Léargas In Vitro Agus i Silico ar Choscairí Tyrosinase

Teagmháil: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ríomhphost:audrey.hu@wecistanche.com

Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Páirc Yujin a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a

Teibí

Is príomh-einsím é Tyrosinase atá freagrach as bithsintéis melanin agus tá sé éifeachtach chun damáiste craiceann de bharr radaíochta ultraivialait a chosaint. Mar chuid d’iarrachtaí leanúnacha chun coscairí cumhachtacha tyrosinase a fháil amach, dhear agus rinneamar trí dhíorthaigh dhéag (E)-beinsilideéin-1-binsilideéin-1-béinsilideéin(BID1–13) a dhear agus a shintéisiú go córasach agus shocraigh siad a ngníomhaíochtaí coisctheacha i gcoinne tyrosinase. I measc na gcomhdhúile a ndearnadh meastóireacht orthu, b'é BID3 an t-inchoisctheoir is cumhachtaí ar tyrosinase muisiriún (IC50=0.034 mM, gníomhaíocht mhiocophenolate; IC50=1.39 mM, gníomhaíocht défheinóil). Léirigh staidéir chinéiteach gur léirigh BID3 cineál measctha de chosc tyrosinase le luach Ki de 2.4 mM ag baint úsáide as L-DOPA mar fhoshraith. In ionsamhlúcháin mhaolaithe mhóilíneacha silico léiríodh gur féidir le BID3 ceangal a dhéanamh le suíomhanna catalaíoch agus allosteric tyrosinase chun gníomhaíocht einsíme a chosc a dheimhnigh staidéir thurgnamhach in vitro idir BID3 agus tyrosinase. Ina theannta sin, tháinig laghdú ar an ábhar melanin agus cuireadh bac ar ghníomhaíocht tyrosinase cheallacha tar éis cóireála BID3. Léirigh na breathnuithe seo gur coscóir cumhachtach tyrosinase é BID3 agus go bhféadfaí é a úsáid mar oibreán whitening chun neamhoird a bhaineann le lí a chóireáil.

Cistanche: luibh gníomhaire whitening craiceann

1. Réamhrá

Déantar melanin a shintéisiú le melanocytes sa chiseal vassal den eipideirm, go ginearálta tagraíonn sé don teaghlach líocha ar a dtugtar go coitianta craiceann mamaigh a chosaint ó dhamáiste de bharr radaíocht UV díobhálach trí fhréamhacha saor in aisce a scavening nó solas UV a scaipeadh [1]. Mar sin féin, tá giniúint flúirseach meileanncan ina chúis le hipearpigment infheicthe an eipideirm, rud a d’fhéadfadh a bheith soiléir mar melasma, freckles, spotaí aoise, nó leitísíní senile[2].

Is príomh-einsím é Tyrosinase (EC 1.14.18.1), meitealeinsím ina bhfuil copar, a bhfuil baint aige le próisis mheileaigineacha. Déanann Tyrosinase an dá chéim a theorannú rátaí i melanogenesis a chatalú; hiodrocsailiú tyrosine (gníomhaíocht cresolase nó mycophenolate) chun 3,4-déhidroxyphenylalanine (L-DOPA) a tháirgeadh agus ocsaídiú L-DOPA (gníomhaíocht catecholase nó défheinóil) chuig an DOPA-quinone comhfhreagrach. Nuair is L-tyrosine an tsubstráit, is é an táirge oftyrosinase catalyzed imoibriú DOPA-quinone, a thiontú ansin go melanin [3]. Tá na céimeanna seo ríthábhachtach chun an craiceann a chosaint i gcoinne damáiste UV. Muisiriún Agaricus úsáidtear chun itscommercially ar fáil agus homology ard le mammaliantyrosinase einsím a fhágfaidh go bhfuil sé oiriúnach go maith mar mhúnla le haghaidh staidéir ar melanogenesis [4]. I ndaoine, cabhraíonn melanin leis an gcraiceann a chosaint ón damáiste a dhéanann UV [5]. Mar sin féin, tá an leibhéal iomarcach melanincan ina chúis le neamhoird dermatological éagsúla lena n-áirítear hyperpigmentations, melasma, freckles, agus spotaí aoise [6]. Dá bhrí sin, tá gá le coscairí newtyrosinase a thaispeánann airíonna atá cosúil le drugaí agus le bánú craicinn chun bac a chur ar lí iomarcach an chraiceann.

1-Breathnaítear ar indanone, le cnámharlach benzoyl-cyclopentanone, mar chol ceathracha dochta cailcíní, a ionchorpraíonn an córas céatóin neamhsháithithe de chailcóin a fhoirmíonn fáinne timthriallach 5 bhall, ar comhábhar é a tharlaíonn go nádúrtha i láthair i bhfoinsí éagsúla plandaí inite [7 ]. Tá sé léirithe ag roinnt staidéir go bhfuil tábhacht chógaseolaíoch ag comhdhúile a bhfuil 1-déanta acu, mar go léiríonn siad gníomhaíochtaí bitheolaíocha tairbhiúla éagsúla, lena n-áirítear frith-athlastach [8-10], frith-ailse [11,12], frithocsaídeach [13], frith-Parkinson's. galair [14], galar frith-Alzheimer[15-17], frithmhiocróbach [18], airíonna frith-imdhíonachta [19], andanti-tyrosinase [20].

