Próifíliú Meitibileachta Bhunaithe NMR Le haghaidh Scavening Radacach agus Airíonna Frith-Aosaithe Cuid 2

Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais

2.5. Sleachta Luibh a Aicmiú de réir Anailís Phríomh-Comhpháirte

Rinneadh anailís bhreise ar an éagsúlacht meitibilít idir duilleoga na luibheanna tástáladh ag baint úsáide as anailís sonraí multivariate (MVDA). Is MVDA gan mhaoirseacht é anailís phríomh-chomhpháirt (PCA), modh aitheantais patrún, a sheachadann tuiscint mhór ar an gcomhlachas idir na samplaí. Léirigh na ceapacha scóir PCA scaradh luibheanna ina gcnuasaigh, ach léirigh ceapacha luchtaithe na meitibilítí a sholáthraíonn an scaradh [85,86]. Léirigh an tsamhail PCA folláine mhaith (R2X=0.997)agus ard-intuarthacht (Q2=0.993) nuair a bhí an éagsúlacht idir R2X(cum) agus Q2(cum) níos lú ná 0 .3, rud a thugann le fios gur chuir gach sliocht luibheanna go cothrom agus go cothrom leis an scaradh grúpa a breathnaíodh. Bhí an bhreathnóireacht seo ar aon dul le Wheelock et al. [87].

Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh eolais a fháil

Léirigh scóir scóir na hanailíse príomh-chomhpháirte go raibh na luibheanna roghnaithe deighilte ina dhá bhraisle gan aon asluiteach suntasach mar a léirítear i bhFíor 4A. Ba é an príomh-chomhpháirt (PC)1 a léirigh an t-athrú sampla is mó, agus PC2 ina dhiaidh sin. Chuir PC1 agus PC2 leis an gcéatadán athraitheas ag 29.7 faoin gcéad agus 24.9 faoin gcéad , faoi seach. Mar sin, chuir na ríomhairí pearsanta seo síos ar éagsúlacht iomlán de thart ar 54.6 faoin gcéad. Léirigh torthaí ó phlota an cholúin luchtaithe na meitibilítí a bhí freagrach as scaradh na luibheanna isteach sa taobh dearfach de PC1 (V.negundo agus C.longa) agus taobh diúltach PC1 (P. lúide, P. indica, O.javanica agus C. caudatus)(Fíor 4B).

Fuair ​​​​sonraí ó phlota colún luchtaithe PC1 amach go raibh na comhdhúile feanólacha, go príomha an grúpa flavonoid agus aigéid feanólacha, freagrach as scaradh na luibheanna roghnaithe. Quercetin (1), quercetin-3-O-rhamnoside (2), quercetin-3-O-glúcósíd (3), quercetin-3-O-glucuronide (4), quercetin-3- O-arabinofuranoside (5), rutin (6), díorthaigh mvricetin (7), catechin (8), epicatechin (9), isorhamnetin (10), astragalin (11), aigéad chlorogenic (12), aigéad galic (13), Aigéad cúmarach (14), aigéad ascorbic (15), aigéad formach (21), aigéad fumaric (22), 3-methylxanthine (26) agus apigenin (28) bhí ábhar níos airde den chuid is mó i P. lúide, P. indica , C. caudatus agus O.javanica mar go raibh siad suite ar thaobh diúltach an phlota. I gcodarsnacht leis sin, bhí V.negundo agus C.longa idirdhealú ó na luibheanna eile ag láithreacht serotonin (27) agus D-limonene (29) ina gcuid sliocht.

2.6. Comhghaol idir Bithghníomhaíochtaí agus na Meitibilítí ag Úsáid Anailís Páirteach ar Chearnóga is Lú (PLS)

Chun an gaol idir na bithghníomhaíochtaí tomhaiste agus na meitibilítí a fuarthas sna luibheanna a tástáladh a thuiscint, cuireadh PLS, mar mhodheolaíocht MVDA maoirsithe, i bhfeidhm chun na sonraí athróg neamhspleácha (aistriú ceimiceach NMR na meitibilítí) a chomhghaolú le sonraí na n-athróg cleithiúnacha, a Ba é an cosc ​​ar thástálacha DPPH, ABTS agus ORAC, chomh maith le gníomhaíochtaí frith-elastáis agus frith-collagenase. Cuireadh an mhodheolaíocht seo i bhfeidhm toisc go bhfuil éacht iontach ag PLS chun na bithghníomhaíochtaí tástálaithe a nascadh le meitibilítí, agus mar sin is féidir samhail a sholáthar le haghaidh tuar [88]. Tríd an anailís PLS, d'fhéadfaí an gaol idir bithghníomhaíochtaí cosúil le gníomhaíochtaí scavening radacacha agus airíonna frith-aosaithe le meitibilítí sna samplaí a bhunú. Mar sin, d’fhéadfaí meitibilítí a bhí freagrach mar mharcóirí bithghníomhacha a mholadh ansin.

