Gníomhaíocht Imdhíon-spreagthach Polaisiúicrídí In-Inbhainte Uisce Ó Cistanche Deserticola Mar Aidiúvach Plandaí in Vitro Agus in Vivo

Réamhrá

Tá vacsaíní tábhachtach chun galair a rialú nó a chosc. Is antaiginí athchuingeacha an-íonghlanta iad vacsaíní nua-ghinte agus vacsaíní atá á bhforbairt faoi láthair le sábháilteacht níos airde, ach ní féidir le hantaiginí íonaithe freagairt imdhíonachta sásúil a spreagadh i gcomparáid le hullmhóidí pataigin mhaolaithe nó díghníomhaithe. Le cabhair ó aidiúvach, is féidir le vacsaíní freagairtí imdhíonachta leanúnacha a chothú [1,2]. Tá imní mhór ar aidiúvaigh chumhachtacha nua sa dá vacsaínforbairt agus sláinte an duine. Go dtí seo, sainaithníodh aidiúvaigh éagsúla agus rinneadh staidéar forleathan orthu. Tugann na aidiúvaigh seo roinnt buntáistí do vacsaíní, lena n-áirítear an méid riachtanach antaiginí a laghdú, líon na n-imdhíonta a theastaíonn le haghaidh gnáthfhreagairtí imdhíonachta a íoslaghdú, agus freagairtí imdhíonachta níos gasta, níos leithne agus níos láidre a spreagadh [3–5]. Cé gur forbraíodh go leor aidiúvach cumhachtach, mar lipopolysaccharide (LPS) agus aidiúvach iomlán Freund (FCA), ní chuirtear i bhfeidhm go forleathan iad mar gheall ar a tocsaineacht. Mar sin, níl ach dornán aidiúvach, mar Alum, ceadúnaithe le haghaidh úsáide cliniciúla [6]. Ar an iomlán, ba cheart aidiúvaigh níos éifeachtaí agus níos sábháilte a fhorbairt chun vacsaíní próifiolacsacha agus teiripeacha níos fearr a chur chun cinn in aghaidh galair thógálacha agus neamh-ionfhabhtaíocha.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN DÍOLÚINE A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Is fachtóir tábhachtach machnaimh í sábháilteacht i bhforbairt aidiúvach. I measc comhábhair luibheacha na Síne tá cothaithigh agus comhábhair ghníomhacha thábhachtacha, amhail comhdhúile feanólacha agus polaisiúicrídí, ar féidir leo feidhmiú mar imdhíon-spreagthaí cumhachtacha [7-9]. Ina measc, rinneadh iniúchadh forleathan ar pholaisiúicrídí ó luibheanna traidisiúnta na Síne mar gheall ar a ngníomhaíochtaí inmunostimulatory agus tocsaineacht íseal. Mar shampla, is aidiúvach imdhíonachta é inulin gan tocsaineacht aidiúvach eile ar nós FCA. D'éirigh le aidiúvach delta inulin AdvaxTM freisin feabhas a chur ar imdhíon-ghineacht na vacsaíne [10,11]. Tá Astragalus, ar a dtugtar Huangqi sa tSínis agus Radix Astragali sa Laidin, scaipthe go forleathan ar fud an domhain. Tá polaisiúicríd ar cheann dá phríomh-chomhábhair ghníomhacha atá freagrach as an ngníomhaíocht inmunomodulatory. Tá sé léirithe ag staidéir thurgnamhacha go raibh éifeachtaí inmunomodulatory láidir ag polaisiúicríd Astragalus in vitro agus in vivo [12, 13]. Léirigh polaisiúicrídí barbarum Lycium mar aidiúvach vacsaín freisin feabhsuithe maithe agus éifeachtaí spreagthacha [14, 15]. Thug na staidéir seo le fios go raibh polaisiúicrídí luibhe Síneacha ina n-iarrthóirí idéalacha d'fhorbairt aidiúvach.

Cistanche deserticolaIs luibh luachmhar Síneach traidisiúnta é YC Ma (CD, "Rou Cong Rong" i Sínis) a mheastar go coitianta mar "Ginseng na bhfásach" mar gheall ar a éifeachtaí tonic níos fearr. Déantar é a dháileadh i réigiúin arid nó leath-arid i Xinjiang. Sa tSín, tá a gas méithe triomaithe in úsáid mar bhia tonach leis na céadta bliain [16, 17]. Le blianta fada anuas, baineadh úsáid as CD bruite mar bhia tonic chun lagú ró-spreagtha a chóireáil, rud a thugann le tuiscint go bhfuil sé sábháilte le haghaidh riarachán béil. Breathnaítear go forleathan ar an bplanda seo mar gheall ar a fheidhmeanna leighis leathan. Léirigh staidéir fíteiceimiceacha agus cógaseolaíochta le déanaí gurb iad polaisiúicrídí na príomhchodanna atá gníomhach go bitheolaíoch agus go raibh éifeachtaí bitheolaíocha éagsúla acu, lena n-áiríteargníomhaíocht inmunomodulatory, éifeacht frithocsaídeach, agus éifeachtaí frith-athlastacha[18–21]. Mar sin féin, is annamh a tuairiscíodh gníomhaíocht feabhsaithe imdhíonachta polaisiúicrídí inbhainte uisce ó C. deserticola i Xinjiang.

