Déan teagmháil le:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls cliceáil anseo chun Cuid 1

Tá éifeacht neuroprotective an-mhaith ag luibh Cistanche

2.6. Éifeachtaí Frith-Apoptotic na gCítocínín arna gcinneadh ag Caspase-3/7 Tomhais Gníomhaíochta

Mar atá léirithe ag na measúnachtaí staining PI a bhfuil cur síos orthu thuas, ba chúis le SAL méaduithe ar rátaí báis cealla SH-SY5Y. Toisc go bhfuil baint ag SAL le apoptosis agus necróis [51] rinneamar imscrúdú freisin ar ghníomhachtú caspase-3 agus 7 (casp-3/7) mar shainmharcóir apoptosis (an chéim fhorghníomhaithe) [52] tar éis na cealla a nochtadh do CKs. Rinneadh normalú ar ghníomhaíochtaí Caspase-3/7 tar éis cóireála le gach ceann de na comhdhúile tástála maidir leo siúd a taifeadadh tar éis cóireála le 50{{30}} uM SAL (socraithe mar 100 faoin gcéad). Mar a léirítear i bhFíor 4, chuir an t-inhibitor caspase aitheanta Ac-DEVD-CHO (san áireamh mar rialú sonrach, a bhaineann le apoptosis) bac láidir ar ghníomhaíocht caspase-3/7 ag tiúchan fo-mhicrómóileach (go 36.3 ± 2.66 agus 25.2 ± 2.69 faoin gcéad de na leibhéil i gcealla atá cóireáilte le SAL amháin ag 0.05 agus 0.5 uM, faoi seach). Breathnaíodh ar leibhéil chosúla coiscthe roimhe seo [53] i múnlaí néarmheathghiniúna in vitro SH-SY5Y éagsúla atá bunaithe ar chill. Laghdaigh an rialú dearfach NAC gníomhaíocht caspase go suntasach freisin, go 88.7 ± 1.87 faoin gcéad agus 78.5 ± 2.56 faoin gcéad de leibhéil SAL-spreagtha ag 100 uM agus 1000 uM, faoi seach. Bhí raon leathan éifeachtaí ag na CKanna a tástáladh ar ghníomhaíochtaí caspase{-3/7. Díol spéise é ó na ribosides CK, ní raibh ach éifeachtaí suntasacha ag cZR ar na gníomhaíochtaí ag 0.1 uM (iad a laghdú go 83.3 ± 4.33 faoin gcéad de na leibhéil spreagtha SAL, faoi seach), agus níor tháinig laghdú suntasach ar iPR ag 1 uM ar an casp-3 ,7. Ar deireadh, laghdaigh K3G gníomhaíocht caspase-3/7 leis an éifeacht uasta ag 10 uM (go 81.7 ± 4.31 faoin gcéad den leibhéal spreagtha SAL). Tríd is tríd, ba chúis le SAL méadú 1.6-méadú ar ghníomhaíocht caspase-3/7 i gcomparáid le cealla rialaithe sláintiúla (CTR, Fíor 4), i gcomhréir le torthaí staidéir níos luaithe, ina raibh a leithéid de Baineadh úsáid as tiúchan SAL (400 uM) agus an líne cille céanna [54]. Is eol go mbíonn tionchar ag NAC ar ghníomhaíocht caspase i roinnt samhlacha denéaránachbás [55–58]. Mar sin féin, soláthraíonn na torthaí a chuirtear i láthair anseo an chéad léiriú dá caspase-3/7 i múnla SH-SY5Y de chuid SAL-spreagtha cille denéaránachbás. Laghdaigh an rialú dearfach an ghníomhaíocht caspase-3/7 a tharlódh de 500 uM SAL ar an mbealach céanna le CKanna, ach bhí cZR agus K3G éifeachtach fiú ag tiúchan fo-mhicreamólach nó micromolar. Staidéir eile le samhlacha struis a bhaineann le PD (inhibitor proteasome MG 132- nó H2O{2-tocsaineacht spreagtha i gcealla SH-SY5Y [17] agus fibroblasts [15])) agus galar Huntington (múnla ocrais serum i Tá sé léirithe ag cealla PC12 [19]) freisin gur féidir gníomhaíochtaí frith-apoptotic (caspase-3) a bheith ag CKs K agus tZR [17], agus gur féidir gníomhaíochtaí frith-seanseachta a bheith ag K agus tZR araon [17,19]. . Ina theannta sin, tá baint ag baint le laghdú casp-3,7 gníomhachtaithe agusneuroprotectivetuairiscíodh gníomhaíocht le haghaidh samhlacha SAL agus SAL [54,59,60].