Is meascán de scóir agus ceapacha luchtaithe é an biplot mar thoradh ar an anailís PLS, mar a thuairiscigh Mediani et al. [80]. Léiríodh le leathphlota páirt-chearnógacha don ghníomhaíocht scavenála radacach (Fíor 5A) agus airíonna frith-aosaithe (Fíor 5B) go raibh na samplaí go léir deighilte go maith agus cnuasaithe gan asluit shuntasach. Scar an PC1 duilleoga P. lúide, C.caudatus, agus P. indica ó V. negundo, O.jaoanica, agus C.longa. Bunaithe ar ghníomhaíochtaí radacacha scavening agus airíonna frith-aosaithe na mbíoplaí, chuir an tsamhail luachanna folláine maith (R'Y) de {{10}}.988 agus 0.966 i láthair, faoi seach. Idir an dá linn, ba é 0.984 agus 0.951, faoi seach, an intuarthacht (Q4) do ghníomhaíochtaí scavening radacacha agus airíonna frith-aosaithe.

Mar a léirítear ón biplot PLS de ghníomhaíochtaí scavenging radacach (Fíor 5A), díríodh na bithghníomhaíochtaí (DPPH, ABTS, agus ORACassay) chuig taobh dearfach an biplot, a bhí ar na réimsí is gníomhaí agus is gaire do P.minus, P. indica agus C.caudatus. I gcodarsnacht leis sin, díríodh V. negundo, O.javanica, agus C. longa chuig na taobhanna diúltacha den biplot, a measadh mar na réimsí is lú gníomhacha agus a bhí níos faide ó thástálacha DPPH, ABTS, agus ORAC, agus léirigh siad comhghaol diúltach. le bithghníomhaíochtaí. Sa chás seo, tá cnuasaigh déanta ag P. mimus, P. indica, agus C.caudatus seachas na luibheanna is lú gníomhaí, rud a thugann le fios go raibh éifeacht radacach-scavenála níos láidre ag na luibheanna seo, rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh leibhéil níos airde feanólacha a bheith sna sleachta luibhe seo. comhdhúile. I measc na dtrí luibh is gníomhaí, fuarthas go raibh P. lúide comhghaolú níos láidre le measúnacht DPPH agus ABTS, agus measúnú ORAC ina dhiaidh sin.

Bhí an toradh seo ag teacht le torthaí in vitro na ngníomhaíochtaí scavening radacacha a rinneadh. Léirigh na torthaí gur léirigh P. minus éifeacht scavening radacach saor in aisce i gcomparáid leis na luibheanna eile. Léirigh na torthaí dá bhrí sin gurb é P. lúide an luibh is gníomhaí don speiceas ocsaigine imoibríoch. Aithníodh meitibilítí tánaisteacha suntasacha a chuir le gníomhaíocht scavening radacach P. lúide mar quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, catechin, isorhamnetin, astragalin, agus apigenin.oteflavonoidBhí na meitibilítí seo go léir suite níos gaire don P. lúide agus freisin do thástálacha scavening radacach DPPHand ABTS. Staidéar a rinne Mediani et al roimhe seo[80] fuair sé amach freisin gur léirigh sampla de phlandaí reoite-triomaithe méid níos airde -glúcóis, -glúcóis, catechin, agus aigéad chlorogenic, a d'fhéadfadh a bheith tar éis cur le cumas scavenging radacach DPPH potent an luibh. Mar sin féin, d'fhéadfadh na meitibilítí neamhaitheanta sa sliocht cur le héifeacht scavening radacach ard P.minus freisin.

