RNA Neamhchódaithe Fada KCNQ1OT1 Rialaíonn sé Próitéin Kinase CK2 Trí MiR-760 i Seanfhocal agus Srianadh Calraí

Eochairfhocail:KCNQ1OT1GenericName; RNA fada neamhchódaithe; seanchas ;srian calorie; próitéin kinase CK2;miR{0}}

Cliceáil Anseo Chun Tuilleadh Eolais a Fháil faoi Éifeachtaí Frith-Aosaithe Cistanche

1. Réamhrá

Is tras-scríbhinní iad RNAanna fada neamhchódaithe (lncRNAs) le méid níos mó ná 200 núicléatídí nach n-aistrítear go próitéiní. Tá LncRNAs freagrach as feidhmeanna éagsúla, lena n-áirítear rialáil tras-scríofa sacisnótras, eagrú na bhfearann ​​núicléach, agus idirghníomhú le microRNAs (miRNAs) [1–3]. Go háirithe, cuireann tuiscint ar líonra idirghníomhaíochta lncRNAs agus miRNAs peirspictíocht nua ar fáil ar mheicníochtaí rialála na ngéinte. An lncRNAKCNQ1OT1, arb é a ainm iomlánKCNQ1tras-scríbhinn fhorluiteach 1, is tras-scríbhinn 91 kb í atá tras-scríofa ag RNA polymerase II i dtreoshuíomh antisense, i gcoibhneas leKCNQ1[4,5]. KCNQ1OT1i láthair in intron 10 den ghéin KCNQ1. Tá anKCNQ1Tá lócas suite ar an ngéag ghearr de chrómasóim daonna 11 (11p15.5). Trí earcú G9a agus an H3K27 histone methyltransferase PRC2 (polycomb repressive casta 2),KCNQ1OT1idirghníomhaíonn sé le crómatin chun struchtúr fillte casta a dhéanamh agus ansin cuireann sé ilghéineacha ina dtost [6]. Chomh maith,KCNQ1OT1Tá baint aige le roinnt neamhoird, lena n-áirítear galar croí, stróc ischemic cheirbreach, atherosclerosis, piroptosis, agus ailsí éagsúla (gastric, ovarian, agus calaireicteach) trí cheangal le miRNAs éagsúla (mar shampla, miR-760, miR{{1} }a, miR-452-3p, miR-320a, miR-701-3p, agus miR-2054), agus iad go léir a rialaíonn slonn a spriocghéinte [7–13]. Mar sin féin, tá rólanna bitheolaíocha agKCNQ1OT1i seandacht agus srian calorie (CR) fós doiléir.

Is éard atá i senescence cheallacha ná gabháil chríochfoirt iomadú, spreagtha ag roinnt strusanna ceallacha mar ghiorrú telomere, gníomhachtú oncogenic, agus strus ocsaídiúcháin [14,15]. D'aithin staidéir roimhe seo an próitéin kinase CK2 (CK2), comhdhéanta de dhá chatalaíoch ( agus/nó 0 ) fo-aonaid agus dhá cheann rialála fo-aonaid, mar rialtóir seantachta. CK2cuireann cosc ​​ar roinnt marcóirí seanaoise a chur in iúl, lena n-áirítear a bhaineann le seangacht -galactosidase (SA- -gal) gníomhaíocht [16], p53–p21Cip1/WAF1gníomhachtaithe aise [17], táirgeadh speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) [18], foirmiú fócais heitreacromatin a bhaineann le seantagairt (SAHF) [19], agus slonn feinitíopa rúnaithe seanaoise (SASP) [20]. Cuireann miR-186, miR-216b, miR-337-3p, agus miR-760 seanaoiseacht cheallacha chun cinn trí CK2 a chosc [21,22]. Is é srianadh calraí (CR), arb éard é laghdú ainsealach ar iontógáil iomlán calorie gan míchothú, an straitéis is rathúla chun moill a chur ar sheansacht cheallacha [23]. Tuairiscíodh le déanaí go bhfuil CK2 uasrialaithe ag CR agus go gcothaíonn sé autophagy [24]. Mar sin féin, tá an mheicníocht mhóilíneach atá mar bhonn le huasrialáil CK2 CR-idirghabhálaí doiléir fós.

Sa staidéar seo, ról féideartha naKCNQ1OT1i seangacht agus rinneadh measúnú ar CR.KCNQ1OT1Chuir knockdown feinitíopa seangachta chun cinn trí íosrialáil CK2 i gcealla ailse daonna MCF-7 agus HCT116 agus i gcealla fibroblasts scamhóg IMR-90. Léiríonn an taighde seo go bhfuilKCNQ1OT1CK2 a rialáil léiriú trí idirghníomhú le miR-760 le linn seanaoise agus CR, rud a thugann le tuiscintKCNQ1OT1d’fhéadfadh a bheith ina sprioc teiripeach nua do ghalair a bhaineann le haosú.

2. Torthaí

2.1. KCNQ1OT1 Gníomhachtaithe Spreagtha Chnoc an Dúin SA- -gal Staining, an p53-p21Cip1/WAF1Conair, agus H3K9 Trimethylation Trí CK2 Tost i gCealla Ailse Daonna

Aistríodh cealla MCF-7 agus HCT116 leKCNQ1OT1siRNA chun rannpháirtíocht naKCNQ1OT1i seangacht.KCNQ1OT1SA-rialaithe leagadh síos- -gal gníomhaíocht (Fíor1A). Ina theannta sin, léirigh torthaí immunoblot goCnagadh KCNQ1OT1uasrialáladh na leibhéil p53 agus p21Cip1/WAF1, agus sainmharcanna SAHF (méadú H3K9 trimethylation (H3K9me3) agus laghdú H3K9 aicéitilation (H3K9Ac)) (Fíor1B). Tuairiscíodh roimhe seo go gcothaíonn íosrialú CK2 na marcóirí seanaoise seo (gníomhachtú SA- -gal staining, an p53-p21Cip1/WAF1cosán, agus SAHF) [16,17,19]. Ar an ábhar sin, scrúdaíodh an raibhKCNQ1OT1idirghníomhaíonn sé le CK2. Suimiúil go leor, CK2 ectopic aisghair an abairt ionduchtú SA- -gal gníomhaíochta, p53, p21Cip1/WAF1, agus H3K9me3, arna idirghabháil agKCNQ1OT1downregulation (Fíor1A, B). Ina theannta sin,Cnagadh KCNQ1OT1laghdaigh an leibhéal próitéine CK2 (Fíor1B). Tugann na torthaí seo le chéile go bhfuilKCNQ1OT1cothaíonn an t-anuas seangacht cheallacha trí CK2 a íosrialáil.

2.2. KCNQ1OT1 Léiriú Fachtóra SASP Ionduchtaithe Chnoc an Dúin agus Giniúint ROS Trí CK2 Tost i gCealla Ailse Daonna

Fiosraíodh an raibhKCNQ1OT1mhéadaigh íosrialáil léiriú fachtóirí SASP mar gheall ar thuairiscí go secrete cealla senescent fachtóirí pro-athlastacha [14,15]. KCNQ1OT1ba chúis leis an mbrú an slonn fachtóirí SASP, lena n-áirítear interleukin (IL)-1 , IL-6, agus maitrís metalloproteinase (MMP) 3 (Fíor2A). KCNQ1OT1mhéadaigh íosrialáil an méid ROS intracellular toisc go bhfuil strus ocsaídiúcháin ina phríomhchúis le seangacht [14,15]. Chun na críche seo, aistríodh cealla HCT116 agus MCF-7 leKCNQ1OT1siRNA agus dhaite le CM-H2DCFDA.KCNQ1OT1táirgeadh méadaithe ROS a laghdú, mar atá léirithe ag an athrú ceart ar fhluaraiseacht FL le linn cítoiméadracht flflow (Fíor2B). Tuairiscíodh roimhe seo go gcothaíonn íosrialáil CK2 slonn SASP [20] agus giniúint ROS [18]. Slonn ectopic de CK2 aisghair sé ionduchtú léiriú fachtóir SASP agus giniúint ROS, arna idirghabháil agKCNQ1OT1downregulation (Fíor2A, B). Le chéile, léiríonn na torthaí seo go bhfuilKCNQ1OT1aslaítear giniúint ROS agus athlasadh trí CK2 a íosrialáil.

Figiúr 1. KCNQ10Gníomhachtú spreagtha T1 de smálú SA{--gal, an p53-p21CipI/WAFpathway, agus trímheitiolú H3K9 trí tosta CK2x i gcealla ailse daonna. Aistríodh cealla HCT116 agus MCF{{1{0}} le KCNO10T1 siRNA ar feadh dhá lá in éagmais nó láithreacht pcDNA3.1.HA-CK2x. (A) Dathaíodh cealla le 5-bróma-4-clóra-3-indolyl{--D-galactosíd, agus fuarthas íomhánna ionadaíocha ag formhéadú 20x (uachtarach). Barra scála=100 um. Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha. Léiríonn na graif an céatadán de chealla dhaite gorm (bun). (B) Baineadh úsáid as immunoblotting chun leibhéal gach próitéine a chinneadh ag baint úsáide as antasubstaintí sonracha (uachtair). 3-Úsáideadh Actin mar rialtán, Léiríonn na graif cainníochtú gach próitéine i gcoibhneas le B-actin (bun). Tuairiscítear sonraí mar mheán-SEM.* p < 0.05; ** p < 0.01, ** p < 0.001.H3K9me3, histone H3 Lys9 trimethylation; H3K9AC, H3 Lys9 acetylation.

Figiúr 2. KCNQ10T1 léirithe fachtóir feinitíopa rúnaithe comhcheangailte seanaoise spreagtha (SASP) agus giniúint speiceas ocsaigine imoibríoch (ROS) trí thosta CK2x i gcealla ailse daonnaHCT116 agus MCF-7 aistríodh cealla le KCNO1{ {20}}T1 siRNA ar feadh dhá lá in éagmais nó i láthair pcDNA3.1-HA-CK2a. (A) Socraíodh leibhéal gach mRNA trí imoibriú slabhra trascríobh-polaiméaráis droim ar ais (RT-PCR) ag baint úsáide as primers sonracha (uachtair). Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha. Léiríonn na graif cainníochtú gach mRNA i gcoibhneas le 6-actin (bun). (B) Bhí gor na cealla le 10 UM CM-HDCEDAF Rinneadh déine fhluaraiseacht a chinneadh trí anailís cíteiméadracht sreafa (uachtair). Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha. Léiríonn na graif an leibhéal coibhneasta fluaraiseachta (bun)Tuairiscítear sonraí mar mheán 士 SEM. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

2.3. Bhí baint ag KCNQ1OT1 le Lipopolysaccharide (LPS) - Léiriú Fachtóra SASP Idirmheánach Trí Tosta CK2 i gCealla Ailse Daonna

Toisc go n-eascraíonn cóireáil le LPS seanaoise ceallacha trí CK2 a íosrialáil [20], tástáladh an ndearna LPS íosrialúKCNQ1OT1léiriú. Cóireáil le LPS (6µg/µL) laghdaigh leibhéil tras-scríofa naCK2Name agusKCNQ1OT1i gcealla ailse daonna (Fíor3A). Ina theannta sin, an éifeachtKCNQ1OT1ar léiriú fachtóir SASP i gcealla cóireáilte le LPS. Mar sin féin, cóireáil le LPS (6µg/µL) fachtóir SASP méadaithe (IL-1 slonn , IL-6, agus MMP3) i gcealla ailse daonna; cóireáil bhreise le pcDNA3.1-D’aisghair KCNQ1OT1 (36,181–37,140) ionduchtú fachtóirí SASP-idirghabhálaithe LPS (Fíor3B). Taispeánadh roimhe seo gur spreag gníomh comhbheartaithe miR-760, miR- 186, miR-337-3p, agus miR-216b seanaoise roimh am tríd an CK2 a chur ina thost próitéin i gcealla HCT116 [21], agus go ndearnadh miR-760 agus miR-186 a uasrialáil i gcealla macasamhlacha IMR-90 [22]. Cinneadh patrúin slonn na miRNAs seo a raibh tionchar ag cóireáil le LPD orthu. Léirigh anailís chainníochtúil imoibriú slabhrúil polaiméaráise fíor-ama (qPCR) gur tháinig méadú níos mó ná 200 faoin gcéad ar an méid miR-760 i gcealla HCT116 agus MCF{-7 a cóireáladh le LPS (6).µg/µL), i gcomparáid leis na cealla rialaithe. níor uasrialáladh miR-186 le cóireáil LPS, agus bhí miR-337-3p agus miR-216b rialaithe go difriúil sna cealla seo (Fíor3C). Mar sin, léiríonn na torthaí seo le chéile gur mhéadaigh LPS méideanna miR-760 trí íosrialáilKCNQ1OT1GenericName, agus CK2 mar thoradh air senescence downregulation-idirghabhála.

Figiúr 3. Bhí baint ag KCNO10T1 le feinitíopa rúnaíochta a bhaineann le hidirghabháil lipopolysaccharide (LPS)-idirghabhála (SASP) a chur in iúl trí CK2x a chur i gcealla ailse daonna. (A) Cóireáladh cealla HCT116 agus MCF{-7 le LPS (6 ug/uL) ar feadh dhá lá. Socraíodh leibhéal gach mRNA ag RI-PCR ag baint úsáide as primers ar leith (barr). Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha. Baineadh úsáid as B-Actin mar rialú. Léiríonn na graif cainníochtú gach mRNA i gcoibhneas le B-actin (bun). (B) Cóireáladh cealla le LPS (6 ug/uL) in éagmais nó i láthair pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) ar feadh dhá lá. Socraíodh leibhéal gach mRNA ag RI-PCR ag baint úsáide as primers sonracha (ar chlé). Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha gur úsáideadh 3-Actin mar rialúchán. Léiríonn na graif cainníochtú gach mRNA i gcoibhneas le -actin (ar dheis). (C) Cóireáladh cealla le LPS (6 ug/uL) ar feadh dhá lá leithlisíodh RNA iomlán ó chealla agus cuireadh faoi anailís PCR é chun leibhéil choibhneasta miR-760, miR-186, miR{{) a chinneadh 26}}p, agus miR-216b ag baint úsáide as RNU48 le haghaidh normalú. Taispeántar sonraí mar théamaí 士 SEM.*p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

2.4. KCNQ1OT1 CK2 Uasrialaithe trí miR{0}} a spongáil i gCealla Ailse Daonna

Ansin, scrúdaíodh an raibhKCNQ1OT1rialaíonn CK2 slonn trí miR{0}}. Aistríodh cealla HCT116 agus MCF-7 le pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36,181–37,140) nó KCNQ1OT1 siRNA, mar aon le miR-760 mimiceach nó coscaire (seichimh léirithe i dTábla Forlíontach S1). Léiriú ectopic deKCNQ1OT1(36,181–37,140) an leibhéal mRNA deCK2Name , cé gur cuireadh cóireáil bhreise leis an miR-760 faoi choisKCNQ1OT1GenericName-idirghabhálaCK2Name upregulation (Fíor4A). I gcodarsnacht,KCNQ1OT1Laghdaigh an titim leibhéal mRNA deCK2Name , ach cóireáil bhreise le coscaire miR-760 faoi choisKCNQ1OT1knockdown-mediatedCK2Name downregulation (Fíor4B). Níorbh fhéidir leis an miR{0}} aithrise agus an coscaire méid naKCNQ1OT1GenericName, ag tabhairt le fios nach rialtóir réamhtheachtacha é miR{0}} deKCNQ1OT1. San iomlán, léiríonn na torthaí sinKCNQ1OT1méaduithe ar an méid deCK2Name mRNA trí miR-760 a spongáil. Léiríonn Fíor Forlíontach S1 na seichimh agus na suíomhanna ceangailteacha deKCNQ1OT1GenericName, miR-760, agusCK2Name mRNA, arna chinneadh ag baint úsáide as TargetScan agus Miranda.

Fíor 4. KCNQ10D’uasrialáladh T1 CK2x trí miR a spongáil-760 i gcealla ailse daonna. (A) Aistríodh cealla HCT116 agus MCF-7 le pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) ar feadh dhá lá sa easnamh nó láithreacht miR-760. (B) Aistríodh cealla HCT116 agus MCF-7 le KCNO10T1 siRNA ar feadh dhá lá in éagmais nó láithreacht coscaire miR-760. Socraíodh leibhéal gach mRNA ag RT-PCR ag baint úsáide as primers ar leith (barr). Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha. Léiríonn na graif cainníochtú gach mRNA i gcoibhneas le B-actin (bun). Déantar sonraí a thuairisciú mar mheán 士 SEM.* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

2.5. Coinníoll CR CK2x Uasrialaithe ag miR-760 Downrialáil Trí Uathrialú KCNQ1OT1 i gCealla Ailse Daonna

Bhí sé ceaptha go raibh léiriú KCNQ1OT1 upregulated sa riocht CR toisc go raibh an leibhéal CK2x mRNA upregulated sa riocht CR [24]. Goradh cealla HCT116 agus MCF-7 faoi choinníollacha CR chun an hipitéis seo a thástáil. Mar a thaispeántar i bhFíor 5A, bhí léiriú KCNO10T1 agus CK2x spreagtha ag CR sna cealla seo nuair a chuir cóireáil bhreise le KCNQ10T1 siRNA faoi chois CR-idirghabhála CK2ainduction, rud a léiríonn KCNQ10T1 mar rialtóir dearfach CK2x i gcoinníollacha CR. Ina theannta sin, léirigh anailís le qPCR fíor-ama gur tháinig laghdú 70 faoin gcéad ar an leibhéal miR-760 i gcoinníollacha CR, ach gur tháinig laghdú ar na leibhéil miR-186, miR-216b, agus miR{{22) }}p i gcoinníollacha CR gan athrú nó méadaithe (Fíor 5B). Ansin, scrúdaíodh éifeacht miR-760 ar uasrialáil CRmediated CK2x. Déanann cóireáil le miR-760 aithris ar upregulation CK2x trí mheán suppresseoCR, rud a léiríonn miR-760 mar rialtóir diúltach mór ar choinníollacha CK2ain CR (Fíor 5C). Mar fhocal scoir, léirigh anailís fíor-ama gPCR gur mhéadaigh cóireáil le KCNO10T1 siRNA na leibhéil miR-760, ach chuir CR faoi chois ionduchtú miR-760 knockdown-mediated KCNO10T1 (Fíor 5D). San iomlán, léiríonn na torthaí seo gur laghdaigh CR miR-760 trí KCNQ10T1 a uasrialáil, rud a d’fhág go raibh CK2x ag athrialú i gcealla ailse daonna. Toisc gur tuairiscíodh go bhfeidhmíonn an lncRNA SNHG6 freisin mar aspúinse miR{0}} i gcealla CRC [25], tástáladh cibé an uasrialaíonn CRslonn SNHG6. Ach,SNHG6níor athraíodh slonn sa riocht CR (níor léirítear sonraí)

Fíor 5. Coinníoll srianta calraí (CR) CK2x a uasrialáil le miR-760 downregulation trí KCNO10uprialú T1 i gcealla ailse daonna. (A, C agus D) Aistríodh cealla HCT116 agus MCF-7 le KCNO1{{2{0}T1 siRNA (A agus D) nó miR-760 (C) ar feadh 1.5 lá agus goradh ansin faoi choinníollacha CR ar feadh seacht n-uaire an chloig. (B) Goradh cealla HCT116 agus MCF-7 faoi choinníollacha CR ar feadh seacht n-uaire an chloig. (A,C) Socraíodh leibhéal gach mRNA ag RT-PCR ag baint úsáide as primers sonracha (barr) Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha. 3-Úsáideadh Actin mar ghraf rialaithe chun cainníochtú gach RNA a léiriú i gcoibhneas le B-actin (bun). (B,D) Leithlisíodh RNA iomlán ó chealla agus rinneadh anailís air ag qPCR ag baint úsáide as RNU48 le haghaidh normalú chun leibhéil choibhneasta na miRNAs léirithe a chinneadh Taispeántar sonraí mar acmhainn móide SEM * y < 0.05.*p < 0.01;** * p < 0.001.

2.6. Laghdaíodh KCNQ1OT1 le linn Seanaoise Macasamhail i gCealla Fibroblast na Scamhóg Daonna, Cé na Coinníollacha CR a tarrtháil

Ós rud é go bhfuil CK2x ísrialaithe i gcealla síneacha macasamhlacha agus i bhfíocháin aosta [16]scrúdaíodh cibé an bhfuil KCNO1OT1 íosrialaithe le linn seanaoise i gcealla fibroblast scamhóg daonna IMR-90. Laghdaigh cnag síos KCNO10T1 an leibhéal mRNA de chealla CK2xin IMR-90 (Fíor 6A). Os a choinne sin, rinne cnag síos KCNO1OT1 gníomhaíocht SA-P-gal upregulated i gcealla IMR-90, agus léiriú ectópach CK2a aisghairm ar ionduchtú gníomhaíochta SA-3-gal a idirghabháil ag íosrialáil KCNO1OT1 (Fíor 6B). Chun a fháil amach conas a laghdaigh slonn KCNQ10T1 de réir seanaoise macasamhail, ritheadh ​​cealla IMR-90 arís agus arís eile go dtí gur breathnaíodh staid cosúil le seanchas. Bhí dath dearfach ar an gcuid is mó de na cealla ag PDL 47 do SA-B-gal, ach níor dhaite ach dornán díobh go dearfach le haghaidh SA-B-gal i measc cealla luathsleachta (PDL 34) (ní thaispeántar sonraí). Tháinig laghdú 60 faoin gcéad ar leibhéil tras-scríbhinne KCNO10T1 i gcealla seanaoise macasamhlacha (PDL 47), i gcomparáid le cealla luathsliocht (PDL 34), rud a thugann le fios go raibh KCNO10T1 íosrialaithe le linn seanaoise macasamhail. Ar deireadh, mhéadaigh coinníollacha CR KCNO1OT1 faoi 150 faoin gcéad i gcealla pasáiste luath (PDL 34) i gcomparáid le gnáthchoinníollacha calraí. Mar sin féin, mhéadaigh coinníollacha CR KCNO10T1 níos láidre (faoi 250 faoin gcéad) i gcealla seanaoise macasamhail (PDL 47) i gcomparáid le gnáthchoinníollacha calraí. rud a thugann le fios gur féidir le CR an slonn laghdaithe KCNO10T1 agus CK2x a tharrtháil, arna idirghabháil ag seanfhocal macasamhail (Fíor 6C). I dteannta a chéile, léiríonn na sonraí seo go laghdaíonn seanaoise macasamhail slonn CK2x trí íosrialáil KCNQ10T1, agus gur féidir le CR seanaoise macasamhail a chosc trí ais KCNO1OT1-CK2

Fíor 6. KCNQ10 Rinneadh íosrialáil 11 le linn seanaoise macasamhail i gcealla fibroblast na scamhóg daonna, rud a d’fhéadfaí a tharrtháil trí choinníollacha srianta calraí (CR). (A) Aistríodh cealla IMR-90 (PDI36) le KCNO10T1 siRNA. Socraíodh leibhéal gach mRNA ag RT-PCR ag baint úsáide as primers ar leith (barr). Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha3-Úsáideadh Actin mar rialúchán. Léiríonn na graif cainníochtú gach mRNA i gcoibhneas le 6-actin (bun). (B) Aistríodh cealla IMR-90 (PDL 36) le KCNO10T1 siRNA ar feadh dhá lá in éagmais nó láithreacht pcDNA3.1-HA-CK2a. Dathaíodh cealla le 5-bróma-4-chloro3-indolyl--D-galactosíde, agus fuarthas íomhánna ionadaíocha ag barra Scála méadaithe 20x (ar chlé)=100 um . Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha. Léiríonn na graif an céatadán de chealla dhaite gorm (ar dheis). (C) Goradh cealla IMR-90 PDL 34 agus PDL 47 faoi choinníollacha CR ar feadh seacht n-uaire an chloig. Socraíodh leibhéal gach mRNA ag RT-PCR ag baint úsáide as primers sonracha (ar chlé). Taispeántar sonraí ionadaíocha ó thrí thurgnamh neamhspleácha3-Úsáideadh Actin mar rialúchán. Léiríonn na graif cainníochtú gach mRNA i gcoibhneas le 6-actin (ar dheis). Tuairiscítear sonraí mar mheán 土 SEM.* p < 0.05, ** p < 0.01; *** p < 0.001. (D) Samhail fhéideartha a léiríonn róil KCNO10T1 maidir le seantúlacht agus CR. PDL, leibhéal dúbailt daonra