Cuid 1: Laghdaíonn Cistanoside Of Cistanche Herba Damáiste atáirgthe Fireann de bharr Hipocsa trí Shochtadh Strus Ocsaídeach
Mar 26, 2022
Déan teagmháil le:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Coimriú:Léiríonn fianaise mhéadaithe go bhfuil hypoxia ina chúis le neamhthorthúlacht fireann, agus d’fhéadfadh go mbeadh baint ag hypoxia le strus ocsaídiúcháin (OS). Is comhdhúil glycosíde feinileatánóideach é Cistanoside (Cis) is féidir a bhaint as CistanchesHerba agus tá feidhmeanna bitheolaíocha éagsúla aige. Bhí sé mar aidhm ag an staidéar seo imscrúdú a dhéanamh ar na héifeachtaí cosanta atá ag damáiste atáirgthe Cis de bharr hypoxia agus na meicníochtaí sonracha bunúsacha a iniúchadh. Tógadh samhlacha turgnamhacha hypoxia cille agus ainmhithe, agus rinneadh measúnú in vitro agus in vivo ar éifeachtaí cosanta na bhfochineálacha éagsúla Cis ar an gcóras atáirgthe fireannaigh. Léirigh na torthaí gur laghdaigh hypoxia inmharthanacht cealla GC-1 go suntasach trí ghabháil timthriall cille agus gníomhachtú apoptosis, a raibh baint acu le méadú ar OS.Moreover, léirigh Cis éifeachtaí frithocsaídeacha láidir in vitro agus in vivo araon, ag athchóiriú gníomhaíochtaí einsímí frithocsaídeacha go suntasach. agus leibhéil speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) a íosrialú agus ag an am céanna ag méadú inmharthanacht cille agus ag laghdúapoptóis. Rud atá tábhachtach, léirigh na subtypes Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C, agus Cis-H) a ndearnadh staidéar orthu anseo go léir éifeachtaí frithocsaídeacha áirithe, agus ina measc bhí éifeachtaí Cis-B na cinn is suntasaí. Léiríonn an staidéar seo go maolaíonn Cis éifeachtaí dochracha OS a chothaítear le hipocsa trí dhul i bhfeidhm ar ghníomhaíochtaí einsímí frithocsaídeacha i dtásail agus i gcealla GC{-1.
Eochairfhocail: Cistanoside, hipoxia hypobaric, infertility fireann, strus ocsaídiúcháin, cosaint atáirgthe
planda cistanche úr
Réamhrá
Faoi láthair, tá thart ar 48.5 milliún (15 faoin gcéad) lánúin d'aois atáirgthe ar fud an domhain a bhfuil tionchar ag neamhthorthúlacht [1], ina measc tá 40-50 faoin gcéad de na cásanna sannta do neamhthorthúlacht fireann [2], coinníoll a bhfuil baint láidir aige leis an gcomhshaol agus le stíl mhaireachtála. fachtóirí. Molann fianaise go bhfuil so-ghabhálacht an mhamach i leith brú íseal ocsaigine ina fhachtóir is cúis le roinnt cineálacha neamhthorthúlachta fireann [3]. Mar a léiríodh i staidéir roimhe seo, déantar an spermatogenesis a lagú agus a laghdú nuair a bhíonn sé faoi lé hipoxia hipobaric [4-7].
Chun an mheicníocht bhunúsach a iniúchadh, léirigh staidéir go méadaíonn nochtadh do hipoxia hipobaric táirgeadh speiceas ocsaigine imoibríoch (ROS) [8, 9]. Tá ról tábhachtach ag ROS sa chóras atáirgthe téamaí. Ag leibhéil ísle, tá siad ag teastáil le haghaidh toilleas sperm, an imoibriú acrosome, agus comhleá spermatozoa-úicít[10]. Mar sin féin, is féidir le ROS iomarcach damáiste DNA spermnuclear / mitochondrial agus damáiste sárocsaídeach membrane plasma a aslú, atá ina fhachtóirí móra etiological don riosca méadaithe neamhthorthúlachta fireann [11, 12]. Mar sin, d’fhéadfadh carnadh ROS spreagtha hypoxia a bheith ina chúis amháin le neamhthorthúlacht fireann.
