Tá ISG15-Gníomhachtú an Bhraiteora MDA5 ag brath ar an mbraiteoir ag SARS-CoV-2 Protease cosúil le Papain Chun Imdhíonacht Dhéanach Óstach a Imghabháil

Bunaíonn gníomhachtú na ngabhdóirí RIG-I-cosúil le, géine inducible I (RIG-I) aigéad retinoic-, agus próitéin melanoma difreála-ghaolmhar 5 (MDA5) stát antiviral trí ghéinte spreagtha interferon (IFN)-spreagtha (ISGanna) a rialáil. Ina measc seo tá ISG15, a bhfuil a róil mheicníochta fós ann maidir le himdhíonacht dhúchasach. Sa staidéar reatha, tuairiscímid go bhfuil comhchuingeach ISG15 riachtanach do fhreagraí frithvíreasacha IFN arna n-idirghabháil ag an braiteoir víreasach RNA MDA5. Cuireann ISGylation de na fearainn gníomhachtaithe agus earcaíochta caspase de MDA5 a oligomerization chun cinn agus dá bhrí sin spreagann gníomhachtú díolúine dúchasach i gcoinne raon de víris, lena n-áirítear coronaviruses, flaviviruses, agus picornaviruses. Tá an ISG{12}}gníomhachtú cleithiúnach MDA5 fealltach trí dhí-ISGylation díreach arna idirghabháil ag próitéas cosúil le papain SARS-CoV-2, coróinvíreas a tháinig chun cinn le déanaí agus ba chúis leis an bpaindéim COVID-19 . Léiríonn ár gcuid oibre ról ríthábhachtach do ISG15 i bhfreagairt frithvíreasach trí mheán an MDA agus sainaithnítear freisin príomh-mheicníocht imghabhála imdhíonachta de SARS-CoV-2, a d’fhéadfaí a dhíriú ar fhorbairt frithvíreas agus vacsaíní nua chun comhrac in aghaidh COVID-19.

cistanche tubulosa-feabhas a chur ar chóras imdhíonachta

Cliceáil anseo chun táirgí Cistanche Feabhsú Díolúine a fheiceáil

【Iarr tuilleadh】 Ríomhphost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Déanann an córas imdhíonachta dúchasach monatóireacht ar shuaitheadh ​​víreasach ar hoiméastáis imdhíonachta ósta, a bhraitheann ar ghabhdóirí a bhraitheann patrúin mhóilíneacha a bhaineann le contúirt nó pataigin (PAMPanna)1–3. Tá na gabhdóirí cosúil le RIG-I (RLRanna) RIG-I agus MDA5 ríthábhachtach maidir le víreas a bhrath trí shuirbhé a dhéanamh ar an gcíteaplasma le haghaidh RNAanna imdhíon-spreagthacha víreasacha nó óstaigh4. Mar thoradh ar cheangal RNA leis an bhfearann ​​​​C-críochfort (CTD) agus héileacaptar RIG-I agus MDA5, déantar a gcomhfhoirmiú comharthaíochta-priomaithe a cheadaíonn earcú roinnt einsímí5. Athraíonn na heinsímí seo RLRanna ag fearainn agus suíomhanna iolracha, agus déantar staidéar an-mhaith ar mhodhnuithe iar-aistrithe (PTManna) do na fearainn gníomhachtaithe agus earcaíochta caspase (CARDanna), na modúil chomharthaíochta. Próitéin fosfatase 1 (PP1) / dífhosfarailítí na CARDanna RIG-I agus MDA56 . I gcás RIG-I, cuireann dífhosfarlú chun cinn polyubiquitination de na CARDanna atá nasctha le Lys le TRIM25 (móitíf trípháirteach ina bhfuil 25) agus ligases E3 eile7,8, a chobhsaíonn an fhoirm oligomeric de RIG-I, rud a chumasaíonn mitochondrial antiviral -comhartha próitéine (MAVS) ceangailteach. I gcomparáid leo siúd de RIG-I, ní thuigtear chomh maith na céimeanna aonair de ghníomhachtú MDA5 agus PTManna criticiúla atá i gceist. Spreagann gníomhachtú RLR táirgeadh IFNanna de chineál I agus III, rud a iomadaíonn comharthaíocht fhrithvíreasach trí ISGanna9,10 a rialáil. Ina measc sin tá ISG15, próitéin atá cosúil le ubiquitin ar féidir a chomhchuingeach go comhfhiúsach le hiarmhair lísín de spriocphróitéiní, próiseas PTM ar a dtugtar ISGylation11. Cé go n-aithnítear go forleathan go bhfuil comhchuingeach ISG15 ag gníomhú go frith-víreasach12, níl fios faoi láthair ar mheicníochtaí ISGylation próitéine óstach a d'fhéadfadh gníomhaíocht srianta antiviral leathan ISG15 a mhíniú. Is leis an teaghlach Coronaviridae a bhfuil roinnt pataiginí daonna eile ann gníomhaí cúiseach na paindéime COVID-19 leanúnach, géarshiondróm riospráide géarghéar 2 (SCoV2). Tá cumas eisceachtúil ag coróinvíreas chun freagraí frithvíreasacha IFN-idirghabhálaithe a shochtadh, agus táirgeadh IFN íseal in othair ionfhabhtaithe SCoV a bhaineann le galair thromchúiseacha13. I measc na n-antagonists corónach IFN tá an próteas cosúil le papain (PLpro) a bhfuil gníomhaíochtaí dí-uibítíneachta agus dí-ISGylating aige14,15. Sa staidéar reatha, sainaithnímid ról riachtanach do ISGylation i ngníomhachtú MDA5. Léirímid freisin go n-idirghníomhaíonn SCoV2 PLpro le MDA5 agus go ndéanann sé frithghníomhú ISG15-spleách MDA5 trí dhí-ISGylation gníomhach, ag nochtadh go bhfuil SCoV2 tagtha chun cinn cheana féin chun éalú ó fhaireachas imdhíonachta ag MDA5.

Torthaí

MDA5, ach ní RIG-I, tá gá le comharthaíocht ISG15.

Chun PTManna na gCártaí MDA5 a aithint a d’fhéadfadh gníomhachtú MDA5 a rialáil, chuireamar faoi réir MDA5-2CARD íonaithe cleamhnais a comhleádh le glutathione-S-transferase (GST-MDA5-2CARD), nó GST amháin, le crómatagrafaíocht leachta i dteannta le mais-speictriméadracht comhcheangailte (LC). –MS/MS), agus fuarthas amach, go sonrach, gur chomhíonaigh GST–MDA5–2CARD le ISG15, a bhí cosúil le dhá bhanda a chuaigh ar imirce níos moille (faoi ~15 agus 30 kDa) ná GST–MDA5– 2CARD (Sonraí Leathnaithe) neamhathraithe Fíor 1a). Dheimhnigh Immunoblotting (IB) go bhfuil GST-MDA5-2CARD modhnaithe ag ISG15 (Sonraí Leathnaithe Fíor. 1b). Ansin chinneamar ábharthacht ISG15 do chomharthaíocht spreagtha MDA. De bharr an méid a d’eascair le slonn FLAG-MDA5 i bhfibibríní suthach luch de chineál fiáin (MEFanna) IFN- messenger RNA agus próitéin chomh maith le tras-scríbhinní Ccl5 ar bhealach dáileog-spleách, d’eascair slonn FLAG-MDA5 in Isg15 -/ - MEFanna géine antiviral agus léiriú próitéine (Fíor 1a agus Sonraí Leathnaithe Fíor 1c). Ar an gcaoi chéanna, tháinig laghdú mór ar ionduchtú géine frithvíreasach i gcealla cnagála ISG15 (KO) HeLa (daonna) i gcomparáid le cealla rialaithe WT (Fíor 1b agus Sonraí Leathnaithe Fíor. 1d), rud a chuir deireadh le héifeacht speiceas-shonrach. I gcodarsnacht leis sin, spreagtha FLAG-RIG-I méideanna inchomparáide secreted IFN- próitéin chomh maith le Ifnb1 agus Ccl5 athscríbhinní i Isg15 - / - agus WT MEFs (Fíor. 1a agus Sonraí Breisithe Fíor. 1c). Bhí tras-scríbhinní IFNB1 agus CCL5 chomh maith le táirgeadh próitéin IFN ag FLAG-RIG-I cosúil le nó beagán feabhsaithe i gcealla ISG15 KO HeLa i gcomparáid le cealla WT (Fíor 1b agus Sonraí Leathnaithe Fíor. 1d), comhsheasmhach le tuairiscí roimhe seo go ISGylation diúltach tionchair comharthaíocht RIG-I16,17