Fíor 4. Gníomhaíocht Caspase-3/7 sa tsamhail PD arna spreagadh le SAL. Trioblóidí i gceithre lá neamhspleácha ar a laghad. * P i gcomparáid leis an bhfeithicil le 500 uM SAL, # P i gcomparáid leis an bhfeithicil gan 500 uM SAL.

2.7. Aithint Ghníomhaíocht Néarchosanta Cytokinin sa tSamhail Bás Cille de bharr Glutamate

Toisc nach gcuireann cealla SH-SY5Y gach fo-aonaid receptor NMDA in iúl [61], is é an mheicníocht is dóichí a bhaineann le tocsaineacht glutamáit (Glu) ná bac ar an Xc-antiporter cistine / glutamáit le ionduchtú ollmhór strus ocsaídiúcháin [62]. Léirigh údair roimhe seo go bhfuil baint idir bás cille de bharr glútamáit agus necroptosis i gcealla SH-SY5Y [63], agus an tábhacht a bhaineann le gníomhachtú caspase i dtocsaineacht glutamáit-spreagtha dóibh [62,64]. Léirigh roinnt staidéir freisin go dtarlódh bás cille iarainn-tiomáinte (ferroptosis) tar éis meisce glutamáit [62,65,66], agus léirigh siad go dtarlódh trí chineál bás cille (necroptosis, apoptosis, agus ferroptosis) tar éis imshuí an Xc. - córas antiporter. D'fhonn meastóireacht chuimsitheach ar anneuroprotectiveacmhainneacht na tástálacítocínín, áiríodh an córas measúnaithe bás cille glutamate-spreagtha i bpainéal anailíse leis an eolasneuroprotectiveiarann ​​chelator deferoxamine (DFO) agus inhibitor necroptosis necrostatin-1 (NEC-1) [67] mar rialuithe dearfacha. Anseo, rinneadh cealla SH-SY5Y a dhifreáil ar feadh 48 h, ansin cóireáilte le 160 mM Glu nó i gcomhchóireáil de le cineálacha éagsúlacítocíníntiúchan ({{{0}}.1–10 uM) ar feadh 24 h agus daite ag PI. Sa mhúnla seo, ba é éifeacht Glu ar bhás cille comhartha PI 100 faoin gcéad, agus mar sin rinneadh meastóireacht ar an laghdú ar bhás cille ag na comhdhúile tástála. D'eascair glu méadú beagnach 4-i mbás cille i gcomparáid le rialuithe sláintiúla SH-SY5Y (26.1 ± 0.42 faoin gcéad ). Scagadh ar rialuithe dearfacha aguscítocínínle fios gur laghdaigh an dá rialú dearfach NEC -1 (50 uM,76.6 ± 2.51 faoin gcéad ) agus DFO (10 uM, 84.2 ± 4.54 faoin gcéad ) bás cille de bharr glutamáit. Mar a léirítear i bhFíor5A, ó phainéal nacítocínín, ach trí cinncítocínínbhí siad in ann a chosaintnéaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y ar bhealach cosúil le rialuithe dearfacha. An ceann is gníomhaícítocínínbhí tras-zeatin (tZ) (0.1 uM, 79.5 ± 2.91 faoin gcéad; 1 uM, 81.3 ± 2.77 faoin gcéad) agus cis-zeatin (CZ) (0.1 uM, 82.1 ± 3.29 faoin gcéad; 1 uM, {{20}}.2 ± 2.89 faoin gcéad ) agus cinéitín (K) (1 uM, 88.0 ± 3.76 faoin gcéad; 10 uM, 79.9 ± 3.44 faoin gcéad ). Chun a ngníomhaíocht ghealltach a dhearbhú, baineadh úsáid as measúnacht orthogonal chun éifeachtaí bitheolaíocha CKanna a shoiléiriú sa mhúnla seo: Measúnacht scaoileadh lachtáit dehydrogenase (LDH) [68], a léirigh freisin (4-huaire drámatúil) méadú ar thocsaineacht tar éis cóireáil Glu. Is díol suntais é gur thug cinneadh scaoileadh LDH deis dúinn idirdhealú a dhéanamh idir gníomhaíochtaí CKanna agus na rialuithe dearfacha (NEC-1 agus DFO). Bhí gníomhaíocht cosanta measartha ach suntasach ag na CKanna (laghdaigh tZ na rátaí báis go 91.9 ± 1.40 faoin gcéad ag 0.1 uM; laghdaigh cZ iad go 92.3 ± 1.15 faoin gcéad ag 0.1 uM agus 91.7 faoin gcéad ± 1.56 faoin gcéad ag 1 iad ± 2 uM; 1.06 faoin gcéad ag 1 uM). Bhí éifeachtaí cosanta níos láidre ag na rialuithe dearfacha NEC-1 agus DFO ach bhí siad éifeachtach ag tiúchan i bhfad níos airde (laghdaigh na rátaí go 76.9 ± 2.94 faoin gcéad agus 81.6 ± 3.74 faoin gcéad ag 50 agus 10 uM, faoi seach) (Fíor 5B). Rinne an measúnú LDH bailíochtú ar na tásca a fuarthas le staining PI agus bhí éifeachtaí breathnaithe na rialuithe dearfacha comhsheasmhach le sonraí foilsithe [69,70]. Léiríonn torthaí maidir le héifeachtaí K sa mhúnla bás cille glu-spreagtha i gcealla HT22 [18] agus ár dtuairimí ar éifeachtaí CKanna ionadaíocha cosúil le tZ, cZ, agus K go bhfuil CKanna ag gealladh iarrthóirí le haghaidh cóireáil galair neurodegenerative a bhaineann le strus ocsaídiúcháin [ 71]. Ar deireadh, b'fhearr le tZ agus cZ toisc go raibh siad éifeachtach ag tiúchan níos ísle agus roghnaíodh iad, in éineacht le K, le haghaidh staidéir bhreise ar a n-éifeachtaí ar leibhéil strus ocsaídiúcháin agus gníomhachtú caspase-3,7.

