Cuid 4: An tIdirghníomh Eipigineach Agus Trascriptómach a Mhapáil le linn Cruthú na Cuimhne agus Aisghairme sa Ensemble Engram Hippocampal

ali.ma@wecistanche.com

Pls cliceáil anseo go Cuid 3

Pls cliceáil anseo go Cuid 5

RNA- seq

ul uisce saor ó núicléas), ar feadh 30 nóiméad ag 37c le rocking milis. Aimplíodh blúirí DNA méadaithe agus barrchódaíodh iad ag baint úsáide as imoibriú PCR (1 timthriall; 5min - 72c, 30sec - 98c, 10 timthriall; 15sec - 98c, 30sec - 60c, 3min - 72c). Tar éis prótacal an mhonaróra, rinneadh DNA aimplithe a ghlanadh agus a íonú ag baint úsáide as coirníní AMPure 1.8x (coirníní AmpureXP, Beckman Coulter, A63880). Tar éis bithanalyzer QC maidir le méid agus dáileadh leabharlainne, cuireadh leabharlanna in ord ar ardán Illumina Nextseq 550 ag Ionad MIT BioMicro.

Cistanche agus Cistanches chun cuimhne a fheabhsú

Anailís ATAC-seq—Ailíníodh na sonraí fastq amh de 40-bp léite seicheamhú foirceann péireáilte le géanóm tagartha mm9 na luiche ag baint úsáide as Bowtie 2.0 i mód péireáilte50. Baineadh úsáid as bailiúchán Samtools51 chun dúblaigh PCR (rmdup) a shórtáil, a bhaint as, comhaid BAM a innéacsú (innéacs), agus staitisticí leabharlainne a ríomh (flagstat, féach Tábla Forlíontach 13). Rinneadh comhaid BAM a íosshampláil ó léitheanna a bhí ailínithe i gceart, i bpéireáilte agus uathúla go 50M. Rinneadh anailís ar bhuaiceanna crómatin oscailte ag baint úsáide as bogearraí MACS252 D'aithin Diffbind v1.16.353 réigiúin inrochtana difreálach (DARs) le paraiméadair agus socruithe réamhshocraithe chun DESeq2 a úsáid (scor; FDR < 0.01;="" athruithe="" fillte=""> 1.5). Aisghabh an pacáiste DiffBind maitrís iomlán na gcomhaireamh normalaithe (RPKM54). Ar feadh glúin de rianta bigwig, tógadh comhaid comhartha pileup (pileup blúirí in aghaidh an mhilliúin léamh) i bhformáid beathaisnéise trí úsáid a bhaint as buaicfheidhm glaonna MACS2 leis na bratacha -B –SPMR. Ansin, gineadh saibhriú huaire normalaithe (FE) thar rianta lambda ionchuir ag baint úsáide as feidhm bdgcmp ofMACS2 leis an socrú - m FE. Ansin aistríodh comhaid bedGraph go formáid bigwig.

