Clónáil Mhóilíneach agus Tréithriú Bithcheimiceach Coumarin Nua Glycosyltransferase CtUGT1 Ó Cistanche Tubulosa

le haghaidh tuilleadh eolais:ali.ma@wecistanche.com

Dúirt Xiping Xu, et al

Teibí

Is teaghlach tábhachtach agus éagsúil feidhmiúil einsímí iad UDP-glycosyltransferases (UGTanna) a bhfuil baint acu le bithshintéis meitibilíte tánaisteach. Tá Coumarin ar cheann de na cnámharlaigh is coitianta de tháirgí nádúrtha le gníomhaíochtaí cógaseolaíochta iarrthóra. Mar sin féin, go dtí seo, d'aithin go leor OT a thuairiscigh ó phlandaí go príomha flavonoids mar ghlacadóirí siúcra. Ní fhéadfadh ach OTanna teoranta gliocóisiliú cúmairin a chatalú. Sa staidéar seo, rinneadh UGT nua a chlónáil óCistanche tubulosa, luibh Sínis tonic traidisiúnta luachmhar, atá flúirseach le gliocóisídí éagsúla cosúil le gliocóisídí feinileatánóideach, gliocóisídí lignan, agus gliocóisídí iridoid. Léirigh ailíniú seicheamh agus anailís phylogenetic goCtUGT1tá sé i bhfad i gcéin ó chuid is mó de na UGTanna flavonoid tuairiscithe agus cóngarach do UGTanna feinilpropanoid. Fuarthas amach i measúnachtaí fairsinge einsímí in vitro cé go raibhCtUGT1nach raibh baint acu leis an biosintéis na gliocóisídí bithghníomhacha iCistanche tubulosa, d'fhéadfadh sé glucosylation de coumarins umbelliferone 1, esculetin 2, agus hymecromone 3 a chatalú i toradh suntasach. Aithníodh na táirgí glycosylated trí chomparáid a dhéanamh leis na caighdeáin tagartha nó speictreascópacht NMR, agus léirigh na torthaí é sinCtUGT1is féidir leo glucosylation de hiodrocsaile cúmarins ag suíomh C7- OH a chatalú go regispecific. Na príomh-iarmhair a chinnCtUGT1Rinneadh tuilleadh plé ar ghníomhaíocht bunaithe ar shamhaltú homaleolaíochta agus anailísí duga móilíneach. In éineacht le torthaí mutagenesis faoi stiúir an tsuímh, fuarthas amach go raibh ról do-athsholáthair ag H19 mar bhunús ríthábhachtach catalaithe.CtUGT1D'fhéadfaí é a úsáid in ullmhú einsímeach na gliocóisídí bithghníomhacha cúmarin.

Eochairfhocail:Glicosyltransferases plandaí, gliocóisídí Coumarin,Cistanche tubulosa, Samhaltú Homeolaíochta, Mutagenesis faoi stiúir an tsuímh

Cliceáil chun táirgí sochair sliocht cistanche

Réamhrá

Tá glycosylation ar cheann de na cineálacha modhnú struchtúir is coitianta de tháirgí nádúrtha tánaisteacha. D’fhéadfadh gliceasúlú cobhsaíocht agus/nó tuaslagthacht an aglycon a athrú, agus cur go mór le héagsúlacht táirgí nádúrtha/mínádúrtha de bharr na gcineálacha comhchuingeacha iolracha. I bplandaí, is gnách go ndearnadh na frithghníomhartha seo trí glycosyltransferases (UGTanna)-spleách ar urdine diphosphate (UDP), ar chineál na n-einsímí a chatalaíonn aistriú moieties monaisiúicríde ó shiúcra nucleotíde gníomhachtaithe go móilín glacadóir glycosil ar féidir a bheith ina carbaihiodráit, glycosíd, oligosaccharide. , nó polaisiúicríd [1,2]

Go dtí seo, tá go leor géinte a ionchódaíonn UGTanna scoite amach ó roinnt plandaí [3]. Tharla an glycosylation go príomha ag grúpaí hiodrocsaile nó grúpaí carboxyl de raon leathan táirgí tánaisteacha, mar shampla flavonoids [4], phenylpropanoids [5], terpenoids [6], stéaróidigh [7], alcalóidigh [8], agus mar sin de. Is meitibilítí feinilpropanoids iad coumarins a dháiltear go forleathan i go leor speiceas plandaí. Is minic a bhíonn coumarins a tharlaíonn go nádúrtha ann mar glycoconjugates, agus léirigh na díorthaigh seo speictream leathan gníomhaíochtaí cógaseolaíochta, lena n-áirítear antioxidant [9], antiviral [10,11], hepatoprotective [12], anti-inflammatory [13], anti-ailse [14]. ], gníomhaíochtaí coisctheacha antimutagenic [15], agus cholinesterase (ChE) & monoamine oxidase (MAO) [14,15], etc., áfach, go dtí seo, i gcomparáid leis na UGTanna flavonoids is minice a tuairiscíodh agus a imscrúdaíodh go forleathan, ní raibh ach UGTanna teoranta tuairiscíodh go raibh siad in ann an taise siúcra a aistriú go cúmairíní [16-18].

D’fhéadfadh plandaí atá saibhir i gliocóisídí éagsúla feidhmiú mar chomhthiomsú géine idéalach UGTanna le gníomhaíochtaí catalaithe núíosacha. Ina theannta sin, tuairiscíodh go bhfuil go leor UGTanna soiléire glactha go leor chun gliocóisiliú foshraitheanna iolracha a chatalú, cuid acu nach raibh scartha fiú sna gléasraí [19]. San Airteagal seo, glycosyltransferase úrscéalCtUGT1aithníodh óCistanche tubulosa, luibh íocshláinte traidisiúnta atá flúirseach le gliocóisídí éagsúla cosúil le gliocóisídí feinileatánóideach (PhGs), gliocóisídí lignan, agus gliocóisídí iridoid. Léirigh léiriú heitreolaíoch agus tréithriú feidhmeanna cé go raibh siad athchuingreachCtUGT1Ní raibh baint aige le bithshintéis na gliocóisídí seo iCistanche tubulosa, féadann sé glucosylation de cúmarins hiodrocsaile a chatalú, agus tharla an t-imoibriú go sonrach ar shuíomh 7- OH coumarins umbelliferone 1, ag ardú 2, agus hymecromone 3 chun trí chomhdhúile atá gníomhach ó thaobh cógaseolaíochta de skimming (1a), cichoriin (2a) a tháirgeadh. , agus 4-glúcósíd meitiolumbelliferyl (3a) le táirgeacht shuntasach, faoi seach. Ina theannta sin, d'fhéadfaí glacadh freisin le substráit benzophenone 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), substráit isoflavone genistein (5), agus substráit anthraquinone aló-emodin (6).CtUGT1. Na hairíonna catalaíoch agus na heochair-iarmhair a chuireann béim ar chumas catalaíochCtUGT1Rinneadh meastóireacht orthu freisin bunaithe ar shamhaltú homaleolaíochta, anailís AutoDock, agus mutagenesis faoi stiúir an tsuímh.

2. Turgnamhach

2.1. Ábhar plandaí agus ceimiceáin

Cistanche tubulosaBailíodh úsáid sa staidéar seo ó cheantair fhásacha i réigiúin uathrialacha Hetian, Xinjiang. Dheimhnigh an tOllamh Pengfei Tu in Ollscoil Peking a bhféiniúlacht luibheolaíoch. Ceannaíodh na coumarins a ndearnadh tástáil orthu agus na foshraitheanna eile sa staidéar seo ó Sigma-Aldrich (St Louis, SAM), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd (Chengdu, an tSín), agus Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd (Chengdu, an tSín). (b) mura luaitear a mhalairt. Ceannaíodh caighdeáin tagartha skimming (1a) agus cichoriin (2a) ó Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, an tSín).

2.2. Clónáil mhóilíneach CtUGT1 ó Cistanche tubulosa

RNA iomlán deCistanche tubulosaBaineadh as an gas méithe ag baint úsáide as OMEGA Gléasra RNA Kit (GA, SAM) agus tras-scríofa droim ar ais go cDNA le PrimeScript™ RT imoibrí Kit (TaKaRa, an tSeapáin) de réir threoracha an déantóra. Dearadh primer degenerate do 3′RACE bunaithe ar na sraitheanna aimínaigéad sa PSPG caomhnaithe (Glycosyltransferases Táirge Tánaisteach Gléasra) -bosca de glycosyltransferases plandaí. Na aimplithe 3′-deireadh agus 5′-deireadh deCtUGT1Rinneadh úsáid as Smart RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, SAM) de réir phrótacal an mhonaróra ag baint úsáide as primers (Tábla S1). An cDNA lán-fhad anCtUGT1arna mhéadú ag PCR ag baint úsáide as KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, an tSeapáin) le péirí primer géine-shonracha (Tábla S1) faoi na coinníollacha seo a leanas: céim dínádúraithe tosaigh ag 94 ◦C ar feadh 2 nóiméad, agus ina dhiaidh 35 timthriallta dínádúraithe ag 98 ◦C ar feadh 15 s, annealing ag 55 ◦C ar feadh 30 s, agus síneadh ag 68 ◦C ar feadh 55 s, le céim síneadh deiridh ag 68 ◦C ar feadh 7 nóiméad. Clónáladh na blúirí DNA go léir a fuarthas isteach i veicteoir peasY-Blunt (TransGen Biotech, an tSín) agus cuireadh iad in ord.

2.3. Ailíniú seicheamh agus anailís fhileigineach

Ailíniú seicheamh deCtUGT1le glycosyltransferases tuairiscithe (Tábla S2) ag baint úsáide as pacáiste bogearraí DNAMAN 4.0 (Lynnon Biosoft, Ceanada). Rinneadh anailís ar na móitífeanna agus ar na fearainn agus úsáid á baint as uirlis fearainn chaomhnaithe (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi). Tógadh an crann fylogenetic trí bhogearraí MEGA 7.0.14 a bhrostú ag baint úsáide as an modh ceangal comharsan le 1000 macasamhlú bootstrap [20]. An seicheamh próitéin aistrithe deCtUGT1ailínithe leis na glycosyltransferases plandaí aitheanta a thaisceadh i mbunachar sonraí GenBank NCBI (Tábla S3) le ClustalW.

2.4. Léiriú heitrologach agus íonú próitéin CtUGT1 in Escherichia coli

Réigiún códaithe naCtUGT1a aimpliú le BamH I agus Ní I mar shuímh srianta ag baint úsáide as priméirí a thaispeántar i dTábla S1. Rinneadh imoibrithe PCR ag baint úsáide as KOD-Plus-Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Osaka, an tSeapáin). Fíoraíodh na sraitheanna a fuarthas trí chlónáil isteach sa veicteoir peasY-Blunt (TransGen Biotech, an tSín). Tá an táirge aimpliúcháin deimhnithe deCtUGT1díleáite ina dhiaidh sin agus fo-chlónáilte isteach sa slonn veicteoir pET-28a( plus ) (Novagen, USA). Rinneadh an tógáil fhíoraithe a chlaochlú ansin go E. coli Transetta (DE3) chun an brú athchuingreach a fháil. Rinneadh cultúr athchuingreach thar oíche a ionaclú i meán Luria-Bertani (LB) ina raibh 50 ug⋅mL− 1 kanamycin agus 40 ug⋅mL− 1 chloromycetin ag cóimheas 1:1{{ 19}}0. Fásadh na cultúir ag 37 ◦C, 200 rpm go dtí gur shroich luach OD600 0.4–0.6. Cuireadh Isopropil- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) le tiúchan deiridh de 0.5 mM ina dhiaidh sin agus fásadh na cealla ar feadh 16 h ag 18 ◦C, 180 rpm. Ansin baineadh millíní cille trí lártheifneoiriú (7600 × g, 10 min, 4 ◦C), agus ath-fhionraí i 3 ml / g maolán lysis fuaraithe (Sonraí Forlíontacha Nóta 1), agus chuir sonication ar oighear isteach orthu. Baineadh an smionagar cille trí lártheifneoiriú ag 7600 × g, 4 ◦C ar feadh thart ar 30 nóiméad. Úsáideadh colún Histrap réamhchothromaithe (GE Healthcare, Uppsala, an tSualainn) le haghaidh crómatagrafaíocht cleamhnais de réir threoracha an déantóra. Cuireadh an phróitéin athchuingreach ar ceal ag 10 méideanna colún de mhaolán elution (Nóta Sonraí Forlíontacha 1) ina raibh imidazole 250 mM. Rinneadh anailís ar íonacht próitéin 10 faoin gcéad SDS-PAGE. Dhírigh feadán ultrascagtha 30 kDa (Sigma-Aldrich, SAM) an phróitéin íonaithe agus díshaillte é ag baint úsáide as colún PD-10 (GE Healthcare, Uppsala, an tSualainn) le maolán díshaillte (Nóta Sonraí Forlíontacha 1). Cinneadh an tiúchan próitéine ag modh Bradford ag baint úsáide as BSA mar chaighdeán.

2.5. Measúnachtaí gníomhaíochta einsímeacha agus sainiúlacht an tsubstráit CtUGT1

Imscrúdú a dhéanamh ar ghníomhaíocht glycosylation deCtUGT1, rinneadh measúnachtaí einsíme i meascán imoibrithe (150 μL) comhdhéanta de 0.4 mM aglycone, 0.8 mM UDP-glúcóis (UDPG), agus 50 ug de íonaitheCtUGT1próitéin sa mhaolán díshaillte. Goradh gach imoibriú ag 30 ◦C ar feadh 12 h agus críochnaíodh é trí 300 μL de meatánól fuar a chur leis. Rinneadh na meascáin a lártheifneoiriú ag 15,000 ×g ar feadh 30 nóiméad chun an comhshnaidhm a bhailiú le haghaidh anailísí HPLC-UV/ESI-MS. De ghnáth rinneadh trí mheasúnú comhthreomhara do gach imoibriú. Bhí brathadóir eagair dé-óid feistithe ag HPLC (Agilent 1260, SAM) agus colún CAPCELL PAK C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm; Shiseido, an tSeapáin) ag ráta sreafa 1 mL⋅min− 1, agus teocht an cholúin coinníodh ag 30 ◦C. Is éard a bhí sa chéim shoghluaiste A (ie, tuaslagán uiscí aigéad formach 0.1 faoin gcéad) agus B (ie, acetonitrile). Liostaíodh na cláir ghrádáin i dTábla S4. Taifeadadh sonraí HRESI-MS ar chóras LCMS-IT-TOF, atá feistithe le comhéadan ESI (Shimadzu, Kyoto, an tSeapáin) le íonacht ultra-ard He mar ghás imbhuailte, agus N2 mar an gás nebulizing. Ba iad seo a leanas na paraiméadair foinse optamaithe ESI: ráta sreafa gáis sheath, 1.5 mL⋅min− 1; ráta sreafa gáis chúnta, 1.5 mL⋅min− 1; voltas spraeála, 4.5 kV; teocht ribeach, 200 ◦C. Taifeadadh na speictrim sa raon 100–1500 m/z le haghaidh anailíse scanta iomlán MS.

2.6. Éifeachtaí am imoibrithe, luach pH agus teocht ar ghníomhaíocht einsíme, agus staidéir chinéiteach ar CtUGT1

Éifeachtaí am imoibrithe, luach pH, ​​agus teocht ar ghníomhaíocht einsímíCtUGT1Rinneadh tástáil orthu ag baint úsáide as UDPG mar dheontóir siúcra agus 3 mar ghlacadóir siúcra sna coinníollacha imoibrithe mar a thuairiscítear thuas. Chun an pH optamach a chinneadh, rinneadh comparáid idir an ghníomhaíocht einsíme i maolán 100 mM (aigéad citreach-citrate sóidiam) le luachanna pH idir 3.0 go 6.{{ 14}}, 10{{20}} maolán mM (KH2PO4-K2HPO4) le luachanna pH idir 6.0 go 8.{{29} }, bhí maolán 100 mM (Tris-HCl) le luachanna pH idir 7.0 agus 9.0, maolán 100 mM (Na2CO3-NaHCO3) le luachanna pH sa raon ó 9.0 go 11.0. Chun an teocht imoibrithe is fearr a mheas, goraíodh na himoibrithe ag teochtaí éagsúla ó 0 go 65 ◦C. Rinneadh measúnú ar chúrsaí ama an imoibrithe ag 12 phointe ama éagsúla idir 0 agus 24 h. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí chóip. Rinne HPLC-MS anailís ar na meascáin imoibriúcháin mar a thuairiscítear thuas. Le haghaidh staidéir cinéiteach arCtUGT1, rinneadh measúnachtaí einsímeacha in imleabhar deiridh de 100 μL ina raibh 100 mM KH2PO4-maolán K2HPO4 (pH 8.0), 25 ug de íonaitheCtUGT1, 3 mM de UDPG, agus tiúchain éagsúla (50-3000 μM) de 3. Rinneadh na frithghníomhartha ag 37 ◦C ar feadh 30 nóiméad agus ansin críochnaíodh iad le meatánól oighear-fhuar 100 μL. Rinneadh na frithghníomhartha seo go léir i dtrí chóip, agus rinneadh meastóireacht ar ghníomhaíocht einsíme trí na díorthaigh glucosylated comhfhreagracha a chainníochtú. Ríomhadh paraiméadair chinéiteach, lena n-áirítear tairiseach Michaelis-Menten (Km) agus Vmax, trí anailís aischéimniúcháin neamhlíneach ag baint úsáide as bogearraí GraphPad Prism 5.

2.7. Foshraith agus roghnaíocht deontóra siúcra CtUGT1

Iniúchadh a dhéanamh ar roghanna tsubstráit naCtUGT1, rinneadh tástáil ar 27 foshraith a bhaineann le cineálacha struchtúracha éagsúla ag baint úsáide as UDPG mar an deontóir. Liostaíodh a gcuid faisnéise ceimiceach i dTábla S5, agus léiríodh a struchtúir i bhFíoracha. S1 agus S2. Iniúchadh a dhéanamh ar roghnaíocht deontóirí siúcraCtUGT1, rinneadh measúnachtaí ag baint úsáide as umbelliferone (1), esculetin (2), hymecromone (3), 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), genistein (5), agus aló-emodin (6) mar fhoshraitheanna le UDPG, UDP- N aicéitil galactosamine, UDP-galactose, OTI-mannose, OTI-fiúcós, UDP aigéad galacturonic, UDP-rhamnose mar dheontóirí siúcra, faoi seach. Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí chóip. Rinne HPLC-MS anailís ar na meascáin imoibriúcháin mar a thuairiscítear thuas.

2.8. 4-glúcósíd meitiolumbelliferyl (comhdhúil 3a) a ullmhú ag CtUGT1

Bhí an meascán imoibriúcháin ullmhúcháin comhdhéanta de {{0}}.034 mmol substráit cumaisc 3, 0.04 mmol UDPG, 5 mg íonaitheCtUGT1i maolán imoibrithe 50 mL. Bhí na frithghníomhartha corraithe go réidh ag na coinníollacha barrmhaithe (100 mM KH2PO4-K2HPO4 le pH 8.0; 37 ◦C). Tar éis gortha ag 37 ◦C ar feadh 24 h, scartha an forshnaidhm imoibriúcháin le crómatagrafaíocht colún le roisín macraporous (MCI GEL CHP) tar éis é a lártheifneoiriú ag 12,000 × g ar feadh 30 nóiméad. Ba é an chéim shoghluaiste ná elution grádán de 100 faoin gcéad uisce go 100 faoin gcéad meatánóil. Rinneadh anailís ar gach codán de réir HPLC-UV. Ní raibh ach codáin ina raibh táirgí spriocdhírithe galaithe go triomacht faoi bhrú laghdaithe agus speictreascópacht 1H athshondais mhaighnéadaigh (NMR) agus speictreascópacht 13C NMR mar thréith acu.

2.9. Ducáil mhóilíneach agus só-ghineacht suíomh-dhírithe de CtUGT1

Múnla próitéine deCtUGT1Bunaíodh SWISS-MODEL [21–25]. Roghnaíodh struchtúr criostail Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) mar an struchtúr teimpléid [26]. Rinne VERIFY-3D [27,28] an tsamhail bhunaithe a mheasúnú. Baineadh úsáid as Auto-Dock Vina le haghaidh staidéir mhóilíneach duga [29]. Baineadh úsáid as struchtúr criostail UGT74F2 [30], glycosyltransferase ó Arabidopsis thaliana, i gcoimpléasc le ligand UDP agus aigéad salaicileach (PDB ID 5U6M) mar an struchtúr rialaithe le haghaidh póca deontóra siúcra agus anailís phóca glacadóra siúcra, faoi seach. . Baineadh úsáid as na Auto-Dock-Tools 1.5.6 ó MGLTools (uirlisí Saotharlainne Grafaic Mhóilíneach) chun an UDPG deontóra siúcra agus an tsubstráit 1, 2 a ullmhú do dhugáil mhóilíneach. Socraíodh na slabhraí taobh iarmhair timpeall an chuas gníomhach-láithreáin solúbtha, agus fágadh bannaí rothlacha na ligands saor chun rothlú. Rinneadh anailís amhairc ar an staidiúir barr-rangaithe mar a measadh ag samhail dhugála Vina leis an gcleamhnas is airde (kcat/mol) trí úsáid a bhaint as bogearraí PyMOL 2.0.

Le haghaidh imscrúduithe mutagenesis, an t-ord optamaithe géine deCtUGT1(Sonraí forlíontacha Nóta 2) a shintéisiú agus a thástáil mar an cineál fiáin. Suíomh-stiúrtha mutagenesis anCtUGT1Rinneadh úsáid as an gCóras Fast Mutagenesis (TransGen Biotech). Méadaíodh na mutants ó theimpléad na géine optamaithe a tógadh isteach sa pET{0}}veicteora ag baint úsáide as na primers sonracha a thaispeántar i dTábla S1. Fíoraíodh na mutants tógtha trí PCR agus seicheamhú sular chlaochlú iad go E. coli (DE3) le haghaidh léiriú heitreolaíoch. Rinneadh íonú próitéine agus imoibrithe einsíme agus rinneadh anailís orthu mar a thuairiscítear thuas.

3. Torthaí agus plé

3.1. Clónáil cDNA lánfhad na géine CtUGT1 óCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) Is luibh leighis traidisiúnta Síneach a tháirgeann raon leathan de gliocóisídí nádúrtha bithghníomhacha. Ba cheart go mbeadh líon suntasach géinte glycosyltransferases nua a bhí ina ghéanóim. Chun glycosil-aistritheoirí nua a lorg le gníomhaíochtaí catalaithe suimiúla, dearadh priméir dhíghiniú le haghaidh 3′-RACE bunaithe ar an móitíf caomhnaithe PSPG chun UGTanna ceadaitheacha a chlónáil óCistanche tubulosa. Rinneadh anailís bhreise ar an seicheamh deireadh a fuarthas 3 'ag soinneáin NCBI agus dearadh an primer sonrach le haghaidh 5′-RACE bunaithe ar an seicheamh a fuarthas. Rinneadh na foircinn aimplithe 5′ cDNA agus na foircinn 3′ cDNA a spliceáil agus fad iomlán anCtUGT1seicheamh, lena n-áirítear 1739 nucleotides, fuarthas (Fíor S3) agus atá liostaithe i Sonraí Forlíontacha Nóta 3. Ina dhiaidh sin, fráma léamh oscailte (ORF) deCtUGT1d'aimsigh uirlisí Aimsitheoir NCBI ORF agus rinneadh an seicheamh códaithe 1482 bp a chlónáil go rathúil trí aimpliú RT-PCR ag baint úsáide as primers sonracha i dTábla S1. Tá seicheamh cDNA CtUGT1 curtha faoi bhráid NCBI (aontachas Uimh. MW629113).

3.2. Anailís seicheamh agus léiriú heitreolaíoch ar CtUGT1

Tá anCtUGT1bhíothas ag súil go n-ionchódódh géine próitéin de 493 iarmhair aimínaigéad le mais mhóilíneach measta de 55.78 kDa. Léirigh pléascadh NCBI go bhfuil seicheamh próitéin asbhainte deCtUGT1a roinneann an t-aitheantas is airde (76.39 faoin gcéad ) le heinsímí cosúil le UGT86A1-. Níl tréithe iomlána ag feidhmeanna bithcheimiceacha den chineál seo einsím. Tá sé tuartha go bhféadfadh siad a bheith páirteach in oiriúnú plandaí do strusanna aibitheacha. Léirítear ailíniú na sraitheanna aimínaigéad CtUGT1 agus glycosyltransferases plandaí eile i bhFíor S4.

Fuarthas na 44 iarmhair ardchaomhnaithe den mhóitíf PSPG ag críochfort C deCtUGT1. Laistigh den PSPG-bhosca, bhí seicheamh peptide de HCgwNS suite ag an 373ú aimínaigéad, a aimsíodh i 95 faoin gcéad de na glycosyltransferases go léir [31]. Ba é glutamine an t-iarmhar deiridh den mhóitíf PSPG, rud a léirigh go bhfuil claonadh ag an einsím seo UDPG a úsáid mar dheontóir siúcra [32] (Fíor S4). Tógadh an crann fylogenetic bunaithe ar na seichimh polapeiptíde tuartha deCtUGT1agus cineálacha éagsúla gliocóisilaistritheoirí de bhunadh planda a raibh baint acu le bithshintéis meitibilítí tánaisteacha éagsúla. Go dtí seo, d'aithin an chuid is mó de na glycosyl-aistritheoirí tuairiscithe ó phlandaí flavonoids mar a bhfoshraitheanna, mar na flavóin 7-O-glycosyltransferases, flavonoid 3-O-glucosyltransferases, isoflavone 7-O-glycosyltransferases, agus glycosyltransferases chalcóin. Léirigh torthaí anailíse phylogenetic goCtUGT1nach bhfuil grúpáilte isteach sa chlúdach GTanna flavonoid. Ina áit sin, tá sé suite in aice le UGT74T1 agus UGT74S1 (lignan glycosyltransferases ó Linum usitatissimum) agus NtGT2 (coumarin glycosyltransferase ó Nicotiana tabacum), a léirigh goCtUGT1d'fhéadfadh go mbeadh roinnt gníomhaíochtaí catalaíocha núíosacha i dtreo foshraitheanna feanilpropanoid (Fíor 1), go háirithe a mheastar nach bhfuil ach baill theoranta aitheanta go feidhmiúil a bhaineann leis na cladaí seo.

Chun a ghníomhaíocht catalaíoch a nochtadh tuilleadh, beidh anCtUGT1Cuireadh seicheamh in iúl faoi rialú an tionscnóra T7 lac i gcealla E. coli Transetta (DE3) mar a6-phróitéin chomhleá chlibáilte. An athchuingreach His-clibCtUGT1íonaithe go héifeachtúil chuig aonchineálacht ag crómatagrafaíocht chleamhnais Ni-NTA. Ba é meáchan móilíneach an athchuingreach íonaithe CtUGT1 ná thart ar 55 kDa (Fíor S5), atá ag teacht leis an mais mhóilíneach réamh-mheasta.

3.3. Sainiúlacht an tsubstráit glactha in vitro de CtUGT1

Chun tástáil a dhéanamh ar ghníomhaíocht glycosylation deCtUGT1, rinneadh measúnachtaí einsímeacha in vitro. Baineadh úsáid as UDPG mar dheontóir siúcra. Roghnaíodh glacadóirí siúcra bunaithe ar ábhair imní éagsúla. Gcéad dul síos, anCtUGT1clonadh géine óCistanche tubulosaarb iad PhGanna a bpríomh-chomhábhair cheimiceacha. Chun a fhíorú an bhfuilCtUGT1Tá baint aige le bithshintéis PhGanna, aglycóin choitianta PhG iCistanche tubulosaar nós tyrosol (NP1, Fíor S2) agus salidroside (NP2, Fíor. S2) a roghnaíodh ar dtús mar fhoshraitheanna. Ar an drochuair, níor aimsigh anailísí HPLC agus HRESI-MS aon táirgí glycosilated, rud a léirigh é sinCtUGT1d’fhéadfadh sé nach mbeadh baint aige le bithshintéis PhGanna.

Ar an dara dul síos, bunaithe ar an ailíniú seicheamh agus torthaí anailíse phylogenetic (Fíor 1),CtUGT1go raibh baint phylogenetically le lignanoid agus coumarin glycosyltransferases, a mhol goCtUGT1is dócha gur glycosyltransferase feinilpropanoid é. Chun an tuar seo a fhíorú, rinneadh tástáil ar thrí fhoshraith coumarin 1, 2, agus 3 mar aon le substráit lignanoid amháin magnolol NP17 mar ghlacadóirí siúcra, faoi seach. Baineadh úsáid as einsímí teas-dhíghníomhaithe (100 ◦C, 10 min) mar rialú diúltach. Ní bhfuarthas aon táirge le hanailís HPLC-HRESI-MS ar imoibrithe ag baint úsáide as NP17 mar fhoshraith. I gcodarsnacht leis sin,CtUGT1léirigh cumais glucosylation soiléir i gcoinne na foshraitheanna cúmarin tástáladh (1,2,3). Ag baint úsáide as substráit 1 mar shampla, mar a thaispeántar i bhFíor 2A, táirgeadh buaic nua (1a) le laghdú ama coinneála (11.46 nóim) i gcomparáid le foshraith 1 (19.75 nóim) agCtUGT1ag teacht isteach de 37.78 faoin gcéad . Tá a speictream ionsúcháin UV ag freagairt do 1. Léirigh speictream HRESI-MS gur thaispeáin buaic 1a [M móide H] móide ag m/z 325.1029, agus [M móide Na] móide ag m/z 347.0710 (calcd. 347.0737 do C15H16O8Na ) leis an bhfoirmle tuartha C15H16O8, a bhí 162 amu níos mó ná sin de 1 agus comhsheasmhach le foirmle teoiriciúil táirge glucosylated (Fíor 2A). Ar an gcaoi chéanna, fuarthas an táirge glucosylated de shubstráit 2 (14.21 min, Fig. 2B) agus 3 (21.92 min, Fíor. 2C) freisin ag an am coinneála de 10.85 min agus 13.80 min, leis an ráta comhshó 22.03 faoin gcéad agus 68.67 faoin gcéad , faoi seach. Mais mhóilíneach na dtáirgí a mheaitseáil go díreach le mais ríofa na dtáirgí glucosylated, rud a dheimhnigh sinCtUGT1d'fhéadfadh glucosylation na gcomhdhúile cúmairine 1-3 (Tábla 1) a chatalú.

Ina dhiaidh sin, ag cur san áireamh gur léirigh an chuid is mó de na heinsímí a tuairiscíodh le déanaí soiléireacht catalaíoch in vitro, chun iniúchadh breise a dhéanamh ar speictream an tsubstráit deCtUGT1, rinneadh measúnuithe fairsinge einsímí ar chomhdhúile éagsúla a bhaineann le cineálacha éagsúla táirgí nádúrtha, lena n-áirítear flavonoids, comhdhúile feanólacha, cúmarins, stilbene, anthraquinones, benzophenone, naftailéin, agus iridoid (Figs. S1-S2), ag baint úsáide as UDPG mar an deontóir siúcra. Fuarthas amach go bhféadfadh an tsubstráit benzophenone 4,4′-dihydroxy benzophenone (4), tsubstráit isoflavone genistein (5), agus substráit anthraquinone aló-emodin (6) a chatalú freisin agCtUGT1chun an táirge glucosylated comhfhreagrach 4a, 5a, 6a a fhoirmiú le polaraíocht níos airde (Fíor 3). Léirigh anailís HRESI-MS go raibh beanna ian na dtáirgí ar fad 162 amu níos airde ná mar a bhí sna foshraitheanna, rud a thugann le tuiscint go raibhCtUGT1d'fhéadfadh siad glucosylation na gcomhdhúile seo a chatalú chun a dtáirge mona-glúcósíde comhfhreagrach a fhoirmiú. Ba iad na rátaí comhshó de 4 , 5 agus 6 4.12 faoin gcéad , 14.14 faoin gcéad agus 23.33 faoin gcéad , faoi seach ( Tábla 1 ) .

Roghnaíocht deontóra siúcraCtUGT1rinneadh iniúchadh freisin. Chomh maith le UDPG, rinneadh tástáil ar sheisear deontóirí eile, lena n-áirítear UDP-N-acetyl galactosamine, UDP galactose, OTI-mannose, OTI-fiúcós, aigéad UDP-galacturonic, agus UDP rhamnose, ag baint úsáide as foshraitheanna 1-6 mar ghlacadóirí. Léirigh na torthaí goCtUGT1roghnaithe go heisiach UDPG mar an deontóir siúcra. Níor breathnaíodh aon táirge nuair a rinneadh tástáil ar shiúcraí gníomhachtaithe eile (níor léirítear sonraí).

3.4. Airíonna bithcheimiceacha agus paraiméadair chinéiteach CtUGT1

Airíonna bithcheimiceacha deCtUGT1imscrúdaíodh iad ag úsáid 3 mar ghlacadóir siúcra agus UDPG mar an deontóir siúcra mar a léirítear i bhFíor 4. Gníomhaíocht catalaitheCtUGT1Rinneadh tástáil i raon teochta 4-60 ◦C, braitheadh ​​an ghníomhaíocht is fearr ag 37 ◦ C (Fíor 4 A). Léirigh anailís ar ghníomhaíocht na heinsíme idir pH 3.0 agus 9.0 gur breathnaíodh an luach pH is fearr ag pH 8.0 (maolán 100 mM KH2PO4-K2HPO4, Fíor. 4C). Mhéadaigh toradh an táirge glucosylation 3a go líneach laistigh de 1 h agus bhí an ráta fáis ag leibhéalú tar éis 5 h (Fíor 4 B). An luach Km dealraitheach deCtUGT1le haghaidh 3 bhí 218.7 ± 7.176 μM, agus bhí Vmax 0.0 2255 ± 0.0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. Ullmhúchán einsímeach agus sainaithint struchtúrach táirgí glucosylated

Bunaithe ar thorthaí na measúnachtaí einsíme,CtUGT1claonadh a bheith ina glucosyltransferase ar leith a d'fhéadfadh catalyze an glucosylation de chineálacha éagsúla de tháirgí nádúrtha. Rinneadh achoimre ar fhaisnéis HPLC-HR-MS ar na táirgí i dTábla 1. Ina measc, léirigh foshraitheanna coumarins ráta comhshó suntasach. Rinneadh tuilleadh anailíse ar ghníomhaíocht na heinsíme i gcoinne cúmarins. Ba chóir a thabhairt faoi deara gur ghlac gach ceann de na trí fhoshraitheanna cúmarin tástálaithe leCtUGT1tá grúpa hiodrocsaile acu ag an suíomh C-7, agus tá grúpa hiodrocsaile breise ag esculetin (2) ag an suíomh C-6. Taispeántar próifíl HPLC an táirge glucosylated de esculetin i bhFíor 2. Níor breathnaíodh ach táirge amháin, rud a thugann le tuiscint gur tharla an t-imoibriú glúcóisithe go regispecific ag an suíomh C-6 nó C-7. Chun an suíomh glycosilúcháin a dhearbhú, sainaithníodh táirge 2a trí anailís HPLC-UV/HRESI-MS trí anailís HPLC-UV/HRESI-MS a chur i gcomparáid leis na glúcóisídí barántúla. Nuair a chuirtear an cichoriin glucoside barántúla (glucosylated ar an suíomh 7-OH de 2) sa chóras imoibriúcháin, an buaic forluí le 2a, dheimhnigh próifíl comh-HPLC tuilleadh go bhfuil an táirge glycosylated de 2 catalyzed agCtUGT1is cichoriin [33], rud a chruthaigh gur aistríodh an taise glucosil go sonrach ar shuíomh C7-OH. Sainaithníodh táirge 1a freisin i gcomparáid leis an gcaighdeán tagartha. Léirigh speictrim UV-HPLC mar aon le hanailís comh-HPLC (Fíor 2) go raibh struchtúr ceimiceach 1a curtha i leith mar scimming [34], arb é an táirge glucosylated de 1 ar shuíomh C7-OH.

Ullmhaíodh táirge 3a ó imoibriú de réir scála agus arb iad is sainairíonna struchtúracha é HRESI-MS, 1H NMR, agus 13C speictreascópacht NMR (Fíoracha S13, S14, agus Nóta 4). Sa chomhartha NMR 1H, i gcomparáid le foshraith 3, d'imigh comhartha hiodrocsaile feanólach ag an suíomh C{{10}, agus bhog an comhartha carbóin C-7 δ 1.{{25} } ppm chuig an bpáirc ard, agus aistríodh comharthaí C-6 agus C-8 chuig an bpáirc íseal in 13C NMR. Dhearbhaigh na torthaí seo go raibh an t-iarmhar glucopyranosyl ceangailte leis an ngrúpa hiodrocsaile feanólach ag suíomh C-7 de 3 [35]. Thairis sin, léirigh speictream 1H NMR comharthaí prótón ainimiceacha ag δH 5.00 (1H, d, J=7.0 Hz); cuireadh in iúl go raibh an comhábhar siúcra -D-glúcopyranós. Léirigh an toradh seoCtUGT1is coumarin O-glucosyltransferase é a chatalaíonn glucosylation de hiodrocsaile cúmarin ag an suíomh 7-OH.

3.6. Samhaltú hoimeolaíochta, Á mhóilíneach, agus mutagenesis suíomh-dhírithe de próitéin CtUGT1....

Léirigh imoibrithe einsímeacha fairsinge sinCtUGT1d'fhéadfadh sé glucosylation de thrí cúmarins a chatalú isteach ina dtáirge glucosylated comhfhreagrach, agus tharla an suíomh glucosylated go sonrach ag an suíomh 7- OH. Chun na príomh-iarmhair a chinn gníomhaíochtaí catalaithe naCtUGT1, samhaltú homaleolaíochta, dug móilíneach, agus imscrúduithe mutagenesis faoi stiúir an tsuímh ar CtUGT1. Bunaíodh samhaltú móilíneach homalógach le haghaidh CtUGT1 ag baint úsáide as SWISS-MODEL [21–25]. Roghnaíodh struchtúr criostail Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), arna chinneadh ag réiteach 2.1 Å, an scór iomlán is airde le hoimeolaíocht seicheamh uasta agus E-luach íseal, mar an struchtúr teimpléad [26]. Taispeánadh measúnú réasúntachta ar an tsamhail bhunaithe sa phlota Ramachandran (Fíor S6), tá 88.5 faoin gcéad de na hiarmhair sa mhúnla bunaithe sa réigiún is mó a bhfuiltear ag súil leo. Is éard atá i múnla homaleolaíochta CtUGT1 ná dhá mhóitíf fillte cosúil le Rossmann ag an gcríochfort N- agus C, faoi seach (Fíor 5 A). Tá leatháin chomhthreomhara seacht-shnáithe timpeall ar dheich helice ag fearann ​​an chríochfoirt N. Tá bileoga sé shnáithe i bhfearann ​​​​C-críochfort agus naoi héilíos ar gach taobh díobh (Fíor 5A, S7).

Chun póca gníomhach naCtUGT1, rinneadh Á mhóilíneach. Ós rud é nach bhfuil ach an struchtúr foirm apo ag UGT85H2, roghnaíodh homolog UGT74F2 eile le UDP agus aigéad salaicileach mar dhá ligand mar an teimpléad rialaithe. Ullmhaíodh an UDPG mar dheontóir siúcra. Ullmhaíodh dhá fhoshraith cúmarin 1 agus 2 mar na glacadóirí siúcra faoi seach. Rinneadh suíomhanna ceangailteacha deontóra glycosil agus glacadóir a ríomh agus a dhuga ar leithligh mar a thaispeántar i bhFíor 5. Léirigh na torthaí go bhfuil an dá phóca ceangailteach suite laistigh den scoilt dhomhain i limistéar idirghníomhaithe an fhearainn N-críochfort atá pacáilte go docht agus C. -terminus fearainn deCtUGT1agus gar go spásúil dá chéile (Fíor 5A). Ceann scríbe CCtUGT1go príomha i dteagmháil leis an deontóir glycosil mar a thuairiscítear in UGTanna plandaí eile, agus tá an chuid is mó de na hiarmhair máguaird hidreafail agus an-chaomhnaithe. Ar nós an bhosca PSPG tipiciúil, d'fhéadfadh iarmhair W377 sa mhóitíf seo bannaí hidrigine a fhoirmiú leis an ngrúpa glúcóis de UDPG (Fíor 5 B); D'fhéadfadh N378 agus S379 sa mhóitíf seo naisc hidrigine a fhoirmiú leis an ngrúpa diphosphate de UDPG (Fíor 5B). Ina theannta sin, de réir na dtorthaí docking, féadfaidh iarmhair W356 agus Q359 idirghníomhú leis an ngrúpa fualáin trí idirghníomhaíocht bannaí hidrigine chun an deontóir sa phóca gníomhach a chobhsú. Chun feidhm na n-iarmhar réamh-mheasta seo a fhíorú, roghnaíodh 16 láithreán san iomlán agus cuireadh iad faoi réir mutagenesis scanadh alanine. Rinneadh tástáil ar ghníomhaíochtaí catalaithe na mutants seo ag baint úsáide as gach ceann de na sé fhoshraith dhearfach a luaitear thuas. Thaispeáin anailísí HPLC, nuair a bhí iarmhair G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397, agus D398 comhshóite isteach i ngníomhaíocht alanine, ba é an ghníomhaíocht próitéine glycosil. caillte go hiomlán i dtreo gach foshraitheanna tástáladh. Thug na torthaí seo le fios gurb iad na 16 iarmhar thuas na príomh-iarmhair a chinn ceangal an deontóra UDPG agus gníomhaíocht glycosylation deCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 faoin gcéad ) mar V14, V132, E153, T212, agus I209 ( Fíor. S8). Tá sé tuartha go bhféadfadh na hiarmhair hidreafóbach seo timpeall ar an bhfáinne aramatacha idirghníomhaíochtaí van der Waals a chruthú leis an tsubstráit sa phóca ceangailteach.

4. Plé

Tá glycosylation ar cheann de na céimeanna modhnuithe is tábhachtaí i go leor bealaí bithshintéise meitibilítí tánaisteacha. D’fhéadfadh gliceasúlú bith-infhaighteacht táirgí nádúrtha a mhéadú trína dtuaslagthacht uisce a fheabhsú agus a dtocsaineacht a laghdú. Meastar gurb é Coumarin an fhoirm is simplí laistigh d’aicme ollmhór de shubstaintí feanólacha a tharlaíonn go nádúrtha agus atá déanta as fáinne -pyrone comhleádh le fáinne beinséine. Tá an dá comhdhúile nádúrtha agus sintéiseacha cúmarin-bhunaithe a tharraing aird go leor ó na cógaiseoirí leighis agus eolaithe dearadh drugaí mar thoradh ar a n-airíonna éagsúla cógaseolaíochta agus bitheolaíocha [36]. D'fhéadfadh tuilleadh modhnuithe glycosilaithe cúmairíní cuidiú le héagsúlacht struchtúrach na gcomhdhúl seo a shaibhriú agus feabhas a chur ar a dtuaslagthacht agus a mbith-infhaighteacht freisin. I bplandaí, déantar próiseas glycosylation den sórt sin a chatalú ag UDP-glycosyltransferase. Cé gur aithníodh UGTanna iolracha ó phlandaí éagsúla, go dtí seo, bhí baint ag an gcuid is mó de na UGTanna tuairiscithe le modhnú glycosylated flavonoids. Níor tuairiscíodh ach UGTanna teoranta a bheith in ann glacadh le cúmairíní mar fhoshraitheanna. Sa staidéar seo, géine glycosyltransferase nuaCtUGT1a bhí clónáilte as an luibh Síneach traidisiúntaCistanche tubulosa. Léirigh ailíniú seicheamh agus torthaí anailíse phylogenetic goCtUGT1tá sé i bhfad i gcéin ó chuid is mó de na UGTanna flavonoid tuairiscithe, agus i bhfad gar do UGTanna feinilpropanoid. Léirigh measúnachtaí fairsinge einsímí nach bhféadfadh CtUGT1 glycosylation na gcomhdhúile eatánóil feinile a chatalú chun PhGanna a fhoirmiú, arb é an príomh-chomhpháirt cheimiceach deCistanche tubulosa. Ina áit sin, d'fhéadfadh sé cúmarins a aithint mar a fhoshraitheanna, agus an t-imoibriú glycosylation a sheoladh. Léirigh elucidation Struchtúr de na táirgí go bhfuil an suíomh glycosylation catalyzed agCtUGT1tharla go sonrach ag suíomh C7-OH cúmairíní. Ag baint úsáide as CtUGT1, rinneadh trí glycosídí coumarin lena n-áirítear scimeáil (1a), cichoriin (2a), agus 4-methylumbelliferyl glucoside (3a) a shintéisiú go rathúil agus a shainaithint go struchtúrach. Tuairiscíodh na trí chomhdhúil seo go léir mar mhóilíní atá gníomhach ó thaobh na cógaisíochta. Mar shampla, measadh go bhfuil gníomhaíochtaí cógaseolaíochta éagsúla ag 1a, lena n-áirítear gníomhaíocht renoprotective, frith-athlastach, frith-ailse, agus airíonna frith-amóbacha [37]. Léirigh 2a gníomhaíocht antibacterial ard i gcoinne roinnt baictéir Gram-dearfach cosúil le Bacillus cereus agus Staphylococcus aureus [38]. Is féidir le 3a cabhrú leis na plandaí a gcumas freagartha ar cheimiceáin agus tocsainí a fheabhsú [39].

Chomh maith le cúmarins, fuair measúnachtaí fairsinge einsímí go raibhCtUGT1léirigh freisin gníomhaíocht glucosylation inbhraite i dtreo tsubstráit benzophenone 4, substráit isoflavone 5, agus substráit anthraquinone 6, rud a léirigh go bhfuil caoinfhulaingt substráit áirithe ag CtUGT1. Mar sin féin,CtUGT1níorbh fhéidir biosintéis na gcomhpháirteanna gliocóisídí a chatalú iCistanche tubulosamar gliocóisídí feinileatánóideach (PhGs), gliocóisídí lignanoid, agus gliocóisídí iridoid. Thairis sin, de réir na n-imscrúduithe roimhe seo, ní raibh aon gliocóisídí cúmarin aonraithe óCistanche tubulosa. Mar sin, feidhm in vivo deCtUGT1fós le fiosrú a thuilleadh. Mar gheall ar ghníomhaíocht glucosylation CtUGT1 i dtreo foshraitheanna coumarin tá an einsím seo ina uirlis úsáideach le haghaidh modhnú glycosylation einsímeach cúmarins agus léirigh sé freisin go bhféadfadh na heinsímí meitibileach tánaisteacha plandaí gníomhaíochtaí catalaithe neamh-mheasta a dhéanamh atá i bhfad níos faide ná a bhfeidhmeanna dúchais.

Dearbhú Leasa Iomaíoch

Dearbhaíonn na húdair nach bhfuil aon choinbhleachtaí leasa ann.

Admháil

Fuair ​​an obair seo tacaíocht airgeadais ó Beijing Natural Science Foundation (Deontas Uimh. 7192112); Clár Urraíochta na nEolaithe Óga Mionlach de réir CAST (Uimh. Deontais CACM− 2018− QNRC1− 02); Fondúireacht Eolaíochta Nádúrtha Náisiúnta na Síne (Deontas Uimh. 81402809); Ciste Scoláireachta Stáit Chomhairle Scoláireachtaí na Síne (Deontas Uimh. 201906555010) agus an Fhondúireacht Eolaíochta do Scoláirí Óga den Scoth de chuid Ollscoil Leighis na Síne Beijing (Uimh. Deontais 2018-JYB-XJQ006).

Aguisín A. Sonraí forlíontacha

Is féidir sonraí forlíontacha leis an alt seo a fháil ar líne ag https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

Ó: ' Clónáil mhóilíneach agus tréithriú bithcheimiceach ar glycosyltransferase coumarin nuaCtUGT1óCistanche tubulosa' leDúirt Xiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

Tagairtí

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, anailís Phylogenetic ar theaghlach multigene UDPglycosyltransferase de Arabidopsis thaliana, J. Biol. Ceimic. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: glycosidase mutant do shintéis oligosaccharide, J. Am. Ceimic. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Bithshintéis neamhghnách siúcra agus glycósúlú táirgí nádúrtha, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Chun cinn ar na glycosylations in vivo agus in vitro flavonoids, Appl. Micribhith. Biteicneolaíocht. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Clónáil mhóilíneach agus tréithriú glúcóis UDP: glucosyltransferase beinséine so-ghalaithe/feinilpropanoid i bláthanna petunia, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases ó phlandaí, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Iniúchadh ar thábhacht feidhmiúil einsímí glycosyltransferase stéaróil, Prog. lipid Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001 .
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, An glucosyltransferase alcalóideach stéaróideach bunscoile in vivo ó phrátaí, Phytochemistry. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Gníomhaíocht frithocsaídeach de limonoids citris, flavonoids, agus coumarins, J. Agric. Ceimic Bhia. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, Gníomhaíocht Antiviral de angelicin i gcoinne gammaherpesviruses, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, Coumarin-bhunaithe díorthaigh le gníomhaíocht potent frith-VEID, Fitoterapia. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitóta.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Gníomhaíocht frithocsaídeach agus acmhainneacht hepatoprotective de Cedrelopsis grevei ar strus ocsaídiúcháin spreagtha cypermethrin agus damáiste ae i lucha fireann, Comhlánú BMC. Malartach. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Coumarin: núicléas féideartha do mhóilíní frith-athlastacha, Med. Ceimic. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, Coumarin díorthaigh mar ghníomhairí frith-ailse le haghaidh teiripe ailse scamhóg: athbhreithniú, Anti Cancer Agents Med. Ceimic. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15]             A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: scafall nádúrtha, pribhléideach agus ildánach do chomhdhúile bithghníomhacha, Móilíní 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/móilíní23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, clónáil agus tréithriú glucosyltransferase a imoibríonn ar 7-grúpa hiodrocsaile flavonol agus 3-grúpa hiodrocsaile cúmarin ó cealla tobac, Arch. Bithcheimic. Bithfhis. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Biosynthesis de gliocóisídí coumarin ag fréamhacha trasgenic hairy de Polygonum multiflorum, Biosci. Biteicneolaíocht. Bithcheimic. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Clónáil mhóilíneach agus tréithriú coumarin glucosyltransferase i fréamhacha gruagacha Pharbitis nialasach (Ipomoea nialas), Cult Fíocháin Plandaí. Lett. 31 (2014) 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Tréithriú mhóilíneach agus struchtúrach de Cglycosyltransferase promiscuous ó Trollius Chinensis, Aingeal. Ceimic. Int. Ed. Eng. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: anailís ghéiniteach éabhlóideach mhóilíneach leagan 7.0 le haghaidh tacair shonraí níos mó, Mol. Biol. Éabhlóid. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21]             A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, SWISS-MODEL: samhaltú homaleolaíochta ar struchtúir agus ar choimpléisc próitéin, Aigéid Núicléacha Res. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Samhaltú struchtúr próitéine comparáideach uathoibrithe le SWISS-MODEL agus an t-amharcóir Swiss-Pdb: peirspictíocht stairiúil, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/eilimint.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, An stór SWISS-MODEL-gnéithe nua agus feidhmiúlacht, Nucleic Aigéid Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24]             G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo-shrianta achair curtha i bhfeidhm ar mheastachán cáilíochta múnla, Bithfhaisnéisíocht. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, Struchtúr ceathartha próitéine de homo- agus heitrea-olaigiméirí a shamhaltú thar idirghníomhaíochtaí dénártha trí homaleolaíocht, Sci. Ionadaí 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, struchtúr Crystal Medicago truncatula UGT85H2-léargais ar bhunús struchtúrach flavonoid ilfheidhmeach (iso). glycosyltransferase, J. Mol. Biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Measúnú ar mhúnlaí próitéine le próifílí tríthoiseacha, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: clár chun cáilíocht steiré-cheimiceach struchtúir próitéin a sheiceáil, J. Appl. Criostail. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: feabhas a chur ar luas agus cruinneas an chuga le feidhm scórála nua, barrfheabhsú éifeachtach, agus ilshnáithe, J. Comput. Ceimic. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Difríochtaí i gcomhchuingeacha glúcóis aigéid salaicileach ag UGT74F1 agus UGT74F2 ó Arabidopsis thaliana, Sci. Ionadaí 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases i sintéis táirgí nádúrtha plandaí: tréithriú teaghlach supergene, Treochtaí Plandaí Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Athrú ar shainiúlachtaí deontóra siúcra glycosyltransferases plandaí trí shóchán aonphointe, Arch. Bithcheimic. Bithfhis. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glucosylation de chomhdhúile feanólacha ag Pharbitis nialais fréamhacha gruaige: I. Glúcósacht coumarin agus díorthaigh flavóin, Biosci. Biteicneolaíocht. Bithcheimic. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hidrealú glúcóisídí nádúrtha tocsaineacha arna gcatalú ag cyclodextrin dicyanohydrins, Eur. J. Org. Ceimic. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Biotransformation díorthaigh hidroxycoumarin ag cealla fionraí saothraithe de Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Dul chun cinn le déanaí ar ghníomhairí frith-ailse atá bunaithe ar coumarin: athbhreithniú cothrom le dáta, Bioorg. Ceimic. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Éifeachtaí díorthach coumarin, 4-methylumbelliferone, ar phéacadh síolta agus bunú síológ in Arabidopsis, J. Chem. Éacla. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, Ocht sesquiterpenoids nua eudesmane- agus eremophilane-cineál ó Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Cinneadh agus staidéar cógaschinéiteach ar scimeáil ag UHPLC-MS/MS i bplasma francaigh, J. Pharm . Biomed. Anal. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.