Is eol go maith gur cealla tábhachtacha tíolactha antaiginí (APCanna) iad DCanna a sholáthraíonn comharthaí a theastaíonn chun freagairtí imdhíonachta a thionscnamh agus chun cealla dúchasacha agus oiriúnaitheacha a mhodhnú. Is féidir le roinnt aidiúvach a fheabhsaíonn glacadh antaigine ag DCanna móilíní comhspreagthacha nó MHC a mhéadú agusdíolúine a fheabhsú. Nuair a thosaíonn aibiú DCanna, déantar níos mó móilíní comh-spreagthacha agus cytokines a tháirgeadh agus léiríonn DCanna feinitíopaí ar leith [22, 23].

Sa staidéar seo, rinneamar leas ar dtús an bhféadfadh WPCD gníomhachtú DCanna a chur chun cinn trí chonair chomharthaíochta TLR4 in vivo. Ós rud é go raibh DCanna mar nasc idir freagairtí imdhíonachta dúchasacha agus oiriúnaitheacha, rinneamar hipitéis go mbeadh tionchar ag gníomhachtú DCanna arna spreagadh ag WPCD ar thoradh díolúine oiriúnaitheach. Scrúdaíomar an freagra imdhíonachta sonrach ar ubhalúimín (OVA) i lucha atá cóireáilte le WPCD, lena n-áirítear titers fo-aicme IgG, IgG1, agus IgG2a, iomadú T- agus B-, agus táirgeadh cítocín. Rinneamar imscrúdú an gcuirfeadh cóireáil WPCD le gníomhaíocht cealla DC agus Treg i spleen na lucha seo. Chruthaigh ár dtorthaí an ghníomhaíocht imdhíonmhodúil a d'fhéadfadh a bheith ag polaisiúicrídí nádúrtha ó C. deserticola agus leathnaigh siad a raon feidhme.

abhair agus modhanna

Ainmhithe

Ceannaíodh lucha baineanna ocht go deich seachtaine d'aois C57BL/6, BALB/c, nó ICR ó Chéad Ospidéal Ollscoil Leighis Xinjiang (Urimuqi, Xinjiang, an tSín). Coinníodh na lucha faoi choinníollacha saor ó phataigin de réir threoirlínte Choiste um Chúram agus Úsáid Ainmhithe (ACUC) Ollscoil Xinjiang um Shláinte agus Folláine Ainmhithe. Bhí na nósanna imeachta um thurgnamh ainmhithe ceadaithe ag AUCC Ollscoil Xinjiang.

Eastóscadh sleachta uiscí

Is planda é C. deserticola i gCúige Xinjiang sa tSín. Fuarthas an polaisiúicríd amh trí eastóscadh uisce agus deascadh eatánóil. Go hachomair, meilteadh 100 g de C. deserticola triomaithe ina phúdar agus ansin scagadh é. Rinneadh an púdar a aife le héitear peitriliam arís agus arís eile ag teocht an tseomra agus ansin aife le eatánól ainhidriúil ar feadh 1 h chun comhábhair daite agus lipidí a bhaint. Baineadh iarmhair le fiuchphointe uisce ar feadh trí huaire agus comhthiomsaíodh na sleachta le chéile, lártheifneoirithe ag 4000 rpm ar feadh 10 nóiméad, agus aife ag 60˚C ar feadh 4 h. Cuireadh ceithre huaire toirte eatánóil 95% isteach sa tuaslagán chun polaisiúicrídí amh a deascadh. Aththuaslagadh na polaisiúicrídí amh in uisce driogtha agus cóireáilte le himoibrí Sevage chun próitéiní a bhaint. Rinneadh sleachta a thuaslagadh i PBS agus a steiriliú trí scagaire 0.22-μm. Ar deireadh, b'ionann cion iomlán siúcra WPCD agus 59.58%, mar atá léirithe ag an anailís feanól-aigéad sulfarach [24].

Giniúint DCanna

Gineadh BM-DCanna de réir an mhodha a thuairiscítear roimhe seo le modhnuithe beaga [25]. Rinneadh DCanna smeara ó lucha C57BL/6 a shruthlú amach le RPMI-1640 meán iomlán (Gibco) arna fhorlíonadh le séiream lao féatais 10% (Hioclone). Athchromadh na cealla bailithe i meán RPMI-1640 le 50 μM -mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO) agus 20 ng/mL murine GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) agus gortha ag 37˚ C in atmaisféar 5% CO2. Cuireadh meán úr ina raibh GM-CSF in ionad leath den mheán cultúir gach 1-2 lá. Bailíodh cealla ar Lá 6, cóireáilte le dáileoga éagsúla de WPCD, agus LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) ar feadh 24 h, agus ansin rinneadh measúnú orthu ag cíteiméadracht sreafa.