Is cetóin aramatacha iad cailcóin (1, 3-dialann-2-cinn chuí) a chuimsíonn dhá fháinne aramatacha atá nasctha le córas carbóinile a,b-neamhsháithithe trí charbón mar chroílár lárnach [21, 22]. Is comhpháirteanna a fhaightear go nádúrtha iad seo a fhaightear i bplandaí nádúrtha inite éagsúla agus a mheastar mar chomhdhúile réamhtheachtaithe le haghaidh bealach sintéiseach flavonoids agus isoflavonoids cosúil le pirimidín, flavanol, flavones, flavanones, isoflavones, aurones, anthocyanidin, dihydroflavanol, agus dihydrochalcone [23-25]. Tá an córas carbóinile neamhsháithithe a, b fíorthábhachtach don chineál bitheolaíoch, ós rud é go ndéantar na córais seo a dháileadh i go leor táirgí nádúrtha cosúil le cailcíní chomh maith le indanone, áit a bhfuil na móilíneacha sách níos plánach, agus go ndéantar tarchur éifeachtaí leictreonacha na n-ionadaí aryl a threorú. don ghrúpa carbóinile [7]. Thuairiscigh go leor taighdeoirí roimhe seo gur aibhsíodh cailcíní mar aicme nua coscairí tyrosinase i roinnt foilseachán [26-29]. Le déanaí, dhear agus rinne Kim agus comh-oibrithe [30,31] sraith díorthaigh chailcóin a dhearadh agus a shintéisiú agus rinne siad iad a mheas le haghaidh theirin vitro frith- tyrosinase agus gníomhaíochtaí frith-melanogenic i gcoinne melanocytes murine.

De réir ár sonraí a tuairiscíodh roimhe seo, léirigh díorthaigh le scafall carbóinile an(E)-b-phenyl-a,b-neamhsháithithe cosc ​​​​potenttyrosinase [32-34]. (E)-Beinsilideéin-1-Is féidir le indanóin a bheith ina n-oibreán tarraingteach frith-melanóigineach ós rud é go bhfuil an scafall carbóinile (E) -b-feinil-a,b-neamhsháithithe ina struchtúr ceimiceach ag na comhdhúile. Go háirithe, Radhakrishnan et al. (2015) [20]dhear agus rinne sé sraith de dhíorthaigh bheinsiledéinea-1-beinsiledéine a bhfuil cumraíocht (Z)-chumraíocht orthu a dhearadh agus a shintéisiú agus rinne siad meastóireacht ar ghníomhaíocht forant-tyrosinase. Cé go bhfuil imscrúduithe déanta ar na díorthaigh (Z)-beinsileideéin-1-andanóin{-1-seo, tá gníomhaíochtaí frith-tírosinase agus frith-melanogenic de (E)-beinsilideéin-1-díorthaigh indanóine le hiniúchadh fós.

Mar sin, dhear agus rinneamar trí chomhdhúil dhéag (BID1-13) den chnámharlach indanóin a bhfuil foirm (E) beinsilideéin orthu a dhearadh agus a shintéisiú. I measc na gcomhdhúile sintéiseacha seo, léirigh 2,{5}}déhidroxygroup ar an bhfáinne B de 1-indanone an cosc ​​tyrosinasein is mó (thart ar 400-huaire níos éifeachtaí ná aigéad kojic, rialú dearfach). Ina theannta sin, déanaimid meastóireacht bhreise ar ghníomhaíocht choisctheach tyrosinasein BID3 chomh maith lena ról rialála i sintéis melanin a shainiú ag baint úsáide as cealla melanoma B16F10. I dturgnaimh leathnaithe, rinneamar measúnú ar acmhainneacht frith-melanóigineach BID3 agus rinneamar iarracht cinéitic na heinsíme agus staidéir mhóilíneacha docking a aithint. I dturgnaimh leantacha, rinneadh iniúchadh freisin ar acmhainneacht tyrosinase cheallacha BID3 agus ar tháirgeadh melanin i gcealla B16F10melanoma a-MSH agus IBMX-spreagtha.

FRITH-ocsaídiúcháin AGUS CRUTHÚ Craiceann: Sliocht CISTANCHE

2. Ábhair agus modhanna

2.1. Imoibrithe

Tyrosinase muisiriún (EC 1.14.18.1), hormón a spreagann alfa-melanocyte (a-MSH), 3-isabúitile-1-meitilacsanthine (IBMX), L-tyrosine, L-3,{{ 11}}ceannaíodh déhidrocsafheiniolalainín (L-DOPA), sulfocsaíd démheitiol (DMSO), aigéad kojic, aigéad phthalic, agus aigéad tras-cinnamic ó Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAM). Ceannaíodh meán Eagle (DMEM) modhnaithe Dulbecco, séiream bó féatais (FBS), streptomycin, agus amfatericin ó WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, An Chóiré Theas). Ceannaíodh gach imoibrí eile ó Sigma-Aldrich.

sliocht cistanche tubulosa

2.2. Ceimic

2.2.1. Modhanna ginearálta

Fuarthas na himoibrithe go léir ar bhonn tráchtála agus úsáideadh iad gan íonú breise. Rinneadh crómatagrafaíocht tanaí-chiseal (TLC) agus colúnagrafaíocht ar phlátaí 60F245 réamhbhrataithe Merck agus MP Silica 40–63, 60 Å, faoi seach. Fuarthas sonraí mais-speictreascópachta ardtaifigh (AD) ar mais-speictriméadar crómatagrafaíocht leachta eitilte (LC) Agilent AccurateMass AccurateMass (Q-TOF) i mód dearfach ESI. Taifeadadh speictrim athshondais mhaighnéadaigh núicléach (NMR) ar speictriméadar Varian Unity INOVA 400 nó speictriméadar Varian UnityAS500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) le haghaidh 1H NMR (400 agus 500 MHz) agus le haghaidh 13C NMR (100 MHz), faoi seach . Úsáideadh DMSO d6, CD3OD, agus CDCl3 mar thuaslagóirí NMR le haghaidh samplaí NMR. Tomhaiseadh tairiseach cúplála (J) agus sealluachanna ceimiceacha i hertz (Hz) agus páirteanna in aghaidh an mhilliúin (ppm), faoi seach. Is iad seo a leanas na giorrúcháin a úsáidtear san anailís ar shonraí 1H NMR: s (singil), bs (singil leathan), d (dúbailte), dd (dúbailt dhúbailte), t (tríbhileog), TD (tríleit dhúbailte), q ( ceathairéad), agusm (iolra).