Fuarthas torthaí comhchosúla freisin maidir leis na hairíonna frith-aosaithe. Léiríonn Fíor 5B an biplot a fuarthas ón PLS d'airíonna frith-aosaithe. Rinneadh na bithghníomhaíochtaí (gníomhaíochtaí frith-elastase agus frith-collagenase) a réamh-mheasta ar thaobh dearfach an biplot, arbh é an limistéar is gníomhaí é agus a bhí níos gaire do P.minus, P. indica, agus C.caudatus. I gcodarsnacht leis sin, díríodh V.negundo, O.javanica, agus C.longa go dtí an taobh diúltach den biplot, a measadh mar an limistéar is lú gníomhach agus a bhí níos faide ar shiúl ó na gníomhaíochtaí frith-elastase agus frith-collagenase. Léirigh sé seo comhghaol diúltach nó níos laige leis na bithghníomhaíochtaí. Sa chás seo, cnuasaíodh P.mimus, P.indica, agus C. caudatus seachas na luibheanna is lú gníomhaí, rud a thugann le fios gur léirigh na sleachta luibh seo níos mó cosc ​​​​elastáis agus collaigine. I measc na dtrí luibh is gníomhaí, fuarthas amach arís go raibh comhghaol láidir ag P. lúide leis na hairíonna frith-aosaithe seo i gcomparáid leis na luibheanna eile.

Bhí an toradh seo ag teacht leis na torthaí in vitro ar airíonna frith-aosaithe a rinneadh níos luaithe. Léirigh na torthaí gurbh é P.minus an luibh ba ghníomhaí chun einsímí elastase agus collagenase a chosc. Aithníodh meitibilítí tánaisteacha suntasacha a chuir le hairíonna frith-aosaithe P. lúide mar quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, díorthaigh myricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin, agus apigenin. D'fhéadfadh meitibilítí eile cosúil le -glúcós, -glúcós, aigéad fumaric, agus aigéad sailleach a bheith freagrach as na bithghníomhaíochtaí freisin. Bhí na meitibilítí seo go léir suite níos gaire do P. lúide agus do na gníomhaíochtaí frith-elastase agus frith-collagenase.

Is féidir le Cistanche frith-aging

Bhí idirdhealú na luibheanna roghnaithe seo ag teacht leis na samplaí ardghníomhaíochta scavening radacach go háirithe. lúide, P.India agusC.caudatus, a rabhthas ag súil go ndéanfaí idirdhealú orthu ó na cinn eile mar gheall ar a dtiúchan ard de mheitibilítí tánaisteacha, go háirithe flavonoids, Creidtear freisin go gcuireann láithreacht na gcomhdhúile feanólacha seo le gníomhaíochtaí coisctheacha elastase agus collagenase níos mó de na luibheanna seo [67-79,89-92].

Tá an méid a chuireann comhdhúile bithghníomhacha sleachta plandaí le cumas scavening radacach saor in aisce agus gníomhaíocht frith-aosaithe doiciméadaithe ag staidéir éagsúla [66,72,75,79,92-101]. Ina theannta sin, tá sé cruthaithe go gcuireann meitibilítí cosúil le flavonoids (quercetin, kaempferol, myricetin, epicatechin, agus catechin) agus feanóil eile cosúil le resveratrol agus procyanidin B2, bac suntasach ar elastase agus collagenase [69-71,79].

Sa staidéar reatha, aithníodh agus athbhreithníodh na comharthaí meitibilít maidir le tábhacht athraitheach sna luachanna teilgean (VIP) chun na meitibilítí is suntasaí a fháil a bhí comhghaolmhar leis na bithghníomhaíochtaí a tástáladh. Rinneadh é seo chun sláine na dtorthaí a chuirtear i láthair anseo a mhéadú, a scrúdaigh acmhainneacht idirdhealaitheach na meitibilítí aitheanta.puritans vitimín cGenerally, the metabolites signal with VIP>Cuireadh san áireamh {{0}}.5 a bheith suntasach maidir le hidirdhealú [102]. Sa staidéar seo, d'fhéadfaí na meitibilítí go léir a chuireann le gníomhaíochtaí scavening radacacha agus airíonna frith-aosaithe a rangú mar mheitibilítí idirdhealaitheacha suntasacha ós rud é go raibh a luachanna VIP os cionn 1.0 (Tábla 2). Rinneadh an dá mhúnla PLSbibplots a bhailíochtú trí úsáid a bhaint as 100 iomalartú randamach, chun bailíocht (R2) agus cumais thuarthach (Q2) an bhunsamhail a dhearbhú le roinnt samhlacha, i gcomparáid le feabhas an fheistis. Léirigh an R2 go raibh folláine an mhúnla suntasach agus mhínigh sé grád na n-athróg sa mhúnla, ach thairg C2 cáilíocht thuarthach na samhla cosúil leis an gceann a thuairiscigh Eriksson et al. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). Léirigh na torthaí go bhfuil gach idircheapadh Y-ais de R< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>sistéalBhí na luachanna idircheapa R2 agus Q2 sa raon 0.0367-0.0872 agus-0.444 go-0.492, faoi seach, rud a thugann le tuiscint go raibh an dá mhúnla PLS bailí agus níor léirigh sé ró-oiriúnach. Mar sin, d’fhéadfaí an dá shamhail PLS seo a chatagóiriú mar mhúnlaí dea-fheidhmíochta agus mhéadaigh na torthaí seo iontaofacht na múnlaí.