Baineadh úsáid as uirlisí IGV55 chun comhaid bigwig a léirshamhlú. Baineadh úsáid as ChromHMM56 chun múnla stáit chromatin a bhunú ó dhá staidéar neamhspleácha a bhain úsáid as fíochán hippocampus mórchóir roimh agus tar éis turraing coise21,22 agus chun saibhriú DARs a fhilleadh thar mhúnla an stáit a chinneadh. Rinne uirlisí HOMER59 anailís saibhrithe móitíf57,58 agus anótáil buaic. Tá na cóid ar fad ar fáil i gcomhad bogearraí forlíontacha Eastóscadh RNA agus ullmhú leabharlainne - Lean an socrú agus an sórtáil láithreach (féach ullmhúchán fíocháin), cuireadh 4 ul de phróitéas leis an maolán díleá (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Aonration Kit do FFPE, Life Technologies, AM1975) . Goradh samplaí i mbloic teasa ar feadh 15 nóiméad ag 5{56 céim , ansin 15 nóiméad ag 80 céim . Ansin, cuireadh 0.75 ml de Trizol LS (TRIzol™ LS Imoibrí, Thermo Fisher Scientific, 10296028) agus 0.2 ml feanól: Tuaslagán clóiríform (Feanól : Clóraform: Isoamyl Alcól, 1 Phase, VWR International, K169) le gach sampla agus ina dhiaidh sin. croitheadh ​​​​bríomhar ar feadh 5 min ag teocht an tseomra (RT). Cuireadh an fionraí i bhfeadáin throma glóthacha ghlais Chéim (PLG, 5 Prime, 2302830) agus sníomhadh síos ag 13,000rpm ar feadh 5 nóiméad. Baineadh an chéim uisceach le haigéid núicléacha as na feadáin go feadán úr Eppendorf le méid comhionann eatánóil 100 faoin gcéad. Rinne trealamh Direct-zol™ RNA MicroPrep (Zymo Research, R2060) íonú RNA le haghaidh íonú RNA, de réir threoir an mhonaróra. Cuireadh eluted RNA (10 ul, DEPC) agus ansin a stóráil ag −80 céim . SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Baineadh úsáid as Pico Input Mamalian (Clontech, 635006) le haghaidh ullmhúcháin agus aimplithe na leabharlainne. Baineadh úsáid as 3 mhacasamhlú bhitheolaíocha (N=3) le haghaidh ullmhúcháin leabharlainne. Ullmhaíodh leabharlanna de réir threoracha an mhonaróra gan aon chéim bhreise ilroinnte (FFPE, rogha 2, féach lámhleabhar), le ídiú cDNA ribosomal agus aimpliú PCR deiridh (15 thimthriall). Cuireadh na leabharlanna in ord ar ardán Illumina HiSeq 2000 ag an MIT BioMicro Centre.

Anailís RNA-seq-Ailíníodh na sonraí fastq amh leis an tagairt luch mm9

genome ag baint úsáide as Bowtie 2.0. Phróiseáil Cufflinks 2.260 agus DEseq261 na léamha léarscáilithe ó chomhlachtaí géine (lena n-áirítear léite exons agus introns) le nóta géine tagartha UCSC mm9 chun flúirse tras-scríbhinní a mheas. Rinneadh léiriú géine difreálach agus anailísí iartheachtacha ag baint úsáide as DEseq2 agus scripteanna R saincheaptha. Rinneadh raidhse coibhneasta tras-scríbhinní a thomhas de réir blúirí in aghaidh an chileagraim eacsóin in aghaidh an mhilliúin blúirí a léarscáilíodh (FPKM).

Chun anailís a dhéanamh ar chláir thrascríobh, rinneadh measúnú ar léiriú gach géine le haghaidh difriúilcuimhnecéimeanna (Gníomhachtaithe -luath, Gníomhachtaithe -late, Athghníomhaithe) ag a n-athrú huaire log2 (log2FC) ón stát basal. D’éirigh le 1095 de ghéinte arna gcur in iúl go difreálach (DEGanna) na critéir scoite, inar thugamar faoi deara i gcomparáid amháin ar a laghad de luach-P de< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">

Is féidir le Cistanche cuimhne a fheabhsú

Gabháil comhréireachta crómasóim (Hi-C)

Rinneadh núicléis ó chealla seasta (féach ullmhú fíocháin) a shórtáil i bhfeadáin Eppendorf 1.5 ml ina raibh 500 ul maolán lysis fuar oighear úr (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0.2 faoin gcéad Igepal CA{{ 9}}, uisce de ghrád Pi agus PCR) agus reoite ar oighear tirim agus stóráilte ag −80c go dtí gur úsáideadh iad. Ullmhaíodh leabharlanna Hi-C as 100,000 cill/in aghaidh an ghrúpa (bailithe ó dhá ainmhí) ​​in dhá mhacasamhlú bhitheolaíoch, ag baint úsáide as lámhleabhar trealamh Hi-C Dovetail™ (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA). Cuireadh na sé leabharlann Hi-C in ord (deireadh péireáilte) ar ardán Illumina Nextseq 500. Baineadh úsáid as píblíne HOMER Hi-C chun déantúsáin thurgnamhacha a scagadh mar chiorclánú, féin-ligations agus dúbailt PCR. Ailíníodh léamha scagtha le genome na luiche tagartha (mm9) agus próiseáladh tuilleadh iad ag baint úsáide as píblíne HOMER HI-C.