2.2.2. Nós imeachta do shintéis BID1–13

Tosaíodh tuaslagán beinsaildéad (1.1–1.2 Equiv.) agus 1-indanone(100 mg, 0.76 mmol) in 1 M in aigéad aicéiteach HCl (0.4 mL) ag teocht an tseomra ar feadh 4-48 h. Tar éis an t-uisce a chur leis, rinneadh na deascáin a scagadh agus a ní le huisce agus le heacsán: eitileatáit (1:1), heacsán: déchlóraimeatán (4:1–1:1), nó meascán déchlóraimeatán agus meatánól, ag brath ar airíonna na mbeinsaildéad a bhí fágtha. 32.8–99.1 faoin gcéad 32.8–99.1 faoin gcéad a thabhairt (E)-beinsiledéine-1-indanóin (BID1–13) . Cuirtear tréithriú struchtúrach (1H agus 13C NMR agus sonraí maise gach CFG) de chomhdhúile sintéiseithe ar fáil san Fhaisnéis Fhorlíontach.

2.2.2.1. (E)-2-(4-Hidroxybenzylidene)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one(BID1).

Soladach buí; toradh, 93.4 faoin gcéad ; am imoibrithe, 6 h; foirmle mhóilíneach, C16H12O2; mp, 224.7–225.9 C; 1H NMR (400 MHz,DMSO d6) d 10.10 (s, 1H, OH), 7.72 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7.64–7.58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7.43 (s, 1H, vinilic H), 7.39 (t,1H, J=7.2 Hz, 6-H), 6.87 (d, 2H, J=8.0 Hz, 30-H, {{46 }}H), 3.99 (s, 2H,CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO D6) D 193.9, 160.1, 150.4, 138.3,135.1, 134.0, 133.6, 132.2, 128.2, 127.2, 126.7, 124.1, 116.7, 32.6; H) móide calcd 237.0910, obsd 237.0911.

2.2.2.2. (E)-2-(3,4-Dihydroxybenzylidene)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amháin (BID2).

Soladach buí; toradh, {{{{0}}.6 faoin gcéad ; am imoibrithe, 5 h; foirmle lara mhóilíneach, C16H12O3; mp, 251.2–252.4 C; 1H NMR (400 MHz,DMSO d6) d 9.65 (s, 1H, OH), 9.24 (s, 1H, OH), 7.72 (d, 1H,J=7 .6 Hz, 7-H), 7.66–7.61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7.42 (t, 1H,J {{35 }}.2 Hz, 6-H), 7.35 (s, 1H, vinilic H), 7.19 (s, 1H, 20-H), 7.08 (d,1H , J=8.0 Hz, 60-H), 6.83 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 3.98 (s, 2H,CH2 ); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.8, 150.4, 148.7, 146.3,138.3, 135.1, 134.5, 132.0, 128.2, 127.3, 127.1. . HRMS (ESI móide ) m/z C16H13O3 (M móide H) móide calcd253.0859, obsd 253.0857.

2.2.2.3. (E)-2-(2,4-Dihydroxybenzylidene)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amháin (BID3).

Soladach buí; toradh, 5{{20}}.9 faoin gcéad ; am imoibrithe, 10 h; foirmle mhóilíneach, C16H12O3; mp, 198.5–199.9 C (Nollaig); 1H NMR(500 MHz, CD3OD) d 8.17 (s, 1H, vinilic H), 7.82 (d, 1H, J=8.0 Hz,60-H), 7.67–7.63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7.45 (t, 1H, J=7.0 Hz, 6-H), 6.45 (d , 1H, J=8.5 Hz, 50-H), 6.39 (s, 1H, 30-H), 4.01 (s, 2H,CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.9, 161.6, 160.4, 150.3,138.6, 134.8, 131.7, 130.3, 128.7, 128.1, 127.9, 128.1, 127.9, 128.1, 127.2, 128.1, 127.2, 128.1, 127.2, 128.1, 127.2, 128.1, 127.2, 128.1, 127.2, 128.1, 127.2, 128.1, 127.2, 128.1, 161.6, 160.4 HRMS (ESI móide ) m/z C16H13O3 (M móide H) móide calcd253.0859, obsd 253.0858.

2.2.2.4. (E)-2-(4-Hidrocsa-3-methoxybenzylidene)-2,3-dihydro-1Hinden-1-amháin (BID4).

Soladach buí; toradh, 52.0 faoin gcéad ; am imoibrithe, 4 h; foirmle mhóilíneach, C17H14O3; mp, 186.9–187.4 C; 1H NMR(400 MHz, DMSO d6) d 9.71 (s, 1H, OH), 7.73 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7.67–7.62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7.45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7.43(t, 1H, J=7.2 Hz, 6-H), 7.31 (s, 1H, vinilic H), 7.24 (dd, 1H, J=8.0,2.0 Hz, 60-H), 6.87 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 4.05 (s, 2H, CH2 ), 3.84(s, 3H, OCH3); 13c NMR (100 MHz, DMSO D6) D 193.9, 150.5,149.7, 148.5, 138.3, 135.2, 134.4, 132.3, 128.2, 127.3, 127.1,125.7, 124.1, 116.6, 115.4, 56.3, 32.5; HRMS (ESI móide ) m/z C17H15O3(M móide H) móide cailcd 267.1016, obsd 267.1016.