cistéirléirmheasannaar éifeachtaí naneuroprotection

2.8. Éifeachtaí Cytokinins ar Strus Ocsaídiúcháin Glu-spreagtha i gcealla SH-SY5Y

Murab ionann agus an tsamhail roimhe seo, is féidir le Glu strus ocsaídiúcháin a chothú i gcealla SH-SY5Y trí bhealaí éagsúla. Tá ceann amháin bunaithe ar bhac ar an antiporter Cystine/glutamate (Xc-), as a dtagann ídiú glutathione (GSH) agus éifeachtaí diúltacha ar ghníomhaíocht superoxide dismutase (SOD) [62]. Is éard atá i gceist le bás cille glu-idirghabhála freisin ná foirmiú ROS (go háirithe radacach superoxide) faoi thiomáint ag Rac-NADPH-oxidase i gcealla SH-SY5Y [72]. Tugann na torthaí seo le fios gurb é OS an phríomhchúis le bás cille sa mhúnla spreagtha Glu-spreagtha. Laistigh den tsamhail,néaróincomhchóireáladh cealla cosúil le Glu agus tástáladh comhdhúile, dhaite ag DHE, agus breathnaíodh le micreascópacht fhluaraiseachta. Mar atá le feiceáil i bhFíor 6A, breathnaíodh ardú suntasach ar fhluaraiseacht dearg DHE i gcealla cóireáilte le Glu, rud a tháinig chun cinn ag na substaintí rialaithe dearfacha agus na CKanna a tástáladh. Bunaithe ar an breathnadóireacht micreascópachta, rinneadh cainníochtú na leibhéal superoxide i gcealla spreagtha Glu-spreagtha ar an mbealach céanna, ag an measúnú DHE, leo siúd i gcealla SAL-spreagtha. Rinneadh na torthaí a normalú maidir le leibhéil a tharlódh ó Glu amháin (socraithe mar 100 faoin gcéad ), rud a d'fhág méadú suntasach, beagnach 3-i leibhéil sárocsaíde laistigh de 4 h.néaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y i gcoibhneas le leibhéil i gcealla rialaithe sláintiúla (CTR: 33.79 ± 1.45 faoin gcéad). Mar a léirítear i bhFíor 6B, laghdaigh CKanna ar nós tZ, cZ, agus K go suntasach an leibhéal sárocsaíde i gcealla Glu-mheisciúla: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM, agus Laghdaigh 10 uM K é go 81.0 ± 4.03, 80.6 ± 3.89, 81.8 ± 3.39 agus 83.8 ± 2.32 faoin gcéad de na leibhéil i gcealla cóireáilte le Glu amháin. Tá na leibhéil seo inchomparáide leo siúd a fuarthas leis an inhibitor necroptosis NEC-1 (80.5 ± 3.19 faoin gcéad ag 5 uM agus 80.4 ± 2.70 faoin gcéad ag 50 uM) agus iarann-chelator DFO (80.2 ± 3.80 faoin gcéad ag 10 uM). Tá na torthaí a fuarthas leis an múnla bás cille spreagtha Glu-spreagtha, go háirithe éifeachtaí rialuithe dearfacha, comhsheasmhach le tuarascálacha roimhe seo [70,73]. Tá fianaise roimhe seo go bhfuil éifeachtaí OS-laghdaithe ag CKanna i múnlaí Glu-spreagtha nó samhlacha comhchosúla teoranta do léiriú go bhfuil K ina ghníomhaire laghdaithe OS potent (ag thart ar 23 uM) sa mhúnla bás cille Glu-spreagtha cille HT22 [18 ]. Fuaireamar amach go raibh éifeacht laghdaithe OS ag K ag tiúchain níos ísle (1–10 uM) inár gcealla SH- SY5Y. Ina theannta sin, breathnaíodh éifeachtaí tairbhiúla fadtéarmacha tZ ar fibroblasts daonna, lena n-áirítear gníomhaíocht dianscaoilte sárocsaíd hidrigine [15], rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh éifeachtaí indíreacha OS-laghdaithe a bheith ag tZ agus cZ i múnlaí bás cille spreagtha ag Glu. Ina theannta sin, léirigh tuarascálacha eile na naisc idir éifeacht laghdaithe OS-idirghabhála CKs agus gníomhaíocht chosanta [22,74-76]. Nuair a chuirtear le chéile iad, léirigh tZ, cZ, agus K éifeachtaí iontacha a laghdaíonn OS, inchomparáide leo siúd a bhaineann le rialuithe dearfacha, in ainneoin láidreachtaí éagsúla san iomlán.neuroprotectiveéifeacht.

