chomhdhúile . Nigh cealla faoi dhó i PBS fuar oighir (pH 7.4), athchuireadh na millíní cille i maolán lysis ar oighear ar feadh 15 nóiméad, agus baineadh an smionagar cille ansin trí lártheifneoiriú. Cinneadh tiúchan próitéine trí úsáid a bhaint as imoibrí measúnacht próitéine Bith-Rad de réir threoracha an mhonaróra. Measctha próitéin (20-30 ug) 1:1 le 2: maolán sampla (20 faoin gcéad gliocról, 4 faoin gcéad SDS, 10 faoin gcéad 2- ME, 0.05 faoin gcéad bromophenol gorm, agus 1.25 M Tris [pH 6.8]), luchtaithe ar 8 nó 15 faoin gcéad glóthacha SDS-PAGE, agus a reáchtáil ag 150 V ar feadh 90 min. Aistríodh próitéiní ceallacha go seicní défluairíde polaivinileideéin Immunoblot (Bith-Rad) ag baint úsáide as córas aistrithe leath-thirim Bith-Rad de réir threoracha an déantóra. Goradh na seicní ansin thar oíche leis na hantasubstaintí príomhúla p-NF-入B, NF-入B, pI入B agus -actin (Abcam, Cambridge, RA) faoi seach i saline maolánach Tris ina raibh 5 faoin gcéad bainne bearrtha agus 0.1 faoin gcéad Tween 20. An lá dár gcionn, nite na blotaí trí huaire le saline maolánach Tris (0.1 faoin gcéad Tween 20) agus goraíodh iad ar feadh 1 h le hantasubstaint thánaisteach frith-IgG comhchuingeach HRP (caolaithe 1:2{{{{50}–1) :20,000). Nite na blots arís trí huaire le saline maolánach Tris (0.1 faoin gcéad Tween 20), agus forbraíodh bannaí imdhíon-imoibríocha ag baint úsáide as an tsubstráit chemiluminescent ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SAM).
3.12.Anailís Staidrimh
Cuirtear sonraí turgnamhacha i láthair mar mheán an MLA. Socraíodh an leibhéal suntasachta staitistiúil trí anailís ar athraithis (ANOVA) agus t-thástáil Dunnett d'ilchomparáidí ina dhiaidh sin.p Measadh go raibh luachanna níos lú ná 0.05 suntasach.
Sliocht salsa cistanche
4. Conclúidí
Sa staidéar seo, rinneamar aonrú agus soiléiriú ar struchtúir na gcúig gliocóisídí ionadacha feanilpropanoid nua, ainmnithe cistansalside AE (5, 6, 12, 17, agus 18), chomh maith le 13 chomhdhúil aitheanta a aonrú agus a aithint, ag baint úsáide as straitéis dí-mhaolaithe. Cinneadh na comhdhúile aitheanta a bheith ina lipedoside AI (1) [21], 23-acetylacteoside (2) [22], isocistanoside C (3) [15], osmanthuside B (4) [21], epimeridinoside A ( 7) [15], cistanoside D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubuloside E (10) [16], cistanoside M (11) [15], isomartynoside (13) [24], salsaside C (14) [6], jionoside C (15) [25] agus salsaside F (16) [6]. Bunaíodh a struchtúir trí anailís a dhéanamh ar shonraí fairsinge speictreascópacha agus trí chomparáid a dhéanamh le sonraí tuairiscithe sa litríocht. Deimhníodh go ndearnadh struchtúir gliocóisídí arna n-ionadú feinilpropanoid a thuar go sealadach a mheaitseáil i gceart lena gcuid fíorstruchtúir.