2.3. Meastóireacht bhitheolaíoch

2.3.1. Measúnacht coisctheach tyrosinase muisiriún

Rinneadh measúnacht ar ghníomhaíocht choisctheach Tyrosinase ag baint úsáide as tyrosinase muisiriún mar a thuairiscítear roimhe seo, le mionmhodhnú[35,36]. Go hachomair, cuireadh 10 mL de thiúchan sonraithe de gach comhdhúil (0.0005–50 mM) agus 20 mL de tyrosinase muisiriún (1000 aonad/mL) i maolán fosfáite 50 mM (pH 6.5) le imoibriú 170 mL meascán i 96-mhicrphláta tobair (Corning, SAM).Ba é an cóimheas idir tuaslagán L-tyrosine nó L-DOPA 1 mM, maolán potaisiam fosfáit 50 mM (pH 6.5), agus uisce driogtha ná 10:10:9. Goradh meascáin imoibríochta ag 37 C ar feadh 30 nóiméad. Ina dhiaidh sin, tomhaiseadh an méid dopacróim a táirgeadh i ngach tobar trí anailís speictrophotiméadrach ag 492 nm (OD492) ag baint úsáide as léitheoir micreaphláta. Ríomhadh an ráta coiscthe tyrosinase ( faoin gcéad ) mar (1 Abssample / Abscontrol) 100 faoin gcéad . Léiríodh an leibhéal coiscthe samplach mar an tiúchan a theastaíonn le haghaidh coiscthe 50 faoin gcéad (IC50).

2.3.2. Anailís cinéiteach einsím le tyrosinase

Chun meicníochtaí cinéiteach an choisc a chinneadh, úsáideadh dhá mhodh cinéiteach comhlántacha: Lineweaver-Burk agus Dixonplots [37-39]. Ag baint úsáide as ceapacha Lineweaver-Burk (cómhalartacha dúbailte), socraíodh an cineál coiscthe BID3 trí úsáid a bhaint as tiúchain éagsúla L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5, agus 1 mM), mar fhoshraitheanna, in éagmais agus láithreacht tiúchain éagsúla BID3 (1, 2, agus 4 lM). Fuarthas plota Dixon (ceapacha cómhalartacha aonair) fortyrosinase i láthair tiúchain éagsúla L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5, agus 1 mM ). Ba iad na tiúchain BID3 ná 1, 2, agus 4 mM. Bhí na nósanna imeachta einsímeacha comhdhéanta de na modhanna measúnaithe tyrosinase a ndearnadh cur síos orthu roimhe seo. Cinneadh an tairiseach coiscthe (Ki) ó léiriú ceapacha Dixon.

2.3.3. Insamhaltaí múchta móilíneacha Tyrosinase

Chun struchtúr an choimpléasc einsím-choiscthe a chinneadh agus chun cruinneas, atrialltacht agus iontaofacht na dtorthaí docking a chinntiú, d'fhostaigh muid bogearraí AutoDock4.2. Le haghaidh staidéir dicking, fuarthas na struchtúir chriostail de sprioc próitéin tyrosinase muisiriún ón ailíniú seicheamh próitéine (Banc Sonraí Próitéin (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Rinneadh ionsamhlúcháin uathoibrithe duga idir tyrosinase agus aigéad kojic, aigéad phthalic, aigéad cinnamic, nó BID3 Maidir leis an nós imeachta docking: 2D a thiontú go struchtúir 3D, muirir ríofa, agus adaimh hidrigine curtha leis ag baint úsáide as an gclár ChemOffice (http://www.cam bridgesoft.com) [41 Baineadh úsáid as LigandScout 4.1.5 chun idirghníomhaíochtaí féideartha idir ligands agus tyrosinase a thuar agus chun cógasphores a aithint.

2.3.4. Saothrúchán cille agus measúnacht ar inmharthanacht na gceall

Ceannaíodh cealla melanoma B16F10 Murine ó Bhanc Líne na gCeall na Cóiré (KCLB, Seoul, an Chóiré) agus saothraíodh iad i DMEM arna fhorlíonadh le 10 faoin gcéad FBS agus 1 faoin gcéad streptomycin, agus ansin gortha ag 37 C, taisithe le 5 faoin gcéad atmaisféarach CO2. Rinneadh anailísí inmharthanachta cille mar a thuairiscítear roimhe seo [42]. Go hachomair, síol cealla ag dlús 1 104 cill/tobar i 96-phláta tobair ar feadh 24 h. An lá dár gcionn, nochtadh na cealla do thiúchan éagsúla BID3 agus goraíodh iad ar feadh 24 nó 48 u, faoi seach. Ansin, cuireadh tuaslagán 10 ml EZ-Cytox le gach tobar agus goraíodh na cealla ar feadh 2-4 h. Cinneadh ionsú trí úsáid a bhaint as ELISAat tonnfhad 450 nm. Rinneadh gach measúnacht i dtrí chóip.