Fíor 5. (A) Ráta báisnéaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y i múnla bás cille de bharr glutamáit (Glu); (B) Tocsaineacht ghlú-spreagtha (scaoileadh LDH) denéaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y. Déanann sé faoi thrí i gceann trí lá neamhspleácha ar a laghad.* P i gcomparáid leis an bhfeithicil le 160 uM Glu, # P i gcomparáid leis an bhfeithicil gan 160 uM Glu.

Fíor 6. (A) Strus ocsaídiúcháin glu-spreagtha (OS) agus gníomhaíocht laghdaithe OS de chomhdhúile léirithe sa duinenéaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y arna léirshamhlú ag micreascópacht fhluaraiseachta tar éis lipéadú déhidri-hidiam (DHE). Barraí=50 um. Taispeánann íomhánnanéaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y cóireáilte ag DMSO (Rialú), 160 mM glutamáit (Glu) ina n-aonar, agus in éineacht le: 10 uM deferoxamine (móide DFO), 50 uM necrostatin{{6} } (móide NEC-1), 0.1 uM tZ (móide tZ) agus 0.1uM cZ (móide cZ) ar feadh 4 h, ansin daite ag DHE. (B) Foirmiú radacach superoxide glu-spreagtha inéaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y tar éis 4 h. Taispeánann an graf cainníochtú na gceall daite DHE ag baint úsáide as an léitheoir micreaphláta Infinite M200 Pro (Tecan, an Ostair). Déantar faoi thrí i gcúig lá neamhspleácha.

* P i gcomparáid leis an bhfeithicil le 160 uM Glu, # P i gcomparáid leis an bhfeithicil gan 160 uM Glu.

2.9. Éifeachtaí Cytokinins ar Ghníomhaíocht Caspase-3/7 sa tSamhail Bás Cille de bharr Glu-spreagtha

Tá éifeachtaí tocsaineacha comhchosúla ag Glu ar chealla SH-SY5Y le héifeachtaí a tuairiscíodh roimhe seo ar chealla HT22 a bhaineann le bac Xc-antiporter. Mar sin, tá baint ag meicníochtaí bás cille neamh-apoptotic (ferroptosis, necroptosis, etc.) sa dá chás [62] cé go bhféadfadh léiriú caspase-3 agus go pointe áirithe, fo-aonad NMDA de NR1 a bheith níos láidre i SH. -SY5Y cealla [61]. Mar sin, féadfaidh na céimeanna deiridh de bhás cille sa dá líne cille a bheith difriúil. Tá ról ranníocach de ghníomhaíocht caspase tugtha faoi deara i go leor staidéar sa tsamhail spreagtha Glu-spreagtha de bhás cille de chealla SH-SY5Y [62,77–79]. Sa mheasúnacht seo,néaróin-cóireáladh cealla cosúil le SH-SY5Y anseo le 160 mM Glu, rud a fhágann go bhfuil méadú ar ghníomhaíocht caspase-3/7. In iarrachtaí chun ról apoptosis i mbás cealla SH-SY5Y de bharr Glu-spreagtha a shoiléiriú, cuireadh cosc ​​​​ar leith caspase-3/7, Ac-DEVD-CHO, i bhfeidhm agus fuarthas go raibh éifeacht láidir coisctheach aige: Ag 50 bliain d'aois nM laghdaigh sé gníomhaíocht caspase-3,7 go 23.70 ± 1.01 faoin gcéad den leibhéal i gcealla cóireáilte

le Glu ina aonar agus ag 0.5 uM chuir sé bac beagnach iomlán ar an ngníomhaíocht (laghdaigh sé go leibhéal normalaithe díreach 7.22 ± 1.05 faoin gcéad; inchomparáide leis an leibhéal a breathnaíodh i gcealla sláintiúla:

7.8 ± 0.39 faoin gcéad ), mar a thaispeántar i bhFíor7. Mar thoradh ar chur i bhfeidhm rialuithe dearfacha tháinig laghdú céimseach ar dháileog-spleách ar ghníomhaíocht caspase-3,7. Is díol spéise é go raibh éifeacht bheag ag NEC-1 le huaséifeacht ag 50 uM agus bhí gníomhaíocht choisctheach níos láidre ag 10 uM ag DFO (laghdú an ghníomhaíocht go 80.5 ± 1.85 agus 75.8 ± 3 .00 faoin gcéad , faoi seach). Ar an láimh eile, ní raibh ach éifeachtaí beaga, ach suntasacha ar casp-3,7 bainte amach ag tZ ag 1 uM (89.5 ± 2.50 faoin gcéad), cZ ag 0.1 uM (87.4 ± 1.62 faoin gcéad) agus K ag 1 uM ( 91.0 ± 2.06 faoin gcéad ). Nuair a chuirtear le chéile iad, léiríonn na torthaí go raibh laghdú níos láidre ar ghníomhaíocht caspase-3/7 ag an dá rialú dearfach ná na CKanna a tástáladh, ach bhí éifeachtaí ag na CKanna ag tiúchana i bhfad níos ísle. Tríd is tríd, tugann na torthaí le fios go bhfuil ról lárnach ag modhnú gníomhaíochta caspase-3/7 sa chumhacht chumhachtach.neuroprotectivegníomhaíocht gníomhairí ar nós DFO [58] sa mhúnla Glu-spreagtha de bhás cille [79,80]. Mar a léirítear sa chuid seo, áfach, bhí NEC-1 aige freisinneuroprotectivegníomhaíocht, rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh cineálacha eile bás cille a bheith páirteach i mbás Glu-spreagtha cealla SH-SY5Y néaróin [63,67,81]. Fuarthas tásca go bhfuil meicníochtaí neamhspleácha caspase bainteach le bás cille spreagtha Glu-spreagtha freisin in anailísí ar éifeachtaí NEC -1 [70], DFO [69], agus K [18] ar chealla HT22.

Fíor 7. Gníomhaíocht Caspase-3/7 i múnla Glu de dhamáiste ocsaídiúcháin denéaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y. Trioblóidí i gceithre lá neamhspleácha ar a laghad. * P i gcomparáid leis an bhfeithicil le 160 uM Glu, # P i gcomparáid leis an bhfeithicil gan 160 uM Glu.