Tá Cistanches Herba, planda íocshláinte seadánacha ilbhliantúil, scaipthe go forleathan i limistéir arid [13] agus úsáidtear go forleathan é mar gheall ar a ghníomhaíochtaí cógaseolaíochta [14-17]. I measc na n-ábhar éifeachtach go léir de Cistanches Herba, breathnaíodh ar PhGanna mar an phríomh-chomhpháirt ghníomhach. Go dtí seo, tá 34 PhG scoite amach ó mhonarchana na gCistíneach [13]. Tá aird faighte ag Cistanoside (Cis), PhG gníomhach atá scoite ó Cistanches Herba, as a éifeachtaí frithocsaídeacha.
Agus éifeachtaí frithocsaídeacha Cis á gcur san áireamh agus ról ROS in neamhthorthúlacht fireann de bharr hypoxia, meastar Cis a bheith ina iarrthóir féideartha drugaí le haghaidh cóireáil maleinthorthúlachta de bharr hypoxia. Mar sin féin, is beag tuairisc a thug aghaidh ar éifeachtaí frithocsaídeacha Cis a bhaintear asCistanches Herba i gcóireáil neamhthorthúlachta fireannaigh de bharr hypoxia nó na bealaí comharthaíochta atá i gceist. Sa staidéar seo, tógadh samhlacha turgnamhacha in vitro, agus in vivo hypoxia agus rinneadh measúnú ar chomhpháirteanna éifeachtaí Ciswas éagsúla.
Tá aéifeacht táirgthe atáirgthe.
abhair agus modhanna
Cultúr cille agus imoibrí
Ceannaíodh an líne chill spermatogonia luiche GC-1spg(GC-1) ón American TypeCulture Collection (ATCC) agus saothraíodh í in DMEM(Invitrogen, USA) agus forlíonta le 10 faoin gcéad de shéiream féatais bhó-ainmhithe, 1 faoin gcéad L- glutamine (100 mM), peinicillin (100 U/mL), agus streiptimícin (100 ug/mL) ag 37 céim i gorlann humidithe le 5 faoin gcéad CO2. Ceannaíodh Cis (Cis-A, B, C, H) ó Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (tSín).
Measúnú inmharthanachta cille
Tástáladh inmharthanacht na gceall trí threalamh comhairimh ceall{{{0}}measúnacht (CCK-8). Go hachomair, síolaíodh cealla GC-1 i 96-plátaí tobair ag 1.5×103 in aghaidh an tobair agus saothraíodh iad ag 37 céim ar feadh 24 h. Ansin, déileáladh leis na cealla le tiúchain éagsúla (20 faoin gcéad, 15 faoin gcéad, 10 faoin gcéad, 5 faoin gcéad ) ocsaigine nó tiúchain éagsúla (2 μM, 0.2 μM, 0.02 μM) de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C , Cis-H) don am riachtanach. Ansin, cuireadh an comhshamhail de láimh, agus braitheadh inmharthanacht cille ag baint úsáide as trealamh CCK-8 (DojindoJapan). Rinneadh ionsúchán gach tobair a thomhas ag 450 nm ag baint úsáide as léitheoir micreaphláta (BioRad USA). Ar deireadh, rinneadh inmharthanacht na gceall a ríomh de réir na foirmle seo a leanas:
Inmharthanacht cille=(grúpa turgnamhach OD - grúpa ODblank)/(grúpa ODcontrol - grúpa ODblank) × 100 faoin gcéad .