2.3.5. Measúnacht ábhar melanin

Socraíodh ábhar meileanin mar a thuairiscítear roimhe seo [43].Síolaíodh cealla meileanóma B16F10 (2 105 cill/tobar) i 6-phlátaí saothraithe tobair. Chun éifeacht coisctheach onmelanogenesis BID3 a chinneadh, cuireadh meán ina bhfuil BID3 (1, 5, agus 10 lM) nó aigéad kojic (10 mM) mar rialú dearfach ar feadh 1 uair an chloig, agus ansin spreagtar é le a-MSH (5 lM). ) agus IBMX(200 mM) ar feadh 48 h. Tar éis iad a ní faoi dhó le PBS, scoiteadh na cealla trí gor i Trypsin/EDTA, agus tuaslagadh na millíní i 100 ml de 1 NOH, agus ansin goraíodh iad ag 60 C le haghaidh lámh amháin measctha chun an meileann a thuaslagadh. Cinneadh an t-ábhar melanin trí ionsúchán a thomhas ag 405 nm trí úsáid a bhaint as léitheoir ELISA (TECAN, Sunrise, An Ostair). Rinneadh an t-ábhar melanin a ríomh ag baint úsáide as an gcothromóid seo a leanas: (sampla/rialú) - 100 faoin gcéad . Rinneadh gach cinneadh i dtrí chóip.

2.3.6. Gníomhaíocht cheallacha tyrosinase

Rinneadh measúnú ar ghníomhaíocht tyrosinase ceallacha mar a thuairiscítear roimhe seo, le modhnuithe beaga [44,45]. Go hachomair, plátáladh 2 105/chill i 6-miasa toibreacha agus goraíodh iad thar oíche. Nochtadh na cealla do thiúchan éagsúla BID3 (1, 5, agus 10 mM) aigéad orkojic (10 mM) ar feadh 1 h, agus ina dhiaidh sin spreagadh le a-MSH (5 mM) agus IBMX (200 mM) ar feadh 48 h. Tar éis a bheith rinsáilte faoi dhó le PBS, rinneadh na cealla a lí le tuaslagán lysis 100 mL ina raibh maolán fosfáit 50 mM (pH 6.5), 0.1 mM feinilmethylsulfonylfluoride (PMSF), agus 1 faoin gcéad Triton X-100 agus reoite ag 80 Cfor 30 min. Leáigh agus lártheifneoiríodh lysates ag 12,000 rpm ar feadh 30 nóim ag 4 C. Ansin, comhcheanglaíodh forshnáthán (80 mL) le 2 mg/mL L-DOPA (20 mL) i 96-phláta tobair . Tar éis gor ag 37 C ar feadh 30 nóiméad, tomhaiseadh an dlús optúil ag 492 nm ag baint úsáide as léitheoir ELISA (TECAN, Salzburg, an Ostair). Cinneadh an tiúchan próitéine trí úsáid a bhaint as imoibrí measúnaithe próitéin BCA ag baint úsáide as BCA mar chaighdeán (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Sochar sliocht cistanche: inhibits tyrosinase.

2.3.7. Anailís staitistiúil

Cuirtear na sonraí go léir i láthair mar mheán ± earráid chaighdeánach an mheáin (SEM). Rinneadh anailís ar na sonraí trí anailís aontreo ar athraitheas (ANOVA) chun difríochtaí idir cóireálacha a chinneadh, agus ina dhiaidh sin tástáil iarbhoc Bonferroni. Measadh luach p < 0.05="" a="" bheith="" suntasach="" ó="" thaobh="">

3. Torthaí agus plé

3.1. Ceimic

Sintéisíodh díorthaigh indanóin (E)-beinsiledéine-1-(BID1–13) de réir na Scéime ginearálta 1. Sa staidéar láithreach seo, rinneadh díorthaigh indanóin trí (E) déag (E)-2-beinsilideéin-1-agus a gcuid scrúdaíodh airíonna coisctheacha tyrosinase. Rinneadh sprioc (E)-2-beinsilideéin-1-díorthaigh indanóin a shintéisiú ag úsáid coinníollacha aigéadacha (1 M HCl in aigéad aicéiteach). díorthaigh indanone i dtorthaí 32.8-99.1 faoin gcéad . Dealraíonn sé nár gineadh ach na E-isiméirí de 2-benzylidene-1-andanóin mar gheall ar an A-srian ar a dtugtar an strain 1,{{3-aileach. De réir dealraimh, tá an A-straim (steirichindrance) idir an fáinne feinile agus an grúpa carbóinile sa Z-isiméir níos mó ná é sin idir an fáinne feinile agus an grúpa meitiléine san E-isiméir. Fíoraíodh struchtúir na gcomhdhúile sintéiseacha ag 1H agus 13C NMR agus mais-speictriméadracht mar a thuairiscítear sa chuid turgnamhach (Fíoracha S1-S38). beinsilideéin mar gheall ar éifeacht anisotrópach an ghrúpa charbóinile agus tá an chuma ar an bpáirc (os cionn 7 ppm) i gcomparáid leis an isiméir Z (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">

Scéim 1. Sintéis (E)-2-beinsilideéin-1-indéanóin.

3.2. Airíonna coisctheacha Tyrosinase na gcomhdhúile

Scrúdaíodh poitéinseal coisctheach tyrosinase (E)-benzylidene-1-díorthaigh indanones ag baint úsáide as tyrosinase muisiriún. ​​Úsáideadh na mycophenolate (L-tyrosine) agus défheinóil (L-DOPA) mar fhoshraitheanna do na turgnaimh seo [35]. Rinneadh imoibrithe einsím le coscairí tyrosinase, tsubstráit, agus tástála. Léirigh gach comhdhúil tástála cosc ​​ar thiúchan-spleách. Taispeántar luachanna IC50 na ndíorthach indanone-beinsiledéine i dTábla 1.