3. Conclúidí

Go hachomair, léirigh ár staidéar go bhfuil CKanna agus a gcuid meitibilítíneuroprotectivegníomhaíochtaí sa mhúnla arna spreagadh ag SAL degalar Parkinsonagus Damáiste ocsaídiúcháin glu-spreagtha i SH-SY5Y difreáilte daonnanéaránachcealla. Fuarthas amach go raibh tábhacht bhitheolaíoch ag K3G, cZR, agus iPRneuroprotectivegníomhaíochtaí. Ina theannta sin, bhí na CKanna gníomhacha éifeachtach ag tiúchain níos ísle (fo-mhiocróbach agus micromolar) ná an tsubstaint rialaithe deimhneach NAC. Bhí éifeachtaí dearfacha ag K3G, cZR, agus iPR ar inmharthanacht, cíteatocsaineacht, strus ocsaídiúcháin, agus gníomhaíocht caspase-3,7 (seachas iPR). Léiríonn na taispeántais orthogonal go láidir go bhfuil ról lárnach ag gníomhaíocht strus frith-ocsaídiúcháin in éifeachtaí cosanta CKanna sa mhúnla bás cille spreagtha SAL. Níor chosain ach trí mheitibilít sa phainéal tástáladh CKanna (tZ, cZ, agus K).néaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y sa mhúnla Glu-spreagtha de dhamáiste ocsaídiúcháin ar bhealach cosúil leis an chelator iarainn NEC1 agus inhibitor necroptosis DFO. Chun a ngníomhaíocht ghealltach a dhearbhú, rinneamar tástáil ar a n-éifeachtaí i measúnacht scaoilte lachtáit déhidrigineáis (LDH) orthogonal. Bhí gníomhaíocht cosanta measartha ach suntasach ag na CKanna. Bhí sé seo níos laige ná gníomhaíochtaí comhfhreagracha na substaintí rialaithe, ach in ainneoin na difríochtaí i modhnú nanéaránachsláinte, spreag na trí CK a tástáladh laghduithe láidre i bhfoirmiú radacach superoxide, mar an gcéanna leis na substaintí rialaithe dearfacha. Bhí éifeachtaí inchomparáide ag na CKanna freisin ar strus ocsaídiúcháin Glu-spreagtha i gcealla SH-SY5Y leo siúd de NEC1 agus DFO, ach bhí éifeachtaí coisctheacha níos láidre ag na comhdhúile seo ar ghníomhaíocht caspase-3/7 ná na CKanna. Toisc nach bhfuil bás cille spreagtha Glu-spreagtha ag brath ar chonair caspase-spleách, mar a léirítear i staidéir ar éifeachtaí DFO agus NEC-1 ar chealla HT-22 [70], is cosúil gur féidir le CKanna an dá caspase a mhodhnú. bás cille spleách agus -neamhspleách trí strus ocsaídiúcháin a laghdú [18,82]. I staidéir leanúnacha, déantar meicníocht mhionsonraithe gníomhaíochta na CKanna agus/nó a n-éifeachtaí miteachondrial arnéaránachnó déanfar cealla astrocyte a imscrúdú.

cistéirtaithídonPDaguscuimhne

4. Ábhair agus Modhanna

4.1. Ceimiceáin agus Imoibrithe

CítokininFuarthas caighdeáin ó OlChemIm (Olomouc, Poblacht na Seice). Ceannaíodh Calcein AM (tuaslagán 1 mg/ml), agus trealamh scaoilte LDH, agus trealamh eisfhás Neurite ó ThermoFisher. Iaidíd própidiam, déhidriléitiam, comhpháirteanna de mhaolán measúnachta caspase- 3/7, meánmhéid DMEM/F12 1:1, séiream buaibheach féatais, trypsin, ATRA, hidreabróimíd salsolinóil, salann monosodium glutamáit, deferoxamine, N-aicéitilcysteine , Ac-DEVD-CHO, agus DMSO do chultúir cille ceannaithe ó Sigma Aldrich (Merck). Chuir Enzo Life Science an tsubstráit Ac-DEVD-AMC ar fáil.

4.2. Measúnachtaí ar Ghníomhaíocht Snámha Radacach ORAC

Chinn an measúnú ar Acmhainn Ionsúite Radach Ocsaigin (ORAC) cumas na gcomhdhúile chun fréamhacha saor in aisce a scaveneáil in vitro. Go hachomair, cuireadh fluaraiséis (100 ul, 500 mM), agus 25 ul den tuaslagán cumaisc a tástáladh le 96-mhicreaphláta tobair réamh-ghlais ag 37oC. Ar aghaidh, 25 uL de 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. Cultúr Cille SH-SY5Y

Fásadh an líne chill neuroblastoma daonna SH-SY5Y a ceannaíodh ó ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) i Meascán Cothaitheach Meánach Eagle agus Ham's F12 modhnaithe ag Dulbecco (DMEM: F-12, 1:1 ), arna fhorlíonadh le 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais (FBS) agus 1 faoin gcéad peinicillin agus streiptimícin ag 37 oC in atmaisféar tais 5 faoin gcéad CO2. Trasnaíodh cealla suas le 20 uair agus athraíodh na meáin faoi dhó nó faoi thrí sa tseachtain. Socraíodh dlús cille mar is cuí don mheasúnacht phleanáilte (5000, 7000, 10,000, nó 20,000 cill in aghaidh an tobair) i 96-plátaí ilthuillinn i 100 toirt iomlán meán do gach turgnamh. An lá tar éis an síolaithe, cuireadh ATRA i meán 1 faoin gcéad FBS DMEM/F12 leis na cealla go dtí tiúchan deiridh de 10 uM, agus leanadh leis an gor ar feadh 48 u breise chun difreáil a spreagadh, chun foirmiú neurites níos faide a cheadú, agus laghdú. iomadú.