Aibiú DCanna agus gníomhachtú cille T in vitro a bhrath

Rinneadh éifeacht aibithe in vitro WPCD ar BM-DCanna a mheas bunaithe ar thorthaí anailíse feinitíopacha ag FACanna. Ar Lá 7, ionduchtaíodh BM-DCanna ó C57BL/6 i láthair GM-CSF agus ansin déileáladh leo le tiúchain éagsúla WPCD (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0.1, agus 0.2 mg/mL) ar feadh 12 u faoi thrí. Baineadh úsáid as LPS (100 ng/mL) mar rialú dearfach. Tar éis BM-DCanna a ní i PBS agus baineadh úsáid as Bloc Fc (BD Biosciences, CA) chun cosc ​​a chur ar cheangal antashubstainte neamhshonrach, dhaiteadh cealla i PBS trí úsáid a bhaint as an CD40, CD40, CD11c, CD comhchuingeach FITC-, PE-, nó APC-chomhchuingeach cuí{ {23}}, antasubstaintí CD80, agus MHC-II (BD) ar feadh 20 nóiméad ag 37˚C. Ba iad FACs Calibur (BD) a bhraith na cealla daite. Rinneadh an anailís sonraí le bogearraí FlowJo (Tree Star).

I dturgnamh aibithe DCs in vitro, bailíodh forlíonta saothraithe cille freisin chun anailís a dhéanamh ar IL-12 agus TNF- trí úsáid a bhaint as feisteáin mheasúnachta cytokine (Boster, Wuhan, an tSín) de réir threoracha an mhonaróra. Rinneadh an ionsúiteacht ag 450 nm a thomhas le léitheoir pláta ELISA (Bio-Rad, SAM). Ríomhadh cainníochtaí cíteicne sna samplaí le cuair chaighdeánacha na gcítocínín athchuingreach de réir an mhodha líneach aischéimnithí.

Chun a ngníomhaíocht spreagthach allogenach a thástáil, rinneadh an turgnamh ar imoibriú measctha lymphocyte (MLR) de réir an mhodha roimhe seo [26] le measúnacht MTT (Sigma, St Louis, MO). Go hachomair, aisghabhadh BM-DCanna ó lucha C57BL/6 a úsáideadh mar chealla spreagúla ar Lá 7 i RPMI-1640 meánach móide GM-CSF agus déileáladh leo le tiúchain éagsúla WPCD ar feadh 12 h ag 37˚C. Rinneadh cealla a ní agus a chur ar fionraí arís i meán RPMI-1640 sular cuireadh isteach sa 24-pláta tobair iad. Rinneadh cealla freagartha fionraí aonplenocyte a leithlisiú ó lucha BALB/c. Meascadh BM-DCanna le splenocytes de réir na gcóimheas 1:5 agus 1:10. Saothraíodh cealla ag 37˚C in atmaisféar 5% CO2 ar feadh trí lá faoi thrí. Baineadh úsáid as cóireáil LPS mar rialú dearfach. Cuireadh cultúir leis ina dhiaidh sin le 20 μL de MTT don saothrú 4-h deiridh. Rinneadh na ionsúcháin ag an tonnfhad tomhais (490 nm) agus an tonnfhad tagartha (650 nm) a thomhas le haghaidh anailíse ar iomadú cille T. Tomhaiseadh gach sampla i gcoinne rialú cúlra.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN DO CHÓRAS imdhíonachta A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cóireáil ag coscaire TLR4 in vitro

Rinneadh réamhchóireáil ar BM-DCanna le 5 μM TAK-242 (coscóir TLR4, Medchemexpress Inc. USA) ar feadh 1 h agus ansin comhshaothraíodh iad le tiúchain éagsúla WPCD (100 agus 200 ug/ mL) ar feadh 12 h. i láthair nó in éagmais Golgi Stop faoi thrí. Sa rialú dearfach, cuireadh LPS leis. D'aimsigh FACanna cealla agus súithíní chun anailís a dhéanamh ar mharcóirí dromchla CD86 agus CD40 agus ELISA chun anailís a dhéanamh ar chitocíní TNF-a agus IL-12, faoi seach.

Prótacal imdhíonta

Tástáil ghéarthocsaineachta

Sa tástáil ar ghéarthocsaineacht bhéil sa staidéar seo, úsáideadh 40 lucha ICR sláintiúil do dhaoine fásta. Troscadh lucha ICR (bia ach ní uisce thar oíche) roimh dosáil. Riaradh WPCD ó bhéal faoi seach i dáileoga de 0, 50, 500, nó 5000 mg/kg de mheáchan coirp gach ainmhí ar feadh 7 lá. Áiríodh lucha cóireáilte le saillte agus alúm-chóireáilte sa ghrúpa rialaithe. Breathnaíodh na hainmhithe go laethúil ar feadh 14 lá as a chéile. Breathnaíodh na lucha ina n-aonar chun mortlaíocht agus comharthaí cliniciúla a thaifeadadh. Ina theannta sin, rinneadh meáchain choirp agus tomhaltas bia agus uisce a thomhas le linn an turgnaimh. Ar Lá 14, ríomhadh an t-innéacs spleen nó thymus mar (meáchan spleen nó thymus/meáchan coirp) × 10.

Gníomhaíocht imdhíonmhodúil WPCD in vivo a bhrath.