I bhfoshraitheanna L-tyrosine agus L-DOPA araon, léirigh BID3 gníomhaíocht choisctheach láidir le luachanna IC50 de 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM agus 1.39 ± {0.00004 mM, faoi seach, i gcomparáid leis an aigéad kojic rialaithe dearfach, a raibh luachanna IC50 de 13.77 ± 0.20 mM agus 33.14 ± 0.93 mM, faoi seach (Fíor 1A). Ina theannta sin, léirigh BID6 gníomhaíocht chumhachtach i dtreo L-tyrosine agus L-DOPA le luachanna IC50 de 5.00 ± 0.91 mM agus 53.11 ± 2.79 mM, faoi seach. Léirigh BID1 cosc ​​suntasach ar tyrosinase trí L-tyrosine agus L-DOPApathways, le luachanna IC50 de 39.74 ± 3.71 mM agus130.0 ± 5.39 mM, faoi seach. Léirigh BID4 agus BID11 gníomhaíocht coisctheach measarthatyrosinase. Bhí díorthaigh eile neamhghníomhach. Mar an gcéanna, léirigh BID2 gníomhaíocht shuntasach i dtreo L-tyrosine agusL-DOPA, le luachanna IC50 de 41.27 ± 3.03 mM agus 52.93 ± 2.62 mM. Ina theannta sin, thuairiscigh coscairí de chineál measctha, níor léirigh aigéad phthalic agus aigéad cinnamic aon choisctheach éifeacht ag an tiúchan de200 mm [47].

Ag teacht le torthaí staidéir ar an ngaolmhaireacht struchtúr-ghníomhaíochta (SAR), bhí tionchar suntasach ag díorthaigh ina raibh (E)-beinsilideéin-1-ionadaithe indanones ar an bhfáinne feinile ar chosc ar fhéidearthacht tyrosinase. BID3, a chuir bac ar tyrosinase leis an gcumas is airde, tá 2-grúpa hiodrocsa i láthair 4-ghrúpa hiodrocsa agus a chuireann bac mór ar ghníomhaíocht tyrosinase (BID1 vsBID3). Thug na torthaí seo le tuiscint go bhféadfadh an grúpa déhidrocsa 2,4-(moiety resorcinol) i struchtúr fáinne feinile a bheith freagrach as cosc ​​​​fheabhsaithe tyrosinase. Is díol spéise é, i staidéar roimhe seo ar choscóirí tyrosinase sintéiseacha féideartha, gur léirigh an t-ionadú dé-hiodrocsa 2,4-go bhféadfadh gníomhaíocht tyrosinase bac a chur ar ghníomhaíocht tyrosinase [48,49]. Ina theannta sin, thug ár sonraí SAR le fios freisin go gcuireann tabhairt isteach grúpa hiodrocsa 3-i láthair 4-hiodrocsaghrúpa isteach ar chosc ar tyrosinase. Léiríodh na feiniméin seo ag an gcinneadh gur mhéadaigh 4-methocsa-3-gníomhaíocht coisctheach fáinne hiodrocsafheinile i gcoinne tyrosinase, cé gur laghdaigh tabhairt isteach grúpa 3,4-dé-hiodrocsa (catechol moiety) gníomhaíocht choisctheach tyrosinase ( BID2 vs BID6) [35]. Tugann na torthaí seo le fios go bhfuil an grúpa meatocsa 3-hiodrocsa-4- freagrach as gníomhaíocht choisctheach fortyrosinase freisin. Mar sin féin, inár staidéar faoi láthair, léirigh BID9 agus BID11, ina bhfuil 2,4-ghrúpa dimethocsa feinile nó 3,5-démheatocsaí feinile, gníomhaíocht measartha coisctheach tyrosinase. Bunaithe ar luachanna IC50 tríd an gcosán L-tyrosine agus L-DOPA, léirigh BID3 an ghníomhaíocht coisctheach tyrosinase is cumhachtaí dá bhrí sin, rinneamar staidéar breise ar an meicníocht atá mar bhunús leis an éifeacht coisctheach seo. Radhakrishnan et al. (2015) [20] tuairiscíodh go hiodrocsaile ionadach (Z)-beinsiledéine-1-coscairí tyrosinase comhdhúile indanone comhdhúile. Cé gur léirigh staidéir roimhe seo go bhfuil díorthaigh indanóin indánóin a bhfuil gníomhaíocht frith-tírosinase ina n-ionad hiodrocsaile (Z) acu, chomh fada agus is eol dúinn, níor tugadh aon tuairiscí ar chosc tyrosinase le (E)-beinsilideéin{-1- díorthaigh indanone ag baint úsáide as turgnaimh cille-bhunaithe.

Tábla 1. Poitéinseal coisctheach tyrosinase muisiriún den 2 ionadach,3-dé-hidr-1H-inden-1-cosúil le cailcón amháin (1-indanóin)

díorthaigh (BID1–13).

Fíor 1. Cosc tiúchan-spleách ar ghníomhaíocht tyrosinase muisiriún ag BID3 agus aigéad kojic (rialú dearfach) (n=3).

3.3. Anailís cinéiteach einsím ar chosc ar tyrosinase

Ós rud é go raibh BID3 ar an gcosc is cumhachtaí, rinneamar staidéar breise ar an mheicníocht ba bhun lena éifeacht coisctheach. In iarracht an modh coiscthe einsíme a mhíniú, rinneadh anailísí cinéiteach ar thiúchan éagsúla L-DOPA agus tiúchain BID3 éagsúla. Tarraingíodh ceapacha Dixon agus Lineweaver-Burk ag baint úsáide as na sonraí a fuarthas ó na staidéir chinéiteach chun an patrún coiscthe agus na tairisigh chosc (Ki) a dhearbhú trí léirmhíniú ceapacha Dixon ( Fíor. 2 A agus B ). Sonraítear tiúchan L-DOPA mar seo a leanas: 1, 2, 4 mM. Tá an crosbhealach suite ar an taobh clé, rud a léiríonn cosc ​​de chineál measctha i gcoinne tyrosinase le luach Ki de 2.4 mM (Fíor 2 B). Léiríonn luach Ki na tiúchain a theastaíonn chun coimpléasc einsím-choiscthe a chruthú, mar sin léiríonn coscaire le luach Ki níos ísle go bhfuil gníomhaíocht choiscthe tyrosinase níos mó in iúl.