Fíor 1|Tá ISGylation ag teastáil le haghaidh comharthaíochta MDA5, ach ní RIG-I. a,b, ELISA de IFN- ó sháithíní de MEFanna (WT nó Isg15−/−) (a) agus cealla HeLa (WT nó ISG15 KO) (b) a aistrítear go neamhbhuan le méideanna méadaitheacha MDA5 nó RIG-I atá clibeáilte ag GÁGI le haghaidh 40 h. Scrúdaigh IB lísáití lánchealla (WCLanna) le frith-ISG15, frith-FLAG, agus frith-actin (rialú lódála). c, ELISA de IFN- ó sháithíní WT nó Isg15−/− MEFanna a spreagtha nó a aistríodh le EMCV RNA (0.1 nó 0.4 µg ml−1 ), HMW-poly (I: C) (0.5 µg ml−1 ) nó RABVLe (1 pmol ml−1 ), nó ionfhabhtaithe le SeV (10 aonad haemagglutination (HAU) ml−1 ) le haghaidh 24 h. d, anailís RT-qPCR ar Ifnb1, Ccl5, agus Tnf mRNA i WT agus Isg15 -/ - MEFanna spreagtha mar c. e, fosfarylation IRF3 sna WCLanna de NHLFanna a aistríodh leis na siRNAs léirithe ar feadh 30 h agus ansin bréige spreagtha nó aistrithe le EMCV RNA (0.4 µg ml−1 ) nó RABVLe (1 pmol ml−1 ) ar feadh 6 h, arna mheasúnú ag IB le frith-pSer396-IRF3 agus frith-IRF3. f, ELISA de IFN- ó sháithíní de NHLFanna a aistríodh leis na siRNAs léirithe ar feadh 30 h agus ansin bréige spreagtha nó aistrithe le EMCV RNA (0.4 µg ml−1 ) nó RABVLe (1 pmol ml−1 ), nó ionfhabhtaithe le SeV (10 HAU ml - 1 ) ar feadh 16 h. g, ELISA de IFN- ó sháithíní PBMC a aistríodh ar feadh 40 h leis na cáithníní lentiviral shRNA léirithe agus ansin ionfhabhtaithe le mutEMCV (MOI=10) nó SeV (200 HAU ml−1 ) ar feadh 8 h. h, anailís RT–qPCR ar IFNA2 agus IL-6 mRNA i PBMCanna a aistríodh agus a ionfhabhtaíodh mar in g. Léiríonn sonraí ar a laghad dhá thurgnamh neamhspleácha le torthaí comhchosúla (meán ± sd de n= 3 macasamhla bitheolaíocha in a–d agus f, agus meán n= 2 macasamhla bitheolaíocha in g agus h). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.

Ansin rinneamar tástáil ar éifeacht scriosta géine ISG15 ar ghníomhachtú MDA5 ingenous agus RIG-I ag a gcuid ligandaí faoi seach. Táirgeadh IFN chomh maith le léiriú géine IFNB1, CCL5, agus TNF a tharlódh de bharr aistriú víreas einceifileamócharditis (EMCV) RNA nó polaipís ard-mheáchan móilíneach (HMW) (I: C), a bhraitheann an dá cheann acu go príomha ag MDA5, maolaíodh go mór i gcealla Isg15 -/ - MEF, ISG15 KO HeLa agus ISG15 KO HAP-1 i gcomparáid lena gcealla rialaithe faoi seach (Fíor 1c,d agus Sonraí Leathnaithe Fíor 1e-g). Is é an rud atá tábhachtach ná nach raibh an ablation ionduchtaithe géine antiviral ag EMCV RNA nó HMW-pola (I: C) i gcealla ISG15 KO mar gheall ar léiriú géine MDA5 aisghairthe; a mhalairt ar fad, feabhsaíodh slonn MDA5 mRNA i gcealla ISG15 KO i gcomparáid le cealla WT (Sonraí Breisithe Fíor. 1f,g). I gcodarsnacht leis an spreagadh le agonists MDA5, spreagadh cealla Isg15-/ - MEFs agus ISG15 KO HeLa trí aistriú ceannaire víreas confadh RNA (RABVLe) nó ionfhabhtú víreas Sendai (SeV), ar spreagthaigh RIG-I iad, ba chúis le táirgeadh IFN agus slonn géine antiviral atá inchomparáide le cealla WT (Fíor 1c,d agus Sonraí Leathnaithe Fíor 1e). Chun éifeachtaí clónacha féideartha a d’fhéadfadh baint a bheith acu le cealla scriosta géine ISG15 a chur as an áireamh, rinneamar turgnaimh díomuana géine tosta i ngnáthfhibibríní scamhóg daonna (NHLFanna). Mar thoradh ar tosta ISG15, cosúil le cnagadh MDA5, cailleadh beagnach iomlán de phosphorylation fachtóir rialála IFN-3 (IRF3) - sainmharc de ghníomhachtú comhartha RLR-tar éis spreagadh le EMCV RNA ach ní RABVLe ished IFN- táirgeadh chomh maith le léiriú trascríobh antiviral i NHLFs transfected le EMCV RNA, ach ní i cealla spreagtha le RABVLe nó SeV (Fig. 1f agus Sonraí Leathnaithe Fíor. 1h). Laghdaigh hairpin beag (sh) tost trí mheán RNA de ISG15 nó MDA5 i gcealla monanúicléacha fola forimeallacha príomhúla daonna (PBMCanna) go suntasach freisin próitéin frith-víreasach agus léiriú trascríobh tar éis ionfhabhtú le EMCV mutant athchuingreach (mutEMCV) easnamhach in antagonism MDA518,19, i gcomparáid le PBMCanna ionfhabhtaithe aistrithe le shRNA rialaithe neamh-spriocdhírithe (Fíor 1g,h agus Sonraí Leathnaithe Fíor. 1i). I gcodarsnacht leis sin, níor chuir ídiú ISG15 nó MDA5 isteach ar fhreagraí cítocine i PBMCanna tar éis ionfhabhtú SeV (Fíor 1g,h agus Sonraí Breisithe Fíor 1i). Léiríonn na torthaí seo go bhfuil ISG15 riachtanach do chomharthaíocht imdhíonachta ag MDA5, ach ní RIG-I. Tá na CÁRTAÍ MDA5 ISGylated ag Lys23 agus Lys43.

sochair cistanche do na fir-neartú chóras imdhíonachta

Chun tacú lenár n-anailís MS a shainaithin MDA5–2CARD ISGylation, rinneamar tástáil ar dtús cibé an modhnaítear MDA5 ingenous freisin le ISG15. Rinneadh MDA5 endogenous ISGylated go láidir i gcealla transfected le HMW-pola (I: C), nó ionfhabhtaithe le dengue (DENV) nó Zika (ZIKV) víris a bhraitheann ag MDA5 (tag. 5 ) ( Fíor. 2a ). Go háirithe, rinneadh ISGylated freisin MDA5 ingenous i gcealla neamhionfhabhtaithe, cé go ag leibhéil an-íseal (Sonraí Breisithe Fíor. 2a), atá ag teacht le torthaí roimhe seo go bhfuil go leor próitéiní óstaigh freisin ISGylated ag leibhéil ísle i ngnáthchoinníollacha (neamhionfhabhtaithe)20. I gcealla a ndearnadh cóireáil orthu le frith-IFNAR2 chun cosc ​​a chur le huasrialú ISG trí chomharthaíocht IFNAR, d’eascair laghdú inchomparáide ar shloinneadh géine IFNB1 tar éis ionfhabhtú mutEMCV de bharr tosta ISG15 nó MDA5 (Sonraí Breisithe Fíor. 2b), rud a thugann le fios go bhfuil ISG15-cleithiúnaí Tarlaíonn comharthaíocht MDA5 fiú in éagmais comharthaíochta IFNAR.

t Is é MDA5Δ2CARD (ina bhfuil héileacás agus CTD), príomhshuíomh MDA5 ISGylation a thaispeánann dhá bhanda fheiceálach do ISGylated 2CARD (Fíor 2b). Léirigh athdhéanamh cealla ISG15 KO HeLa le ceachtar WT ISG15, nó mutant neamh-chomhchuingeach ISG15 inar cuireadh alanín (ISG15-AA)21 in ionad an dá glicín a bhí ag teastáil le haghaidh comhchuingeach, comhchuingeach comhfhiúsach ISG15 (Fíor 2c) . Sóchán na n-iarmhar lísín aonair i GST-MDA5-2CARD go arginine le fios go bhfuil aon-suíomh sóchán de Lys23 agus Lys43 suntasach laghdaithe ISGylation (Sonraí Breisithe Fíor. 2c), ach a n-sóchán comhcheangailte (Lys23Arg/Lys43Arg) deireadh beagnach ISGylation (Fig. ). FLAG-MDA5 Lánfhaid Léirigh Lys23Arg/Lys43Arg ISGylation suntasach laghdaithe freisin (Fíor 2e agus Sonraí Leathnaithe Fíor. 2d); is dócha go bhfuil an ISGylation iarmharach a fheictear i FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg mar gheall ar mhionláithreáin bhreise sa 2CARD agus/nó Δ2CARD. Díol suntais, níor chuir an sóchán Lys23Arg/Lys43Arg isteach ar MDA5-2CARD SUMOylation5 (Sonraí Breisithe Fíor. 2e). Ina theannta sin, cé go raibh RIG-I-2CARD uileláithreach go láidir (rud a léiríonn Lys comhfhiúsach ubiquitination7 ), níor léirigh MDA5-2CARD WT ná an tsóiteáin Lys23Arg/Lys43Arg leibhéil inbhraite uileláithreachta (Sonraí Breisithe Fíor. 2f). I dteannta a chéile, léiríonn na torthaí seo go ndéantar ISGylation ar Chártaí MDA5 ag dhá mhórshuíomh, Lys23 agus Lys43.