2.7. Cainníochtú Coibhneasta Meitibilítí Tánaisteach

Léirítear cainníochtú coibhneasta cuid de na meitibilítí tánaisteacha a aithníodh ó na luibheanna roghnaithe i bhFíor 6. Fuarthas go raibh na meitibilítí seo níos airde den chuid is mó sna luibheanna is gníomhaí ar nós P. lúide, bhí siad suite ar thaobh dearfacha na mbíoplaí, i.e. agus bhí siad níos gaire do bheagnach na bithghníomhaíochtaí a tástáladh.cad é cisteánLéirigh na torthaí seo go bhféadfadh meitibilítí tánaisteacha go háirithe ón ngrúpa flavonoid comhdhúile atá i láthair i méideanna ard P. lúide a bheith tar éis cur le díothú radacach saor in aisce agus airíonna frith-aosaithe an luibh seo?

Nuair a dhéantar comparáid le struchtúir éagsúla an flavonoid a d'fhéadfadh cur lena n-éifeachtacht, tugadh faoi deara go bhféadfadh an patrún hiodrocsailiú sa fáinne B a bheith ar cheann de na fachtóirí tábhachtacha maidir le héifeacht coiscthe na meitibilítí ar ghníomhaíocht einsímí aosaithe[80] . Sim et al.[104] tugadh le fios freisin go raibh éifeacht coisctheach na flavonoids seo cumhachtach ag an leibhéal próitéine agus mRNA araon le méadú ar líon na ngrúpaí sa B-fáinne, agus scrúdaigh siad comhlachas struchtúr-gníomhaíochta roinnt flavonoids in MMP{5}} léiriú géine i fibroblasts deirmeacha daonna UV-Aerradaithe.

3. Ábhair agus Modhanna

3.1. Ceimiceáin agus Imoibrithe

Sholáthair Merck Millipore International (Darmstadt, an Ghearmáin), meatánól-d4(CH3OH-d4) deuterated meatánól-d4(CH3OH-d4), KH2PO4 neamh-deuterium, ocsaíd deoitéiriam sóidiam (NaOD), aigéad trimethyl siile propionic-d4 (TSP), eatánól, agus meatánól. Quercetin, maolán fosfáit, 2,2-défheinile-1-pícríhiodráitíle (DPPH),2,2-azinobis(3-eitil-beansait-asóil-6-aigéad sulfónach)[ABTS ],Trolox, persulfate potaisiam,2,2'-azobis(2-amidinopropane)[AAPH, gallate epigallocatechin (EGCG), maolán HEPES, einsímí elastase,N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro,N -Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide agus ocsaíd deoitéiriam (D2O) a sholáthair Sigma (Aldrich, an Ghearmáin).

3.2. Ábhar Plandaí agus Sampláil

Bailíodh duilleoga úra de O.jacanica, P. lúide, agus C.longa ó Felda Sungai Koyan Satu, Raub, agus Pahang. Fuarthas duilleoga V.negundo ó Institiúid na Bitheolaíochta, Universiti Putra Mhalaeisia. Baineadh duilleoga úra P. indica i bPáirc Talmhaíochta na hOllscoile, Universiti Putra Mhalaeisia, agus bailíodh duilleoga úra de duilleoga C. caudatus ag an Institiúid Talmhaíochta, Serdang, Selangor. Cuireadh eiseamal dearbhán de na luibheanna seo ag an luibhiam, Institiúid na hEolaíochta Bitheolaíochta, Universiti Putra Malaysia, agus dheimhnigh an luibheolaí gach eiseamal.Ciste frith-aosaitheBaineadh na duilleoga go léir go comhsheasmhach ar maidin, ar laethanta grianmhara chun iontaofacht ábhar meitibilítí a chinntiú. Scaradh an ceap ag an bpáirc oscailte do gach luibh ina sé chuid agus bailíodh gach sampla ó gach mír mar sé mhacasamhail.