Baineadh úsáid as uirlisí Hi-C HOMER chun anailís phríomh-chomhpháirt (PCA) a dhéanamh ar na sonraí Hi-C chun urranna fo-núicléacha (A agus B) a aithint ag taifeach 50 Kb (féach bogearraí forlíontacha). Chun anailís a dhéanamh ar lasc urrann, rinneamar na luachanna PC1 a dhealú idir na grúpaí ar dtús. Ina dhiaidh sin d’aithníomar na haistrithe BtoA is airde mar réigiúin ina bhfuil athrú PC1 os cionn an 90ú peircintíl agus na haistrithe AtoB is airde de réir mar a athraíonn réigiúin le PC1 faoi bhun an 10ú peircintíl. Ós rud é go rialaítear urranna fo-núicléacha mar aonaid de na céadta cileabón, chomhdhlúthaíomar codanna AtoB nó BtoA 50 Kb as a chéile a bhí laistigh d'achar 100 Kb óna chéile. Chuireamar suas fearann ​​comhdhlúite a bhí níos lú ná 200 Kb i méid iomlán. Níor breithníodh lasc urrann ach amháin má athraíodh luach diúltach go luach dearfach (agus vice versa). Ar deireadh, rinneadh comparáid idir luachanna dearfacha agus diúltacha na chéad chomhpháirte idir na trí dhaonra néaróin (Basal, Gníomhachtaithe - luath agus Gníomhachtaithe - déanach).

Gabháil tionscnóir Hi-C

Lean socrú agus sórtáil (féach ullmhú fíocháin) rinneadh cealla a shórtáil i bhfeadáin Eppendorf 1.5 ml ina raibh 500 ul maolán lysis fuar oighear úr (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0.2 faoin gcéad Igepal CA{ {9}}, uisce de ghrád Pi agus PCR), reoite ar oighear tirim agus a stóráil i −80c go dtí gur úsáideadh iad. Ullmhaíodh leabharlanna Hi-C ó 10,000 cill / in aghaidh an ghrúpa (N=3–4), mar a cuireadh síos cheana62, le roinnt modhnuithe. Sníomhadh samplaí (4 céim , 1,600 g ar feadh 20 nóiméad) agus cuireadh an millíní ar fionraí i 400 ul de mhaolán Cutsmart 1.2x (New England Biolabs,

USA). Rinneadh díleá den chéad srian mar a thuairiscítear sa bhunphrótacal le 1,500 U de HindIII (R3104L, New England Biolabs, SAM), mar 6-bunghearrthóir (in ionad BglII sa bhunphrótacal). Tar éis lipéadú Biotin agus ligation thar oíche (féach an prótacal bunaidh le haghaidh sonraí), sníomhadh samplaí (4 céim , 1,600 × g ar feadh 15 nóiméad) agus cuireadh an millíní ar fionraí arís i 25 ul de PBS. Goradh an fhionraí i 65c le 3 ul de phróitéineas K ar feadh 12-16h. Rinneadh íonú DNA Hi-C mar a thuairiscítear sa bhunphrótacal le 100 ul de choirníní streiptídín (Dynabeads M-280-streptavidin, Life Technologies, 11205D). Don dara heinsím srianta, d'úsáideamar 4-bunghearrthóir Hpych4V (10 U / in aghaidh an tsampla, R0620S, New England Biolabs, SAM). Tar éis imoibriú A-fuíre (féach an prótacal bunaidh le haghaidh sonraí), méadaíodh samplaí ag baint úsáide as PCR (17 timthriall) agus íonaithe le coirníní AMPure XP. Cuireadh leabharlanna Hi-C ar ceal i 20 ul de 10 mM Tris-HCl (pH 8.5). Dearadh córais um ghabháil bhaoite le haghaidh Gabháil Tionscnóra Hi-C – Fuarthas liosta de 5000 tionscnóir géine luiche ón bprótacal a foilsíodh roimhe seo in Schoenfelder. Et al.29. Níl sa liosta ach athscríbhinní le bithchineál de réigiúin códaithe próitéine, le suíomhanna blúirí srianta HindIII. Dearadh dhá thaiscéalaí gabhála 120 bp, ceann do gach ceann den phíosa. Rinne Agilent Technologies na taiscéalaithe a shintéisiú de réir chóras saibhrithe sprice SureSelect (Agilent Technologies).