Le blianta fada anuas, tá léargais thábhachtacha curtha ar fáil ag gabháil mhóilíneach ar fhionnachtain drugaí. Mar sin féin, tá sé mar aidhm ag nósanna imeachta dugaireachta suíomhanna cearta ligands i bpóca ceangailteach na n-apróitéin a aithint agus an cleamhnas idir ligand agus próitéin a thuar. Is é sin le rá, cuireann an chuing síos ar phróiseas trína n-oireann dhá mhóilín le chéile i spás tríthoiseach. Chun a chinneadh an bhfuil BID3 ceangailte le suíomh gníomhach tyrosinase, rinneadh anailís mhóilíneach chun na suíomhanna ceangailteacha féideartha BID3 a aithint i struchtúr criostail tyrosinase muisiriún (PDB ID: 2Y9X) (Fíor 3 A). Ríomhadh na torthaí seo trí úsáid a bhaint as AutoDock4.2. clár. Ba é an suíomh ceangailteach is cobhsaí ná an scór ab ísle [50]. Le déanaí, Hassani et al. [47] thuairiscigh gur bacóirí tyrosinasein mód measctha iad aigéad cinnamic agus aigéad phthalic. Mar sin, baineadh úsáid as cúnamh, aigéad cinnamic, agus aigéad phthalic chun torthaí dug a bhailíochtú [51]. Léirítear i bhFíor 3B [52] na múnlaí dug móilíneach de BID3 agus aigéad kojic (coisctheoir de chineál iomaíoch ar a dtugtar) i suíomh catalaíoch tyrosinase. ]. Chuir an coimpléasc inhibitor tyrosinase-BID3 i láthair fuinneamh ceangailteach 6.28 kcal/mol lena n-áirítear bannaí dháhidrigine le hiarmhar tyrosinase ASN260 agus MET280, agus breathnaíodh idirghníomhaíochtaí hidreafóbach idir BID3 agus iarmhair tyrosinase VAL248, PHE264, agus VAL283, a d'fhág an t-idirghníomhú cobhsaithe breise sa suíomh seo. mushroomtyrosinase (Tábla 2, agus Fíor 3E agus H). Ina theannta sin, tá múnlaí dug móilíneach BID3, aigéad phthalic (inhibitor allosteric 1), agus aigéad cinnamic (inhibitor allosteric 2) sa dá shuíomh allosteric léirithe i bhFíor. 3C agus 3D. Glacadh aigéad phthalic agus aigéad cinnamic mar ligandanna tagartha ag láithreáin allosteric 1 agus 2, faoi seach[47,51]. Mar a léirítear i bhFíor 3F agus I, thaispeáin BID3 agus aigéad phthalic banna hidrigine amháin leis an iarmhar TRY140 tyrosinase, agus trí iarmhair idirghníomhaíochtaí hidreafóbach leis an LEU24, PHE147, agus ILE148 tyrosinase ag suíomh allosteric 1. Na hidirghníomhaíochtaí comhfhreagracha ligand aigéad BID3 agus cinnamic i suíomh2 allosteric tyrosinase san áireamh bannaí hidrigine idir ASP312 andLYS376 de tyrosinase, ach THR308 idirghníomhú hidreafóbically ag suíomh allosteric 2 ( Fíor. 3 G agus J ). Ina theannta sin, fuarthas amach go raibh fuinneamh ceangailteach ag baint le tírosinase de chuid CFG sa dá shuíomh allosteric de tyrosinase (4.38 agus 5.68 kcal/mol, faoi seach), rud a léiríonn ard-chleamhnas ceangailteach leis an dá shuíomh allosteric. Bunaithe ar staidéir einsímchinéiteach, d'fheidhmigh BID3 cosc ​​de chineál measctha, dheimhnigh incheangailteacht BID3 leis an suíomh catalaíoch agus le dhá shuíomh allosteric araon a chosc de chineál measctha tyrosinase.

Fíor 2. Ceapacha Fíodóirí Líne-Burk (A) agus Dixon (B) chun tyrosinase muisiriún a chosc trí BID3 ag baint úsáide as L-DOPA mar an tsubstráit.

3.4. Gníomhaíocht bhitheolaíoch

Chun leas a bhaint as éifeachtaí frith-tyrosinase BID3 sa mhúnla cultúir cille, rinneamar scrúdú ar a éifeachtaí citotocsaineacha ar chealla B16F10. Cóireáladh cealla le tiúchain éagsúla BID3 (1–20 mM) ar feadh 48 h agus rinneadh measúnú orthu ag baint úsáide as an measúnacht EZ-Cytox. Léirigh na torthaí nach raibh aon éifeacht cíteatocsaineach suntasach ag BID3 i melanomacells B16F10 suas le 20 mM (Fíor 4A agus B). Mar sin, rinneadh turgnaimh ina dhiaidh sin ag baint úsáide as BID3 suas le 20 mM.

Tábla 2 Suíomhanna ceangailteacha agus scóir dhuála BID3 i tyrosinase muisiriún (PDB ID: 2Y9X) mar a chinntear ag baint úsáide as an gclár AutoDock4.2.

Tá melanogenesis á rialú ag easghluaiseachta einsímeacha tyrosinase. Ar an gcúis seo, forbraíodh roinnt comhdhúile craiceann-bhánú chun gníomhaíocht tyrosinase a laghdú. Baineadh úsáid as aigéad Kojic, tirosinaseinhibitor, mar rialú dearfach [53]. Mar sin, chun imscrúdú a dhéanamh ar éifeachtaí BID3 ar hipearpigmentation spreagtha ardaithe cAMP, déileáladh le cealla B16F1{{53 le a-MSH agus IBMX i láthair BID3 (1, 5, agus 2{{2{3}} mM) le haghaidh 48 u, agus cinneadh ábhar melanin, agus gníomhaíochtaí cellulartyrosinase (Fig. 4 C agus D). D'eascair méadú suntasach (P < 0.001#)="" ar="" an="" ábhar="" melanin="" (fíor="" 4c)="" agus="" gníomhaíocht="" tyrosinase="" ceallach="" (fíor="" 4d)="" i="" gcealla="" b16f10="" i="" gcomparáid="" leis="" an="" rialú="" neamhchóireáilte.="">< 0.01**;="" p="">< 0.001***)agus="" laghdaigh="" tiúchan-spleách="" ar="" ábhar="" melanin="" agus="" ar="" ghníomhaíocht="" cheallacha="" tyrosinase="" de="" chealla="" b16f10="" i="" gcomparáid="" le="" cealla="" cóireáilte="" a-msh="" oribmx,="" rud="" a="" thugann="" le="" fios="" go="" bhféadfadh="" an="" laghdú="" ar="" melaninin="" cheallacha="" a="" bheith="" mar="" gheall="" ar="" chosc="" ar="" ghníomhaíocht="" tyrosinase="" .="" mar="" sin,="" léiríonn="" na="" torthaí="" seo="" go="" soiléir="" gur="" chuir="" bid3="" éifeachtaí="" frith-melanogenic="" i="" bhfeidhm="" a="" chuir="" bac="" ar="" ghníomhaíocht="" tyrosinase="" agus="" sintéis="" melanin="" i="" gcealla="" b16f10="" gan="" cíteatocsaineacht="" a="">

Tá Indanone ar cheann de na struchtúir phribhléideacha de cheimic íocshláinte agus baineann sé go ginearálta le héagsúlacht comhdhúile cógaseolaíochta atá gníomhach [54]. Tá an taise indanone i láthair i raon de tháirgí nádúrtha atá gníomhach go fiseolaíoch. I bhfianaise seo, thuairiscigh Okpekonet al., [55] go bhfuil comhdhúil indanone úrscéal 1-, scoite ó fhréamhacha Uvaria. Is í an chomhdhúil seo an chéad 1-díorthach indanóin atá scoite amach ó phlandaí. Nagle et al., [56] thuairiscigh go raibh indan-aldehyde meitile nua scoite amach ó marinecyanobacterium mar rialtóir angiogenesis meall. Mar an gcéanna, ós rud é go bhfuil tábhacht bhitheolaíoch ag croí an indanóin, tá taighdeoirí le blianta beaga anuas ag díriú ar analógacha indanóin atá gníomhach ó thaobh cógaseolaíochta a fhorbairt mar ghníomhairí teiripeacha. Tugann éagsúlacht struchtúrach 1-indanones le tuiscint go bhfuil éagsúlacht freagairtí bitheolaíocha ann agus féadfar na comhdhúile seo a chur i bhfeidhm sa talmhaíocht agus sa leigheas.Forbraíodh comhdhúile éagsúla bunaithe ar indanóin mar ghalar frith-Alzheimer [16,57–59], frith-ailse [60– 62], oibreáin fhrithmhiocróbacha[63,64], agus oibreáin fhrithvíreasacha [65,66]. Mar gheall ar an bpoitéinseal feidhme leathan, 1-bhí na hindéanaigh ina réada suimiúla le haghaidh tuilleadh taighde agus tá sé inmhianaithe ranganna nua a dhearadh dá sintéis.

cistanche tubolosa: frith-aging

4. Conclúid

Chun coscairí cumhachtacha tyrosinase nua a aithint, rinneamar trí dhíorthaigh dhéag (E)-bheinsilideéin-1-indanone-1-díorthaigh indanóine déag a dhearadh agus a shintéisiú. Chuir {6}},3-dihydro-1H-in-1-amháin (BID3) bac ar ghníomhaíocht tyrosinase (IC50=0.034 agus 1.39 mM, do L-tyrosine agus L-DOPA, faoi seach), a bhí níos fearr ná cumaisc thagartha, aigéad kojic (IC50=13.77 mM agus 33.14 mM, faoi seach). Léirigh an gaol struchtúr-gníomhaíochta gur fheabhsaigh láithreacht an ghrúpa déhiodrocsaile ag suíomh 2 agus 4-an (E)-beinsilideéin-1-an chnámharlaigh indanóin an ghníomhaíocht i gcoinne tyrosinase. Léirigh modh cosc ​​​​einsímeacha na heinsíme, arna chinneadh ag ceapacha Lineweaver-Burk agus Dixon, gur inhibitor de chineál measctha é BID3. Léiríonn staidéir dhugála mhóilíneacha gur meicníochtaí tábhachtacha iad ceangailteach ag an suíomh gníomhach agus ag suíomhanna allosteric i dtreo gníomhaíocht coisctheach tyrosinase. Bunaithe ar na torthaí seo, ba chosúil go raibh BID3 ina choscóir cumhachtach tyrosinase chun neamhoird chraiceann mar hipearpigmentation a chóireáil.

sochair cistanche Desert: inhibits foirmiú melanin