3.3.Sample Ullmhú

Nuair a bhí siad bainte, nitear na duilleoga úra faoi uisce sconna reatha chun na hiarmhair go léir a bhaint, triomaíodh iad le páipéar fíocháin saotharlainne, agus reoitear iad láithreach le nítrigin leachtach chun na frithghníomhartha einsímeacha go léir a stopadh agus chun na meitibilítí a chaomhnú roimh lyophilization. Triomaíodh na samplaí ansin i dtriomadóir reoite LABCONCO (Kansas City, MO, USA) go dtí gur shroich an meáchan comhsheasmhach agus an cion taise faoi bhun 10 faoin gcéad . Meilt na samplaí triomaithe go léir ag baint úsáide as cumascóir saotharlainne go púdar mín agus criathar ag baint úsáide as criathar tástála saotharlainne (ENDECOTTS LTD.London, Sasana) ar mhéid 300 um chun an méid aonfhoirmeach a fháil. Pacáladh na samplaí púdraithe i bhfolúsphacáistiú i bpacáistíocht alúmanaim chun iad a chosaint ar nochtadh solais agus taise agus stóráladh iad ag -80 céim roimh an anailís.

3.4. Eastóscadh

An nós imeachta eastóscadh cur síos ag Mediani et al. [105] rinneadh roinnt modhnuithe ina dhiaidh sin. Go hachomair, tumadh 10 g de gach sampla púdraithe i 100 mL 60 faoin gcéad eatánól i bhfleascán cónúil ómra agus sonicated for1 h ag baint úsáide as sonicator folctha ultrasonaic (WiseClean, múnla WUC-D10H, Seoul, an Chóiré) faoi theocht rialaithe (faoi bhun 40 céim) . Scagadh na samplaí trí pháipéar scagaire Whatman uimh. 1 agus rinneadh na hiarsmaí a ath-eastóscadh faoi dhó agus a scagadh tar éis don chéad eastóscadh a bheith críochnaithe. Ansin rinneadh na sleachta a chomhthiomsú agus a chomhchruinniú ag baint úsáide as evaporator rothlach faoi fholús ag 40 céim. Rinneadh na substaintí slaodacha díorthaithe a reo ansin trí úsáid a bhaint as triomadóir reoite LABCONCO chun díothú cuimsitheach uisce a chinntiú agus a stóráil ag céim-80 go dtí go n-úsáidfí a thuilleadh é. Ar deireadh, caolaíodh na hamhábhair thriomaithe go dtí na tiúchain riachtanacha do na himscrúduithe go léir a rinneadh.

3.5. Gníomhaíocht Scavening Radacach DPPH

Cinneadh gníomhaíocht scavening radacach na samplaí trí leanúint leis an teicníc a d'fhorbair Kong et al.[106], a forbraíodh ó mhodh modhnaithe de chuid Brand-Williams et al. [107]le mionathrú. Go hachomair, cuireadh eastóscáin shamplacha 50ulL i meatánól ag tiúchain dhifriúla (0 go 500 ug/mL) le tuaslagán 195uL-ullmhaithe 0.2mMethanolic2,2-défheinile{-1-picrylhydrazil (DPPH) agus stóráiltear iad. Ullmhaíodh na samplaí tástála ar fad i 96 pláta tobair. Taifeadadh Thedecolourizingprocess ag 515 nm ag baint úsáide as speictrophotometer (léitheoir microplate Biotek EL 800, Bio-Tek, Winooski, VT, SAM) tar éis gor 60 nóiméad sa dorchadas agus i gcomparáid le rialú dearfach agus samplaí bán. Tomhaiseadh an céatadán de ghníomhaíocht scavenging radacach de réir na cothromóide seo a leanas:

áit a bhfuil A rialú an absorbance de rialú gan sleachta plandaí agus is Simplí an ionsú na sleachta plandaí.

Rinneadh na sleachta plandaí nó na tiúchain rialaithe dearfacha a scavened 50 faoin gcéad de DPPH radacach saor in aisce a ríomh mar na ICanna ag baint úsáide as an ngraf líneach de chéatadán gníomhaíochta scavenging radacach i gcoinne

eastóscáin phlandaí/tiúchain rialaithe dearfacha. Léirigh ICso níos ísle gníomhaíocht frithocsaídeach níos airde. Reáchtáladh na turgnaimh go léir i sé mhacasamhlú le Trolox agus quercetin mar rialuithe dearfacha.