Tairbhe sliocht salsa Cistanche
Tagairtí
1. Shimamura, H. ; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Cur faoi chois Gníomhaíocht Spreagtha SOS de Trp-P-1 ag Aigéid Shailleacha ó Cistanche salsa sa Tástáil Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu. Nat. Táirg. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Éifeachtaí Frith-Iomadú salsa Cistánach ar Dhul Chun Cinn Hipearpláis Phróstatach Neamhurchóideacha. An féidir. J. Fisiol. Cógaslann. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X. ; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; An Ghrian, S. Idirdhealú Mear na gCistánach Luibhe trí mhéarlorgaireacht infridhearg ilchéime a chomhcheangal le samhaltú bog neamhspleách ar analaí aicme (SIMCA). Speictrichim. Acta Cuid A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y. ; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Difreáil na gCistánacha Luibhe de réir méarloirg le speictriméadracht braite-mhaise crómatagrafaíochta leacht-eagar dé-óid ardfheidhmíochta. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H .; Karasawa, H. ; Miyase, T. ; Fukushima, S. Staidéir ar Chomhábhair Cistanchis Herba. V. Leithlisiú agus Struchtúir Dhá Ghlicóisídí Nua Phenylpropanoid, Cistanosides E agus F. Ceimic. Pharm. Tarbh. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6.Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Glycosides Nua ó Cistanche salsa. Helv. Chim. Acht 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamov, GA; Ternynko, II Staidéar comhdhéanamh ar chomhdhúile feanólacha de Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, ag fás i bPoblacht na Casacstáine. J. Ceimic. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Carnadh feabhsaithe de gliocóisídí feinileatánóideach trí bheathú réamhtheachtaithe do chultúr fionraí Cistanche salsa. Bithcheimic. Eng. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Feidhmíonn sliocht salsa Tachibana, H. Cistanche mar an gcéanna le próitéin-cheangal
polaisiúicríd-K (PSK) ar chineálacha éagsúla línte cille. J. Traidisiún. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F. ; Pú, X.-P. Cuireann gliocóisídí feanileatánóideach ó Cistanches salsa bac ar apoptóis arna tharlú ag 1-meitil-4-ian feinilpiridiniam i néaróin. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11.Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Coincheapa Nua, Cur Chuige Turgnamhach, agus Straitéisí Dímheabhrú chun Fítea-estrogens Úrscéalta a Fhionnadh ó Fhoinsí Nádúrtha. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Cuireann leithlisiú treoraithe dímhíolactha na n-aghaidh na n-aflavins ST agus lecanora DF ón bhfungas endophytic Setophoma sp. Fíteiceimic 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Páirc, H.-Y.; Li, J. ; Slebodnik, C. ; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Cnoc, R. ; TenDyke, K.; Sheáin, Y. ; et al. Comhdhúile antiproliferative agus antiplasmodial ó speiceas Streptomyces roghnaithe. Bioorg. Med. Ceimic. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14.Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Leithlisiú saponins triterpenoid hepatoprotective nua-threoraithe ó Celosiae Semen trí chrómatagrafaíocht leacht ardfheidhmíochta i dteannta le mais-speictriméadracht ianaithe leictreaspré mar aon le mais-speictriméadracht ceathairpóil-am-ama eitilte. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15.Zhang, J.; Li, C. ; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W. ; Li, Y. ; Ma, Z.; Tu, P. Straitéis bunaithe ar LTQ-Orbitrap do leigheas traidisiúnta Síneach fionnachtain aicme spriocdhírithe, sainaithint agus a cuid taighde omics: Cás-staidéar ar gliocóisídí feanileatánóideach i dtrí speiceas éagsúla de Cheistíní Luibhe. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F. ; Deyama, T. ; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Comhábhair Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Leithlisiú agus Struchtúir Glicóisíd Nua Phenylthanoid agus Gliocoside Nua Neolignan. Ceimic. Pharm. Tarbh. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T. ; Nakashima, T.; Ueda, T. ; Tomii, K. ; Kouno, I. Idirdhealú Facile ar Eantaiméirí Aldose ag HPLCistancheChem Chéim Droim ar ais. Pharm. Tarbh. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Ceann, ZQ; Xia, B. ; Li, N. Staidéar ar aigéad cis-cinnamic in Arabidopsis thaliana. Fisiol Plandaí. Bithcheimic. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Trans-Cis-Equilibrium Aigéad Hidroxycinnamic le linn Ionradaíochta Réitigh Uisciúla ag pH Éagsúla. Fíteiceimic 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