Anailís blot an Iarthair
Rinneadh maolán inRIPA a aonchineálú ar chealla nó fíocháin bhuainte chun próitéiní a bhaint as (RIPA Beyotimean tSín; Cocktail Roche Eilvéis). Bailíodh súithíní, agus rinneadh tástáil ar thiúchan na bpróitéiní leis an modh BCA (Beyotime). Scar SDS-PAGE thart ar 40 ug de na próitéiní a bhaintear as gach sampla agus aistríodh iad leictrileictreach ar scag-scannán nitrocellulose (NC) (BeyotimeChina). Cuireadh bac ar sheicní scagaire NC le 5 faoin gcéad de bhainne neamhshaille ar feadh 1.5 h agus goradh iad le hantasubstaintí sonracha (frith-PARP 1:1000, frith-Caspas-3 1:1000, frith-Bcl-2 1:1000, frith-Bax1: 1000, frith-GAPDH 1:1000; ceannaíodh gach antasubstaint ó Theicneolaíocht Comharthaíochta Cille, SAM) thar oíche ag 4 céim. Ansin, goraíodh gach seicní NC leis an antashubstaint chomhfhreagrach horseradish peroxidase-conjugated tánaisteach ar feadh 1.5 h ag teocht an tseomra agus íomháithe le córas íomháithe (Tannon, An tSín).
forlíontaí púdar sliocht cistanche
Brath timthriall cille
Rinneadh measúnacht sreafa cítiméadrach (FCM) chun an timthriall cille a anailísiú. Cóireáladh cealla faoi choinníollacha éagsúla ar feadh 72 h agus baineadh iad. Ansin nite na cealla le PBS, socraithe i eatánól 75 faoin gcéad, agus dhaite le propidiumiodide (PI). I gcás gach sampla, bailíodh cealla 1 × 104 agus rinneadh anailís orthu de réir cíteiméadracht sreafa (FACSCalibur, BD Biosciences). Ansin, rinneadh comhréir na gcealla céim G1/S/G2 agus an t-innéacs iomadú [Céim (S móide G2)/Céim (G1 móide S móide G2) × 100 faoin gcéad] a ríomh.
Ki-67 staining
Saothraíodh cealla i mias comhfhócasach agus déileáladh leo le hipoxia nó le fochineálacha éagsúla Cis ar feadh72 h. Tar éis gach cill a shocrú le paraformaildéad 4 faoin gcéad, goradh iad le frith-choirp frith-Ki-67 (1:200, Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille). Ansin, goradh na cealla go léir le antashubstaint chomhfhreagrach IgG frith-choine coinín (1:200, Boster, an tSín) agus réiteach DAPI (1.0ug/mL, Beyotime). Breathnaíodh fluaraiseacht le micreascóp comhfhócasach Fluoview FV1000 (Olympus, an tSeapáin).
ROS a bhrath
Tugadh FCM isteach chun leibhéil ROS intéireallacha a thomhas ag baint úsáide as DCFH-DA. Síolaíodh cealla ar fionraí i 6-plátaí tobair agus cuireadh cóireálacha difriúla orthu. Tar éis 72 h de chóireáil, cuireadh cealla ar fionraí i DMEM gan serum le 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Rinneadh ábhar ROS a chinneadh ansin trí shórtáil cille fluaraiseachta-ghníomhachtaithe ar Chóras Cytometry Sreabhadh Coulter Beckman le tonnfhad excitation de 488nm agus tonnfhad astaithe de 525 nm [18].
Cinneadh sárocsaídiú lipid (LPO)
Rinneadh an measúnú ar shubstaintí imoibríocha aigéid thiobarbituric (TBARS) chun LPO a bhrath. Rinneadh céimeanna oibríochta de réir na dtreoracha (Sigma USA). Ríomhadh na tiúchain trí úsáid a bhaint as comhéifeacht díothaithe molar de 1.56×105/(M·cm), a fuarthas trí úsáid a bhaint as malondaildéad mar chaighdeán. Cuirtear na torthaí in iúl mar choibhéisí nmol ofMDA/mg próitéine.
Cinneadh ar ghníomhaíochtaí einsíme
Rinneadh tástáil ar ghníomhaíochtaí na heinsíme ag baint úsáide as trealamh measúnaithe lena n-áirítear glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx), agus superoxide dismutase (SOD). Rinneadh na céimeanna oibriúcháin go léir de réir na dtreoracha a soláthraíodh (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China).
Ainmhithe agus prótacal turgnamhach
Fuarthas francaigh Wistar fireann aibí (180-220 g, 8 w d'aois) ó lárionad ainmhithe an Cheathrú Míochaine Míleata Ollscoil, Xi'an, an tSín.Fuarthas cead úsáid a bhaint as na hainmhithe ó Choiste Eitice na hOllscoile (Uimhir Thagartha : 20190506). Rinneadh an turgnamh ainmhithe de réir threoirlínte na hollscoile maidir le cúram agus úsáid ainmhithe saotharlainne.