Chun imscrúdú a dhéanamh an raibh gníomhaíocht inmunomodulatory ag WPCD, baineadh úsáid as ovalbumin (OVA) (Sigma) mar an antigen múnla, agus roinneadh lucha ICR baineann go randamach i 7 ngrúpa (grúpa rialaithe diúltach (0.9% NaCl agus WPCD 400 ug). ) agus an rialú dearfach (Alum 200 ug le OVA)). Tugadh na lucha go subcutaneously faoi dhó le 10 ug OVA amháin nó WPCD le OVA de réir an dáileog de 20, 100, nó 400 ug le eatramh de 2-seachtain. Fuarthas samplaí fola agus spleen tar éis an vacsaínithe teanndáileog chun titers IgG, na fo-aicmí IgG, iomadú splenocyte agus cítocín, marcóirí dromchla DCs, agus minicíocht Treg a bhrath.

Antasubstaintí a bhaineann go sonrach le OVA a bhrath

Scrúdaigh ELISA titers agus fo-aicmí IgG a bhaineann go sonrach le OVA de réir an mhodha roimhe seo [27]. Brataíodh plátaí ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) thar oíche agus ansin cuireadh bac orthu. Caolaíodh samplaí séirim go sraitheach le haghaidh anailíse titer IgG nó chun IgG1 agus IgG2a a bhrath (Southern Biotech, Inc.). Goradh na plátaí ansin le PBST ina raibh IgG frith-luiche comhchuingeach HRP, IgG1, agus IgG2a ar feadh 1 h ag 37˚C. Forbraíodh an t-imoibriú dathmhéadrach le tetramethylbenzidine (TMB) agus ansin rinneadh na hionsúintí ag 450 nm/655 nm a thomhas agus a chur in iúl mar aonaid dlús optúla (OD).

Iomadú splenocyte agus cytokine a bhrath

Socraíodh iomadú splenocyte ag an measúnacht MTT. Ar Lá 21 tar éis an chéad vacsaínithe, fuarthas fionraí splenocyte amháin. Saothraíodh cealla i meán RPMI-1640 i 96-phlátaí tobair de réir tiúchan na gceall 1×106/tobar i dtrí chóip. Spreagadh na cultúir le OVA (tiúchan deiridh 10 ug / mL), ConA (tiúchan deiridh 5 ug / mL) (Sigma, St Louis, MO), agus LPS (tiúchan deiridh 100 ng / mL) ar feadh 48 h ag 37˚C . Saothraíodh cealla ar feadh 48 h agus cuireadh 20 μL (5 mg / ml) de MTT (Sigma, St Louis, MO) isteach i ngach tobar agus goraíodh iad ar feadh 4 u eile. Tar éis 50 μL de DMSO a chur isteach i ngach tobar chun stop a chur le forbairt dath (Sigma), léigh léitheoir pláta microtiter (BioRad, CA, SAM) plátaí ag 570 nm. Cuireadh iomadú splenocyte in iúl mar innéacs spreagtha (IR), arbh é an cóimheas OD570 nm de tobar spreagtha le tobar neamhspreagtha.

Rinneadh táirgeacht IL-4 agus IFN- i gcealla T a thomhas trí staining cítocine intracellular de réir prótacail foilsithe le mionathruithe [27, 28]. Ullmhaíodh fionraí splenocyte aonair ar Lá 21 tar éis an chéad vacsaínithe. Tar éis lysis cille fola dearga, goradh an splenocyte (2 × 106 cealla / mL) le OVA (10 ug/mL) le haghaidh spreagadh 4-h agus cuireadh stad Golgi (BD) le haghaidh goir 12 h, PMA mar dearfach smacht. Bailíodh cealla, nite le PBS, dathaíodh iad le CD4-FITC/CD8-FITC, agus greamaíodh agus tréscaoiltear iad le trealamh Cytofix/Cytoperm (BD) de réir threoracha an déantóra. Rinneadh staining cítocine intracellular leis an tiúchan cuí d'antasubstaintí IL-4-PE nó IFN{- -APC ag 4˚C ar feadh 20 nóiméad. Braitheadh ​​FACanna cealla dhaite. Rinneadh anailís sonraí sa FlowJo.

Measúnú ar aibiú DCanna agus cealla Treg sa spleen

Chun anailís a dhéanamh ar aibiú DC ó splenocytes i lucha, rinneadh staining dromchla cille le antasubstaintí CD11c-PE, CD40-FITC, agus CD80-APC. Ar Lá 3 tar éis an chéad vacsaínithe, fuarthas fionraí splenocyte singil (1 × 106 cealla / ml) agus cuireadh cealla faoi réir staining dúbailte. Rinneadh na déine fluaraiseacha a thomhas ag an FACs Calibur agus rinne FlowJo anailís ar na sonraí tomhaiste.

Breathnú an bhféadfadh WPCD minicíocht cealla Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ a ísliú. Ullmhaíodh fionraí splenocyte aonair ar Lá 7 tar éis an dara vacsaíniú. Rinneadh an splenocyte (2×106 cealla/mL) a smálú ar dhromchla na cille le hantasubstaint CD4-APC, agus ina dhiaidh sin staining cítocín núicléach leis an antasubstaintí cuí CD{8}FITC agus Foxp3-PE leis an bhfearas staining T-chealla rialála luiche (eBiosciences) de réir threoracha an déantóra. Rinneadh minicíocht cealla Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ a thástáil ar FACanna. Rinneadh anailís sonraí sa FlowJo.