3.6.ABTS Measúnacht Scavening Radacach

Maidir le measúnacht radacach ABTS, rinneadh an anailís de réir an nós imeachta a ndearna Arnao et al.[108] agus roinnt leasuithe air. Ba iad na réitigh stoic a ullmhaíodh ná tuaslagán 7mM ABTS móide agus tuaslagán sársulfáit photaisiam 2.45 mM. D'fhonn an réiteach oibre a ullmhú, rinneadh an dá réitigh stoic a mheascadh sna méideanna céanna agus fágtar iad chun freagairt sa dorchadas ar feadh 16 h ag teocht an tseomra. Ansin, caolaíodh an tuaslagán oibre le huisce driogtha chun ionsúiteacht de 0.700±0.005 aonad a fháil ag 734 nm ag baint úsáide as speictreafótaiméadar (UV-1650PC spectrophotometer, Shimadzu, Kyoto, Japan) agus ar a dtugtar ABTS móide réiteach. Ullmhaíodh an réiteach ABTS móide as an nua do gach measúnacht. Ceadaíodh an réiteach ABTS móide （900 μL） chun imoibriú le 100 μL de shleachta luibh ar feadh 2 nóiméad. Léadh an t-ionsúchtúchán ansin ag 734 nm ag baint úsáide as an speictreafótaiméadar. Forbraíodh an cuar caighdeánach comhdhéanta de 3.1 ug/mL go agus 50 ug/mL Trolox, agus cuireadh na torthaí in iúl mar mg sampla Toilleadh Frithocsaídeach Coibhéiseach Trolox/g (mg sampla TEAC/g).

3.7. Measúnacht Scavening Radacach ORAC

Cuireadh measúnú ORAC i bhfeidhm chun éifeachtúlacht scavenála radacach sárocsaile a thomhas mar a luaigh Huang et al. [109] ag baint úsáide as an léitheoir fluaraiseacht microplate FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH, Ortenberg, an Ghearmáin). Ullmhaíodh gach sliocht luibh agus Trolox (caighdeánach) i dtuaslagán maolánach fosfáite 75 mM （PBS） pH 7.4. I 96-micreaplate tobair dubh, cuireadh iomlán de 150 μL fluorescein (10 nM tuaslagtha i PBS) leis agus ina dhiaidh sin 25 μL de Trolox, sleachta plandaí, nó PBS mar bhán. Pípéadaíodh na réitigh seo i dtoibreacha faoi thrí. Goradh an microplate ar feadh 15 nóiméad ag 37 céim agus clúdaigh sé le clúdach. Tomhaiseadh an fhluaraiseacht le tonnfhad excitation ag 458 nm agus tonnfhad astaithe ag 520 nm. Socraíodh an comhartha cúlra tríd an tomhas a ghlacadh gach 90 s.

Ina dhiaidh sin, thug insteallairí ar bord isteach 2,2'-azobis (2-amidinopropane)(AAPH,240 mM i PBS) úrullmhaithe. Tógadh an meath ar fhluaraiseacht suas le 90 nóiméad ansin ag baint úsáide as na tonnfhaid excitation agus astaithe céanna. Rinneadh an mheastóireacht ar na limistéir faoin gcuar le haghaidh samplaí (fluaraiseacht in aghaidh ama) lúide an limistéar faoin gcuar don bhán agus i gcomparáid le cuar caighdeánach （25-400 μM Trolox）. Ríomhadh na luachanna ORAC a bhaineann leis an Trolox ag baint úsáide as an gcothromóid mar seo a leanas:

3.8.Measúnú Cosc ar Elastase

Cinneadh an ghníomhaíocht coisctheach elastase de réir na teicníochta a ndearna Krause et al.[110] cur síos uirthi, le mionathruithe ag Ndlovu et al. [75]. Sna toibreacha samplacha bhí maolán 25 μL 0.1 M HEPES (pH7.5), 25 μL sliocht luibh (100 ug / ml), agus 25 μL elastase einsím (1 ug/mL). Ní raibh ach maolán 75 μL HEPES sna toibreacha bána agus bhí maolán 50 μL HEPES agus einsím elastase 25 μL sna toibreacha rialaithe diúltacha. Bhí maolán 25 μL HEPES sna toibreacha rialaithe dearfacha, 25 μL N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro (10 ug/mL), agus 25μL d'einsím elastase. Sna toibreacha rialaithe tuaslagóirí bhí maolán 25 μL HEPES, 25 μL de 10 faoin gcéad meatánóil, agus 25 μL elastase einsím. Bhí maolán 150 μL HEPES agus 25 ul den sliocht luibhe i rialuithe bána don sliocht luibh (le haghaidh rialuithe datha gach eastóscáin a tástáladh). Goradh an pláta micrea-tobar ansin ar feadh 20 nóiméad ag teocht an tseomra. Ina dhiaidh seo, cuireadh substráit 100μL (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide,1 mM). Ansin goradh na plátaí ar feadh 40 nóiméad breise ag 25 céim. Tar éis goir, léadh an t-ionsúite ag baint úsáide as speictreafótaiméadar (léitheoir micreaphláta Biotek EL800) ag 405 nm. Ríomhadh céatadán coiscthe na n-sleachta luibh ag baint úsáide as an gcothromóid mar seo a leanas:

áit a bhfuil A control an absorbance maolán le elastase agus tuaslagóir agus Atest an ionsú maolán, elastase, agus luibh sliocht nó N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro.

3.9. Measúnacht ar Chosc Collagenase

Rinneadh an ghníomhaíocht choiscthe collagenase tar éis modh Van-Wart agus Steinbrink [111] (1981) le modhnuithe le Madrone et al. [92]. Cuireadh an tástáil i bhfeidhm i maolán 50 mM TES (pH7.4 le 0.36 mM CaCl2). Ullmhaíodh einsím collagenase ó Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23.3) ag an tiúchan de 0.8 aonad/mL (tuaslagtha i dtuaslagán stoc maoláin TES). Ullmhaíodh an tsubstráit shintéiseach N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) ag tiúchan 2 mM i dtuaslagán stoc maoláin TES. Bhí toirt iomlán 150 μL don mheascán imoibrithe deiridh 46.3 μL TESbuffer, 60 μL FALGPA (0.8 mM tiúchan deiridh FALGPA）, 18.7 μL einsím collagenase (0.1 aonad/mL tiúchan deiridh) ） 100 ug/ml）. Gortaíodh eastóscáin luibhe agus einsímí i maolán TES ag teocht an tseomra ar feadh 15 nóiméad sula gcuirtear an tsubstráit leis chun an t-imoibriú ceimiceach a thionscnamh. Rinneadh rialuithe diúltacha le maolán TES. Tar éis an tsubstráit a chur leis, léadh an t-ionsúchtúchán láithreach ag 340 nm ag baint úsáide as speictreafótaiméadar (Microplate Tagarmharc Plus, Bith-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i 96 pláta microtiter tobair agus tomhaistear go leanúnach le haghaidh pláta eile. 20 nóim. Rinneadh rialú dearfach ag baint úsáide as epigallocatechin gallate (EGCG) ag 12.5ug/mL. Ríomhadh céatadán an choisc ar shamplaí ag baint úsáide as an gcothromóid mar seo a leanas:

i gcás inarb é A rialú ionsúchán maolán TES agus gurb é Atest an t-ionsú maolán TES, einsím collagenase, agus eastóscán plandaí nó FALGPA.

Próifíleáil 3.10.Metabolite Ag Úsáid 'Tomhas H-NMR

Rinneadh próifíliú meitibilít ag baint úsáide as H-NMR de luibheanna roghnaithe bunaithe ar an bprótacal a ndearna Kim et al cur síos air. [47] le mionathruithe. Aistríodh sleachta luibhe amh (25mg) isteach i bhfeadán microcentrifuge ml. Cuireadh meascán de mhaolán meatánóil-d4 agus KHPO4 i Dao (pH 6.0)ina bhfuil 0.1 faoin gcéad de shalann sóidiam aigéid sileapróiónach trímheitile (TSP) leis na samplaí luibhe le toirt iomlán de { {10}}.7mL ag (1:1)cóimheas. Rinneadh na feadáin microcentrifuge ina raibh sleachta luibh a vortexed ansin ar feadh 1 nóiméad ag teocht an tseomra agus ina dhiaidh sin ultrasonication ar feadh 15 nóiméad. Ansin, lártheifneoiríodh an meascán ar feadh 10 nóim ag 5678g chun an comhshnámhán a scaradh ó aon ábhair dothuaslagtha. Ina dhiaidh sin, ionchorpraíodh forshnáthán soiléir 0.6mL i bhfeadáin NMR agus rinneadh anailís H-NMR air. Baineadh an anailís ar H-NMR trí speictriméadar INOVA NMR Athraitheach 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, SAM) a d'fheidhmigh ag minicíocht 499.887 MHz agus taifeadadh speictrim ag 26 céim . Chuimsigh gach speictream 64 scanadh le 3.53 nóiméad d'am fála agus leithead 20 ppm. Rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as bogearraí Chenomx (v.6.2)(Clhenomx Inc, Edmonton, AB, Ceanada) chun ceartú céimnithe agus bonnlíne a dhéanamh le socrú comhsheasmhach. Rinneadh anailís ar shonraí ilathraithe ag baint úsáide as bogearraí SIMCA (leagan 13.0, Umetrics, Umea, an tSualainn). 3.11. Buicéadú 'H-NMR Spectra