Tá ISGylation CÁRTA ag teastáil le haghaidh gníomhachtú MDA5.

Agus a gcumas aistrithe comhartha á gcur i gcomparáid leo, léirigh mutants aon-láithreáin MDA5-2CARD Lys23Arg agus Lys43Arg gníomhachtú tionscnóra IFN laghdaithe go páirteach i gcomparáid le WT MDA5–2CARD, ach bhí gníomhaíocht comharthaíochta an-laghdaithe ag an tsóiteáin Lys23Arg/Lys43Arg, a bhí beagnach chomh láidir. mar sin de na mutants lochtach comharthaíochta Ser88Glu agus Ser88Asp6 (Sonraí Breisithe Fíor. 2g). I gcodarsnacht leis sin, léirigh tsóiteán inar cuireadh arginine (Lys68Arg) in ionad Lys68, arb é an t-iarmhar lísín atá gar do Lys43 agus Lys23, cumas comhchuingeach agus comharthaíochta ISG15 inchomparáide le WT 2CARD (Sonraí Leathnaithe Fíor 2c,g). MDA5-2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, i gcodarsnacht le WT MDA5-2CARD, theip freisin a aslú IRF3 dimerization (Sonraí Breisithe Fíor. 2h). FLAG-MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg nó Lys23Arg/Lys43Arg Léirigh freisin laghdaithe, nó beagnach deireadh, IFN-inniúlachtaí tionscnóir-ghníomhachtú, i gcomparáid le FLAG-MDA5 WT (Fíor 2f). MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg léirigh locht comharthaíochta domhain fiú nuair a cuireadh in iúl ag méideanna arda, ach WT MDA5 spreagtha tras-scríbhinní antiviral ar bhealach dáileog-spleách (Fig. 2g). I gcomhaontú, d'eascair fosfarylation STAT1, sainmharc de chomharthaíocht IFNAR, chomh maith le léiriú próitéin ISG go mór ag MDA5 WT, ach ní Lys23Arg/Lys43Arg (Fíor 2h). Mar thoradh ar chomhlánú astrocytes daonna géine-in eagar (SVGAanna) le MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg nó Ser88Glu tháinig laghdú mór ar thrascríbhinní IFNB1, CCL5 agus ISG i gcomparáid le cealla a léirigh WT MDA5 (Fíor 2i agus Sonraí Breisithe) Fíor 2i. . Léiríonn na torthaí seo go bhfuil ISGylation ag Lys23 agus ag Lys43 riachtanach le haghaidh freagraí cítocine trí mheán MDA.

sochair cistanche do na fir-neartú chóras imdhíonachta

Rialaíonn dífhosfarú trí PP1 ISGylation MDA5.

Cosúil le RIG-I, déantar MDA5 a phosphorylated laistigh de na CARDanna i gcealla neamhionfhabhtaithe, rud a chuireann cosc ​​​​ar uathghníomhú; tá dífhosfarú RIG-I agus MDA5 faoi PP1 / ríthábhachtach chun RLRanna a scaoileadh óna stáit faoi bhrú comharthaíochta6,22-24. Ligeann dífhosfarú RIG-I uileláithreacht nasctha le Lys ar na CARDanna, rud a chuireann chun cinn iolrú agus comharthaíocht RIG-I5. Tá na sonraí faoin gcaoi a spreagann dífhosfarú CÁRTA (ag Ser88) gníomhachtú MDA5 fós doiléir, agus dá bhrí sin rinneamar tástáil ar cibé an rialaíonn dífhosfarú MDA5 ISGylation. PP1 a bheith tosta / ISGylation MDA5-2CARD laghdaithe go mór (Sonraí Breisithe Fíor. 3a). Ina theannta sin, laghdaigh na mutants fosphomimetic Ser88Glu agus Ser88Asp ISGylation, ach léirigh an tsóiteáin phospho-null Ser88Ala ISGylation níos láidre ná WT MDA5-2CARD (Sonraí Breisithe Fíor. 3b). Os a choinne sin, bhí fosfarylation Ser88 inchomparáide ag MDA5 WT agus Lys23Arg/Lys43Arg (Sonraí Breisithe Fíor. 3c). Le chéile, tugann na sonraí seo le fios go dtagann dífhosfarú MDA5 ag Ser88 roimh CARD ISGylation. An chéad uair eile bhaineamar úsáid as próitéin víreas V na bruitíní (MeV-V), a chuireann in aghaidh dífhosfarú MDA5 Ser88 trí PP1 / frithbheartaíocht25. D'fheabhsaigh slonn MeV-V fosfarylation Ser88 (táscach dífhosfarú blaistithe) de GST-MDA5-2CARD nó FLAG-MDA5 ar bhealach dáileog-spleách, mar a léiríodh roimhe seo25. Bhí comhghaolú idir fosfarylation feabhsaithe ag MeV-V agus laghdú ar ISGylation (Sonraí Breisithe Fíor 3d,e). I gcodarsnacht le WT MeV-V, níor léirigh MeV-V mutant a chuir deireadh le PP1-ceangailteach agus MDA{{{{5-antagonism dephosphorylation (MeV-VΔtail))25, mórán éifeacht ar MDA5–2CARD ISGylation (Sonraí Leathnaithe). Fíor 3f), neartú ar an gcosc ar ISGylation a bheith go príomha mar gheall ar chosc PP1, agus ní éifeachtaí freasúla eile, ag MeV-V. Chuir na próitéiní V ó víris Nipah agus Hendra (NiV-V agus HeV-V) feabhas freisin ar fhosfarylation MDA5 Ser88 agus, dá réir sin, dampened MDA5 ISGylation (Sonraí Leathnaithe Fíor. de fosfarylation Ser88, cé go bhfuil na meicníochtaí beachta do phróitéiní V aonair fós le cinneadh. Nuair a chuirtear le chéile iad, tugann na sonraí seo le fios go bhfuil ISGylation CARD MDA5 ag brath ar dhífhosfarú ag Ser88.

Cuireann ISGylation tionóil MDA5 ar ord níos airde chun cinn.

Éilíonn gníomhachtú RLR ceangailteach RNA, oligomerization RLR, agus a n-aistriú ón cítosól go mitochondria le haghaidh idirghníomhú le MAVS5. Chun an mheicníocht trína dtéann ISGylation i bhfeidhm ar ghníomhaíocht MDA5 a shoiléiriú, rinneamar scrúdú ar dtús an bhfuil tionchar ag ISGylation ar cheangal RNA. MDA5 endogenous íonaithe ó WT nó Isg15 -/ - idirghníomhaigh MEFanna chomh maith céanna le HMW-poly (I: C) in vitro (Sonraí Breisithe Fíor. 4a). Léirigh MDA5 WT agus Lys23Arg/Lys43Arg ceangailteach inchomparáide le HMW-poly(I:C), rud a thugann le fios nach gcuireann ISGylation isteach ar chumas RNA-cheangailteach MDA5 (Sonraí Leathnaithe Fíor 4b). Nuair a rinneamar monatóireacht ar thrasuíomh MDA5 ón gcíteasól go mitochondria tar éis spreagadh EMCV RNA, fuaireamar amach gur chuir tosta ISG15, ach ní aistriú so.C, deireadh le trasghluaiseacht MDA5 (Fíor 3a). I gcodarsnacht leis sin, bhí trasghluaiseacht RIG-I tar éis aistriú RABVLe éifeachtach in ISG15-ídithe agus si. Cealla C-aistrithe (Fíor 3b). Léirigh na sonraí seo go rialaíonn ISGylation traslonnú MDA5 nó céim in aghaidh srutha de. Toisc go dteastaíonn idirghníomhú le 14-3-3 η26 le traslonnú cíteasal-go-mitochondria MDA5, rinneamar comparáid idir 14-3-3η ceangailteach WT agus mutant MDA5. Bhí cumas MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg chun ceangal a dhéanamh 14-3-3η cosúil le cumas WT MDA5 nó an tsóiteáin Lys68Arg (Sonraí Breisithe Fíor. 4c). Mar sin féin, cé gur spreag spreagadh RNA EMCV go héifeachtach olagaiméiriú MDA5 i MEFanna WT, athchóiríodh foirmiú olagóiméirí MDA5 in ISG{15-MEFanna easnamhacha (Fíor 3c). Chuir cnagadh ISG15 i gcealla 293T deireadh freisin le holagoiméiriú FLAG-MDA5-2CARD (Fíor 3d). Os a choinne sin, chuir comhléiriú na gcomhpháirteanna innealra ISGylation, Ube1L agus UbcH8, go mór le oligomerization MDA5-2CARD in si. Cealla C-aistrithe, ach níl siad i gcealla ídithe ISG{15-(Fíor 3d), rud a thugann le fios go bhfuil ISGylation ag teastáil le haghaidh foirmiú oligomer MDA5. Chun tacú leis an gcoincheap seo, léirigh FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg oligomerization beagnach deireadh, ach WT MDA5 oligomerized go héifeachtach ( Fíor. 3e ). Chuireamar i gcomparáid freisin éifeacht sóchán Lys23 Arg/Lys43Arg le héifeacht na sóchán oligomerization-buaite a logánú ceachtar don chomhéadan idir monaiméir MDA5 agus a chuireann bac ar filiméadú RNA-ceangail-idirghabhálaithe MDA5 (Ile841Arg/Glu842Arg agus Asp848Ala/Aphla), nó chuig na CARDanna (Gly74Ala/Trp75Ala) agus cuir isteach ar oligomerization 2CARD27. Murab ionann agus WT MDA5, léirigh an tsóiteáin Lys23Arg/Lys43Arg, cosúil le MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, oligomerization easnamhach agus, ag teacht leis seo, cuireadh deireadh le cumas gníomhachtú tionscnóra IFN (Fíor 3f, g). Tugadh isteach Lys23Arg/Lys43Arg isteach i gcúlra Ile841Arg/Glu842Arg nó Asp848Ala/Phe849Ala, a laghdaigh ceachtar acu ann féin oligomerization agus comharthaíocht MDA5, deireadh freisin le foirmiú oligomer MDA5 agus IFN-ionduchtú (Fig. 3f,). Toisc go n-éascaíonn LGP2 núicléas MDA5 ar RNA dháshnáithe agus ar an gcaoi sin oligomerization MDA529,30, rinneamar comparáid idir an ceangal LGP2 de MDA5 WT agus Lys23Arg/Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg idirghníomhú le LGP2 chomh héifeachtach le WT MDA5 (Sonraí Leathnaithe Fíor. 4d), ag neartú an togra go gcuirfeadh CARD ISGylation oligomerization MDA5 chun cinn go neamhspleách ar fhiliméadú RNA-cheangailteach-idirghabhála. Le chéile, léiríonn na torthaí seo go n-éascaíonn ISGylation oligomerization CARD agus tionóil MDA5 ardoird.

Fíor 2|Éilíonn gníomhachtú MDA5 ISGylation ag Lys23 agus Lys43. ISGylation MDA5 Inghineach i NHLFanna a ndearnadh cóireáil bhréige orthu, a aistríodh le HMW-poly(I:C) (0.1 µg ml−1 ) ar feadh 40 h (ar chlé) nó ionfhabhtaithe le DENV nó ZIKV (MOI {{). 10}} do gach ceann acu) ar feadh 48 h (ar dheis), arna chinneadh ag IP le frith-MDA5 (nó rialú isitíopa IgG) agus IB le frith-ISG15. b, ISGylation de MDA5-2CARD agus MDA5Δ2CARD clibáilte FLAG i gcealla HEK293T aistrithe go neamhbhuan a léirigh freisin V5-ISG15, HA-Ube1L agus FLAG-UbcH8, arna measúnú ag FLAG PD agus IB le frith-V5 ag 40 h iar-aistriú. c, ISGylation MDA5 Endogenous i gcealla ISG15 KO HeLa athdhéanta go cobhsaí le veicteoir, WT ISG15 nó ISG15-AA agus comh-aistrithe le HA–Ube1L agus FLAG–UbcH8 tar éis cóireála IFN- (1,000 U ml−1 ) ar feadh 24 h, arna chinneadh ag IP le frith-MDA5 agus IB le frith-ISG15. d, ISGylation GST–MDA5–2CARD WT agus Lys23Arg/Lys43Arg i gcealla HEK293T a comh-aistrithe le V5–ISG15, HA–Ube1L agus FLAG–UbcH8 ar feadh 24 h, arna chinneadh ag GST PD agus IB le frith-V5. e, ISGylation de FLAG-MDA5 WT agus Lys23Arg/Lys43Arg i gcealla HEK293T a comh-aistrithe le V5–ISG15, HA–Ube1L agus FLAG–UbcH8, arna chinneadh ag FLAG PD agus IB le frith-V5. f, gníomhaíocht tuairisceora IFN- luciferase i gcealla HEK293T a aistríodh ar feadh 40 h le veicteoir, FLAG-MDA5 WT nó mutants. Cuirtear luachanna Luciferase i láthair mar ionduchtú fillte i gcoibhneas leis na luachanna do chealla veicteoir-aistrithe, socraithe go 1. Rinne IB iniúchadh ar WCLanna le frith-FLAG agus frith-actin. g, anailís RT-qPCR ar IFNB1 agus CCL5 mRNA i gcealla HEK293T a aistríodh go neamhbhuan le veicteoir nó méideanna méadaithe FLAG-MDA5 WT nó Lys23Arg/Lys43Arg. h, fosfarylation STAT1 agus flúirse próitéine ISG (IFIT1 agus -2) sna WCLanna de chealla HEK293T a aistríodh go sealadach le veicteoir nó FLAG-MDA5 WT nó Lys23Arg/Lys43Arg, arna chinneadh ag IB. Anailís I, RT–qPCR ar na géinte frithvíreasacha léirithe i MDA5 KO SVGAs a athdhéantar go neamhbhuan le veicteoir folamh nó MDA5 WT le clib FLAG, Lys23Arg/Lys43Arg nó Ser88Glu. Léiríonn sonraí ar a laghad dhá thurgnamh neamhspleácha a bhfuil torthaí comhchosúla acu (meán ± sd de n= 3 macasamhla bitheolaíocha i f, g, agus i). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Fíor 3|Cuireann CARD ISGylation chun cinn bunú tionóil MDA5 ard-oird. a,b, codánúchán Cytosol-mitochondria de WCLanna ó NHLFanna a aistríodh ar feadh 30 h le siRNA rialaithe neamh-spriocdhírithe (si. C) nó ISG15-siRNA sonrach (si.ISG15), agus ansin déan cóireáil bhréige nó tras-aistrithe le EMCV RNA (0.4 µg ml−1 ) (a) nó RABVLe (1 pmol ml−1 ) (b) ar feadh 16 h. Rinneadh IB le frith-MDA5 (a), frith-RIG-I (b), frith-ISG15, agus frith-actin (a agus b). -D'fheidhmigh Tubulin agus MAVS mar mharcóirí íonachta don chodán citosólach agus mitochondrial, faoi seach (a agus b). c, oligomerization MDA5 endogenous in WT agus Isg15 -/ - MEFanna a aistríodh le EMCV RNA (0.5 µg ml -1 ) ar feadh 16 h, agus a mheas SDD-AGE agus IB le frith-MDA5. Rinne SDS-PAGE anailís bhreise ar WCLanna agus rinne IB iad a iniúchadh le frith-MDA5 agus frith-aicin. d, Oligomerization de FLAG-MDA5-2CARD i gcealla HEK293T a bhí transfected go leis an siRNAs in iúl, le nó gan HA-Ube1L agus FLAG-UbcH8 ar feadh 48 h, arna chinneadh ag Dúchasach LEATHANACH agus IB le frith-FLAG. Rinne SDS-PAGE anailís bhreise ar WCLanna agus rinne IB iad a iniúchadh le frith-FLAG, frith-HA, frith-ISG15, agus frith-actin. e, Oligomerization FLAG-MDA5 WT agus Lys23Arg/Lys43Arg i gcealla MDA5 KO HEK293 a aistrítear go neamhbhuan, arna measúnú ag SDD-AGE agus IB le frith-FLAG. Rinne SDS-PAGE agus IB anailís bhreise ar WCLanna le frith-FLAG agus frith-aicin. f, Oligomerization MDA5 WT le clib FLAG agus mutants i gcealla MDA5 KO HEK293 a aistrítear go neamhbhuan, arna measúnú ag NativePAGE agus IB le frith-MDA5. Rinne SDS-PAGE anailís bhreise ar WCLanna agus rinne IB iad a iniúchadh le frith-MDA5 agus frith-aicin. g, IFN- gníomhaíocht tuairisceora luciferase i gcealla MDA5 KO HEK293 a aistríodh ar feadh 24 h le veicteoir folamh, nó MDA5 WT nó mutants atá clibáilte ag FLAG. Cuirtear gníomhaíocht Luciferase i láthair mar ionduchtú fillte i gcoibhneas leis na luachanna do chealla veicteoir-aistrithe, socraithe go 1. Léiríonn sonraí ar a laghad dhá thurgnamh neamhspleácha le torthaí comhchosúla (meán ± sd de n= 3 macasamhla bitheolaíocha in g). ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Cuireann comharthaíocht MDA5 atá ag brath ar ISGylation srian ar mhacasamhlú víris.

An chéad chéim eile a mheasamar an bhfuil gá le ISGylation de MDA5 dá chumas srian a chur ar mhacasamhlú víris. FLAG-MDA5 WT, ach ní Lys23Arg/Lys43Arg, go bhféadfadh (faoi ~2log) bac ar mhacasamhlú EMCV (Fíor 4a). Mar an gcéanna, rinne cealla MDA5 KO HEK293 athdhéanta le WT MDA5, ach níor cuireadh cealla leis an tsóiteán Lys23Arg/ Lys43Arg, a chuir srian éifeachtach ar mhacasamhlú DENV (Fíor 4b). Rinneamar athdhéanamh freisin ar SVGAanna astrocyte MDA5 KO, cineál cille a bhaineann go fiseolaíoch le haghaidh ionfhabhtú ZIKV, le veicteoir, nó MDA5 WT nó Lys23Arg/Lys43Arg, agus ansin rinneamar measúnú ar mhacasamhlú ZIKV thar chúrsa ama 40-h. Maolaíodh macasamhlú ZIKV le ~100-huaire i gcealla athdhéanta le WT MDA5 i gcomparáid le cealla veicteoir-léirithe. I gcodarsnacht leis sin, níor chuir cealla comhlánaithe le MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg srian ar ZIKV, cosúil le cealla a léirigh MDA5 Ser88Glu (Fíor 4c). Chuir WT MDA5, ach ní Lys23Arg/Lys43Arg, srian freisin ar mhacasamhlú SCoV2, cé go pointe níos lú ná mar a chonacthas do na víris eile a tástáladh (Fíor 4d).

Fíor 4|Tá gá le ISGylation le haghaidh srianadh víreasach faoi MDA5. Titreoirí EMCV in ollnós cealla HEK293T a aistríodh ar feadh 40 h le veicteoir, nó FLAG-MDA5 WT nó Lys23Arg/Lys43Arg, agus ansin ionfhabhtaithe le EMCV (MOI=0.001) ar feadh 24 h, arna chinneadh ag measúnacht TCID50. b, Céatadán na gcealla MDA5 KO HEK293 ionfhabhtaithe le DENV a aistríodh ar feadh 24 h le veicteoir, nó FLAG-MDA5 WT nó Lys23Arg/Lys43Arg, agus ansin bréagchóireáil nó ionfhabhtaithe le DENV (MOI=5) ar feadh 48 h. , arna measúnú ag FACS ag baint úsáide as frith-bhlaivirus E (4G2). SSC, scaip taobh. c, titers ZIKV i snámhán MDA5 KO SVGA a aistríodh ar feadh 30 h le veicteoir nó MDA5 WT clibáilte FLAG, Lys23Arg/Lys43Arg nó Ser88Glu agus ansin ionfhabhtaithe le ZIKV (MOI=0.1) do na hamanna sonraithe , arna chinneadh ag measúnú plaic. pfu, aonaid foirmithe plaic; hpi, uair an chloig tar éis an ionfhabhtaithe. d, titers SCoV2 i snámhán cealla HEK293T–hACE2 a aistríodh ar feadh 24 h le veicteoir folamh, nó FLAG-MDA5 WT nó Lys23Arg/Lys43Arg, agus ansin ionfhabhtaithe le SCoV2 (MOI=0.5) ar feadh 24 h, arna chinneadh ag measúnú plaic. e, Scéimreach den chur chuige turgnamhach chun ról ISG15 in MDA a ‘dhíchúpláil’{5-idirghabháil IFN ionduchtaithe óna ról i maolú comharthaíochta IFNAR. Sup., supernatant. f, aistríodh cealla 'deontóra' NHLF ar feadh 40 h leis na siRNAs léirithe agus ansin ionfhabhtaithe le mutEMCV (MOI=0.1) ar feadh 16 h. Bhí súithíní cille díghníomhaithe UV agus aistríodh go cealla 'faighteoir' Vero iad. Tar éis 24 h, bhí cealla ionfhabhtaithe le ZIKV (MOI=0.002-2) ar feadh 72 h, agus socraíodh cealla ZIKV-dearfach trí imdhíon-chothaithe le substráit frith-flavivirus E (4G2) agus TrueBlue peroxidase. g, RIG-I KO HEK293 aistríodh cealla 'deontóra' le si. C nó si.ISG15 mar aon le veicteoir nó FLAG-MDA5 WT nó Lys23Arg/Lys43Arg, ar feadh 24 h, agus ionfhabhtú EMCV (MOI=0.001) ina dhiaidh sin ar feadh 16 h. Aistríodh forlíonta cille UV-dhíghníomhaithe go cealla 'faighteoir' Vero ar feadh 24 h, agus ina dhiaidh sin ionfhabhtú le EMCV (MOI=0.001-0.1) ar feadh 40 u. Léiríodh éifeachtaí cíteapatacha arna spreagadh ag EMCV le staining Coomassie Blue. Léiríonn sonraí ar a laghad dhá thurgnamh neamhspleácha a bhfuil torthaí comhchosúla acu (meán ± sd de n= 3 macasamhla bitheolaíocha in a–d). *P< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Ansin chinneamar an éifeacht a bheadh ​​ag tosta ISG15 ar chumas MDA5 macasamhlú víris a chosc. Cé gur theip ar MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg macasamhlú EMCV a shochtadh beag beann ar tosta ISG15, chuir WT MDA5 srian éifeachtach ar mhacasamhlú EMCV in si. Cealla C-aistrithe agus, gan choinne, i gcealla ídithe ISG15- freisin (Sonraí Breisithe Fíor. 5a). Agus iniúchadh á dhéanamh againn ar mheicníocht bhunúsach na dtorthaí gan choinne seo, fuaireamar amach go raibh na cealla ionfhabhtaithe EMCV a léirigh WT MDA5 tar éis feabhas suntasach a chur ar leibhéil léiriú próitéine ISG nuair a cuireadh ISG15 ina thost i gcomparáid le cealla ionfhabhtaithe a aistríodh le WT MDA5 agus si. C (Sonraí Breisithe Fíor 5b). Mar an gcéanna, breathnaíodh tras-scríbhinn ardaithe ISG agus léiriú próitéine i gcealla easnamhacha ISG a aistríodh le EMCV RNA nó a bhí ionfhabhtaithe le mutEMCV, in ainneoin aisghairm ionduchtaithe IFN (Sonraí Breisithe Fíor 5c,d). I gcodarsnacht leis sin, aisghaireadh MDA5 an dá abairt próitéin IFN- agus ISG, mar a bhíothas ag súil (Sonraí Leathnaithe Fíor. 5d). Thugamar faoi deara gur laghdaíodh go mór an raidhse próitéine de USP18, einsím deubiquitinating a rialaíonn comharthaíocht IFNAR go diúltach31, i gcealla ídithe ISG tar éis ionfhabhtú EMCV i gcomparáid le cealla ionfhabhtaithe a aistríodh le si. C nó MDA5-siRNA sonrach (Sonraí Leathnaithe Fíor 5b,d), atá ag teacht le ról tuairiscithe ISG15 maidir le díghrádú USP18 a chosc32. I dteannta a chéile, tugann na sonraí seo le fios go bhfuil éifeacht frithvíreasach MDA5 ISGylation folaithe ag upregulation ISG neamhbhuan mar gheall ar ablation éifeacht coisctheach ISG15 ar chomharthaíocht IFNAR i socruithe turgnamhacha de spriocdhíriú géine ISG (is é sin, tosta nó KO).

Fíor 5|Ceanglaíonn SCoV2 PLpro le agus dí-ISGylates MDA5–2CARD. Léiriú ribíneach ar struchtúr criostail an choimpléasc SCoV2 PLpro: ISG15 (Banc Sonraí Próitéin, aontachas uimh. 6YVA). Léirítear iarmhair thábhachtacha a dhéanann idirghabháil ar idirghníomhaíocht láithreán 1 (Asn156 agus Arg166/Glu167) nó idirghníomhaíocht láithreán 2 (Phe69) in PLpro, chomh maith lena shuíomh gníomhach catalaíoch (Cys111). b, ISGylation de GST-MDA5-2CARD i gcealla HEK293T a comh-aistrithe ar feadh 20 h le veicteoir nó V5-clibáilte SCoV2 PLpro WT nó mutants, mar aon le FLAG–ISG15, HA–Ube1L agus FLAG–UbcH8, arna chinneadh ag GST PD agus IB le frith-FLAG agus frith-GST. Scrúdaigh IB WCLanna le frith-V5, frith-HA, frith-FLAG, agus frith-actin. c, MDA5 nó RIG-I le clib HA a cheangal le V5-clibáilte SCoV2– PLpro nó MeV-V (rialú dearfach) le clib FLAG i gcealla HEK293T a aistrítear go neamhbhuan, arna chinneadh ag HA PD agus IB le frith-V5 nó frith-FLAG, agus frith-HA. Rinne IB iniúchadh ar WCLanna le frith-V5 agus frith-FLAG. d, Oligomerization FLAG-MDA5-2CARD i gcealla HEK293T a comh-aistrithe le veicteoir, nó V5-clibáilte SCoV2 PLpro WT nó Cys111Ala ar feadh 24 h, arna measúnú ag NativePAGE agus IB le frith-FLAG. Rinne SDS-PAGE anailís bhreise ar WCLanna agus rinne IB iad a iniúchadh le frith-FLAG, frith-V5, agus frith-aictin. e, ISGylation de GST-MDA5-2CARD i gcealla HEK293T a léirigh freisin FLAG-ISG15, HA-Ube1L, agus FLAG-UbcH8, agus a comh-aistrithe ar feadh 40 h le veicteoir nó an V5-clibáilte PLpro corónach próitéiní, arna chinneadh ag GST PD agus IB le frith-FLAG, frith-V5 agus frith-GST. Léiríonn sonraí ar a laghad dhá thurgnamh neamhspleách le torthaí comhchosúla.

D'fhostaigh muid measúnacht cosanta víreas ina dhiaidh sin a dhíchúplálann go turgnamhach comharthaíocht MDA5 i gcealla ionfhabhtaithe le víreas ó chomharthaíocht IFNAR iartheachtacha sna cealla céanna (Fíor 4e). Foslíonta ó chealla 'deontóra' ionfhabhtaithe mutEMCV a bhí si. Bhí C a aistríodh, nó ídithe de cheachtar acu ISG15 nó MDA5, díghníomhaithe ultraivialait (UV) agus ansin aistríodh ar aghaidh go dtí cealla 'faighteoirí' neamhionfhabhtaithe. Rinneadh cealla faighteora ‘primed’ a ionfhabhtú le ZIKV ansin chun monatóireacht dhíreach a dhéanamh ar éifeacht fhrithvíreasach táirgeadh IFN arna idirghabháil ag cealla deontóra MDA. Whereas na supernatants ó si. Chuir cealla 'deontóra' C-aistrithe bac go láidir ar mhacasamhlú ZIKV, agus chuir na sútháin ó chealla leagain ISG15 nó MDA5 srian íosta ar ionfhabhtú ZIKV (Fíor 4f). Mar an gcéanna, aistríodh na súiteoirí cultúir ó chealla deontóra ionfhabhtaithe le EMCV le WT MDA5 mar aon le si. C ba chúis le cosaint níos mó ar chealla faighteora ón dúshlán víreasach ná mar a bhí ó chealla a léirigh WT MDA5 agus ídíodh ISG15 (Fíor 4g). I dteannta a chéile, léiríonn na sonraí seo go bhfuil ISGylation tábhachtach maidir le srianadh idirghabhálaithe MDA ar raon víreas RNA.

Fíor 6|Cuireann SCoV2 PLpro bac ar chomharthaíocht ISG15-mDA5 trí mheán a ghníomhaíochta dí-ISGylase. a, anailís RT-qPCR ar thrascríbhinní IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5, agus RIG-I i NHLFanna a aistríodh leis na siRNAanna sonraithe ar feadh 40 h agus a aistríodh ansin le RNA bréige nó SCoV2 RNA (0.4 µg ml -1 ) ar feadh 24 h. b, SCoV2 Nsp3 a cheangal le MDA5 ingenous i gcealla A549-hACE2 a bhí ionfhabhtaithe le SCoV2 (MOI=0.5) ar feadh 24 h, arna chinneadh ag IP le frith-MDA5 (nó rialú isitíopa IgG) agus IB le frith-Nsp3 agus frith-MDA5. Scrúdaigh IB WCLanna le frith-Nsp3 agus frith-actin. c, ISGylation MDA5 inchríneacha i gcealla A549–hACE2 a bhí ionfhabhtaithe nó ionfhabhtaithe le SCoV2 (MOI=0.5) ar feadh 40 h i láthair coscaire PLpro (GRL-0617; 50 µM) nó feithicil rialú (dimethylsulfoxide), arna chinneadh ag IP le frith-MDA5 (nó rialú isotype IgG), agus IB ina dhiaidh sin le frith-ISG15 agus frith-MDA5. Rinne IB raidhse próitéine de IFIT1, RSAD2, ISG15, agus actin sna WCLanna a scrúdú. D'fhíoraigh IB macasamhlú víreas éifeachtach le frith-Nsp3 agus frith-Spike (S). d, anailís RT-qPCR ar thrascríbhinní IFNB1, CCL5, agus IFIT1, agus RNA genomic EMCV (gRNA), i gcealla HeLa a aistríodh go sealadach ar feadh 24 h le veicteoir, nó V5-SCOV2 PLpro WT nó mutants, agus ansin ionfhabhtaithe le muteMCV (MOI=0.5) ar feadh 12 h. e, titers EMCV i gcomhshuíomh cealla RIG-I KO HEK293 a aistríodh go neamhbhuan ar feadh 24 h le veicteoir nó FLAG-MDA5, mar aon le V5-clibáilte SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala nó Arg166Ser/Glu167Arg ionfhabhtaithe, agus an ionfhabhtaithe le EMCV (MOI=0.001) ar feadh 16 h, arna chinneadh ag measúnú plaic. f, Flúirse próitéine de na ISGanna léirithe sna WCLanna ón turgnamh in e, arna chinneadh ag IB leis na hantasubstaintí atá léirithe. Léiríonn sonraí ar a laghad dhá thurgnamh neamhspleácha a bhfuil torthaí comhchosúla acu (meán ± sd de n= 3 macasamhla bitheolaíocha in a, d, agus e). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Díríonn SCoV2 PLpro ar MDA5 le haghaidh dí-ISGylation.

Ionchódaíonn coróinvíreas mar SARS-CoV (SCOV), MERS-CoV agus an SCoV2 a tháinig chun cinn le déanaí PLpro a dhéanann idirghabháil ar scoilteacht víreasach polapróitéine33. Ina theannta sin, tá gníomhaíochtaí deubiquitinating agus dí-ISGylating ag PLpro. Taispeánadh le déanaí go ndéanann SCoV2 PLpro freagraí frithvíreasacha a mhodhnú go príomha trína ghníomhaíocht dí-ISGylase15. Toisc gur eol gur braiteoir mór é MDA5 chun coróinvíreas34,35 a bhrath, agus toisc gur léirigh ár sonraí go bhfuil ISGylation ag teastáil le haghaidh srianadh víreas trí mheán an MDA, scrúdaíomar an mbaineann SCoV2 PLpro MDA5 ISGylation go heinsímeach chun imdhíonacht dhúchasach a bhréagnú. Chuir SCoV2 PLpro WT, ach ní a tsóiteáin neamhghníomhach catalaíoch (PLpro Cys111Ala)15, deireadh le ISGylation GST-MDA5-2CARD agus FLAG-MDA5 (Fíor 5a,b agus Sonraí Breisithe Fíor. 6a). Na mutants PLpro Asn156Glu agus Arg166Ser/Glu167Arg, a bhfuil lagú beag nó lagaithe go mór orthu i gceangal ISG15 ag an gcomhéadan 'suíomh 1', faoi seach14,36, rinne siad difear beag, nó ní raibh, ar ISGylation. I gcodarsnacht leis sin, cuirtear isteach ar PLpro Phe69Ala, ina gcuirtear isteach ar an gcomhéadan 'suíomh 2' a chinneann go tosaíocht ceangailteach le ubiquitin, ach ní ISG15,14,36, ISGylation MDA5 chomh cumasach le WT PLpro (Fíor 5a,b agus Sonraí Leathnaithe Fíor 6a ). Níor choisc SCoV2 PLpro, áfach, uileláithreacht RIG-I–2CARD (Sonraí Leathnaithe Fíor. 6b). Fuaireamar amach go ndearna PLpro idirghníomhú go sonrach le MDA5, ach ní le RIG-I, mar a rinne MeV-V a cheanglaíonn MDA5 agus a bhí ina rialtán37 (Fíor 5c). Chuir méideanna ísle PLpro bac ar chomharthaíocht le MDA5, ach ní RIG-I, ach chuir méideanna níos airde de PLpro comharthaíocht fhrithvíreasach faoi chois ag an dá RLR (Sonraí Breisithe Fíor. 6c). Neartaíonn sé seo MDA5 mar sprioc díreach ag PLpro. Is dócha gurb é dí-ISGylation de IRF3 an éifeacht coisctheach a bhíonn ag dáileoga níos airde de PLpro ar chomharthaíocht RLR15,38. Nuair a scrúdaíodh éifeacht PLpro ar oligomerization MDA5-2CARD, chuir PLpro WT ach ní Cys111Ala bac ar oligomerization MDA5-2CARD (Fíor 5d) go héifeachtach, rud a léiríonn go gcuireann SCoV2 PLpro bac ar fhoirmiú oligomer MDA5 ISGylation-spleách trína ghníomhaíocht einsímeach. Tá na heinsímí PLpro den -coronaviruses, SCoV, MERS-CoV agus víreas heipitíteas murine (MHV) gaolmhar, chomh maith leis an -coronavirus HCoV-NL63 (NL63) ceangailte freisin le ISGylation MDA5-2CARD (Fig. 5e) agus laghdaíodh go héifeachtach é. , ag tabhairt le tuiscint go bhféadfaí freasúlacht MDA5 le PLpro a chaomhnú go forleathan i measc coróinvíreas.

cistanche córas imdhíonachta a mhéadú plandaí

Déanann SCoV2 PLpro frithghníomhú ar chomharthaíocht ISG15-spleách MDA5.

Ansin chinneamar ábharthacht chomharthaíocht ISG15-spleách MDA5 le haghaidh ionduchtú cítocine frithvíreasach arna lorg ag SCoV2. Toisc gur eol go gcothaíonn ionfhabhtú SCoV2 IFNanna cineál I a laghad de bharr freasúlachtaí víreasacha éifeachtacha39, d’aonraigh muid RNA iomlán ó chealla ionfhabhtaithe SCoV agus ansin d’athaistrigh muid é ina chealla chun comharthaíocht imdhíonachta dúchasach a spreagadh. RNA SCoV2, ach ní RNA ó chealla bréige, tras-scríbhinní IFN a tharlódh go láidir; áfach, tháinig laghdú suntasach ar an ionduchtú seo nuair a tosaíodh ISG15 nó MDA5 (Fíor 6a). Ní raibh tionchar diúltach ag knockdown RIG-I ar an léiriú géine antiviral a tharraing SCoV2 RNA, rud a léiríonn go bhfuil SCoV2 RNA-PAMPanna mothaithe go príomha ag an ais ISG15-MDA5 (Fig. 6a).

Fuaireamar amach go ndearna próitéin neamhstruchtúrtha SCoV2 3 (Nsp3), a bhfuil PLpro suite laistigh de, idirghníomhú go héasca le MDA5 endogenous le linn ionfhabhtú SCoV2 barántúil (Fíor 6b). Bhí ISGylation MDA5 in-inbhraite do-bhraite i gcealla ionfhabhtaithe SCoV, cé gur spreag an víreas slonn ISG15; áfach, i gcealla ionfhabhtaithe a ndearnadh cóireáil orthu le cosc ​​​​ar leith PLpro15, feabhsaíodh MDA5 ISGylation agus ionduchtú ISG le sruth (Fíor 6c), ag tacú leis an moladh go gcuirfeadh PLpro faoi chois go héifeachtach MDA5 ISGylation agus comharthaíocht le linn ionfhabhtú beo SCoV2. Ansin rinneamar scrúdú ar éifeacht WT agus mutant PLpro ar ghníomhachtú MDA5 ingenous le linn ionfhabhtú mutEMCV. Ag teacht lena n-éifeacht ar MDA5 ISGylation (Fíor 5b agus Sonraí Breisithe Fíor. 6a), chuir SCoV2 PLpro WT agus Phe69Ala cosc ​​ar ionduchtú tras-víreasach, ach níor chuir MDA5 Arg166Ser/ Glu167Arg, cosúil leis an tsóiteán Cys111Ala, isteach ar léiriú géine frithvíreasach F. 6d). Mar aontú leis seo, feabhsaíodh macasamhlú mutEMCV i gcealla a léirigh PLpro WT nó Phe69Ala, ach ní i gcealla a léiríonn PLpro Cys111Ala nó Arg166Ser/Glu167Arg (Fíor 6d). Mar an gcéanna, chuir WT PLpro, ach ní an tsóiteáin Arg166Ser/Glu167Arg nó Cys111Ala, bac ar shrianadh EMCV ag FLAG-MDA5 (Fíor 6e); an éifeacht ar mhacasamhlú víreas a chomhghaolú le próitéiní spreagtha ISG (Fíor 6f). Le chéile, bunaíonn sé seo SCoV2 PLpro mar fhrithghníomhaí IFN a dhí-ISGylates MDA5 go gníomhach.

Plé

Is eol go dtugann comhchuingeacha ISG15 gníomhaíocht frithvíreasach don iliomad víreas; áfach, níor aithníodh ach cúpla foshraitheanna fíor12. Ar an láimh eile, gníomhaíonn ISG15 ina fhoirm neamh-chomhchuingeach go cúigeach trí chosc ar chomhartha IFNAR arna idirghabháil ag USP31,32,40 a neartú. Aithníonn an staidéar seo ról lárnach ag ISGylation in ionduchtú IFN trí mheán an MDA. Leagann ár gcuid oibre béim freisin ar a thábhachtaí atá dearadh turgnamhach ina bhfuil sé ríthábhachtach ról ISG15 i ngníomhachtú MDA5 a dhíchúpláil uaidh sin maidir le comharthaíocht IFNAR a mhaolú chun gníomhaíocht fhrithvíreasach ISG15 a nochtadh. In orgánach ionfhabhtaithe, is dócha gurb é suim na n-imeachtaí iomadúla ISGylation (a dhéanann difear do phróitéiní óstacha agus víreasacha araon) a chinneann toradh an ionfhabhtaithe agus na pataiginéis, a d’fhéadfadh a bheith ag brath ar an gcomhthéacs12.

Buntáistí cistanche tubulosa- an córas imdhíonachta a neartú

Tugann ár dtorthaí le fios go bhfeidhmíonn ISGylation de MDA5 ar aon dul leis an uileláithreacht atá nasctha le Lys de RIG-I5: tá an dá PTM (1) á rialú ag PP1-dífhosfarú spreagtha agus (2) a chuireann oligomerization CARD agus RLR chun cinn níos airde. -ordú tionóil. Mar sin féin, cé go bhfuil ubiquitin flúirseach i gcealla neamh-ionfhabhtaithe agus ionfhabhtaithe, méadaítear léiriú ISG15 go láidir trí spreagadh IFN. Mar sin féin, fiú ag leibhéil bhunúsacha, tá ISG15 comhchuingeach le go leor próitéiní óstaigh20, lena n-áirítear MDA5 mar a léirigh ár gcuid oibre, a d'fhéadfadh a bheith leordhóthanach do ghníomhachtú tosaigh MDA5. Le linn ionfhabhtuithe víreasacha a bhraitheann an iliomad PRRanna, féadfaidh MDA5 ISGylation a bheith ina mheicníocht 'priming' trína rialaítear ISG15 ag braiteoir láithreach dúchasach (mar shampla, RIG-I)41 a chuireann tús le MDA5 chun dul isteach i mód 'tús'. Toisc go rialaíonn ISG15 go diúltach RIG-I16,17, féadfaidh ISGylation 'athrú braiteora' a spreagadh nuair a chuirtear gníomhachtú MDA5 chun cinn nuair a mhéadaíonn leibhéil ISG15, agus go bhfuil gníomhaíocht RIG-I á mhaolú. D'aithníomar go gcuireann SCoV2 PLpro antagonizes MDA5 ISGylation trína ghníomhaíocht einsímeach tar éis ceangal leis an braiteoir; is dócha go gcaomhnaítear an straitéis seo i measc coróinvíreas, rud a dteastaíonn tuilleadh imscrúdaithe. Nocht anailísí micreascópachta crió-leictreoin go bhfuil Nsp3 corónach mar chuid de choimpléasc pore a chuimsíonn vesicles dúbailte-membrane endoplasmic-díorthaithe reticulum agus a onnmhairíonn RNA víreasach nua-shintéisithe42. Mar sin, féadfaidh MDA5 é féin a shuíomh gar do shuíomh onnmhairithe víreasach RNA chun braite PAMP a éascú; áfach, cuireann fearann ​​PLpro Nsp3 (atá ar an taobh cíteaplasma) bac ar chomharthaíocht MDA5 trí dhí-ISGylation díreach. D’fhéadfadh roinnt víris bac a chur ar ISGylation MDA5 freisin trí dhírialú fosfarylation MDA5, mar a thaispeántar do MeV-V. Go hachomair, nochtar inár staidéar ról suntasach ag ISGylation maidir le himdhíonacht idirghabhála MDA a ghníomhachtú chomh maith lena chosc ag SCoV2, ag nochtadh sprioc mhóilíneach fhéideartha do dhearadh na teiripe in aghaidh COVID{-19.

Tagairtí

1. Liu, G. & Gack, MU Feidhmeanna sainiúla agus ceolfhoirneacha na mbraiteoirí RNA dúchasach. Díolúine 53, 26–42 (2020).

2. Wu, J. & Chen, ZJ Braiteadh imdhíonachta dúchasach agus comharthaíocht aigéid núicléacha chitosólacha. Annú. Ath. Immunol. 32, 461–488 (2014).

3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I agus braiteoirí RNA eile i díolúine antiviral. Annú. Ath. Immunol. 36, 667–694 (2018).

4. Schlee, M. Máistir-bhraiteoirí ar ghabhdóirí pataigineacha RNA-RIG-I like. Imdhíonbhitheolaíocht 218, 1322–1335 (2013).

5. Gabhdóirí cosúil le Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I: a rialáil agus a róil i braiteadh RNA. Nát. Ath. Immunol. 20, 537–551 (2020).

6. Wies, E. et al. Tá dífhosfarú na mbraiteoirí RNA RIG-I agus MDA5 ag an phosphatase PP1 riachtanach do chomharthaíocht imdhíonachta dúchasach. Díolúine 38, 437–449 (2013).

7. Gack, MU et al. Tá TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase riachtanach do ghníomhaíocht frithvíreasach RIG-I-idirghabhála. Nádúr 446, 916–920 (2007).

8. Chiang, C. & Gack, MU Rialú iar-aistrithe ar bhealaí braite pataigin intracellular. Treochtaí Imdhíonachta. 38, 39–52 (2017).

9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Feidhmeanna comhroinnte agus sainiúla de chineál I agus de chineál III interferons. Díolúine 50, 907–923 (2019).

10. Schoggins, JW Géinte spreagtha Interferon: cad a dhéanann siad go léir? Annú. Rev. Viol. 6, 567–584 (2019).

11. Zhang, D. & Zhang, DE Interferon-spreagtha géine 15 agus an córas próitéin ISGylation. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119–130 (2011).

12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 in imdhíonacht antiviral agus níos faide anonn. Nát. An tUrr. Micribhith. 16, 423–439 (2018). 13. Hadjadj, J. et al. Gníomhaíocht lagaithe de chineál I interferon agus freagairtí athlastacha in othair thromchúiseacha COVID-19. Eolaíocht 369, 718–724 (2020).

14. Klemm, T. et al. Meicníocht agus cosc ​​ar an bpróitéin cosúil le papain, PLpro, de SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).

15. Shin, D. et al. Rialaíonn próitéáis cosúil le Papain scaipeadh víreasach agus díolúine dúchasach SARS-CoV-2. Nádúr 587, 657–662 (2020).

16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY Rialú aischothaithe diúltach ar chomharthaíocht frithvíreasach RIG-I-idirghabhála trí chomhchuingeach ISG15 arna spreagadh ag interferon. J. Víreas. 82, 1474–1483 (2008).

17. Du, Y. et al. Cuireann LRRC25 cosc ​​ar chomharthaíocht chineál I IFN trí dhíriú ar ISG15-RIG-I bainteach le haghaidh díghrádaithe uathphagaigh. EMBO J. 37, 351–366 (2018).

18. Hato, SV et al. Blocann an próitéin ceannaire mengovirus te tras-scríobh géine interferon-alfa/beta agus cuireann sé bac ar ghníomhachtú fachtóir rialála interferon 3. Micribhithile cille. 9, 2921–2930 (2007).

19. Deddouche, S. et al. Gníomhaire MDA5 atá bainteach le LGP a shainaithint i gcealla a bhfuil ionfhabhtú picornavirus orthu. eLife 3, e01535 (2014).

20. Díríonn córas comhchuingeach Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Te ISG15 go ginearálta ar phróitéiní nua-shintéisithe: impleachtaí d’fheidhm fhrithvíreasach ISG15. Mol. Cill 38, 722–732 (2010).

21. Lenschow, DJ et al. Sainaithint géine spreagtha interferon 15 mar mhóilín antiviral le linn ionfhabhtú víreas Sindbis in vivo. J. Víreas. 79, 13974–13983 (2005).

22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Fosphorylation-idirghabhála rialáil diúltach ar ghníomhaíocht antiviral RIG-I. J. Víreas. 84, 3220–3229 (2010).

23. Nistal-Villan, E. et al. Ról diúltach RIG-I serine 8 phosphorylation i rialáil táirgeadh interferon-beta. J. Biol. Ceimic. 285, 20252–20261 (2010).

24. Rialaíonn Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU kinase próitéine traidisiúnta C-alfa (PKC-alpha) agus PKC-beta trasdul comhartha antiviral RIG-I go diúltach. J. Víreas. 86, 1358–1371 (2012).

25. Davis, ME et al. Teastaíonn frithbheartaíocht an phosphatase PP1 ag víreas na mbruitíneach V de phróitéin chun éalú imdhíonachta dúchasach MDA5. Miocrób Óstach Cill 16, 19–30 (2014).

26. Cuireann Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3eta próitéin chaperone díolúine dúchasach antiviral chun cinn trí oligomerization MDA5 agus athdháileadh infhéitheach a éascú. PLoS Pathog. 15, 1007582 (2019).

27. Wu, B. et al. Bunús struchtúrach le haghaidh aitheantais dsRNA, foirmiú filiméid, agus gníomhachtú comhartha frithvíreasach ag MDA5. Cill 152, 276–289 (2013).

28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Struchtúir Cryo-EM de chuid filiméid dsRNA MDA ag céimeanna éagsúla de hidrealú ATP. Mol. Cill 72, 999–1012 (2018).

29. Bruns, AM, Leser, GP, Uaineoil, RA & Horvath, CM Te braiteoir imdhíonachta dúchasach Gníomhaíonn LGP2 comharthaíocht fhrithvíreasach trí idirghníomhaíocht MDA5-RNA agus cóimeáil filiméid a rialáil. Mol. Cill 55, 771–781 (2014).

30. Uchikawa, E. et al. Anailís struchtúrach ar dsRNA ceangailteach le gabhdóirí aitheantais patrún frithvíreasacha LGP2 agus MDA5. Mol. Cill 62, 586–602 (2016).

31. Malakhova, OA et al. Is rialtóir nua é UBP43 ar chomharthaíocht interferon neamhspleách ar a ghníomhaíocht isopeptidase ISG15. EMBO J. 25, 2358–2367 (2006).

32. Zhang, X. et al. Cuireann ISG15 incheallach daonna cosc ​​ar ró-aimpliú interferon-alfa/béite agus uath-athlasadh. Nádúr 517, 89–93 (2015).

33. Fhearchair, BH et al. Aithint táirgí macasamhail den choróinvíreas géar-siondróm riospráide agus tréithriú gníomhaíochta próitéáis cosúil le papain. J. Víreas. 78, 13600–13612 (2004).

34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Aithníonn MDA5 víreas heipitíteas luiche coronavirus Murine agus spreagann sé interferon de chineál I i macraphages inchinne/microglia. J. Víreas. 82, 9829–9838 (2008).

35. Menachery, VD et al. Tanú agus athchóiriú géarshiondróm riospráide géar tsóiteáin coronavirus in easnamh ar ghníomhaíocht 2′-O-methyltransferase. J. Víreas. 88, 4251–4264 (2014).

36. Bekes, M. et al. Aitheantas do ghníomhaíochtaí dé-ubiquitin agus dí-uibítín a bhaineann le próitéáis cosúil le papain coronavirus SARS. Mol. Cill 62, 572–585 (2016).

37. Childs, K. et al. Is comhsprioc é mda-5, ach ní RIG-I, do phróitéiní paramyxovirus V. Víreolaíocht 359, 190–200 (2007).

38. Shi, HX et al. Rialúchán dearfach ar ghníomhachtú fachtóir rialála 3 interferon ag Herc5 trí mhodhnú ISG15. Mol. Cill Biol. 30, 2424–2436 (2010).

39. Blanco-Melo, D. et al. Tiomáineann freagra neamhchothrom óstaigh ar SARS-CoV-2 forbairt COVID-19. Cill 181, 1036–1045 (2020).

40. Speer, SD et al. Easnamh ISG15 agus friotaíocht víreasach méadaithe i ndaoine ach ní lucha. Nát. Cumann. 7, 11496 (2016).

41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. Te róil riachtanacha, neamhiomarcacha RIG-I agus MDA5 maidir le hionfhabhtú víreas na Níle Thiar a bhrath agus a rialú. J. Víreas. 87, 11416–11425 (2013).

42. Mac Tíre, G. et al. Cuimsíonn pore móilíneach membrane dúbailte an orgánail mhacasamhlú coronavirus. Eolaíocht 369, 1395–1398 (2020).

43. Mór, EO et al. Bunú líne de chealla glial féatais daonna a thacaíonn le iolrú víreas JC. Proc. Natl Acad. Sci. USA 82, 1257–1261 (1985).

44. Hertzog, J. et al. Gineann ionfhabhtú le víreas Zika aonraíoch Brasaíleach RNA spreagthach RIG-I agus na bloic próitéin víreasach NS5 cineál I ionduchtúcháin agus comharthaíochta IFN. Eur. J. Imdhíon. 48, 1120–1136 (2018).

45. Cerikan, B. et al. Oiriúnú cille intreach ag eascairt as ablation ainsealach príomhrialtóir rho GTPase. Dev. Cill 39, 28–43 (2016).

46. ​​Chan, YK & Gack, MU Meicníocht phospomimetic-bhunaithe de víreas dengue chun imdhíonacht dhúchasach a chomhrac. Nát. Imdhíonól. 17, 523–530 (2016).

47. Riedl, W. et al. Déanann víreas Zika NS3 aithris ar mhóitíf cheangailteach 14-3-3-cheallach chun imdhíonacht dhúchasach inmheánaithe RIG-I- agus MDA a bhréagnú. Miocrób Óstach Cill 26, 493–503 (2019).

48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM STAT3 uileláithreacht agus díghrádú ag víreas leicneach faoi chois cítocín agus comharthaíocht oncogene. J. Víreas. 77, 6385–6393 (2003).

49. Oudshoorn, D. et al. Is é HERC6 an príomh-ligáis E3 le haghaidh comhchuingeach domhanda ISG15 i gcealla luiche. PLoS ONE 7, e29870 (2012).

50. Kim, DK et al. Bailiúchán cuimsitheach, solúbtha de réigiúin chódú SARS-CoV-2. G3 (Bethesda) 10, 3399–3402 (2020).

51. Chiang, C. et al. Díríonn an t-oncoprotein víreas papilloma daonna E6 ar USP15 agus TRIM25 chun comharthaíocht imdhíonachta dúchasach RIG-I-idirghabhála a chosc. J. Víreas. 92, r01737-17 (2018).

52. Gack, MU et al. Róil RIG-I N-terminal CARD tandem agus malairt splice in aistriú comhartha frithvíreasach trí mheán TRIM. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 16743–16748 (2008).

53. Chiang, JJ et al. Cothaíonn díchumhachtú víreasach tras-scríbhinní pseudogene rRNA ceallacha 5S díolúine RIG-I-idirghabhála. Nát. Imdhíonól. 19, 53–62 (2018).

54. Sparrer, KMJ et al. Déanann TRIM23 idirghabháil ar uathphagaireacht víreas-spreagtha trí TBK1 a ghníomhachtú. Nát. Micribhiol. 2, 1543–1557 (2017).