Anailís staitistiúil

Rinneadh anailís aontreo ar thástálacha athraithis (ANOVA) (Tástáil Ilchomparáide Tukey) chun anailís a dhéanamh ar na difríochtaí i measc grúpaí turgnamhacha iolracha. Sloinntear gach luach mar mheán ±SD. p< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Torthaí Chuir WPCD aibiú agus feidhm BM-DCs in vitro chun cinn

Déantar díolúine oiriúnaitheach a chinneadh trí ghníomhachtú DCanna, lena n-áirítear na cineálacha móilíní comh-spreagthacha agus cytokines [29, 30]. Ar dtús, rinneamar imscrúdú an bhféadfadh WPCD léiriú móilíní comh-spreagthacha a chur chun cinn. De réir dáileoga éagsúla de WPCD, BM-DCs

ó C57BL/6. Rinneadh anailís ar leibhéil slonn CD11c, CD86, CD80, CD40, agus MHC-II i gcealla (Fíor 1). Léirigh na cealla gated le SSC agus FSC nár athraigh an chóireáil le dáileoga éagsúla de WPCD moirfeolaíocht BM-DCs (sonraí nach bhfuil léirithe). Rinneadh leibhéil slonn CD86, CD80, agus CD40 a uasrialáil go suntasach ar bhealach a bhí ag brath ar dháileog i gcomparáid leis an ngrúpa neamhchóireáilte agus shroich siad an ardchlár faoin dáileog 20 ug/mL de WPCD, ach bhí an difríocht gan a bheith suntasach i gcomparáid leis an ngrúpa LPS (Fíor 1A–1C). Méadaíodh an leibhéal slonn MHC-II go suntasach go dtí a luach uasta faoin dáileog de 50 ug/mL (Fíor 1D). Léirigh torthaí anailíse na marcóirí dromchla ceallacha gur léirigh DCanna a cóireáladh le LPS nó WPCD leibhéil slonn CD86, CD80, CD40, agus MHC-II go suntasach agus gur chuir siad aibiú feinitíopach chun cinn.

D'fhéadfadh roinnt aidiúvach móilíní comh-spreagthacha a mhéadú ar DCanna nó an t-rún cítocíní a aslú go díreach. Is iad IL-12 agus TNF- na príomhchítocíní chun freagairt imdhíonachta Th1 a ghníomhachtú. Rinneamar anailís ar tháirgeacht cítocine i BM-DCanna ar chóireáil WPCD. Tar éis cóireáil a bheith déanta ar BM-DCanna le hinneachar éagsúla WPCD ar feadh 12 h, bailíodh an t-uaslíontán chun a bhfuil in IL-12 agus TNF- le trealamh ELISA a bhrath. D’fhéadfadh WPCD táirgeadh IL-12 (Fíor 2A) agus TNF- (Fíor 2B) a mhéadú go brath ar dháileog. Léirigh na torthaí go bhféadfadh WPCD aibiú feidhmiúil DCanna a aslú.

I bhfreagra imdhíonachta, is gá DCanna a ghníomhachtú go feidhmiúil. Ansin, ba iad DCanna lánaibí a tharlódh an leibhéal níos airde d'iomadú T-chealla allogeneic. Mar sin, rinne MLR imscrúdú ar fhreagra feidhmiúil DCanna ar WPCD. Feabhsaíodh cumas allostimulatory DCanna WPCD-spreagtha, cosúil le LPS, go mór ar bhealach dáileog-spleách ag an gcóimheas sonraithe (Fíor 2C agus 2D). Thug na torthaí le fios gur fheabhsaigh WPCD cur i láthair antaiginí agus gur fheabhsaigh sé freagra T-chealla ag MLR in vitro.

Chuir WPCD aibiú DCanna chun cinn trí chonair TLR4

D’fhéadfaí tátal a bhaint as na torthaí thuas gur léirigh BM-DCanna arna ngníomhú ag WPCD léirithe cosúla móilíní dromchla DCanna le LPS (ligand TLR4). Rinneamar hipitéis mar sin go bhfuil BM-DCanna gníomhachtaithe ag WPCD tríd an gcosán TLR4. Tar éis do BM-DCanna a réamhchóireáil le TAK-242 (coscairí TLR4) agus iad a chomhshaothrú le WPCD agus LPS ar feadh 12 h, slonn CD40, CD86, TNF-a, nó IL{{12 Bhraith FACanna nó ELISA }}. Mar a léirítear i bhFíor 3A agus i bhFíor 3B, ba é an toradh a bhí ar chóireáil TAK-242 ná slonn CD40 agus CD86 laghdaithe go suntasach arna spreagadh ag LPS nó WPCD, agus táirgeadh cítocine IL-12 nó Tháinig laghdú suntasach freisin ar TNF-a (Fíor 3C agus 3D). Léirigh na torthaí go bhféadfadh WPCD aibiú DC a ghníomhachtú tríd an gcosán TLR4.

