Gníomhachtú Macrophage De réir Meáchan Móilíneach Íseal Sacairídí Ó Cistanche Deserticola

Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com

［Abstracht ］

Imscrúdú a dhéanamh ar an éifeacht gníomhachtaithe imdhíonachta agus meicníocht na saccharides meáchan móilíneach íseal óCistanche deserticola(LMSC) ar mhacrophages peritoneal luch, RAW264. 7 gcill. Cluiche RAW264. Roinneadh 7 gceall sa ghnáthghrúpa rialaithe, grúpa rialaithe dearfach LPS, agus grúpaí cóireála LMSC. Cluiche RAW264. Cóireáladh 7 gceall le tiúchain éagsúla LMSC ó 3. 91 go 62. 5 g · L - 1. Baineadh úsáid as an measúnacht neodrach dearg chun gníomhaíocht phagocytic macrophages a bhrath. Braitheadh ​​NÍL scaoileadh trí úsáid a bhaint as trealamh NÍL, agus leibhéil léirithe próitéine a bhaineann le gníomhachtú macrophage (TNF- , IL-6, IKK , p-IKK , IκB , p-IκB , NF-κB, agus p-NF-κB) braitheadh ​​​​blot an Iarthair. Léirigh torthaí go raibh éifeacht gníomhachtaithe ag LMSC ar macrophages; féadfaidh sé scaoileadh NÍL a mhéadú go suntasach i RAW264. 7 gcill agus cuireann siad slonn cítocíní TNF- agus IL-6 chun cinn. Thairis sin, mhéadaigh LMSC go suntasach fosfarú IKK , IκB , Agus NF-κB p65. Ina theannta sin, chuir ceann de na príomh-chomhábhair mannitol i LMSC go mór le gníomhaíocht phagocytic macrophages. Léirigh na torthaí seo go bhféadfadh LMSC macrophages a ghníomhachtú trí chosán comharthaíochta NF-κB a uas-rialáil, agus d'fhéadfadh go mbeadh mannitol ar cheann de na príomhchodanna gníomhacha in LMSC.

［Eochairfhocail］ Sacairídí ísealmheáchan móilíneach; Cistanche deserticola; gníomhachtú imdhíonachta; macraphage; fachtóir athlastach; NF- κB

Cistanche deserticola YC Mais planda a bhaineann leis an ghéineasCistanche deserticolaYC Ma. Is féidir a gas méithe a úsáid mar leigheas. Tá na feidhmeanna aige maidir le yang duáin a chothú, bunúsacht agus fuil a chothú, agus an intestines a thaisiú. Tugtar "ginseng desert" air. I measc na gcomhpháirteanna ceimiceacha de Cistanche tá gliocóisídí feinileatánóideach, gliocóisídí iridoid, siúcraí, lignans, agus go leor cineálacha eile. D'aimsigh staidéir chógaseolaíochta nua-aimseartha go bhfuil go leor gníomhaíochtaí bitheolaíocha ag Cistanche mar neuroprotection, frith-meall, rialáil imdhíonachta, frith-athlastach, agus frithocsaídeach [1]. Tá sé léirithe ag staidéir gur féidir le decoction Cistanche agus polaisiúicrídí feabhas suntasach a dhéanamh ar chumas phagocytic agus feidhm secretion macrophages [2-3]. Mar sin féin, níl aon tuarascáil ar thaighde gníomhaíochta a carbaihiodráití íseal-mheáchan móilíneach. Mar sin, bhain an staidéar seo úsáid as an gcóras cultúir in vitro de RAW264. 7 macrophages peritoneal luch chun iniúchadh a dhéanamh ar ghníomhaíocht inmunomodulatory agus meicníochtaí gaolmhara de Cistanche carbaihiodráití íseal-móilíneach-mheáchan. Is féidir leis an taighde seo fianaise níos turgnamhaí a sholáthar chun tuiscint chuimsitheach a fháil arÉifeacht inmunomodulatory Cistanchesa todhchaí, chun a chur i bhfeidhm cliniciúil a threorú tuilleadh.

Tá go leor éifeachtaí ag Cistanche deserticola, cliceáil anseo chun tuilleadh eolais a fháil

1. Ábhair

RAW264. ceannaíodh 7 gcill ó Lárionad Cille Acadamh Eolaíochtaí Leighis na Síne; ceannaíodh séiream bó féatais (FBS) ó PAN Biotech, an Ghearmáin; ceannaíodh antaibheathaigh agus meán DMEM ó Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Ceannaíodh Lipopolysaccharide ó Escherichia coli O55:B5 (LPS) ó Sigma Company, SAM. Ceannaíodh trealamh ocsaíd nítreach (NO) ó Institiúid Bithinnealtóireacht Nanjing Jiancheng. Ceannaíodh trealamh ceimiceach ECL ó Thermo Fisher, SAM; ceannaíodh antasubstaint ó Cell Signaling Technology, SAM; Rinne ár ngrúpa taighde gliocóisídí iomlána cistanche cistanche, siúcraí íseal-mheáchan móilíneach cistanche, agus polaisiúicrídí cistanche. Ba é an maischodán de gliocóisídí iomlána cistanche ná 78.76 faoin gcéad. An codán mais de shiúcraí íseal-mheáchan móilíneach deCistanche deserticolais 58. 00 faoin gcéad agus mais-chodán deCistanche deserticolaTá polaisiúicrídí 65. 24 faoin gcéad . Tanon-5200Ceannaíodh córas scoilte íomháithe ilghlóthach ó Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Ceannaíodh léitheoir micreaphláta Sunrise-Basic ó chuideachta TECAN.

2. Modh

2. 1 Modh dearg neodrach chun gníomhaíocht phagocytic macrophages a thomhas

Glac macrophages peritoneal na luiche sa chéim fáis logartamach, tar éis trypsinúchán, comhaireamh na cealla, coigeartaigh líon na gceall go 5 × 104 ceall/mL, agus ionaclaithe iad i 96-pláta saothraithe cille tobair, 100 μL/tobar , ag 37 céim Saothraithe faoi choinníollacha 5 faoin gcéad CO2, tar éis do na cealla cloí leis an mballa, caith an forshnáithe cultúir, cuir meán DMEM (10 faoin gcéad FBS móide 1 faoin gcéad P / S), LPS (1 mg·L － 1) agus Cistanche cistanche faoi seach Glicóisídí iomlána,Cistanchepolaisiúicrídí iomlána, agus siúcraí Cistanche cistanche ar mheáchan íseal móilíneach (3.91 ~ 62.5 g·L -1, faoi seach, scagtha le scannán scagaire roimh an riarachán). Tar éis saothrú ar feadh 48 uair an chloig, cuir 100 μL de 0.075 faoin gcéad de thuaslagán salanda fiseolaíocha dearg neodrach le gach tobar, leanúint ar aghaidh ag saothrú ar feadh 4 uair an chloig, asú an snámhán, nigh 3 huaire le PBS, cuir cill lysate (aigéad aicéiteach oighreach). -eatánól 1:1) 100 μL, cuir é ag 4 céim ar feadh 2 h, agus tomhais an t-ionsúcht (A540 nm) tar éis na cealla a lysed.

2. 2 Méid NÍL scaoilte a bhrath i bhfeitheoir cille

Ionaclú RAW264. 7 gcill i 48-pláta tobair (1 × 105 cill/mL, 500 μL/tobar), asú an mheán saothraithe cille tar éis goir thar oíche, cuir meán DMEM (10 faoin gcéad FBS móide 1 faoin gcéad P / S), 500 μL gach ceann de LPS (1 mg·L -1) agus gliocóisídí iomlána cistanche Cistanche, polaisiúicrídí iomlána, agus siúcraí ísealmheáchan móilíneach (3.91 ~ 62.5 g·L -1, faoi seach). Tar éis 24 uair an chloig de chultúr ionduchtaithe, bailíodh an supernatant. Déan an tiúchan NÍL i bhfeadán cille gach grúpa a aimsiú leis an trealamh NÍL, lean na treoracha, agus ar deireadh braite an t-ionsúite (A570 nm) le léitheoir micreaphláta

2. 3. Blot thiar

Ionaclú RAW264. 7 gceall i bpláta tobair 6-, asúigh an meán saothraithe cille tar éis gor thar oíche, cuir meán DMEM (10 faoin gcéad FBS móide 1 faoin gcéad P / S), LPS (1 mg·L － 1), agusCistanchebhí polaisiúicrídí iomlána agus siúcraí íseal-mheáchan móilíneach (3.91 ~ 62.5 g·L -1) an ceann 2 mL, agus caitheadh ​​​​an comhshó tar éis 24 uair an chloig de chultúr ionduchtaithe. Nitear na cealla faoi dhó le PBS agus cuireadh i leataobh iad. Tar éis trypsinization, déantar na cealla a phípéad síos. Lártheifneoir, bain an comhshnáthán, cuir 100 μL NP40 Lysis Maolán leis, agus lís ar oighear ar feadh 40 nóiméad. Tar éis lártheifneoirithe, tógadh an supernatant, agus socraíodh an tiúchan próitéine ag an modh BCA, agus coigeartaíodh tiúchan próitéin gach histone go cothrom. Tóg an méid céanna samplaí próitéine agus scar iad ar 12 faoin gcéad SDS-PAGE faoi bhrú leanúnach. Ansin bain úsáid as an umar leictreafóiréis aistrithe Bio-Rad chun an membrane a aistriú le sruth leanúnach de 350 mA ar feadh 1 uair an chloig, agus an próitéin a aistriú chuig an membrane PVDF (pretreatment an membrane PVDF: soak i meatánól agus cothromaigh leis an maolán aistrithe). Tar éis é a bhlocáil le bainne bearrtha 5 faoin gcéad (cumraithe le TBST ina bhfuil 0.1 faoin gcéad Tween-20) ar feadh 1 h ag teocht an tseomra, niteadh an membrane 3 huaire le TBST, agus goraíodh an scannán sa chaolaitheoir antashubstainte próitéine bunscoile ag 4 huaire. céim thar oíche. Nitear an membrane 3 huaire le TBST gach lá eile, agus cuireadh an caolaitheoir comhfhreagrach le gor ar feadh 1 h. Rinneadh an membrane a nite 3 huaire le TBST, agus forbraíodh na stiallacha le forbróir chemiluminescence ECL.

2. 4 anailís sonraí

Cuirtear na sonraí in iúl mar x ± s, agus déantar tábhacht na difríochta a thástáil trí úsáid a bhaint as bogearraí staidrimh GraphPad Prism 6 le haghaidh anailíse aontreo ar athraithí. Tóg P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Torthaí

3. 1. Éifeachtaí siúcraí íseal-mheáchan móilíneach Cistanche cistanche, gliocóisídí iomlána, agus polaisiúicrídí iomlána ar ghníomhaíocht phagocytic RAW264. 7 gcill

Léiríonn an taighde ar na comhpháirteanna ceimiceacha de Cistanche goCistancheden chuid is mó tágliocóisídí feinileatánóideach, gliocóisídí iridoid, agus carbaihiodráití. Sa turgnamh seo, roghnaítear gliocóisídí iomlána cistanche (lena n-áirítear gliocóisídí alcóil feinitile agus gliocóisídí iridoid), siúcraí íseal-mhóilíneacha, agus siúcraí. Rinneadh imscrúdú ar na trí shuíomh gníomhacha de pholaisiúicrídí iomlána maidir lena n-éifeachtaí ar ghníomhachtú RAW264. 7 gcill. Is féidir le polaisiúicríd Cistanche cistanche agus siúcra íseal-mheáchan móilíneach cistanche araon méadú suntasach a dhéanamh ar ghníomhaíocht phagocytic RAW264. 7 cealla, ach ní athraíonn gníomhaíocht phagocytic an ghrúpa riaracháin glycosíde iomlán go mór. Ina theannta sin, chuir an druga rialaithe dearfach LPS feabhas suntasach ar ghníomhaíocht phagocytic RAW264. 7 gcealla, mar a thaispeántar i bhFíor 1. Tugann na torthaí thuas le fios go bhféadfadh éifeacht a bheith ag siúcraí íseal-mheáchan móilíneach agus polaisiúicrídí Cistanche chun RAW264 a ghníomhachtú. 7 gcill.

3. 2. Éifeacht gliocóisídí iomlána Cistanche, siúcraí íseal-mhóilíneacha, agus polaisiúicrídí iomlána ar ábhar ocsaíd nítreach (NÍL) i supernatant cille

D'fhonn imscrúdú breise a dhéanamh ar éifeacht gníomhachtaithe na dtrí shuíomh gníomhacha de Cistanche ar RAW264. 7 cealla, cinneadh ar an ábhar NÍL sna supernatants cille spreagtha ag drugaí éagsúla. Léirigh na torthaí go raibh scaoileadh NÍL sa ghrúpa LPS i bhfad níos airde ná mar a bhí sa ghrúpa rialaithe bán (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchení raibh aon éifeacht shuntasach aige. Léiríonn na torthaí thuas gur féidir le polaisiúicrídí agus siúcraí íseal-mheáchan móilíneach Cistanche scaoileadh NÍL ó RAW264 a chur chun cinn. 7 gcill. Ina measc, tá éifeacht na siúcraí íseal-mheáchan móilíneach de Cistanche suntasach go háirithe, mar a thaispeántar i bhFíor 2.

3. 3. Éifeacht siúcra íseal-mheáchan móilíneach Cistanche cistanche ar léiriú próitéin TNF- agus IL-6 in RAW264. 7 gcill

Is idirghabhálaí athlastach tábhachtach é TNF- atá le feiceáil i bpróiseas gníomhachtaithe RAW264. 7 gcill, ar féidir leo sintéis agus scaoileadh cítocíní eile a chur chun cinn (amhail IL-6). Léirigh na torthaí gur tháinig méadú suntasach ar léiriú TNF- agus IL-6 tar éis an siúcra íseal-mheáchan móilíneach de Cistanche cistanche a spreagadh, rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh siúcra íseal-mheáchan móilíneach Cistanche léiriú TNF a chur chun cinn. - agus IL-6 in RAW264. 7 gceall, rud a ghníomhachtú imdhíonacht cheallacha Phagocytosis, féach Fíor 3.

3. 4. An éifeacht rialála atá ag siúcra íseal-mheáchan móilíneach Cistanche cistanche ar chosán comharthaíochta IKK /IκB /NF-κB

D’fhonn iniúchadh a dhéanamh ar mheicníocht ionchasach siúcraí íseal-mheáchan móilíneach Cistanche cistanche i ngníomh RAW264. 7 gcill, rinne na húdair imscrúdú ar a éifeachtaí rialála ar chonair chomharthaíochta clasaiceach IKK /IκB /NF-κB. Is féidir le siúcra cistanche cistanche íseal-mheáchan móilíneach méadú suntasach a dhéanamh ar phosphorylation NF-κB agus ar phosphorylation a phróitéiní príomhchomharthaí in aghaidh an tsrutha IKK agus IκB , agus léiriú próitéine iomlán IκB a laghdú, rud a léiríonn go bhfuil éifeacht gníomhachtaithe aige ar an IKK / Conair comharthaíochta IκB/NF-κB. Tá éifeacht rialála comhchosúil ag an LPS drugaí rialaithe dearfacha freisin. Go hachomair, féadfaidh na siúcraí íseal-mheáchan móilíneach Cistanche an cosán comharthaíochta IKK /IκB /NF-κB a ghníomhachtú, rud a fhágann go ndéanfaí sintéis agus scaoileadh cítocíní cosúil le TNF- agus IL-6, agus ar deireadh is cúis leis an imdhíonachta. gníomhachtaithe RAW264. 7 gcill, féach Fíor 4.

3. 5. Comhábhair ghníomhacha a scagadh le héifeacht gníomhachtaithe macrophage i siúcraí Cistanche ar mheáchan íseal-mhóilíneach

Tá anailís déanta ag ár saotharlann ar na siúcraí íseal-mhóilíneacha atá iCistanchesa chéim luath agus fuarthas amach go bhfuil sé den chuid is mó mannitol (16.53 faoin gcéad ), siúcrós (8.34 faoin gcéad ), fruchtós (25.38 faoin gcéad ), agus glúcóis (7. 75 faoin gcéad ) , agus comhábhair eile. Mar sin d'úsáid an t-údar an modh dearg neodrach chun éifeacht gníomhachtaithe na gcomhpháirteanna thuas ar mhacrophages a scagadh. Is féidir le Mannitol gníomhaíocht phagocytic macrophages a mhéadú go suntasach ar bhealach dáileog-spleách, cé nach bhfuil éifeachtaí comhpháirteanna eile suntasach. Tugann sé seo le tuiscint go bhféadfadh mannitol a bheith ar cheann de na príomhchodanna gníomhacha i siúcraí íseal-mheáchan móilíneacha Cistanche cistanche chun macrophages a ghníomhachtú, mar a thaispeántar i bhFíor 5.

4. Plé

Tuairiscíodh go bhfuil éifeachtaí inmunomodulatory ag Cistanche cistanche, planda seadánacha de theaghlach Lydanaceae, agus mar sin ba cheart go mbeadh substaintí inmunomodulatory ann. Sa turgnamh seo, scrúdaigh an t-údar gníomhaíocht phagocytic na macrophages peritoneal luiche ar chodanna íonaithe éagsúla deCistancheagus fuarthas amach go bhfuil éifeacht gníomhachtaithe macrophage ag na siúcraí agus na polaisiúicrídí íseal-mheáchan móilíneach de Cistanche, ach níl gliocóisídí iomlána Cistanche soiléir. Ag an am céanna, fuair an t-údar amach gur féidir le siúcraí íseal-mheáchan móilíneacha macrophages a ghníomhachtú ag tiúchan níos ísle, mar sin roghnaigh na húdairCistanchesiúcraí íseal-mheáchan móilíneach mar fhócas taighde ina dhiaidh sin.

Trí scrúdú a dhéanamh ar éifeacht siúcra cistanche meáchan móilíneach íseal ar léiriú cytokines TNF- agus IL-6, fuair na húdair amach gur mhéadaigh siúcra cistanche de mheáchan móilíneach íseal go suntasach an abairt TNF- agus IL-6, a tuilleadh cruthaithe go bhfuil siúcra cistanche meáchan móilíneach íseal tionchar ar lucha. Tá éifeacht gníomhachtaithe ag macrophages peritoneal. Mar sin rinne an t-údar tuilleadh iniúchta ar a meicníocht gníomhaíochta féideartha. Déan taighde

Léirítear gur féidir le lipopolysaccharide baictéarach (LPS) gníomhachtú macrophages luiche agus cealla glial luiche a spreagadh trí bhealaí comhartha mar JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK, agus MAPK [4-8]. Aithnítear cosán NF-κB mar chosán clasaiceach, agus mar sin rinneadh tástáil ar na próitéiní comhartha ar an gcosán seo sa turgnamh seo. Léirigh na torthaí gur féidir le siúcraí íseal-mheáchan móilíneach Cistanche méadú suntasach a dhéanamh ar phosphorylation NF-κB agus ar phosphorylation na bpríomhphróitéiní comharthaíochta in aghaidh an tsrutha IKK agus IκB , rud a thugann le tuiscint go bhfuil na siúcraí íseal-mheáchan móilíneach deCistancheféadfaidh siad fathaigh peritoneal luiche a ghníomhachtú tríd an gcosán comharthaíochta IKK /IκB /NF-κB. Scaoileann cealla Phage cytokines athlastacha agus ansin bíonn ról acu maidir le himdhíonacht cheallacha a ghníomhachtú.

Go luath sa tsaotharlann, tá comhdhéanamh ceimiceach an eastóscáin siúcra íseal-mheáchan móilíneach deCistanche deserticolarinneadh anailís chórasach air. Fuarthas amach go bhfuil monaiméirí den chuid is mó mar mannitol, siúcrós, fruchtós agus glúcós i siúcraí íseal-mheáchan móilíneach. D'aimsigh taighde breise gur féidir le mannitol feabhas suntasach a dhéanamh ar ghníomhaíocht phagocytic macrophages. Mar sin, tá sé speculated go bhféadfadh mannitol a bheith ina chomhpháirt lárnach de shiúcraí íseal-mheáchan móilíneach a ghníomhaíonn feidhm imdhíonachta cheallacha.

Go hachomair, bhain an staidéar seo úsáid as an macrophage sa chóras cultúir Vitro agus fuarthas amach go raibh na siúcraí íseal-mheáchan móilíneach deCistancheéifeacht gníomhachtú suntasach a bheith acu ar mhacrophages, agus féadfaidh sé macrophages peritoneal luch a ghníomhachtú tríd an gcosán comharthaíochta NF-κB, agus ansin ról a imirt. D'fhéadfadh ról tábhachtach a bheith ag mannitol i siúcraí íseal-mheáchan móilíneach maidir le gníomhaíocht phagocytic macrophages a ghníomhachtú.

Tagairtí

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Teicnící saothraithe de Desert Cistanche agus a óstach Tamarix [M]. Béising: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Meitheamh, Peng Yanli. Forbhreathnú taighde ar na héifeachtaí cógaseolaíochta deCistanche deserticolapolaisiúicríd [J]. Bia agus Drugaí, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, et al. Gníomhachtú Macrophage de Cistanche Polysaccharide [J]. Feasachán Cógaseolaíochta na Síne, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Gníomhaíocht bhitheolaíoch agus meicníocht lipopolysaccharide baictéarach [J]. Athbhreithniú ar Eolaíocht Mhíochaine, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, et al. LPS tríd an cosán p38 /MAPK agus NF-κB Spreagann Gníomhachtaithe an slonn HIF-1 in RAW264. 7 gceall [J]. Chongqing Medical University Journal, 2016, 41(10): 1033.

[6] Tá Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen, et al. Tá cosán comharthaíochta JAK2/STAT3 i gceist le gníomhachtú microglia ［J］ de bharr siúcra. Iris an Tríú Ollscoil Míochaine Míleata, 2009, 31(12):1119.

[7] Amhrán Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Cuireann gliocóisídí Mulbascum bac ar athlasadh de bharr lipopolysaccharide ar mhicroglia BV-2 agus a mheicníocht [J]. Iris na Síne um Leigheas Traidisiúnta na Síne, 2016, 41(13): 2506.