Ceadaíodh do na francaigh go léir oiriúnú ar feadh thart ar sheachtain amháin sular cuireadh tús leis an turgnamh. Tar éis acclimation, rinneadh na francaigh a dháileadh go randamach i 6 ghrúpa le 5 ainmhí i ngach grúpa. Ardaíodh na francaigh sa ghrúpa rialaithe faoi ghnáthbhrú (PO2: 20 faoin gcéad; brú aeir: 101.3 kPa), agus ardaíodh na francaigh sa mhúnla agus i ngrúpaí Cistreated i seomra ocsaigine ísealbhrú (brú inmheánach de 61.6 kPa, comhionann le airde 4000 méadar os cionn leibhéal na farraige; PO2: 14.55 faoin gcéad ) chun timpeallacht ard-airde hypoxic a insamhail. Bhí rochtain saor in aisce ag gach francach ar bhia agus ar uisce i gcliabháin phlaisteacha ag coinníollacha 22± 2 céime agus taise le timthriall uathoibríoch 12-h solais/dorcha. D'fhan na francaigh sa mhúnla agus grúpaí cóireáilte Cis faoi choinníollacha hipiteirme ach aistríodh iad i gcoinníollacha tonormóbacha gach 96 h, ag an am sin cuireadh bia agus uisce ar fáil dóibh agus glanadh na cages. Ba é fad an aistrithe ó hypobaric go hipobárach thart ar 2 h. Cóireáladh na grúpaí cóireála go léir leis an Cis comhfhreagrach (8 mg/kg/d) trí thomhasán béil ar feadh 8 seachtaine, ach caitheadh an méid céanna uisce leis na francaigh rialaithe agus samhail.
Tar éis 8 seachtaine, íobairt francaigh faoi ainéistéise. Scaradh agus meáigh na maistíní, an eipididim agus na feisicíní bunúsacha, agus ríomhadh an t-innéacs orgán de réir na foirmle seo a leanas: (meáchan orgáin/meáchan ainmhithe) × 100 faoin gcéad . Ina dhiaidh sin, bailíodh sperm san epididymis, agus rinneadh tástáil ar a ngníomhaíocht motility agus acrosomeenzyme. Ar an gcaoi chéanna, bailíodh fíocháin testicular le haghaidh staidéir histeapaiteolaíochta agus ROS, LPO, agus braite einsímghníomhaíochta frithocsaídeach.
Meastóireacht ar ráta sperm beo
Greasaíodh an epididymis le siosúr máinliachta, agus ullmhaíodh an fionraí sperm i ngnáth-seile. Chun an ráta sperm beo a mheas, rinneadh 5 μL den fhionraí sperm a mheascadh go cúramach le toirt comhionann eosin-Ystain. Rinneadh an speirm a chomhaireamh ansin faoi mhicreascóp éadrom. Rinneadh rátaí speirme beo a mheasúnú trí speirm dhaite (speirm marbh) agus neamhdhaite (speirm bheo) a ríomh.
Púdar cistanche tubulosaméaduithe ar anrátaí sperm beo.
Le haghaidh tuilleadh eolais, cliceáil anseo le do thoil.
Cinneadh einsímí acrosome sperm
Baineadh úsáid as an measúnú ar ghníomhaíocht einsím acrosome sperm chun acrosomeenzymes sperm a mheas [19]. Rinneadh na torthaí i ngach grúpa a ríomh ag baint úsáide as an bhfoirmle seo a leanas: Gníomhaíocht einsímí acrosóim (μIU)=(ODExperimentgroup - ODBlank group)/(247.5×10) × 106.
Anailís staitistiúil
Cuirtear na sonraí cainníochtúla go léir in iúl mar mheán± SD agus rinneadh anailís orthu trí úsáid a bhaint as bogearraí SPSS 22.0. Baineadh úsáid as tástáil t Mac Léinn Neamhspleách chun na sonraí idir dhá ghrúpa a chur i gcomparáid. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">