WPCD feabhsaithe díolúine humoral agus cheallacha

Chun comparáid a dhéanamh, rinneamar measúnú ar éifeachtaí WPCD ar spreagadh freagairt imdhíonachta humoral i lucha imdhíonta OVA. Roimh an vacsaíniú agus ar Laethanta 14, 21,

35, agus 49 tar éis an chéad vacsaínithe, bailíodh fuil chun IgG titer agus fo-aicmí IgG serum ag ELISA a bhrath. Tháinig méadú ar fhreagairt antasubstainte IgG ar OVA leis an méadú ar an dáileog de riarachán WPCD (100 agus 400 ug) ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 4). Ba é an tiúchan is fearr ná 100 ug/mL de WPCD agus mhéadaigh sé freagairtí IgG faoi dhó i gcomparáid leis an OVA amháin ar Laethanta 21, 35 agus 49 (Fíor 4A). Fuarthas méaduithe suntasacha i leibhéil antashubstaintí OVA-shonracha IgG1 agus IgG2a faoi 20 agus 100 ug de riarachán WPCD i gcomparáid leis an ngrúpa OVA i serum ar Lá 35 (Fíor 4B). Idir an dá linn, níor chuir Alum ach leibhéil léirithe na n-antasubstaintí OVA-shonracha IgG agus IgG1 chun cinn sna lucha imdhíonta. Níor spreag WPCD amháin antasubstaintí a bhaineann go sonrach le OVA. Léirigh na torthaí thuas gur ghin WPCD leibhéil antashubstainte níos airde agus freagraí Th1/Th2 níos cothroime ná Alum.

Is táscaire eile ar dhíolúine cheallacha é iomadú splenocyte. Spreagann ConA T-chealla agus spreagann LPS iomadú B-chealla. Ar Lá 21 tar éis an chéad vacsaínithe, fuarthas fionraí splenocyte aonair agus spreagadh faoi seach le peptide OVA (10 ug / mL), OVA323-339 (10 ug / mL), ConA (5 ug / mL), agus LPS ( 5 ug/mL) ar feadh 48 h. Ansin rinneadh iomadú cealla T a thomhas leis an modh MTT. D'fhéadfadh WPCD iomadú splenocyte OVA-antigen, Con A-mitogen, agus LPS-spreagtha mitogen a chur chun cinn go suntasach sna lucha a imdhíonadh le OVA agus WPCD (Fíor 5) agus ba é an tiúchan is fearr de WPCD ná 100 ug/mL. Léirigh na sonraí seo go bhféadfadh WPCD mar aidiúntóir vacsaíne i lucha imdhíonta OVA gníomhachtú cealla T agus cealla B a spreagadh níos éifeachtaí ná Alum.

Ghin gach aidiúvach WCPD a ndearnadh tástáil air agus a foirmíodh le vacsaíní OVA imdhíonacht ghreannmhar agus cheallacha a bhí chomh láidir céanna (Fíoracha 4 agus 5). Bunaithe ar na sonraí seo, chun tuilleadh meastóireachta a dhéanamh ar thionchair WPCD ar fhreagra cille cúntóir T (Th) OVA-shonrach, rinneamar anailís bhreise ar na slonn cítocine i gcealla CD8+ agus CD4+ T de réir cíteiméadracht Sreafa (Fíor 6). . Ar Lá 21 tar éis an chéad vacsaínithe, leithlisíodh splenocyte lucha amháin agus ansin comhshaothraíodh é leis an OVA (10 ug/ mL). Bhí toradh IL-4 i gcealla CD4+ T sa ghrúpa a riaradh le 100 ug OVA/WPCD i bhfad níos airde ná é sin sa ghrúpa OVA/Alum agus grúpa OVA agus cosúil leis sin i PMA (Fíor 6A). Ina theannta sin, feabhsaíodh toradh IFN i gcealla CD{8+ agus CD4+ T go suntasach freisin sna lucha a riartar le OVA/WPCD (20, 100, agus 400 ug) (Fíor 6B agus 6C). I gcomparáid le aidiúvach Alum, léirigh WPCD cumas níos fearr chun IL-4 agus IFN- táil ó chealla T a aslú.

Aithnítear aibiú DCanna spreagtha ag WPCD agus minicíocht Treg laghdaithe in vivo DCanna mar na APCanna is cumhachtaí a bhaineann le freagairtí imdhíonachta príomhúla a thionscnamh. Mar sin, ar Lá 3 tar éis an chéad vacsaínithe, rinneamar imscrúdú freisin ar éifeachtaí WPCD ar CD40 agus CD80 ar DCanna sa spleen i lucha (Fíor 7A agus 7B). Tháirg na lucha sa ghrúpa 100-ug OVA/WPCD leibhéil i bhfad níos airde de CD40 agus CD80 ar DCanna ná iad siúd sa ghrúpa OVA/Alum. Léirigh na sonraí seo go bhféadfadh WPCD DCanna a ghníomhachtú agus aibiú DC a spreagadh i lucha. Is féidir le cealla Treg cothromaíocht a dhéanamh idir caoinfhulaingt agus freagairtí imdhíonachta. Chun imscrúdú breise a dhéanamh ar conas a mhodhnaigh WPCD an freagra imdhíonachta, rinneadh cealla Treg sa spleen i lucha a dhathú le fearas dathúcháin cille T rialála luiche. Ar Lá 21 tar éis an chéad vacsaínithe, breathnaíodh minicíocht laghdaithe de chealla CD25+ Foxp3+ Treg i gcealla T CD4+ iomlán (Fíor 7C). I gcomparáid leis na grúpaí OVA agus OVA/Alum, léirigh an grúpa WPCD minicíocht Treg laghdaithe go suntasach.