Gabháil tionscnóirí Ullmhúchán agus seicheamhú leabharlainne Hi-C – Chun táirgí ligation Hi-C ina bhfuil seichimh tionscnóra a ghabháil, d’úsáideamar an prótacal a foilsíodh roimhe seo29. Go hachomair, cuireadh bacóirí hibridithe (Agilent Technologies) leis na leabharlanna DNA Hi-C. Ullmhaíodh maolán hibridithe agus RNA bhaoite gabhála de réir threoracha an mhonaróra (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Ansin, téitear bacóirí DNA/hibridithe na leabharlainne Hi-C ar feadh 5 nóiméad ag 95 céim , sular íslíodh an teocht go 65 céim . Meascadh DNA leabharlainne Hi-C le maolán hibridithe (réamhbhéite ar feadh 5 nóiméad go 65 céim ), agus ina dhiaidh sin leis an gcóras baoite gabhála saincheaptha (prewarmed ar feadh 3 nóiméad go 65 céim ), comhdhéanta de 10,000 biotinylated RNAs atá dírithe ar chríochnaíonn blúirí srian HindIII de 5000 tionscnóir géine luiche (Agilent Technologies, féach Ábhar Forlíontach le haghaidh dearadh bhaoite gabhála). Tar éis 24 h ag 65 céim sa mheaisín PCR, rinneadh tarraingt anuas biotin (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) agus nite tar éis prótacal saibhrithe Sprioc SureSelect (Agilent Technologies). Tar éis an nigh deiridh, athchuireadh coirníní i 30 μL NEBuffer 2 gan elution DNA roimh ré, agus rinneadh PCR iar-ghabhála (ceithre thimthriall aimplithe ag baint úsáide as primers uilíoch illumine) ar DNA a bhí ceangailte leis na coirníní trí RNA biotinylated. Cuireadh leabharlanna Gabhála Hi-C in ord péireáilte (Nextseq 500, Illumina).

Anailís Hi-C ar ghabháil tionscnóirí – baineadh úsáid as an bpíblíne HiCUP63 chun na léamha seicheamhaithe mearq amh a phróiseáil. Baineadh úsáid as an bpíblíne seo chun na péirí léite a mhapáil i gcoinne ghéanóm na luiche (mm9), chun déantúsáin thurgnamhacha a scagadh (cosúil le léamha ciorclach agus religations) agus chun léite dúblacha a bhaint. Maidir leis na sonraí pc-HiC, rinneadh na comhaid BAM a bhí mar thoradh air a íosshampláil agus a phróiseáil ag baint úsáide as leagan CHiCAGO 1.2.064, tar éis na socruithe réamhshocraithe chun idirghníomhaíochtaí suntasacha a ghlaoch. Tá sonraí iomlána na píblíne seo ar fáil ó Babraham Bioinformatics

Is féidir le Cistanche cuimhne a fheabhsú

Instealladh Víreas Stereotaxic Adeno-Associated

Rinneadh ainéistéisiú ar lucha ArcCreERT2 le avertin agus le haghaidh insileadh víreas AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (Serotype5, a fhaightear ó chroí víreasach UNC). Ar dtús, rinneadh poll beag sa cloigeann os cionn an hippocampus droma (i gcoibhneas le Bregma: anterior-posterior −2.0 agus meánshleasach ± ​​1.5), íslíodh steallaire Hamilton le snáthaid tomhsaire 33-. go −1.8 dv agus 500 ηl víreas a insileadh le ráta sreafa de 50 ηl in aghaidh an nóiméid isteach sa dá hippocampi. Tarraingíodh siar an tsnáthaid, tar éis tréimhse iar-instealladh 10 nóiméad agus ceadaíodh lucha a ghnóthú ar feadh 4 lá.