4.4. Micreascóip

Micreagraif denéaróinFuarthas cealla cosúil le SH-SY5Y ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseachta DM IL LED (Leica Microsystems, Mannheim, an Ghearmáin) le scagaire excitation cuí don mheasúnacht, nó socrú réimse geal le ceamara digiteach ardfheidhmíochta DP73 (Olympus, Tóiceo, an tSeapáin). ). Ós rud é go raibh an cóimheas comhartha-go-torann le haghaidh staining measartha, coigeartaíodh an chodarsnacht beagán i mbogearraí ImageJ (Fidsí) gan tionchar a imirt ar an mbreathnóireacht a bhí mar thoradh air. Tá buníomhánna san áireamh sna hÁbhair Fhorlíontacha.

4.5. Staining membrane cille (trealamh Neurite Outgrowth, Invitrogen™)

Néaróin-cosúil le SH-SY5Y cealla (5000 cill in aghaidh an tobair) a fuarthas ag an nós imeachta difreála 48 h, dhaite le trealamh eisfhás Neurite (Invitrogen™) de réir mholtaí an déantóra le mionathruithe. Níodh na cealla le PBS, lipéadaíodh iad le tuaslagán den dath staining membrane a soláthraíodh leis an trealamh (tar éis an phrótacail le haghaidh 96 pláta ilthobair) i PBS ar feadh 20 nóiméad ag 37 oC, nite arís le PBS, agus breathnaíodh orthu faoi mhicreascóp fhluaraiseachta ( le 533 agus 585 nm excitation agus tonnfhaid astaíochtaí, faoi seach).

4.6. Cóireáil Cille

Tar éis an nós imeachta difreála, athraíodh an meán difreála go meán 1 faoin gcéad DMEM/F12 arna fhorlíonadh le comhdhúile tástála ag tiúchana de 0.1, 1, agus 10 uM (le 7000 cealla in aghaidh an tobair le haghaidh tástálacha cíteatocsaineachta), nó in éineacht leis an tocsain SAL ag 500 uM (le 7000–10,000 cill in aghaidh an tobair) nó 160 mM Glu (le 20,000 cill in aghaidh an tobair) ar feadh ré cuí don chineál measúnaithe (inmharthanacht, bás cille, etc.). Cóireáladh cealla rialaithe le meán ina raibh .0.1 faoin gcéad de DMSO.

4.7. Inmharthanacht na gCeall agus Bás Cille

Inmharthanacht nanéaróin-cosúil le cealla SH-SY5Y ag fás i 96-mhicrphlátaí tobair (le timpeall 70 00 cill in aghaidh an tobair) tar éis 24 h de chóireálacha a rinne measúnú Calcein AM le mionmhodhnú [31]. Bhí tiúchan 0.75 uM sa tuaslagán Calcein AM i PBS a úsáideadh agus socraíodh an t-am goir go 50 nóiméad. Cinneadh líon na gceall beo i ngach tobar trí úsáid a bhaint as léitheoir micreaphláta Infinite M200 Pro (Tecan, an Ostair), le 495 agus 517 nm excitation agus tonnfhaid astaithe, faoi seach.

Bás cille denéaróin-cealla cosúil le (múnla SAL: 10,000 cealla in aghaidh an tobair; Múnla Glu: 20,000 cealla in aghaidh an tobair) a chinntear trí mheasúnú PI mar a thuairiscigh Stone et al. 2003 le mionathrú [83]. Go hachomair, rinneadh meán na samhla spreagtha SAL a asú agus a athrú go réiteach 1 ug/mL de PI i PBS, ach tá cloí níos laige ag cealla atá faoi réir ionduchtaithe Glu-ionduchtúcháin agus mar sin cuireadh tuaslagán 1 mg/mL de PI i PBS leis. tabhair tiúchan deiridh 1 ug/mL. Sa dá chás, goradh cealla ar feadh 15-25 nóiméad eile ag teocht an tseomra agus ansin tomhaiseadh fluaraiseacht PI ag léitheoir Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, an Ostair) le 535 agus 617 tonnfhad excitation agus astaithe, faoi seach. Socraíodh an fhluaraiseacht PI a fuarthas le tocsainí amháin mar bhás cille 100 faoin gcéad.