Meastóireacht sábháilteachta ar WPCD i lucha

Chun géarthocsaineacht bhéil a mheas, rinneamar an tástáil ghéarthocsaineachta. Níor léirigh na lucha a riaradh ó bhéal le 5000 mg/kg de mheáchan coirp aon iompar mínormálta nó fo-iarmhairtí agus níor aimsíodh aon bhásmhaireacht sa tástáil measúnaithe tocsaineachta. Níor taifeadadh aon difríocht shuntasach i ngnóthachan meáchan coirp, innéacs Thymus, agus innéacs Spleen i measc grúpaí éagsúla lucha a riaradh le dáileoga éagsúla de WPCD agus ní raibh aon difríocht shuntasach acu (Tábla 1). Níor tugadh faoi deara aon bhásmhaireacht tar éis 14 lá. Mar sin, bhí luach LD50 WPCD níos mó ná 5000 mg in aghaidh an kg meáchan coirp.

Chun a thástáil an raibh éifeachtaí diúltacha ag WPCD ar fhás na lucha, roimh agus tar éis vacsaíniú subcutaneous, socraíodh meáchan an choirp faoi seach do gach luch (Tábla 2). Sa bhreathnóireacht ar na lucha ina dhiaidh sin, níor breathnaíodh fo-iarsmaí nó iompraíochtaí neamhghnácha. Ina theannta sin, níor léirigh meáchan coirp na lucha a riaradh le WPCD agus na lucha a riaradh le tuaslagán salanda nó OVA/Alum aon difríocht shuntasach. Léirigh na torthaí breathnóireachta seo go raibh riaradh WPCD sábháilte.

Plé

Is comhpháirteanna lárnacha iad aidiúvach sna vacsaíní [31]. Mar gheall ar an dul chun cinn sa ghéanóm agus sa phróitéamaíocht, aithnítear níos mó athchuingíní agus móilíní vacsaíne sintéiseacha. Dá bhrí sin, tá gá le níos mó aidiúvach agus foirmlithe. Go ginearálta baineann roinnt aidiúvach láidre le tocsaineacht mhéadaithe, mar shampla, FCA. Dá bhrí sin, is gá foirmliú sábháilte a aimsiú ina bhfuil comhpháirteanna sineirgisteacha éagsúla ag tiomáint an fhreagairt imdhíonachta atá ag teastáil ar deireadh thiar.Tá polaisiúicrídí ó luibheanna Síneach neamhthocsaineachagus gan aon fo-iarsmaí suntasacha a thaispeáint [32,28]. Tá aidiúvach sábháilte ag teastáil le haghaidh vacsaín áirithe.

Is luibh thónach tábhachtach é Cistanche deserticola agus tá sé ann go forleathan i dtailte arid agus i bhfásach te in iarthuaisceart na Síne. Tá imní forleathan ar Cistanche deserticola mar gheall ar a bhithghníomhaíochtaí lena n-áirítear éifeachtaí inmunomodulatory, antioxidative, antibacterial, agus antitumor [20,21]. Tá roinnt dul chun cinn déanta ar thréithriú struchtúrach agus ar ghníomhaíocht imdhíoneolaíoch Cistanche deserticola, atá ina iarrthóir maith chun aidiúvaigh a fhorbairt. Rinneamar measúnú turgnamhach ar éifeachtaí aidiúvacha agus meicníocht WPCD in vitro agus in vivo. Chuir riarachán subcutaneous de WPCD freagairtí imdhíonachta greannacha agus ceallacha chun cinn go mór trí antashubstaintí serum agus iomadú limficítí a mhéadú, cur in iúl na cítocíní a fheabhsú, aibiú DC a uasghrádú, agus minicíocht CD{4}} CD{5} a ísliú. } Foxp3+ Cealla Treg.

Is príomh-APCanna iad DCanna le haghaidh príomhchealla T naive. Tá gníomhachtú DCanna tábhachtach d'aidiúvach. Is minic a úsáidtear DCanna, go háirithe DCanna a dhíorthaítear smeara, chun aidiúvaigh agus vacsaíní a mheas. Is féidir le citeiméadracht sreafa idirdhealú a dhéanamh ar na cealla a cuireadh i ngníomh tar éis antaigin a ghabháil ó na cealla máguaird. I anailís FCM, an méid comhiomlánú spreagtha

Is táscaire indíreach é cealla chun sábháilteacht inmunomodulators a mheas [3]. Mar sin, féadfaidh sonraí gníomhaíochta aidiúvacha WPCD i DCanna in vitro faisnéis luachmhar a sholáthar do mhúnlaí ainmhithe. Bunaithe ar an tsamhail BM-DC, aimsíodh na leibhéil slonn MHC-II, CD86, CD80, agus CD40, táirgeadh cítocine, agus iomadú cille T allogenach sa raon tiúchana WPCD is fearr. Rinneadh leibhéil slonn MHC-II, CD86, CD80, agus CD40 a uasrialú i BM-DCanna agus méadaíodh ar thorthaí TNF-a agus IL-12 ar bhealach dáileog-spleách. Breathnaíodh iomadú cealla T allogeneic. Níor athraíodh deilbhíocht BM-DCanna. Trí ghníomhachtú BM-DCs a spreagadh agus secretion cytokines athlastacha in vitro, d'fhéadfadh aidiúvach WPCD méadú suntasach a dhéanamh ar an méid antigen agus ar líon na APCanna agus cealla T a spreagadh chun IFN- a secrete, rud a chuireann le gníomhaíocht inmunomodulatory a fheabhsú.