Cuireadh bucketingof H-NMR spectra i bhfeidhm trí úsáid a bhaint as bogearraí Chenomx (v.6.2, Edmonton, AB, Ceanada). Cuireadh na speictream go léir i mboscaí ó0.5-10.0 pprn réigiún leis na paraiméadair chéanna. Áiríodh leis na paraiméadair leithead speictreach de §0.04 a fuair iomlán de 245 réigiún comhtháite do gach speictream NMR. Cuireadh deireadh leis an aistriú ceimiceach d'uisce agus meatánól iarmharach ag δ4.70-4.90 agus δ3.27-3.35 faoi seach. Rinneadh anailís ar shonraí ilathróg (MVDA) ar na sonraí binn aonfhoirmeacha ansin.

3.12. Cainníochtú Coibhneasta Meitibilítí

Scrúdaíodh na meitibilítí aitheanta maidir lena gcainníochtú coibhneasta a ríomhadh bunaithe ar bhuaic-achar meánach na gcomharthaí tar éis speictrim LH-NMR a chur ar aghaidh.

3.13. Anailís staitistiúil

Cuireadh gach toradh de shé mhacasamhail in iúl mar mhodh ± diall caighdeánach. Chun gníomhaíochtaí scavenging radacach a thomhas, cosc ​​ar ghníomhaíochtaí elastase agus collagenase, agus cainníochtú coibhneasta meitibilítí, rinneadh anailísí staitistiúla ag baint úsáide as Minitab 16 (Leagan 16, Minitab Inc., State College, PA, SAM). Cuireadh anailísí athraitheas (ANOVA) i bhfeidhm chun na difríochtaí suntasacha idir na modhanna le p<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4. Conclúidí

D'éirigh le feidhmiú anailísí H-NMR in éineacht le MVDA iniúchadh a dhéanamh ar éagsúlacht i meitibilítí na luibheanna roghnaithe. Léirigh plota scór PCA deighilt ar leith idir na luibheanna de réir a gcnuasach. Léirigh an staidéar seo go raibh an éifeacht scavening radacach ab airde ag P. minus trí thástálacha DPPH agus ABTS agus léirigh sé na gníomhaíochtaí frith-aosaithe is airde. Rinne an dá dhéphlota d’anailís PLS an toradh seo a bhailíochtú tuilleadh, ó fuarthas go raibh baint láidir idir na meitibilítí a aithníodh in P. lúide agus na bithghníomhaíochtaí a tástáladh. I measc na meitibilítí gníomhacha a chreidtear a chuireann le gníomhaíochtaí scavening radacacha agus airíonna frith-aosaithe P.minus tá quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, díorthaigh myricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin, agus apigenin. Mar sin, is féidir glacadh leis go raibh na meitibilítí seo freagrach as an éifeacht scavenging radacach potent agus airíonna frith-aosaithe ard de P. lúide. Tháinig na meitibilítí seo go príomha ón ngrúpa flavonoids, go háirithe flavonols. Mar sin, is féidir a mholadh go bhféadfadh na meitibilítí ó P. lúide a bheith ina n-imdhíontóir radacach saor in aisce agus ina choscóir einsímí aosaithe ar féidir iad a úsáid le haghaidh comharthaí aosaithe moille agus chun galair ainsealacha a bhaineann le dul in aois a chóireáil. Cabhróidh na torthaí seo le hacmhainneacht P. lúide a shuíomh mar fhoinse nádúrtha fhéideartha d’oibreáin fhrith-aosaithe agus mar dhíomántóir nádúrtha radacach saor in aisce.

Baintear an t-alt seo as Molecules 2019, 24, 3208; doi: 10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules