Is LncRNA Imdhíonachta í LIMIT in Imdhíonacht Ailse agus Imdhíonteiripe

Teibí

Cuireann MHC-I antaiginí siadaí i láthair cealla T CD8+ agus spreagann sé imdhíonacht frith-meall. D’fhéadfadh 30,000-60,{5}} RNAnna fada neamhchódaithe (lncRNAs) a bheith ag daoine. Mar sin féin, ní thuigtear cé acu an bhféadfadh lncRNAnna difear a dhéanamh d'imdhíonacht siadaí. Anseo, sainaithnímid LncRNA, atá in ann MHC-I agus Imdhíonacht Mheall (LIMIT) a aslú i ndaoine agus i lucha. Fuaireamar braisle géine próitéine guanylate ceangailteach (GBP) spreagtha ag IFN LIMIT, LIMIT, agus chuir GBP isteach ar an gcomhlachas idir HSP90 agus fachtóir turraing teasa-1 (HSF1) - rud a d’fhág go raibh gníomhachtú HSF1 agus trascríobh MHC-I mar thoradh air. innealra, ach ní PD-L1. Chuir gníomhachtú CRISPR faoi threoir RNA ar LIMIT le GBPanna agus MHC-I, agus chuir sé le teiripe imdhíon-ghineachta siadaí agus seicphointí.

Laghdaigh LIMIT tosta, GBPanna, agus/nó HSF1 MHC-I, lagú imdhíonacht frith-tumóra, agus éifeachtúlacht imdhíonteiripe maolaithe. Go cliniciúil, bhí tras-scríbhinní comharthaíochta agus próitéiní LIMIT, GBP- agus HSF1-chomhghaolú le MHC-I, cealla T a insíothlaíonn siadaí, agus freagairt blocála seicphointí in othair ailse. San iomlán, léirímid gur lncRNA imdhíon-ghineach ailse í LIMIT nach raibh ar eolas roimhe seo agus d’fhéadfadh an ais LIMIT-GBP-HSF1 a bheith dírithe ar imdhíonteiripe ailse.

Eochairfhocail 

RNA neamhchódaithe fada; Teorainn; MHC-I; IFN; GBP; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; díolúine cille T; imdhíonteiripe ailse

Réamhrá

Scaoileann imshuí seicphointe CD8+ T cumhacht imdhíonachta trí chill-idirghabhála i gcoinne ailse1. Tá príomhról ag coimpléasc histe-chomhoiriúnachta-I (MHC-I) i dtosú agus gníomhachtú cille T CD8+2. Mar sin féin, is minic a laghdaítear MHC-I i gcealla ailse, rud a fhágann imghabháil imdhíonachta siadaí agus frithsheasmhacht in aghaidh imdhíonteiripe3,4. Tá sé tábhachtach a thuiscint conas léiriú MHC-I siadaí a ghnóthú agus freagairt imdhíonachta antitumor a athbheochan5. Tá LncRNAs ag teacht chun cinn go tapa mar aon leis an dul chun cinn i seicheamhú domhain RNA, a chlúdaíonn i bhfad níos mó loci sa ghéanóm daonna ná géinte códaithe próitéin6. Rialaíonn LncRNAanna géinte códaithe próitéine ag leibhéil iolracha7-9 agus imríonn siad róil ríthábhachtacha in imprinting genomic10, difreáil cille11, agus dul chun cinn ailse12. Mar sin féin, ní fios fós céannacht, modh gníomhaíochta, feidhm, agus ábharthacht chliniciúil lncRNAanna sonracha i ndíolúine ailse agus imdhíonteiripe. Anseo, sainaithnímid LIMIT mar lncRNA imdhíon-ghineach ailse nach raibh ar eolas roimhe seo. Bíonn tionchar ag LIMIT ar innealra MHC-I agus ar dhíolúine in aghaidh tumhair. Tá sé faighte amach againn go ndíríonn LIMIT go háitiúil ar GBPanna, agus mar sin cruthaítear easghluaiseachta móilíneach de LIMIT-GBP-HSF1-MHC chun imdhíonacht frith-tumóra agus éifeachtúlacht imdhíonteiripe siadaí a athrú. Ní hamháin go nochtann ár gcuid oibre bitheolaíochta de lncRNA imdhíon-ghineach, LIMIT nach raibh ar eolas roimhe seo, ach tugann sé le fios freisin go bhféadfadh an ais LIMIT-GBP-HSF1 a bheith dírithe ar imdhíonteiripe ailse.

Is lncRNA imdhíon-ghineach é LIMIT

cistanche tubulosa-feabhas a chur ar chóras imdhíonachta

Chun iniúchadh a dhéanamh ar ghéinte rialála anaithnide maidir le díolúine siadaí, bunaithe ar insíothlú cille T CD8+ siadaí, roinneamar meileanóma daonna (TCGA, SKCM) i gcineálacha siadaí te agus fuar agus rinneamar anailís ar chomhghaolta géine imdhíon-ghineacha. Chomh maith le tras-scríbhinní CD8A, IFN , agus MHC-I (HLA-ABC), fuaireamar amach go raibh iarrthóir lncRNA saibhrithe sa meall te, i measc 3926 iarrthóir lncRNA anótáilte ag GENCODE13 (Fíor 1a; Tábla Forlíontach 1). Bunaithe ar staidéir fheidhmiúla sna turgnaimh seo a leanas, d'ainmnigh muid an t-iarrthóir lncRNA seo mar LIMIT: lncRNA Ionduchtú MHC-I agus Imdhíonacht meall (LIMIT). Sa tacar sonraí meileanoma daonna, bhí comhghaol dearfach idir leibhéil LIMIT agus leibhéil IFN , MHC-I, agus CD8 (Fíor 1b-d). Ag teacht leis seo, léirigh Anailís Saibhrithe Set Gene (GSEA) go raibh baint ag léiriú LIMIT le géinte freagartha IFN, cur i láthair antaiginí trí MHC-I, agus gníomhachtú imdhíonachta (Fíor 1e-h). Ina theannta sin, bhain leibhéil LIMIT le rátaí freagartha imdhíonteiripe seicphointe feabhsaithe 14-17 (Fíor 1i) agus bhain siad le maireachtáil in othair le melanoma (Fíor 1j). Ina theannta sin, bhí comhghaol idir léiriú LIMIT agus IFN , MHC-I, agus CD8 thar ilchineálacha ailse (Sonraí Leathnaithe Fíor 1a-l). Mar sin, is lncRNA imdhíon-ghineach féideartha é LIMIT.

Rinneamar bailíochtú más lncRNA é LIMIT. Léirigh blotting thuaidh go raibh LIMIT thart ar 2 kb ar fad i gcealla meileanoma daonna A375 (Fíor 1k). Chuireamar aimpliú tapa ar fhoircinn cDNA (RACE) i bhfeidhm agus bhí sé mar shaintréith ag foircinn cDNA LIMIT i gcealla meileanoma daonna (A375) agus luch (B16) (Fíor 1l, m). Ansin, clónálamar fad iomlán na LIMIT sa dá dhaoine agus i lucha agus rinneamar é a ailíniú le seichimh ghéanóim chomhfhreagracha (Sonraí Leathnaithe Fíor 2a, b). Bhí Teorainn Daonna lonnaithe i crómasóim 1, le 1967 núicléatídí agus 6 exons (Sonraí Breisithe Fíor. 2a), cé go raibh an Teorainn luch suite i crómasóim 3, le 1634 nucleotides agus 7 exons (Sonraí Breisithe Fíor. 2b). Ní raibh seicheamh Kozak bailí in LIMIT. Nuair a d'ullmhaigh muid RNA ó chodáin núicléacha agus cíteaplasmacha de chealla A375, braitheadh ​​LIMIT go príomha sa chodán núicléach (Fíor 1n). Mar sin, níl aon acmhainn códaithe próitéine ag LIMIT. I dteannta a chéile, comhlíonann LIMIT na critéir go léir atá le sainmhíniú mar lncRNA. Go háirithe, i lócas LIMIT, fuarthas iarrthóir lncRNA, pseudogene de GBP1 (GBP1P1) i gcarcanóma hepatocellular (HCC)18. Mar sin féin, léirigh LIMIT cosúlachtaí ísle le GBP1P1 nó GBP1 (Sonraí Breisithe Fíor 2c, Tábla Forlíontach 2). Mar sin, ní GBP1P1 LIMIT. Tugann comhghaol ard idir síniú géine sofhreagrach LIMIT agus IFN (Fíor 1e) le fios go bhféadfadh IFN léiriú LIMIT a spreagadh. Go deimhin, tharlódh cóireáil le IFN léiriú LIMIT, mar a léirítear ag blotting an Tuaiscirt (Fíor 1k) agus RNA-seq i gcealla A375, HT29, Meijuso, agus A549 (Fíor 1o). Mar sin féin, theip ar chóireáil le cítocíní eile, mar IFN agus TNF , léiriú LIMIT a chothú (Fíor 1k). Ina theannta sin, theip ar IFN LIMIT i gcealla leagain STAT1 (KO) A375 (Fíor 1p) a aslú. Mar sin, is lncRNA freagrúil IFN é LIMIT i gcealla daonna agus luchóg araon.

Méadaíonn LIMIT slonn MHC-I

sochair fhorlíonadh cistanche-conas a neartú chóras imdhíonachta

Cliceáil anseo chun táirgí Cistanche Feabhsú Díolúine a fheiceáil

【Iarr tuilleadh】 Ríomhphost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Chun staidéar a dhéanamh ar fheidhm LIMIT i gcealla meall, leagamar síos LIMIT ar dtús le RNAanna beaga bioráin ghruaige (shLIMIT). D'úsáideamar an uirlis Blast chun LIMIT shRNAs a roghnú nach bhfuil aon iarrthóirí lasmuigh den sprioc acu (Táblaí Forlíontacha 3-6). Níor dhírigh ShLIMIT ar ghéinte códaithe GBP (Sonraí Leathnaithe Fíor 3a). I gcealla A375, chuir shLIMIT slonn LIMIT faoi chois (Fíor 2a), ach níor chuir sé isteach ar phosphorylation STAT1 (Fíor 2b) mar fhreagra ar IFN - rud a thugann le tuiscint nach raibh tionchar ag LIMIT ar chomharthaíocht ghéine domhanda IFN. Is géinte sprice IFN19-21 iad MHC-I agus PD-L1. ShLIMIT ba chúis le laghdú ar an abairt MHC-I (Fíor 2c), ach ní PD-L1 (Sonraí Leathnaithe Fíor. 3b), mar fhreagra ar spreagadh IFN. Ag teacht leis na sonraí daonna seo, mar thoradh ar an Teorainn tosta i gcill melanoma murine YUMM1.7 nó cill ailse drólainne CT26 tháinig laghdú ar léiriú MHC-I mar fhreagra ar IFN (Fíor 2d-g). I gcealla A375, rinne shLIMIT difear ní hamháin léiriú MHC-I (HLA-ABC, HLA-E, agus HLA-F) ach freisin léiriú MHC-II (HLA-DRA agus HLA-DMA); ach níor athraigh LIMIT slonn géine comharthaíochta IFN eile (Sonraí Leathnaithe Fíor 3c). Mar sin, glacann LIMIT páirt i rialáil slonn MHC-I agus MHC-II arna spreagadh ag IFN gan cosán comharthaíochta domhanda IFN a athrú.

Is géine idirbhriste é LIMIT le introns mhóra, timpeall 17 kb sa ghéanóm. Theip orainn an lócas LIMIT a leagadh amach le sgRNAs péireáilte agus Cas9. Ós rud é go bhfuil 5 shuíomh ceangailteach STAT1/IRF1 tuartha sa tionscnóir LIMIT, dhearamar 4 sgRNA péireáilte chun na suíomhanna ceangailteacha seo a scriosadh sa tionscnóir LIMIT (Sonraí Leathnaithe Fíor. 3d). Ghineamar cealla A375 le scriosadh tionscnóra LIMIT i ngach ceann de na 4 theaglaim de sgRNAs. Fuaireamar amach nach raibh IFN éifeachtach a thuilleadh chun léiriú LIMIT agus MHC-I a spreagadh i gcealla meall le scriosadh tionscnóra LIMIT i gcomparáid le cealla de chineál fiáin (Fíor 2h, i). Chomh maith leis sin d’fhostaigheamar córas gníomhachtaithe CRISPR treoraithe ag RNA chun slonn Teorainn a ghníomhachtú i gcealla meall22. Bhunaíomar 4 RNA treorach a dhírigh ar an réigiún tionscnóra Teorainn (sgLimit), agus comh-léirithe le dCas9-VPR, gníomhaí tras-scríobhaithe trípháirteach comhleádh le nuclease-null Cas9, isteach i gcealla B16 (Sonraí Breisithe Fíor. 4a). Chuir na 4 sgLimit go léir feabhas ar léiriú Teorainn, chomh maith le MHC-I (Sonraí Leathnaithe Fíor 4b, c). Nuair a d'aistrigh muid cealla B16 le sgLimit comhthiomsaithe agus sgRNAs neamh-spriocdhírithe (sgNT), spreag sgLimit an abairt Teorainn agus MHC-I, ach ní PD-L1 (Fíor 2j, k). Mar sin, díríonn Teorainn go roghnach ar MHC-I, ach ní dhíríonn Teorainn ar PD-L1. San iomlán, léiríonn na turgnaimh chaillteanais agus ghnóthachan feidhme gur féidir le LIMIT slonn fillte-MHC-I 1.{5-3 a athrú i gcealla iomadúla ailse thar lucha agus daoine. An chéad uair eile rinneamar imscrúdú an bhfuil tionchar ag slonn MHC-I arna athrú ag LIMIT ar mharú siadaí in vitro trí mheán na cille TAA ar leith. Chuige sin, leagamar síos go géiniteach B2M ar dtús le shRNAanna sonracha in ubhalbaimin (OVA)--a chuireann in iúl cealla B16. ba é an toradh a bhí ar shRNA-B2M ná laghdú 1.{5-i slonn OVA-H2Kb (Sonraí Leathnaithe Fíor. 4d). Nuair a goradh cealla B16-OVA ag iompar shFluc agus shB2M le cealla OT-I, thugamar faoi deara laghdú ar shB2M-B trí mheán OT-I marú ceall OVA i gcomparáid le shFluc-B{{63} }}Cealla OVA (Sonraí Breisithe Fíor 4e-g). Tugann na sonraí le fios go bhféadfadh athruithe 1.{5-3-i slonn MHC-I arna rialú ag LIMIT a bheith ábhartha ó thaobh feidhme de maidir le cur isteach ar ghníomhaíochtaí CTL a bhaineann go sonrach le TAA. Chun é seo a bhailíochtú, chuireamar LIMIT i ngníomh i gcealla B{16-OVA a léirigh seileaic agus shB2M. De réir mar a bhíothas ag súil leis, spreag gníomhachtú CRISPR ar LIMIT léiriú íosta MHC-I i gcealla shB2M, i gcomparáid le cealla rialaithe (Fíor 2l). Dá réir sin, rinne cealla OT-I idirghabháil ar mharú meall íosta i gcealla shB2M-OVA-B16 i gcomparáid le cealla rialaithe (Fíor 2m, n). Tugann na sonraí le fios go bhfuil slonn MHC-I LIMIT-spreagtha tábhachtach maidir le gníomhachtú agus feidhm cille T a bhaineann go sonrach le TAA. Cuireann cealla a thíolacann antaigin (APCanna), lena n-áirítear macrophages agus cealla dendritic (DCanna), MHC-I in iúl, cuireann siad antaiginí i láthair do chealla T a bhaineann go sonrach le TAA agus gníomhaíonn siad. Leathnaíomar ár gcuid staidéir ó chealla meall go dtí APCanna. Spreagadh potently IFN Léiriú Teorainn i smeara-díorthaithe DCs agus macrophages (Sonraí Leathnaithe Fíor. 4h, i). D'aistrigheamar macrófaigí le siRNA lipéadaithe 5'FAM ag díriú ar Theorainn (siLIMIT). Mar thoradh ar laghdú LIMIT tháinig léiriú MHC-I níos ísle mar fhreagra ar spreagadh IFN, i gcomparáid le rialú (Sonraí Leathnaithe Fíor 4j, k). Mar sin, is lncRNA sofhreagrach IFN é LIMIT agus féadann sé léiriú MHC-I a chur chun cinn i gcealla meall agus APCanna araon.

Feabhsaíonn LIMIT díolúine frith-meall

Buntáistí cistanche tubulosa-Antitumor

Tugann léiriú neamhleor MHC-I imghabháil imdhíonachta siadaí agus friotaíocht imdhíonteiripe3. Chun ról na Teorann i bhfreagraí imdhíonachta antitumor in vivo a thuiscint, rinneamar cealla meall rialaithe (shFluc) agus Tosú Teorann (shLimit) YUMM1.7 a ionaclú isteach i NOD scid c-easnamhach (NSG, imdhíonachta easnamhach) agus fiáin de chineál C57BL/6 (inniúil imdhíonachta) lucha. I gcomparáid le siadaí rialaithe, d'fhás siadaí shLimit YUMM1.7 inchomparáide i lucha NSG (Fíor 3a), ach rinneadh dul chun cinn níos tapúla i lucha de chineál fiáin (Fíor 3b). Ina theannta sin, ionaclaithe againn shLimit CT26 siadaí isteach fiáin de chineál BALB / c lucha. Arís, mar thoradh ar an Teorainn tosta tháinig fás siadaí CT26 feabhsaithe sa mhúnla imdhíonachta-inniúil (Fíor 3c). Tugann na sonraí le fios go bhféadfadh an Teorainn tosta dochar a dhéanamh d’imdhíonacht frith-meall agus fás siadaí a éascú ar bhealach imdhíonachta-spleách. Chun tacú leis seo, bhraitheamar laghdú ar chealla CD3+, IFN +, agus TNF + T sna siadaí shLimit YUMM1.7 (Fíor 3d, e). Le chéile, cuireann Teorainn tosta bac ar dhíolúine frith-meall. Chun slonn MHC-I agus MHC-I: SIINFEKL in vivo a chinneadh, bhunaíomar cealla YUMM1.7 a chuir in iúl go cobhsaí OVA (YUMM1.7-OVA) agus trasduchtaíodh iad le shRNA a dhírigh ar Theorainn nó Fluc. Tar éis cóireáil IFN, bhraitheamar léiriú dromchla laghdaithe OVA-H2Kb i gcealla shLimit-YUMM1.7 (Sonraí Leathnaithe Fíor. 5a). Rinneamar ionaclú shLimit YUMM1.7-cealla OVA agus shFluc-YUMM1.7-Cealla OVA isteach i lucha C57BL/6. Ansin, rinneamar fíocháin siadaí a scaradh agus braitheadh ​​​​H2Db agus OVA-H2Kb i gcealla meall. Thugamar faoi deara laghdú H2Db agus OVA-H2Kb i gcealla shLimit-YUMM1.7-OVA i gcomparáid le cealla rialaithe (Sonraí Leathnaithe Fíor. 5b-f). Léiríonn na sonraí go bhféadfadh tionchar a bheith ag Teorainn ar MHC-I agus MHC-I: léiriú antaigin in vivo. Chomh maith leis sin rinneamar cealla B16 rialaithe (sgNT) agus Teorainn-ghníomhachtú (sgLimit) a ionaclú i lucha C57/BL6 de chineál fiáin. De réir mar a bhíothas ag súil leis, laghdaigh sgLimit (gníomhachtú Teorainn) fás siadaí go mór (Fíor 3f). In éineacht leis seo bhí méadú ar líon na gcealla T a bhí insíothlú siadaí agus gníomhachtú (Fíor 3g, h). Samhail siadaí sách neamhíogair i leith imshuí PD-L123 is ea melanoma B16. Ag teacht leis seo, theip ar imshuí PD-L1 fás siadaí sgNT B16 i lucha a rialú. Suimiúil go leor, gníomhachtú Teorainn i meall B16 le freagra meall íograithe sgLimit ar imshuí PD-L1, mar a léirítear ag dul chun cinn siadaí laghdaithe (Fíor 3i). San iomlán, cuireann Teorainn le himdhíonacht siadaí agus íogaíonn freagairt imdhíonteiripe siadaí.

Gníomhaíonn LIMIT cis GBPanna chun MHC-I agus díolúine siadaí a threisiú

An chéad uair eile rinneamar iniúchadh ar an gcaoi a dtéann LIMIT i bhfeidhm ar MHC-I agus ar dhíolúine siadaí. Is féidir le LncRNAs slonn na ngéinte comharsanachta a rialáil go háitiúil24. Tá LIMIT logánaithe go dlúth le braisle géine, próitéiní ceangailteach guanylate (GBPanna), i ngéanóim daonna agus luiche (Sonraí Breisithe Fíor. 2a, b). D’fhiafraigh muid an bhféadfadh LIMIT slonn GBPanna a rialáil. Laghdaigh LIMIT tosta leibhéil na mRNAs GBP réamhtheachtaithe agus aibí (Fíor 4a), agus próitéiní GBP1-5 (Fíor 4b) i gcealla daonna A375 mar fhreagra ar chóireáil IFN. Tugann na sonraí le tuiscint go bhféadfadh LIMIT trascríobh GBPanna in CIS a chur chun cinn. Chun tacú leis an bhféidearthacht seo, laghdaigh Teorainn tosta léiriú Gbp2 i gcealla luch YUMM1.7 agus CT26 (Sonraí Breisithe Fíor 6a, b). Ina theannta sin, spreag gníomhachtú Teorainn CRISPR léiriú Gbp2 i gcealla B16 (Fíor 4c). Chun a thástáil an bhféadfadh LIMIT GBPanna a thrasrialú, chuireamar iachall ar LIMIT cDNA a shloinneadh i gcealla A375. Fuaireamar amach go raibh GBP1 agus fachtóirí imdhíonachta iolracha (lena n-áirítear IRF1, HLA-ABC, agus PD-L1) gan athrú ag ró-eisiúint LIMIT (Sonraí Leathnaithe Fíor. 6c). Mar sin, is lncRNA cis-ghníomhach é LIMIT atá in ann slonn GBP a aslú. I measc baill teaghlaigh Gbp, is ball den teaghlach Gbp is mó i gcealla luiche é Gbp2 (Sonraí Leathnaithe Fíor. 6d). Chun a thástáil an bhféadfaidh LIMIT MHC-I a rialáil trí GBPanna, bhunaíomar cealla cobhsaí YUMM1.7 a iompraíonn seileaic, shLimit, shGbp2, nó shLimit móide shGbp2. Fuaireamar amach, mar fhreagra ar spreagadh IFN, gur tháinig laghdú inchomparáide ar shLimit agus shGbp2 i slonn Gbp2 agus MHC-I; Theip ar an Teorainn agus Gbp2 a chur ina dtost ag an am céanna le slonn Gbp2 agus MHC-I a athrú freisin (Fíor 4d, e). Ina theannta sin, ní raibh a fhios againn an bhféadfadh ró-eisiúint GBP slonn MHC-I íosrialaithe-MHC-I a tharrtháil i Teorainn ag leagadh cealla meall. Chuireamar iachall ar GBP1 a chur in iúl i gcealla shLIMIT A375 (GBP1OE) agus chóireáileamar na cealla seo le IFN . Thugamar faoi deara gur tháinig laghdú ar léiriú MHC-I i gcealla rialaithe mar thoradh ar shLIMIT, ach ní i gcealla GBP1OE (Sonraí Leathnaithe Fíor. 6e). Ní raibh tionchar ag shLIMIT nó GBP1OE ar shloinneadh PD-L1 agus IRF1 (Sonraí Leathnaithe Fíor 6e, f). Mar sin, féadfaidh Teorainn slonn MHC-I a rialáil ar bhealach atá ag brath ar GBP. An chéad uair eile rinneamar ionaclú ar chealla YUMM1.7 le Teorainn agus/nó Gbp2-tosaithe i lucha C57BL/6. Mar an gcéanna ba é an toradh a bhí ar Theorainn Tosta agus GBPanna tosta ná fás siadaí níos tapúla i gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe, ach níor chuir tosta LIMIT agus GBPanna isteach ar dhul chun cinn siadaí a thuilleadh (Fíor 4f). Ina theannta sin, thugamar faoi deara laghdú ar líon na gceall T a bhí insíothlú siadaí agus gníomhachtú i siadaí shLimit, siadaí shGbp2, agus siadaí shLimit móide shGbp2 (Fíor 4g agus Sonraí Leathnaithe Fíor. 6g). Le chéile, cuireann LIMIT le slonn MHC-I agus díolúine siadaí ar bhealach atá ag brath ar GBP. Is géinte freagrúla IFN iad GBPanna i fibroblasts25 agus macrophages26 i gcomhthéacs cosanta óstaigh i gcoinne pataiginí. Mar sin féin, ní fios ról GBPanna in imdhíonacht ailse. Ós rud é gur laghdaigh GBPanna tosta léiriú MHC-I agus CD8+ gníomhachtaithe cille T (Fíor 4g agus Sonraí Leathnaithe Fíor. 6g), rinneamar hipitéisiú go bhféadfadh tionchar a bheith ag GBPanna ar éifeachtúlacht imdhíonteiripe ailse. Chun an hipitéis seo a thástáil, chuireamar Gbp2 ina thost i gcealla MC38, samhail siadaí atá íogair d’imdhíonteiripe23. De réir mar a bhíothas ag súil leis, laghdaigh tost Gbp2 i gcealla MC38 léiriú MHC-I ar chóireáil IFN (Fíor 4h), agus aisghaireadh den chuid is mó éifeachtúlacht imshuí PD-L1 (Fíor 4i). Tugann sé seo, mar aon leis na sonraí thuasluaite, le fios go bhfuil baint ag LIMIT agus GBPanna le héifeachtúlacht imdhíonteiripe ailse a rialú. Chun tacú leis an bhféidearthacht seo, léirigh anailís ar shonraí cliniciúla go raibh comhghaol idir leibhéil arda de léiriú GBP agus LIMIT, abairt MHC-I, agus freagra imdhíonteiripe (Sonraí Leathnaithe Fíor. 6h-j) in othair le melanoma14-17. Ina theannta sin, bhí baint dhearfach ag leibhéil léiriú GBP le maireachtáil othar (Sonraí Leathnaithe Fíor. 6k). Chun a bhailíochtú an bhfuil GBPanna ina ngéinte a fhreagraíonn do IFN i gcealla ailse, spreagamar cealla A375 le IFN agus cítocíní eile. Bhí tharlódh GBPs ag IFN , ach minimally tionchar ag cítocíní imdhíonachta eile ( Fíor. 4j ). Ansin, d'úsáideamar an córas CRISPR-Cas9 chun díriú ar na seichimh chomhroinnte i measc GBP1-5, agus ghin muid cealla A375 GBP 1-5 knockout (KO) (Fíor 4k). Thugamar faoi deara go ndearna IFN droch-spreagtha ar thrascríbhinní innealra géine MHC-I (Fíor 4l) agus próitéiní HLA-ABC dromchla i gcealla GBP KO A375 (Fíor 4m). Mar sin, gníomhaíonn LIMIT cis GBPanna chun innealra MHC-I agus díolúine siadaí a threisiú.

Gníomhaíonn GBPanna HSF1 chun MHC-I agus imdhíonacht siadaí a spreagadh

Chun a léiriú conas is féidir le GBPanna slonn MHC-I agus díolúine siadaí a rialáil, chuireamar iachall ar GBPanna a léiriú i gcealla A375. Suimiúil go leor, overexpression GBPs méadaithe daonna abairt MHC-I - mar a thaispeántar ag qRT-PCR (Fíor 5a), staining dromchla membrane (Fíor. 5b), agus blotting an Iarthair (Fig. 5c). Tugann na sonraí le fios go bhféadfadh GBPanna MHC-I a ghníomhachtú ag an leibhéal tras-scríbhinne. Go comhsheasmhach, mhéadaigh overexpression Gbp2 léiriú luch MHC-I i gcealla YUMM1.7 agus B16 (Fíor 5d). Chun fachtóir(í) trascríobh a rialaíonn MHC-I trí GBPanna a shainaithint mar fhreagra ar IFN , rinneamar réamh-mheastachán bithfhaisnéisíochta le PROMO27. Fuaireamar 8 bhfachtóir trascríobh athraithe ag IFN i gcealla A375, a d’fhéadfadh díriú ar HLA-ABC, HSPA5, CALR, agus TAP1. Chomh maith le roinnt fachtóirí aithnidiúla, ba é IFN (Sonraí Leathnaithe Fíor. 7a) a spreag gníomhaíocht HSF1 go mór. Trí thacair sonraí ChIP-seq a phróiseáil in ENCODE28, fuaireamar amach go raibh STAT1 agus HSF1 araon saibhrithe i dtionscnóirí géinte a bhaineann le MHC-I le patrúin ceangailteacha éagsúla (Sonraí Leathnaithe Fíor. 7b). Rinneamar measúnacht sliseanna le hantasubstaint frith-HSF1 i gcealla A375 IFN -spreagtha. Saibhríodh HSF1 i dtionscnóirí HLA-ABC, HSPA5, CALR, agus TAP1, ach ní HPRT1, rialú diúltach (Fíor 5e). Tugann na torthaí le fios go bhfuil HSF1 ina fhachtóir trascríobh do MHC-I. Is gnách go gcuirtear HSF1 i ngníomh trí bhriseadh próitéasais29. Chun a thástáil an gcuirfidh gníomhachtú HSF1 le slonn MHC-I, rinneamar cóireáil ar chealla A375 le liosta struis30: turraing teasa, strus ocsaídiúcháin (Luperox), coscairí aistriúcháin (puromycin), proteasome (MG-132), agus caomhnóir (17-AAG). Is díol spéise é gur spreag na strusóirí seo léiriú MHC-I go huilíoch - ach laghdaigh KRIBB11, coscaire HSF1, an éifeacht seo (Fíor 5f agus Sonraí Leathnaithe Fíor.7c). Mar sin, go ginearálta spreagann gníomhachtú HSF1 léiriú MHC-I. Chuireamar ceist an bhféadfadh GBPanna HSF1 a ghníomhachtú. D'eascair léiriú éigeantach GBPanna ar ghníomhaíocht luciferase de thuairisceoir HSF1 HSE-Luc (Fíor 5g), chomh maith le fosphorylation HSF1 (Fig. 5h). Tugann sé seo le tuiscint go bhféadfadh GBPanna HSF1 a ghníomhachtú. Theip ar IFN slonn HSPA5 a aslú i gcealla GBP-KO A375 (Fíor 5i). Mar sin, gníomhaíonn IFN HSF1 trí léiriú GBP a aslú. Ina theannta sin, d'aisghair cóireáil le KRIBB11, coscaire HSF1, an t-uasrialú MHC-I arna idirghabháil ag ró-eisbhrú GBP1 (Fíor 5j). Mar sin, spreagann GBPanna slonn MHC-I ar bhealach cleithiúnach HSF{1-. Chun an caidreamh meicníoch idir GBPs agus HSF1 a dhaingniú, chuireamar Gbp2 agus/nó Hsf1 i gcealla MC38 ina thost (Fíor 5k). Ar chóireáil IFN, laghdaigh tosta Gbp2 nó Hsf1 ina n-aonar léiriú MHC-I, ach ag an am céanna níor éirigh le Gbp2 agus Hsf1 slonn MHC-I a mhodhnú freisin (Fíor 5l). Chun ábharthacht fheidhmiúil na hidirghníomhaíochta idir GBPanna agus HSF1 i ndíolúine siadaí a léiriú, rinneamar cealla meall MC38 a ionaclú ag léiriú seileaic, shGbp2, shHSF1, nó shGbp2 móide shHSF1 i lucha C57BL/6. I gcomparáid le rialuithe shFluc, chuir Gbp2 ina thost agus Hsf1 ina thost ar fhás siadaí inchomparáide (Fíor 5m), agus laghdaigh líon na gcealla T a insíothlú siadaí agus a ghníomhachtú (Fíor 5n agus Sonraí Breisithe Fíor 7d). Ina theannta sin, theip ar Gbp2 agus Hsf1 ag an am céanna cur isteach ar fhás siadaí agus ar chealla T a insíothlú siadaí (Fíor 5m, n agus Sonraí Breisithe Fíor 7d). San iomlán, spreagann GBPanna léiriú MHC-I agus díolúine antitumor trí HSF1 a ghníomhachtú.

Tiomáineann ais LIMIT-GBP-HSF1 MHC-I agus díolúine siadaí

sochair cistanche do na fir-neartú chóras imdhíonachta

Rinneamar scrúdú ar an gcaoi a ngníomhaíonn GBPanna HSF1 chun slonn MHC-I agus imdhíonacht siadaí a athrú. Faoi ghnáthchoinníollacha, tá HSF1 monaiméireach bainteach le agus faoi chois ag chaperones, mar HSP9031. Má chuirtear isteach ar a n-idirghníomhaíocht ceadaítear bearrúchán agus carnadh HSF1 sa núicléas, rud a fhágann go ndéantar a spriocghéin a ghníomhachtú go trasnánach32. Rinneamar hipitéisiú go bhféadfadh GBPanna cur isteach ar an gcomhlachas idir HSP90 agus HSF1, rud a d'fhág go mbeadh gníomhachtú HSF1 ann. Chun an fhéidearthacht seo a thástáil, chuireamar cóireáil ar chealla A375 le IFN agus rinneamar Co-IP le hantasubstaint HSP90. Fuaireamar amach go raibh baint ag GBPanna endogenous IFN-spreagtha le HSP90 (Fíor 6a). Ina theannta sin, d'aistrigh muid cealla A375 le Flag-GBP1 exogenous agus rinneamar an turgnamh Co-IP le Brat-antasubstaint. Braitheadh ​​HSP90 sa táirge IP ó chealla aistrithe Flag-GBP1, ach ní cealla rialaithe veicteoir-aistrithe (Fíor 6b). Léirigh staining imdhíonfluaraiseachta go raibh GBPanna agus HSP90 comh-lonnaithe den chuid is mó sa cíteaplasma (Fíor 6c). Nuair a d'aistrigh muid cealla 293T le dáileoga méadaithe de phlasmid GBP1, laghdaíodh HSP a bhaineann le HSF1 ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 6d). Tugann na sonraí le fios go ndearna GBPanna idirghníomhú le HSP90 agus chuir an idirghníomhaíocht seo isteach ar an gcomhlachas idir HSF1 agus HSP90. Is caomhnóir é HSP90 le haghaidh fillte agus cobhsaíocht ilphróitéin, cheistigh muid an bhféadfadh GBPanna gníomhaíocht chaperone HSP90 a athrú. Cé gur chuir coscaire HSP90 an abairt de phróitéiní cliaint HSP90 faoi chois (cosúil le RAF1, BCL2, agus CDK433), theip ar overexpression GBPanna é sin a dhéanamh (Fíor 6e). Mar sin, idirghníomhaíonn GBPanna le HSP90, agus scaoileann siad HSP1 a bhaineann leis, ach ní athraíonn siad gníomhaíocht HSP90. Ansin, rinneamar scrúdú díreach ar ról HSF1 i léiriú MHC-I. Chuireamar cóireáil ar chealla A375 le IFN i láthair coscaire HSF1 KRIBB11. De réir mar a bhíothas ag súil leis, laghdaigh cóireáil le KRIBB11 léiriú mRNA IFN -spreagtha de ghéinte a bhaineann le MHC-I, lena n-áirítear HLA-ABC, TAP1, HSPA5, agus CALR, ach ní IRF1 (Fíor 6f). Suimiúil go leor, laghdaigh KRIBB11 slonn MHC-I IFN -spreagtha, ach ní raibh ach éifeacht íosta aige ar léiriú PD-L1 (Fíor 6g). Mar sin, is féidir le HSF1 slonn MHC-I IFN-spreagtha a rialáil gan an comharthaíocht IFN domhanda a athrú. Chun imscrúdú a dhéanamh an raibh MHC-I rialaithe ag HSF feidhmiúil, rinneamar B16-OVA a shaothrú le cealla OT-I i láthair KRIBB11 agus IFN . Chuir KRIBB11 cosc ​​ar léiriú IFN-spreagtha ar MHC-I atá faoi cheangal OVA (Sonraí Breisithe Fíor. 8a). Ag teacht leis seo, chuir KRIBB11 éifeachtaí cíteatocsaineacha cille-idirghabhála OT-I ar B16-OVA (Sonraí Breisithe Fíor. 8b) faoi chois freisin. Chun ár gcuid breathnuithe a leathnú chuig siadaí breise, chuireamar Hsf1 ina thost le shHsf1 i gcealla YUMM1.7 agus CT26. Mar thoradh ar chiúnas Hsf1 tháinig laghdú ar léiriú MHC-I i gcealla YUMM1.7 (Fíor 6h, i) agus CT26 (Sonraí Leathnaithe Fíor. 8c) mar fhreagra ar spreagadh IFN. I gcealla YUMM1.7, theip ar chiúnas HSF1 cur isteach ar léiriú Gbp2 mar fhreagra ar IFN (Fíor 6h), rud a léiríonn nach sprioc-ghéine HSF1 é Gbp2. I gcealla shHsf1 YUMM1.7, theip ar KRIBB11 léiriú MHC-I IFN -spreagtha (Sonraí Leathnaithe Fíor. 8d). Tugann na sonraí le fios gur fheabhsaigh HSF1 slonn MHC-I mar fhreagra ar IFN , agus is é Hsf1 sprioc mheicníoch KRIBB11 chun MHC-I a rialáil. Ós rud é go ndearna HSF1 difear do léiriú MHC-I, rinneamar hipitéisiú go raibh díolúine in vivo in vivo rialaithe ag HSF1 i gcoinne meall. Chun an hipitéis seo a thástáil, rinneamar cealla meall rialaithe agus shHsf1 YUMM1.7 a ionaclú isteach i lucha NSG agus C57BL/6. Thugamar faoi deara gur mhoilligh tost HSF1 go páirteach dul chun cinn siadaí YUMM1.7 i lucha NSG (Fíor 6j), ag tacú leis gur chabhraigh Hsf1 le hoiméastáis próitéine agus dul chun cinn siadaí a choinneáil sa tsamhail imdhíonachta-easpa. Mar sin féin, chuir Hsf1 tost go mór le fás siadaí YUMM1.7 i lucha fiáine C57BL/6 (Fíor 6k). Tugann na sonraí le fios go bhféadfadh Hsf1 imdhíonacht fhrith-meall a chur chun cinn sa mhúnla atá inniúil ar imdhíonacht. Chun tacú leis seo, bhraitheamar laghdú ar na céatadáin de chealla CD3+, Ki67+, IFN +, agus TNF + T (Fíor 6l agus Sonraí Leathnaithe Fíor. 8e) i na siadaí shHsf1 YUMM1.7 i gcomparáid le rialuithe scramble shFluc. Ina theannta sin, rinneamar cealla shHsf1 CT26 a ionaclú isteach i lucha fiáine de chineál BALB/c. Arís, mar thoradh ar chiúnas Hsf1 tháinig fás siadaí CT26 feabhsaithe (Sonraí Leathnaithe Fíor. 8f). In éineacht leis seo tháinig laghdú ar na céatadáin de chealla CD3+ siadaí-insíothlaithe, Ki67+, IFN +, agus TNF + T (Sonraí Breisithe Fíor 8g, h). San iomlán, tugann na sonraí le fios go dtiomáineann an ais GBP-HSF1 slonn MHC-I agus díolúine antitumor. Chun Hsf1 agus LIMIT a nascadh go meicniúil, chuireamar LIMIT ina thost i gcealla an A375. Laghdaigh LIMIT tosta gníomhaíocht tras-scríofa HSF1 mar fhreagra ar IFN , arna chinneadh ag measúnacht tuairisceora luciferase (HSE-luc) (Fíor 6m). Tugann na sonraí le fios go gcuireann LIMIT le gníomhachtú HSF1 mar fhreagra ar IFN . Chun baint féideartha HSF1 a thástáil in ionduchtú MHC-I trí mheán LIMIT, spreagamar LIMIT trí ghníomhachtú CRISPR i gcealla B16, i láthair KRIBB11. Thugamar faoi deara gur aisghaireadh MHC-I upregulation, a tharlódh de bharr LIMIT-ghníomhachtú, ag coscaire HSF1 (Fíor 6n). Tugann na sonraí le fios go neartaíonn LIMIT slonn MHC-I ar bhealach atá ag brath ar HSF. Ar deireadh, rinneamar anailís ar nasc i measc LIMIT, GBPs, agus HSF1 i gcomhthéacs léiriú MHC-I, díolúine meall, agus imdhíonteiripe in othair a bhfuil ailse orthu. Léirigh anailís chliniciúil go raibh comhghaol idir géinte comharthaíochta HSF{1-le slonn MHC-I, insíothlú cille T CD8+, agus marthanacht othar (Sonraí Breisithe Fíor. 9a-c). I staidéar imshuí seicphointe imdhíonachta in othair le carcinoma cille basal34, nocht anailís ar sheicheamhú RNA aonchealla 2 bhraisle siadaí; bhí braisle siadaí amháin níos íogaire maidir le cóireáil frith-PD-1 mar a léirigh daonra siadaí laghdaithe go mór (Sonraí Leathnaithe Fíor 9d). Rud suimiúil, léirigh an bhraisle meall íogair seicphointe imdhíonachta seo leibhéil níos airde de ghéinte comharthaíochta HSF chomh maith le hinnealra géine MHC-I (Sonraí Leathnaithe Fíor. 9e). Thairis sin, i staidéar imshuí seicphointe imdhíonachta in othair le melanoma35, léirigh anailís próitéamaíoch go raibh léiriú próitéine GBPanna, géinte comharthaíochta HSF1, agus MHC-I níos airde i bhfreagróirí cliniciúla ná iad siúd i neamhfhreagróirí (Sonraí Leathnaithe Fíor. 9f). Ina theannta sin, thugamar faoi deara comhghaol dearfach idir GBP1 agus HSF1-géinte comharthaíochta in ailsí daonna (Sonraí Leathnaithe Fíor. 9g). Tacaíonn na sonraí a d'fhéadfadh an ais LIMIT-GBP-HSF1 léiriú MHC-I a ghníomhachtú, agus i bhfabhar díolúine frith-meall (Sonraí Leathnaithe Fíor. 10).

Plé

Luibh Sínis cistanche plandaí-Antitumor

Tá 30,000-60,000 lncRNAs ag daoine. Mar sin féin, níl tuiscint mhaith fós ar fhéiniúlachtaí agus ar fheidhmeanna bitheolaíocha fhormhór mór na lncRNAnna féideartha seo. I réimse na bitheolaíochta ailse, rinneadh staidéar den chuid is mó ar lncRNAs sa mhúnla imdhíonachta-easnamhach, rud a fhágann bearna eolais de lncRNAs i gcomhthéacs an chórais imdhíonachta. Tuairiscítear go mbíonn tionchar ag dornán de lncRNAnna ar fheidhm na gceall imdhíonachta36,37, ar dhul chun cinn ailse, agus ar éifeachtúlacht ceimiteiripe38,39. Mar sin féin, tá sé fós gan freagra an bhfuil baint ag lncRNAanna sonracha le himdhíonacht frith-tumor agus le freagairt imdhíonteiripe. Sa staidéar seo, tá sé aitheanta againn gur lncRNA freagrúil IFN nár aithníodh roimhe seo é LIMIT i gcealla daonna agus lucha araon. Is féidir le LIMIT léiriú MHC-I agus MHC-II a aslú, freagairt imdhíonachta siadaí T cille-idirghabhála a chur chun cinn agus éifeachtúlacht imdhíonteiripe a fheabhsú. Mar sin, is lncRNA imdhíon-ghineach siadaí nach raibh aithne air roimhe seo LIMIT. Tá ról lárnach ag cosán comharthaíochta IFN maidir le freagairt theiripeach ar imdhíonteiripe ailse40 a chinneadh trí mheicníochtaí iolracha19,20,41,42. Cuireann sócháin ghéiniteacha i ngéinte comharthaíochta IFN le frithsheasmhacht in aghaidh imshloic seicphointí in othair a bhfuil ailse orthu43-48. Mar sin féin, is féidir le comharthaíocht IFN slonn coisctheach PD-L149 a spreagadh. Mar sin, tá sé oiriúnach príomhghéine comharthaíochta IFN a aithint agus a dhíriú a dhéanann idirghabháil roghnach ar imdhíonacht frith-meall, seachas imghabháil imdhíonachta siadaí. Ag teacht leis an nóisean seo, léirímid go ndéanann LIMIT idirghabháil ar uasrialáil MHC-I agus MHC-II, ach nach ndéanann sé difear do léiriú PD-L1 mar fhreagra ar IFN . Mar sin, d’fhéadfadh LIMIT a bheith suite go sainiúil le bheith ina sprioc imdhíon-ghineach d’imdhíonteiripe ailse. Tá roinnt straitéisí molta chun díriú go teiripeach ar lncRNAs pataigineacha50. Mar sin féin, tá sé dúshlánach i gcónaí conas leibhéil na lncRNAí tairbhiúla a ardú. De réir mar a fheidhmíonn lncRNAnna cis-gníomhach go háitiúil, d’fhéadfadh sé nach mbeifear in ann na lncRNAnna seo a chur in iúl go beacht51. Cé go bhféadfadh lncRNAnna trasghníomhaithe feidhmiú trí struchtúir thánaisteacha ar leith, d'fhéadfadh sé nach mbeadh ró-léiriú na n-lncRNAs seo in ann a struchtúir nádúrtha a ghiniúint mar gheall ar chapairíní RNA cuí52 a bheith in easnamh. Trí úsáid a bhaint as straitéis gníomhachtaithe CRISPR faoi threoir RNA22, chuireamar i ngníomh go díreach slonn LIMIT i gcealla meall i múnlaí réamhchliniciúla. Is féidir le gníomhachtú CRISPR LIMIT faoi threoir RNA léiriú MHC-I siadaí a thiomáint agus teiripe imshuí seicphointí a neartú. Ós rud é go dtarlaíonn caillteanas sínithe géine MHC-I agus IFN go minic i siadaí daonna, molaimid gur féidir le gníomhachtú CRISPR ar lncRNAs tairbhiúla, mar LIMIT, léiriú MHC-I meall a tharrtháil agus a bheith ina chur chuige teiripeach féideartha. Agus sinn sa tóir ar an meicníocht trína gcuireann LIMIT isteach ar dhíolúine siadaí, chuireamar in iúl dúinn go ndíríonn LIMIT ar GBPanna ar bhealach cis. Tá ról ag GBPanna san imdhíonacht dhúchasach26,53,54. Léiríonn lucha nach bhfuil an cnuasach iomlán Gbps iontu drochfhreagairt frith-Tocsoplasma gondii55. Mar sin féin, roimh ár gcuid oibre, ní raibh an nasc meicniúil idir LIMIT agus GBPanna, agus feidhm bhitheolaíoch GBPanna in imdhíonacht siadaí agus imdhíonteiripe cinnte cinnte. Tá sé faighte amach againn go bhfuil GBPanna ag teastáil le haghaidh slonn MHC-I siadaí spreagtha ag IFN, éifeachtúlacht marú cille T CD{8+, agus teiripe seicphointe éifeachtach. Tugann na sonraí le fios gur géinte sprice féideartha iad GBPanna chun imdhíon-ghineacht siadaí a threisiú. Fuaireamar amach gan choinne go ngníomhaíonn GBPanna HSF1 chun léiriú géine a bhaineann le MHC-I agus MHC-I a spreagadh. Tá comhghaol idir gníomhachtú HSF1 arna idirghabháil ag coscairí HSP90 agus rialú siadaí i múnlaí imdhíon-inniúlachta. Mar sin féin, in ainneoin trialacha cliniciúla iolracha le coscairí HSP90, níl aon cheann de na coscairí HSP90 measúnaithe ceadaithe ag an FDA le haghaidh teiripe ailse, go dtí seo. Ardaíonn an fhíric díomá seo an fhéidearthacht go bhféadfadh coscairí HSP90 a bheith díobhálach d’imdhíonacht siadaí. D’fhéadfadh tocsaineacht na gcoscóirí HSP90 seo scrios roinnt próitéiní cliant HSP90 a chothú, mar RAF1 agus BCL2, a d’fhéadfadh a bheith ríthábhachtach d’iomadú agus do mharthanas cille éifeachtóra T59,60. Ós rud é go n-idirghníomhaíonn GBPanna le HSP90 agus go n-eisíonn HSP90-maisithe HSF1, ach nach n-athraíonn siad gníomhaíocht HSP90, tugann ár gcuid sonraí le fios go bhféadfadh sé gur straitéis shábháilte agus neamhthuigthe roimhe seo é díriú ar GBPanna chun HSF1 a ghníomhachtú le haghaidh imdhíonteiripe ailse. Go hachomair, sainaithnímid LIMIT mar lncRNA imdhíon-ghineach ailse nach raibh ar eolas roimhe seo. Tugann ár gcuid oibre le fios gur féidir le díriú ar ais comharthaíochta LIMIT-GBP-HSF1 slonn agus feidhm MHC-I a shábháil, rud a chuireann cur chuige imdhíonteiripeach ailse atá tuar dóchais inti.

Modhanna

Turgnaimh ainmhithe

NSG baineann idir sé agus ocht seachtaine d'aois (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, Stoc# 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, Stoc# 000664), BALB/c (BALB Fuarthas /cJ, Stoc# 000651), agus lucha OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stoc# 003831) ó Shaotharlann Jackson. Coinníodh gach lucha faoi choinníollacha saor ó phataigin. Tá teocht rialaithe (18-23 céim ), taise (40-60%) sa seomra ainmhithe, agus timthriall 12 solas/12 dorcha. Cuireadh cealla YUMM1.7 (1 × 105 ), CT26 (1 × 105 ), MC38 (2.5 × 106 ), agus B16 (1 × 105 ) isteach go subcutaneously isteach sa chliath dheis de na lucha. Le haghaidh cóireála frith-PD-L1 sa mhúnla MC38, riaradh 5 mg/kg frith-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) agus antasubstaint rialaithe (InVivoMAb, LTF-2) go hinimirceach ar laethanta 6, 9, agus 12 ionaclú tar éis meall. Le haghaidh cóireála frith-PD-L1 sa mhúnla B16, riaradh 5 mg/kg frith-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) agus antashubstaint rialaithe (InVivoMAb, LTF-2) go hinimirceach ar an lá 0, 3, 6, 9, 12 agus 15 tar éis ionaclaithe siadaí. Tomhaiseadh trastomhais meall ag baint úsáide as calipers. Ríomhadh toirt meall de réir Fad × Leithead × Leithead/2. Rinneadh staidéir ar ainmhithe faoi cheadú an Choiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe ag Ollscoil Michigan (PRO00008278). Comhlíonann an staidéar na rialacháin eitice ábhartha ar fad maidir le taighde ainmhithe. In aon cheann de na turgnaimh níor sháraigh méid siadaí xenograft 2 cm in aon toisí, agus ní raibh dian-luas bhoilg ar aon ainmhí (Méadú ar mheáchan coirp bunaidh 10% nó níos mó ná nó cothrom leis). Roghnaíodh méid an tsampla bunaithe ar réamhshonraí. Tar éis ionaclú siadaí, rinneadh lucha a randamach agus a shannadh do ghrúpaí éagsúla le haghaidh cóireála.

Imoibrithe

Ceannaíodh KRIBB11 agus 17-AAG ó Cayman Chemical. Ba ó Sigma-Aldrich iad MG-132, Puromycin, agus Luperox. IFN daonna athchuingreach (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ Tháinig 9}} (206-IL), agus luch IFN (485-MI) ó T&F.

Plasmids

Chun HSE-LUC a ghiniúint, rinneadh seichimh DNA a chomhfhreagraíonn d’eilimintí turrainge teasa (HSE) a shintéisiú, a annealadh, agus a ligeadh isteach i bplassid bhunúsach PGL (Promega). Bronntanas ó Stuart Calderwood (Addgene #32537) a bhí i FLAG-HSF1. Le haghaidh léiriú iachall ar GBP1 daonna, GBP2, GBP5, agus luch Gbp2, méadaíodh na sraitheanna códaithe faoi seach PCR ón cDNA a ghintear ó chealla A375 réamhchóireáilte IFN nó cealla B16 agus ina dhiaidh sin cuireadh isteach iad i plasmid PCI-Flag. Ullmhaíodh PCI-Flag plasmid tríd an seicheamh Kozak seo a leanas móide Clib Bratach móide 5 × seicheamh Glycine a chur isteach sa plasmid PCI-neo (Promega) idir NheI agus XhoI. Chun LIMIT daonna agus LIMIT LUACH a laghdú, dearadh agus cuireadh shRNAs isteach i plasmid PLKO.1 (Addgene #10879). D'fheidhmigh an shRNA a dhírigh ar firefly luciferase (shFluc) mar rialú diúltach. Chun díriú ar an réigiún tionscnóra Teorann do ghníomhachtú CRISPR, dearadh sgRNAs (sgLimit) agus cuireadh isteach i phU6- sgRNA plasmid (Addgene #53188). Bhí an sgRNA neamhdhírithe (sgNT) ina rialú diúltach. Chun na suíomhanna ceangailteacha STAT1/IRF1 sa tionscnóir LIMIT a scriosadh, rinneadh scRNAs péireáilte (psgLIMIT) a dhearadh agus a chur isteach sa plasmid PX459 (Addgene #48139). Chun luch Hsf1 agus Gbp2 a laghdú, dearadh agus cuireadh shRNAs isteach i plasmid PLKO.1 (Addgene #10879). Chun GBP1-5 a bhaint amach, rinneadh sgRNA a dhearadh agus a chur isteach sa plasmid PX459 (Addgene #48139). Tá na seichimh sprice liostaithe i dTábla Forlíontach 7. Tá na seichimh primer liostaithe i dTábla Forlíontach 8 .

Cultúr na Cille

Líne chill mheileanóma dhaonna A375 (CRL-1619), línte cille meileanóma na luiche, B16-F0 (CRL-6322) agus YUMM1.7 (CRL-3362 ), líne cille ailse drólainne luiche CT26 (CRL-2638), agus 293T (CRL-3216) ón mBailiúchán Cultúir Cineál Meiriceánach (ATCC). Úsáideadh líne chill ailse drólainne luiche MC38 roimhe seo i saotharlann Zou23,48. B16- Bunaíodh cealla OVA mar a tuairiscíodh roimhe seo42. Gineadh línte cille scriosta tionscnóra A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO, agus A375 LIMIT sa staidéar seo. Rinneadh tástáil rialta ar gach líne cille le haghaidh éillithe mycoplasma agus deimhníodh go raibh sé diúltach don mhiocoplasma. Saothraíodh cealla i meán RMPI (Gibco #11875) arna fhorlíonadh le 10% FBS, seachas cealla A375 agus 293T, saothraíodh an dá líne dheireanacha i DMEM (Gibco #11965) arna fhorlíonadh le 10% FBS. Coinníodh na cealla go léir ag 37 céim agus 5% CO2. Le haghaidh turraing teasa, cuireadh cealla isteach i gorlann ag 43 céim agus 5% CO2 ar feadh 2 uair an chloig. Chun línte cille knockdown a ghiniúint, táirgeadh cáithníní lentiviral trí aistriú PLKO.1 shRNA plasmid le psPAX2 (Addgene #12260) agus pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) isteach i gcealla 293T, agus ina dhiaidh sin aistrigh isteach i meall. cealla le polabréine (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) thar oíche. 48 uair an chloig tar éis aistrithe, roghnaíodh cealla le puromycin (1-2 ug/ml) ar feadh 2 sheachtain breise. Chun línte cille scoite amach a bhunú, aistríodh plasmids PX459- sgRNA isteach i gcealla meall ar feadh 2 lá agus roghnaigh puromycin (1-2 ug/ml) iad ar feadh 2 lá breise. Ansin caolaíodh na cealla go sraitheach agus cuireadh síolú isteach i 96 pláta tobair. Tar éis 2-3 seachtainí, rinneadh coilíneachtaí aonchealla a dhícheangal agus a athphlátáil ina 6 phláta toibreacha. Tar éis comhluadar na gceall, rinneadh leath de na cealla a bhaint agus a bhailíochtú le haghaidh éifeachtúlacht snoite amach (KO) trí bhlotáil an Iarthair. Chun an córas gníomhachtaithe CRISPR a chur i bhfeidhm chun Teorainn luiche a ghníomhachtú, aistríodh phU6-sgRNAs in éineacht le SP-dCas{9-VPR (Addgene #63798) isteach i gcealla B16. Rinneadh gach aistriú le lipofectamine 2000 (Thermofisher) ag cóimheas de 1 ug plasmid: 2 ul transfection regent. Cinneadh dáileog an aistrithe trí thoirtmheascadh.

Measúnacht gníomhaíochta Luciferase

Aistríodh cealla A375 le HSE-LUC agus PRL-SV40P (Addgene #27163) ar feadh 24 uair, mar aon le PCI-neo (veicteoir) nó GBP1, GBP2 ar feadh 48 uair an chloig. Aistríodh cealla A375 shFluc nó A375 shLIMIT le HSE-LUC agus PRL-SV40P (Addgene #27163) ar feadh 24 uair agus ansin cuireadh cóireáil orthu le IFN ar feadh 48 uair sa bhreis. Tomhaiseadh gníomhaíocht Luciferase le haghaidh firefly luciferase (HSE-LUC) agus renilla luciferase (PRL-SV40P) leis an gCóras Measúnaithe Tuairisceora Dual-Luciferase (Promega). Gnáthaíodh gníomhaíocht choibhneasta firefly luciferase le gníomhaíocht renilla luciferase.

Staining dromchla agus anailís chitiméadrachta sreafa (FACS)

Trypsinized cealla agus nite le maolán MACS (PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA). Rinneadh staining dromchla trí na hantasubstaintí seo a leanas a chur leis an bhfionraí cille i maolán 50 ul MACS: frith-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), frith-H2-Db (KH95, BD Bitheolaíochtaí), frith-H1Dd ({34-2-12, BD Biosciences), frith-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, rBhitheolaíocht), agus frith-PD-L1 (MIH1, BD Bitheolaíochtaí). Tar éis gortha ar feadh 30 nóiméad, nitear na cealla le maolán MACS agus rinneadh anailís orthu ar chitoiméadar sreafa BD Fortessa.

Anailís chainníochtúil PCR (qPCR).

Rinneadh RNA iomlán a leithlisiú ó chealla trí íonú colúin (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) le cóireáil DNase. Rinneadh cDNA a shintéisiú trí úsáid a bhaint as RevertAid First Strand cDNA Sintéise Kit (Thermo Fisher Scientific) le primers heicseamair randamach. Rinneadh PCR Cainníochtúil (qPCR) ar cDNA ag baint úsáide as Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ar Chóras PCR Fíor-Ama StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific). Rinneadh cainníochtú ar shloinneadh géine ag baint úsáide as na primers atá liostaithe i dTábla Forlíontach 8. Ríomhadh athruithe fillte i slonn mRNA ag an modh ΔΔCt ag baint úsáide as ACTB mar rialú inghineach. Cuirtear torthaí in iúl mar athrú fillte trí normalú chuig na rialuithe.

Blotting thuaidh

Rinneadh anailís blot thuaidh le 10 ug de RNAanna iomlána ullmhaithe ó chealla A375 réamhchóireáilte IFN , IFN , agus TNF. Réitíodh RNAanna trí leictreafóiréis glóthach agarose (Ambion) a dhínádúrú agus aistríodh go seicní Hybond-XL (GE Healthcare). Braitheadh ​​LIMIT ag baint úsáide as tóireadóirí DNA lipéadaithe digoxin le DIG Northern Starter Kit (Roche). Tá na seichimh taiscéalaithe atá dírithe ar LIMIT liostaithe i dTábla Forlíontach 7.

Aimpliú Mear ar chríochnaíonn cDNA (RACE)

Rinneadh RACE chun foircinn cDNA na Teorainn dhaonna nó na Luiche a shainaithint le SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech). Tá na primers do RACE liostaithe i dTábla Forlíontach 8.

Clón de TEORANTA lán-fhad

Tar éis na seichimh deiridh cDNA a fháil, rinneadh PCR a aimpliú LIMIT lán-fhad agus cuireadh isteach i plasmid PCI-neo idir XhoI agus NotI. Tá na primers clón le haghaidh LIMIT daonna agus Teorainn luiche liostaithe i dTábla Forlíontach 8.

Codánú cille le haghaidh RT-PCR

Bailíodh cealla A375 réamhchóireáilte IFN ó phlátaí 15 cm trí scríobadh agus nite uair amháin le PBS fuar. Rinneadh cealla trí lártheifneoiriú ag 700 g ar feadh 5 nóiméad agus lísíodh iad le maolán lysis hypotonic (10 mM Tris (pH 7.5), NaCl 10 mM, 3 mM MgCl2, 0.3% (toirt/toirt) NP{{ 12}}, 10% (toirt/toirt) gliocról) chun an codán cíteaplasmach a bhailiú. Fuarthas RNA cíteaplasma trí fhrasaíocht eatánóil thar oíche ag −20 céim , agus ina dhiaidh sin ath-eastóscadh ag baint úsáide as imoibrí TRIZOL. Rinneadh an millín núicléach a bhí fágtha a ní trí huaire leis an maolán lysis hypotonic, agus eastóscadh ina dhiaidh sin le himoibrí TRIZOL de réir threoracha an mhonaróra. Trascríobhadh RNAanna scoite ó chodáin núicléacha nó cíteaplasmacha agus RT-PCR le haghaidh LIMIT leis na primers léirithe. Baineadh úsáid as an ACTB neamhsplicáilte nó aibí mar rialuithe do RNA núicléach nó cíteaplasma. Tá na primers do ACTB liostaithe i dTábla Forlíontach 8.

Blotting an Iarthair

Bhí nite cealla i PBS fuar agus lysed i maolán lysis 1 × RIPA (Pierce) le 1 × coscaire protease (Pierce). Goradh lysates ar oighear ar feadh 10 nóiméad agus glanta trí lártheifneoiriú ag 15,000g ar feadh 15 nóiméad. Rinneadh tiúchan próitéine a chainníochtú trí úsáid a bhaint as trealamh measúnaithe próitéin BCA (Thermo Fisher). Meascadh próitéin tríocha microgram le maolán samplach (Thermo Fisher) le -ME agus dínádúraithe ag 95 céim ar feadh 5 nóiméad. Scar SDS-PAGE an sampla agus aistríodh é go Membrane Nitrocellulose (Bith-rad). Cuireadh bac ar scannáin le 5% w/v bainne tirim neamhshaille agus goradh iad le hantasubstaintí príomhúla thar oíche ag 4 céim agus antasubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha HRP (CST) ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra. Braitheadh ​​an comhartha ag baint úsáide as Soiléire agus Soiléire Max Western ECL Blotting Substráit (Bith-Rad) agus a gabhadh ag baint úsáide as Córas Íomháú ChemiDoc (Bith-Rad). Seo a leanas na hantasubstaintí: GBP frith-dhaonna1-5 (Santa Cruz, 166960, 1: 500), frith-HSF1 (CST, 12972, 1: 1,000), frith-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1: 1000), frith-GBP1 (Proteintech, 15303, 1: 1,000), frith-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1: 1,000) , frith-HSP90 (CST, 4877, 1: 1,000), frith-HSPA5 (CST, 3177, 1: 1,000), frith-STAT1 (CST, 9172, 1: 1 ,000), frith-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1: 1000), frith-RAF1 (CST, 9422, 1: 1000), frith-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), frith-CDK4 (CST, 12790, 1: 1000), agus frith-GAPDH (Proteintech, 60004, 1: 5,000). Maidir le blotáil an Iarthair MHC-I daonna, dínádúraíodh lysáití cille iomlána sa mhaolán samplach gan -ME (neamh-laghdaithe) chun na droichid déshulfíde agus comhfhoirmiú na bpróitéiní a bhí le brath ag antashubstaint frith-HLA-ABC a choinneáil (W6/32). , Novus Biologicals, 64775, 1: 1,000).

Comh-imdhíon-fhuascadh (Co-IP)

Bailíodh cealla le maolán lysis IP (Pierce, 87787) móide coscaire protease. Socraíodh tiúchan próitéine le trealamh measúnaithe próitéin BCA. Cuireadh 200-500 samplaí próitéine ug le 1-3 ug antashubstaintí príomhúla frith-HSP90 (Proteintech, 13171) nó frith-HSF1 (CST, 12972), agus gortha iad le racáil mhín ag 4 céim thar oíche. Ansin, goraíodh samplaí a thuilleadh le 20 ul Próitéin A/G PLUS-Agarose (Santa Cruz, sc-2003) ar feadh 2 uair ag 4 chéim; agus lártheifneoirithe ag 7500 × g ar feadh 30 soicind ag 4 chéim . Nite millíní cille 4 huaire le maolán lysis IP, athchuireadh iad le maolán sampla 40 ul 2 × le -ME, agus téite ar feadh 5 nóiméad ag 95 céim . Rinne blot an Iarthair anailís ar na samplaí próitéine dínádúraithe. Maidir le Brat IP, goraíodh lysáití cille le Glóthach Cleamhnas M2 FRITH-BHRAITEACH EZview Red (Sigma Aldrich) agus nite, dínádúraithe, agus rinneadh anailís orthu mar a thuairiscítear thuas.

Staining imdhíonfluaraiseacht

Cóireáladh cealla A375 atá suite ar dhuillíní clúdaigh le IFN ar feadh 24 uair. Tar éis níocháin 2 uair le PBS, socraíodh cealla le 4% PFA ar feadh 15 nóiméad agus nite 2 uair le PBS ar feadh 5 nóiméad an ceann. Ansin, tréscaoiltear na cealla le 0.5% triton x-100 i PBS ar feadh 10 nóiméad agus rinsíodh iad 2 uair le PBS ar feadh 5 nóiméad an ceann. Cuireadh bac ar antaiginí le 10% de ghnáthshéiream gabhar i PBS ar feadh 30 nóiméad. Ansin, cuireadh antashubstaintí príomhúla leis ag caoluithe 1:50 d’antashubstaint frith-daonna GBP1-5 luiche (Santa Cruz, 166960) nó antashubstaint frith-dhaonna HSP90 coinín (CST, 4877), agus gor iad ag 4 céim thar oíche. Ina dhiaidh sin, nite agus gor na cealla le caoluithe 1:500 d’antasubstaint frith-luiche gabhair thánaisteach lipéadaithe Qdot 605 (Thermo Fisher, Q11002) nó AF488-antasubstaint frith-choine gabhair tánaisteach lipéadaithe (Thermo Fisher, A11034), agus ansin gléasta ar shleamhnáin ghloine le himoibrí ProLong Gold ina bhfuil DAPI. Bailíodh íomhánna fluaraiseachta comhfhócasach ag baint úsáide as cuspóir ola-tumtha 63X (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM confocal).

Imdhíon deascadh crómatin (ChIP)

Rinneadh sliseanna le crómatán tras-nasctha ó chealla A375 cóireáilte IFN agus ceachtar antashubstaint HSF1 (CST, 12972) nó Gnáth Coinín IgG (CST, 2729), ag baint úsáide as Simple ChIP Plus Einsímeach Chromatin IP Kit (Coirníní Maighnéadacha) (CST, 9005). Rinneadh an DNA saibhrithe a chainníochtú trí PCR fíor-ama ag baint úsáide as na primers atá liostaithe i dTábla Forlíontach 8. Léiríodh an méid DNA inmunprecipitated i ngach sampla mar chomhartha i gcoibhneas le méid iomlán an chromatin ionchuir, atá comhionann le 1.

Aonrú cille OT-I agus comhchultúr le cealla meall OVA+

Ceannaíodh lucha C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) (stoc JAX #003831) ó The Jackson Laboratory. Rinneadh an spleen a homogenized, agus cuireadh cealla aonair ar fionraí i 2 ml Maolán Lysis Cille Fola Dearg (Sigma-Aldrich) ar feadh 1 nóiméad. Rinneadh na splenocytes a mhilleadh, a ní, agus a athchur ar fionraí ag 2 × 106 cill in aghaidh an ml i meán cultúir RPMI ina raibh 1 ug/ml OVA257-264 peiptíd, 5 ug/ml luch athchuingreach IL-2, agus 40 μM { {15}} mearcapteeatánól. Goradh na cealla ag 37 céim ar feadh 5 lá. Chun comhchultúr na gceall meall OT-I agus OVA+ a shocrú, bailíodh splenocytes tar éis 5-lá gníomhachtaithe. Glanadh cealla OT-I trí úsáid a bhaint as CD luiche EasySep8+ T Cell Isolation Kit (Stemcell). B16-Cuireadh síolú cealla OVA thar oíche. Cuireadh cealla OT-I isteach sa chultúr ansin ag cóimheasa éagsúla. Bailíodh na cealla go léir trí trypsinization agus rinneadh anailís orthu de réir cítoiméadracht sreafa (FACS).

Cealla dendritic díorthaithe smeara (BMDCanna) agus macrophages (BMDMs)

Rinneadh smeara a leithlisiú ó femurs luiche C57BL/6 agus saothraíodh é i meán iomlán RPMI1640 le 20 ng/ml GM-CSF (T & F). Goradh cealla ag 37 céim agus 5% CO2. Cuireadh meán 10 ml breise le 20 ng/ml GM-CSF leis ar an 3ú lá. Ar an lá 7, baineadh cealla neamhfhorleathana agus scaoilte sa chultúir trí níocháin mhín le PBS, agus breithníodh BMDCanna orthu. Measadh gur BMDManna na cealla greamaitheacha.

Próifíliú cealla imdhíonachta intratumoral

Chun cealla T intratumoral agus léiriú cítocine éifeachtóra cille T a chainníochtú, ullmhaíodh fionraí aonchealla ó fhíocháin siadaí úra trí dhul go fisiciúil trí strainers cille 1{00 μm. Saibhríodh cealla imdhíonachta trí lártheifneoiriú grádán dlúis. Le haghaidh staining cytokine, goraíodh cealla imdhíonachta intratumoral i meán cultúir RPMI ina raibh PMA (5 ng/ml), ionomycin (500 ng/ml), brefeldin A (1: 1,000), agus Monessen (1: 1). ,000) ag 37 céim ar feadh 4 huaire. 2-3 ul de Frith-CD45 (30-F11, BD Bitheolaíochtaí), frith-CD90 (53-2.1, BD Bitheolaíochtaí), frith-CD3 (145-2C11, BD Cuireadh antasubstaintí frith-CD4 (RM4-5), BD Biosciences), agus frith-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) leis ar feadh 20 nóiméad le haghaidh staining dromchla. Ansin nitear na cealla agus cuireadh ar fionraí iad i 1 ml de thuaslagán Deisigh/Perm (BD Bitheolaíochtaí) a ullmhaíodh go húr ag ceithre chéim thar oíche. Tar éis iad a ní le maolán Perm/Wash (BD Biosciences), rinneadh na cealla a dhathú le 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), frith-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), agus frith-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) ar feadh 30 nóiméad, nite, agus seasta i 4% formaildéad (Sigma Aldrich). Léadh na samplaí go léir ar chitoiméadar LSR Fortessa agus rinneadh anailís orthu le bogearraí FACS DIVA v. 8.0 (BD Biosciences).

Síniú scór ríomh

D’úsáideamar slonn géinte normalaithe chun na sínithe seo a leanas a shainiú: insíothlú cille CD8+ T (CD8A, CD8B, PRF1, agus GZMB), slonn MHC-I (HLA-A, HLA-B, agus HLA-C) , agus comharthaíocht HSF1 (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5, agus HSP90B1).

Anailís staitistiúil

Maidir le turgnaimh cille-bhunaithe, rinneadh tríchosaigh bhitheolaíocha i ngach turgnamh amháin go ginearálta, mura sonraítear a mhalairt. Maidir le staidéir ar ainmhithe, níor úsáideadh níos lú ná 5 mhacasamhlú in aghaidh an ghrúpa. Rinneadh ainmhithe a randamach i ngrúpaí éagsúla tar éis ionaclaithe cille meall. Ní raibh na himscrúdaitheoirí dall ar an leithdháileadh le linn turgnaimh agus measúnú torthaí. Taispeántar sonraí mar mheánluachanna le díorthú caighdeánach. Rinneadh anailís staitistiúil ag baint úsáide as bogearraí GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). Úsáideadh t-tástáil dhá thaobh 2-chun grúpaí cóireála a chur i gcomparáid le grúpaí rialaithe; Measadh feidhm marthanais trí mhodhanna Kaplan-Meier agus úsáideadh an triail log-ranga chun difríochtaí staitistiúla a ríomh.

Infhaighteacht sonraí

Fuarthas na sonraí RNA-seq (GSE99299) agus sonraí aonchealla próiseáilte (GSE123814) ó Gene Expression Omnibus (GEO). Fuarthas na sonraí próitéamaíochta MS (PXD006003) ó stór PRIDE. Fuarthas tacair shonraí ailse TCGA ó UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/). Chuir na húdair chomhfhreagracha faoi seach na sonraí RNA-seq agus an fhaisnéis chliniciúil do thrialacha cliniciúla ICB ar fáil. Tá na sonraí amh uile a thacaíonn le torthaí an staidéir seo ar fáil ón údar comhfhreagrach ach iad a iarraidh. Cuirtear sonraí foinseacha ar fáil sa pháipéar seo.

Infhaighteacht cód

Rinneadh na hanailísí go léir a úsáideadh sa staidéar seo de réir lámhleabhair Prism Graphpad leagan 8.0 agus an suíomh Gréasáin ar líne ag http://xena.ucsc.edu/. Níor forbraíodh aon chód nó algartam nua le linn an staidéir seo.

Sonraí Breisithe

Sonraí Breisithe Fíor 1:

Tá comhghaol idir LIMIT agus géinte imdhíonacha éifeachtúla thar ilchineálacha ailse.

Sonraí Breisithe Fíor 2:

Loci géiniteach agus seichimh Teorainn daonna agus Luiche.

Sonraí Breisithe Fíor 3: Méadaíonn LIMIT slonn MHC-1

Sonraí Breisithe Fíor 5:

Méadaíonn LIMIT slonn MHC-1 lódáilte antaigin in vivo.

Sonraí Breisithe Fíor 6:

Gníomhaíonn LIMIT cis GBPanna chun MHC-1 agus imdhíonacht siadaí a threisiú.

Sonraí Breisithe Fíor 7:

Gníomhaíonn GBPanna HSF1 chun léiriú MHC-I a spreagadh.

Sonraí Breisithe Fíor 8:

Tiomáineann HSF1 slonn MHC-I agus díolúine meall.

Sonraí Breisithe Fíor 9:

Comhghaolú géinte comharthaíochta HSF1 le MHC-I agus díolúine siadaí.

Sonraí Breisithe Fíor 10: Scéim a thaispeánann conas a théann an ais LIMIT-GBP-HSF1 i bhfeidhm ar MHC-I agus ar dhíolúine siadaí

Ábhar Breise

Déan tagairt don leagan Gréasáin ar PubMed Central le haghaidh ábhar breise.

Buíochas

Gabhaimid buíochas le baill saotharlainne Zou as a n-ionchur intleachtúil. Tacaíodh go páirteach leis an obair seo trí dheontais taighde ó dheontais US NIH/NCI R01 (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ), agus (CA216919, CA213566, CA120458 (MC) tríd an Ollscoil), agus an Ollscoil. Deontas Ionad Ailse Michigan Rogel (CA46592).

Tagairtí

1. Zou W, Wolchok JD & Chen L PD-L1 (B7-H1) agus PD-1 imshuí cosáin le haghaidh teiripe ailse: Meicníochtaí, bithmharcóirí freagartha, agus teaglaim. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/ scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN & Schreiber RD Neoantigens in imdhíonteiripe ailse. Eolaíocht 348, 69–74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. Garcia-Lora A, Algarra I & Garrido F MHC rang I antaiginí, faireachas imdhíonachta, agus éalú imdhíonachta siadaí. J Cill Physiol 195, 346–355, doi:10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. Festenstein H & Garrido F MHC antaiginí agus malignancy. Nádúr 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM & van Hall T An géarghá le MHC rang I a ghnóthú in ailsí le haghaidh imdhíonteiripe éifeachtach. Curr Opinion Immunol 39, 44–51, doi:10.1016/ j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. An tOnórach CC et al. Atlas de RNAanna fada neamhchódaithe daonna le foircinn chruinne 5'. Nádúr 543, 199–204, doi:10.1038/nature21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME & Mattick JS RNAanna fada neamhchódaithe: léargais ar fheidhmeanna. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi:10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL & Reik W Éabhlóid agus feidhmeanna RNAanna fada neamhchódaithe. Cill 136, 629–641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​RNAs neamhchódaithe fada: iontas feidhmiúil ón domhan RNA. Genes Dev 23, 1494–1504, doi:10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D & Lee JT RNAS neamhchódaithe fada: san am atá thart, san am i láthair agus sa todhchaí. Géineolaíocht 193, 651–669, doi:10.1534/géineolaíocht.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA & Chang HY RNAanna neamhchódaithe fada i ríomhchlárú agus athchlárú cinniúint cille. Cealla Gas 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. Ról éiritheach na lncRNAs in ailse. Nat Med 21, 1253–1261, doi:10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A et al. Nóta tagartha GENCODE do ghéanóim an duine agus na luiche. Aigéid Núicléacha Res 47, D766–D773, doi: 10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. Riaz N et al. Éabhlóid Meall agus Micrea-thimpeallachta le linn Imdhíonteiripe le Nivolumab. Cill 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W et al. Gnéithe Géanómacha agus Trascriptomacha den Fhreagra ar Theiripe Frith-PD-1 i Meileanóma Meiteastatach. Cill 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM et al. Comhghaolú géanómaíochta na freagartha ar imshuí CTLA-4 i meileanóma meiteastatach. Eolaíocht 350, 207–211, doi:10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T et al. Sócháin Sómacha agus Homalógacht Nua-eipitíopa i Melanómais arna gCóireáil le Imshuí CTLA-4. Ailse Imdhíonachta Res 5, 84–91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J et al. Anailísí córasacha ar shíniú úrscéal a bhaineann le lncRNA mar an bithmharcóir prognóiseach le haghaidh Carcanóma Hepatocellular. Cancer Med, doi:10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH et al. Léiriú ar chóras faireachais siadaí gáma-spleách interferon i lucha imdhíon-inniúlachta. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi:10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. Fruh K & Yang Y Cur i láthair Antigen ag MHC aicme I agus a rialáil trí interferon-gáma. Curr Opin Immunol 11, 76–81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H et al. Cuireann B7-H1 a bhaineann le meall chun cinn apoptosis T-chealla: meicníocht fhéideartha imghabhála imdhíonachta. Nat Med 8, 793–800, doi:10.1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P et al. Gníomhachtú géine treoraithe ag RNA ag fachtóirí trascríobh bunaithe ar CRISPR-Cas. Modhanna Nat 10, 973–976, doi:10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lín H et al. Cinneann léiriú óstach PD-L1 éifeachtúlacht aischéimniúcháin siadaí imshuí-idirghabhála cosáin PD-L1. J Clin Invest 128, 1708, dáta: 10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. RNA Neamhchódaithe Fada Núicléach Sun Q, Hao Q & Prasanth KV: Príomh-Rialtóirí Slonn Géine. Treochtaí Genet 34, 142–157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ & Yin FH Interferon ionduchtú próitéiní fibroblast le gníomhaíocht cheangailteach guanylate. J Biol Chem 258, 7746–7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH et al. Próitéiní guanylate-cheangailteach-spreagtha interferon i ngníomhú inflammasome agus cosaint óstaigh. Nat Immunol 17, 481–489, doi:10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X et al. PROMO: eilimintí rialála trascríobh atá ar eolas a bhrath ag baint úsáide as cuardaigh shainoiriúnaithe. Bithfhaisnéisíocht 18, 333–334, doi:10.1093/bioinformatics/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. Cuibhreannas, PE Ciclipéid chomhtháite d'eilimintí DNA sa ghéanóm daonna. Nádúr 489, 57–74, doi:10.1038/nature11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: Caomhnóir Proteostasis in Ailse. Treochtaí Cill Biol 26, 17–28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y & Morano KA Gníomhaitheoirí móilíní beaga ar an bhfreagra turraing teasa: airíonna ceimiceacha, spriocanna móilíneacha, agus gealltanas teiripeach. Ceimic Res Toxicol 25, 2036–2053, doi:10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF & Voellmy R Faoi chois ar ghníomhachtú fachtóir trascríobh turraing teasa HSF1 ag HSP90 (cast HSP90) atá mar choimpléasc strus-íogair le HSF1. Cill 94, 471–480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Rialachán an fhachtóra turraing teasa mamaigh 1. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 agus an chaperoning ailse. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi:10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE et al. Athsholáthar clónúil ar chealla T a bhaineann go sonrach le siadaí tar éis imshuí PD-1. Nat Med 25, 1251–1259, doi:10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. Harel M et al. Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Nochtann Spleáchas Mitochondrial. Cill 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA RNAanna fada neamhchódaithe i rialáil na freagairt imdhíonachta. Treochtaí Imdhíonachta 35, 408–419, doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA RNAanna Fada Neamhchódaithe i Rialachán na Freagra Imdhíonachta agus na Díolúine Oilte. Géiniteach Tosaigh 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. Schmitt AM & Chang HY RNA Neamhchódaithe Fada i gCosáin Ailse. Cill Ailse 29, 452–463, doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Sun TT et al. Cuireann LncRNA GClnc1 Carcinogenesis Gastric chun cinn agus Gníomhóidh sé Bealtaine mar Scafall Modúlach de Choimpléisc WDR5 agus KAT2A chun an Patrún Modhnúcháin Histone a Shonrú. Cancer Disov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA & Ribas A Bunscoile, Oiriúnaitheach, agus Friotaíocht Faighte in aghaidh Imdhíonteiripe Ailse. Cill 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. Peng D et al. Cruthaítear imdhíonacht siadaí agus imdhíonteiripe má dhéantar tosta eipigineach de cheimicíní de chineál TH1-. Nádúr 527, 249–253, doi:10.1038/nature15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W et al. CD8(+) Rialaíonn cealla T fearóptóis siadaí le linn imdhíonteiripe ailse. Nádúr 569, 270–274, doi:10.1038/s41586-019-1170-y (2019). [PubMed: 31043744]

43. Gao J et al. Caillteanas Géinte Conair IFN-gáma i gCealla Meall mar Mheicníocht Frithsheasmhachta in aghaidh Teiripe Frith-CTLA-4. Cill 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM et al. Sócháin a Bhaineann le Friotaíocht Faighte in aghaidh Imshuí PD-1 i Meileanóma. N Engl J Med 375, 819–829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT et al. Aithníonn scagthástáil in vivo CRISPR Ptpn2 mar sprioc imdhíonteiripe ailse. Nádúr 547, 413–418, doi:10.1038/nature23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS et al. Príomhfhriotaíocht in aghaidh Imshuí PD-1 Idirghabhálaithe ag JAK1/2 Mutations. Cancer Disov 7, 188–201, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A et al. Cuireann frithsheasmhacht IFNgamma faighte isteach ar imdhíonacht frith-meall agus is cúis le loit meileanóma atá resistant ó chealla T. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. Li J et al. Sócháin tiománaithe eipigéiniteacha in ARID1A cruth feinitíopa imdhíonachta ailse agus imdhíonteiripe. J Clin Invest, doi: 10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL et al. Rialaíonn Comharthaíocht Mheall Interferon Clár Ilchineálach Friotaíocht in aghaidh Imdhíonachta Seicephointe. Cill 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD & Spector DL ​​Díriú Teiripeach ar RNAanna Fada Neamhchódaithe in Ailse. Treochtaí Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I Sloinneadh géine a rialáil trí RNAnna fada neamhchódaithe cis-ghníomhaithe. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi:10.1038/s41576-019-0184-5 (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M Dúshláin agus peirspictíochtaí don bhitheolaíocht struchtúrach de lncRNAs-an sampla d'athdhéantar A-lncRNA Xist. J Mol Cell Biol 11, 845–859, doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR et al. Cuireann GBP5 cóimeáil inflammasome NLRP3 chun cinn agus díolúine i mamaigh. Eolaíocht 336, 481–485, doi:10.1126/science.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A & MacMicking JD Próitéiní atá ceangailteach le guanailáit a tharchuirtear le interferon: Caomhnóirí cosanta óstaigh i sláinte agus galair. J Cait Med 216, 482–500, doi: 10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M et al. Tá ról ríthábhachtach ag braisle de GTPases p65 interferon-gáma-inducible i gcosaint óstach i gcoinne Tocsoplasma gondii. Díolúine 37, 302–313, doi:10.1016/ j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM et al. Cuireann cosc ​​HSP90 le himdhíonteiripe ailse trí ghéinte freagartha interferon a rialáil. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA & Kaufmann GF Ag Díriú ar Phróitéin Turraing Teasa 90 (HSP90) mar Straitéis Chomhlántach chun Imshuíomh Seiceála Imdhíonachta le haghaidh Teiripe Ailse. Ailse Imdhíonachta Res 3, 583–589, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A et al. Measúnú Cliniciúil agus Próifíliú Bithmharcála ar Choscairí Hsp90. Modhanna Mol Biol 1709, 423–441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. Charo J et al. Feabhsaíonn ró-abairt Bcl-2 marthanacht T-chealla meall-shonrach. Cancer Res 65, 2001–2008, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [PubMed: 15753400]

60. Owaki H et al. Tá Raf-1 ag teastáil le haghaidh táirgeadh T-chill IL2. EMBO J 12, 4367–4373 (1993). [PubMed: 8223446]