4.8. Strus Ocsaídeach a Thomhas tríd an measúnú Dihydroethidium (DHE).

Rinneadh cealla a idirdhealú agus a chóireáil mar a thuairiscítear sa rannán roimhe seo le haghaidh ionduchtaithe SAL (10,000 cill in aghaidh an tobair, 24 h nó ionduchtú Glu-ionduchtúcháin (20,000 cill in aghaidh an tobair, 4 h). na cóireálacha, lártheifneoiríodh cealla ag 500 xg ar feadh 330 s, ansin cuireadh tuaslagán 10 uM DHE in PBS in ionad na meáin chultúir (tar éis asú) 96-goradh plátaí iltobair le cealla sa dorchadas ar feadh 30 nóiméad sa seomra teocht, ansin rinneadh fluaraiseacht DHE a thomhas ag léitheoir micreaphláta Éiginnte M200 Pro (Tecan, Grödig, an Ostair) le 500 agus 580 nm excitation agus tonnfhaid astaíochtaí, faoi seach Socraíodh an fhluaraiseacht DHE mar thoradh air a fuarthas le SAL nó Glu amháin mar 100 faoin gcéad sárocsaíd Fuarthas micrfhótagraif fhluaraiseachta léiritheacha de chealla dhaite DHE tar éis tomhais DHE leis an léitheoir micreaphláta.

Tá éifeacht neuroprotective an-mhaith ag gléasra Cistanche

4.9. Gníomhaíocht Caspase-3/7 a thomhas

Rinneadh measúnú caspase aonchéime-3/7 de réir nós imeachta a foilsíodh roimhe seo [84]. I gcás cultúir atá faoi réir SAL-ionduchtú agus Glu-ionduchtú, gor na meascáin imoibrithe (caspase-3,7 maolán agus comhpháirteanna le cealla i 96-plátaí il-toibreacha) ar feadh 2 h agus 3 h ag 37 oC, faoi ​​seach. Rinneadh gníomhaíocht Caspase-3/7 a thomhas ansin ag léitheoir micreaphláta Infinite M200 Pro (Tecan, an Ostair) le tonnfhaid excitation agus astaithe 346 agus 438 nm, faoi seach.

4.10. Anailís staitistiúil

Rinneadh na turgnaimh i dtrí-chomhaltaí agus rinneadh iad arís agus arís eile i dtrí go cúig (n {{{0}}–5) lá neamhspleách. Sloinntear na sonraí go léir mar mheán ± SEM. Sloinntear luachanna na n-athróg tomhaiste go léir mar acmhainn ± SEM, a ríomhadh trí úsáid a bhaint as Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), a úsáideadh freisin chun na figiúirí a ghiniúint. Is é an pacáiste bogearraí PAST (léar. 1.97) [85] a rinne an anailís staitistiúil. Don turgnamh difreála, baineadh úsáid as t-tástáil an Mhic Léinn. Rinneadh measúnú ar an gcuid eile de na turgnaimh le tástáil neamh-pharaiméadrach Kruskal-Wallis le tástáil post hoc Mann-Whitney le ceartú seicheamhach Bonferroni. Measadh luach p < 0.05="" a="" bheith="">

Ábhair Bhreise: Tá buníomhánna ar fáil ar líne.

Ranníocaíochtaí Údair: Seo a leanas ranníocaíochtaí na n-údar: Imscrúdú, modheolaíocht, bailíochtú, anailís sonraí, GG, CWD, agus JG; scríobh – dréacht-ullmhú bunaidh GG, CWD, agus MS; coimeád sonraí, sealbhú maoinithe, maoirseacht, scríobh-athbhreithniú agus eagarthóireacht, CWD, MS, agus PK Tá leagan foilsithe na lámhscríbhinne léite agus aontaithe ag na húdair go léir.

Maoiniú: Tugadh tacaíocht airgeadais don obair seo go páirteach trí dheontais ó Ghníomhaireacht Deontais Inmheánach Ollscoil Palacky in Olomouc, Poblacht na Seice (IGA{{{{{{{{}}}PrF_2020_021), Gníomhaireacht Deontais na Seice ({_2020_021) 2}}S), agus Ciste Forbraíochta Réigiúnaí na hEorpa — Tionscadal ENOCH (Uimh. CZ.02.1.01/{0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) agus deontas mac léinn ó Chiste Dearlaice Ollscoil Palacky.

Ráiteas an Bhoird Athbhreithnithe Institiúideach: Neamhbhainteach.

Ráiteas um Toiliú Feasach: Neamhbhainteach.

Ráiteas Infhaighteachta Sonraí: Tá sonraí san alt nó san ábhar forlíontach.

Buíochas: Gabhann na húdair buíochas le Dita Jordovd, Jana Hrubešovd, agus Lucie Koplikovd as cúnamh teicniúil den scoth. Ina theannta sin, gabhann na húdair buíochas le Sees-editing Ltd., an RA as eagarthóireacht Bhéarla na lámhscríbhinne.

Coinbhleachtaí Leasa: Ní dhearbhaíonn na húdair aon choinbhleacht leasa.

Infhaighteacht Samplach: Níl samplaí de na comhdhúile ar fáil ó na húdair.