ÉagsúlaPolaisiúicrídí luibheacha Síneachaatá in ann an córas imdhíonachta a ghníomhachtú agus tá cumas aidiúvach den scoth acu trí aibiú DC a spreagadh trí chonair TLR4 [33,28]. Mar sin, glacaimid leis go nglacann TLR4 páirt i gcosán comharthaíochta aibithe DCanna WPCD-spreagtha. Mar a bheifí ag súil leis, tháinig laghdú suntasach ar TNF-a agus IL-12 ar chóireálacha coscairí TLR4. Ina theannta sin, chuir cosc ​​ar chonair TLR4 bac freisin ar léiriú CD40 agus CD80 ar DCanna, rud a thugann le fios go raibh aibiú DCanna ag brath ar TLR4. Mar sin, is léir go nglacann TLR4 páirt in aibiú DCanna WPCD-spreagtha.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN DÍOLÚINE A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cinntear go heimpíreach an dáileog is fearr d’ aidiúvaigh agus foirmiú vacsaíní i go leor turgnaimh. Chun iniúchadh a dhéanamh ar an ngaolmhaireacht dáileog-fhreagartha idir aidiúvach WPCD agus antaiginí OVA i lucha, roghnaigh muid dáileoga éagsúla WPCD bunaithe ar shonraí a tuairiscíodh roimhe seo ó BM-DCanna in vitro chun lucha ICR a riar go subcutaneously faoi dhó. Fuaireamar amach gur mhéadaigh WPCD go suntasach an táirgeacht antasubstaintí a bhaineann go sonrach le OVA agus gur spreag sé freagra imdhíonachta cothrom Th1/Th2 le feabhas ar leibhéil IgG1 agus IgG2a. Go háirithe, bhí an leibhéal IgG2a níos airde ná an leibhéal a chóireáil le Alum sa dáileog is fearr. Mar sin, bhí leibhéil níos airde antasubstaintí sonracha mar thoradh ar WPCD agus éifeachtúlacht níos airde leis na instealltaí níos ísle.

Éilíonn vacsaíní nua freagairtí láidre ceallacha a ionduchtú, lena mbaineann antasubstaintí, cealla T cúntóir (Th), agus limficítí T cíteatocsaineacha (CTLanna). Tá sé mar aidhm ag an vacsaín theiripeach freagraí T chealla níos láidre a chothú. Feabhsaíonn an aidiúvach idéalach cumas na vacsaíne agus cuireann sé díolúine cille-idirghabhála chun cinn gan éifeachtaí tocsaineacha a chruthú [34]. I measc na breathnuithe i múnlaí lucha imdhíonta, tháinig méadú ar iomadú splenocyte OVA-shonrach agus neamh-shonrach i gcomparáid le Alum mar thoradh ar WPCD. Déanann roinnt aidiúvach cítocíní agus an córas imdhíonachta a uasrialáil. Mar shampla, d’fhéadfadh saponins freagairtí imdhíonacha cille-idirghabhála a spreagadh ar antaigin a tharlódh de ghnáth ach antasubstaintí. Roghnaíomar IL-4 agus IFN- mar tháscairí chun leibhéil na ndíolúintí i lucha a mheas go hindíreach. D'fhéadfadh WPCD níos mó táil IL-4 agus IFN- ná Alum a aslú. Mar sin, breathnaíodh freagairtí láidre T-chealla cúntóra agus táil chitocín mar thoradh ar vacsaíniú WPCD, rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh WPCD limficítí a spreagadh ar bhealach níos éifeachtaí chun an cítocín den chineál Th1-agus an cineál Th{{34chítocín a cheilt ná mar a Alúm.

Féadfaidh aidiúvaigh a mbíonn tionchar acu ar chur i láthair antaiginí tionchar a imirt ar phróisis chasta imdhíonachta. Is féidir le cealla Treg freagraí Th1 agus Th2 a mhodhnú [35]. Féadfaidh dáileog cuí de WPCD aibiú DCanna i lucha a chur chun cinn trí leibhéil slonn CD80 agus CD40 a mhéadú agus cumas cur i láthair antigen OVA a mhéadú sa luathfhreagairt imdhíonachta. Léirigh torthaí turgnamhacha gníomhachtú DCanna agus minicíocht Treg gur spreag WPCD aibiú DCanna agus laghdaigh minicíocht Treg sa spleen i lucha. Chruthaigh na torthaí seo gur chuir WPCD le héifeachtúlacht na vacsaíní OVA trí dhíriú na gceall a thaispeánann antaiginí a mhéadú agus gníomhachtú T-chealla a chur chun cinn.

I bhforbairt na n-aidiúvach, tá sé deacair an freagra imdhíonachta cuí i gcoinne an ionfhabhtaithe comhfhreagrach a aslú go roghnach. Ba cheart go mbeadh fo-iarmhairtí ísle agus tocsaineacht íseal ag aidiúvach oiriúnach don duine nó d’ainmhithe. Mar sin, ba cheart sábháilteacht WPCD a chur san áireamh, lena n-áirítear fo-iarmhairtí láithreacha agus fadtéarmacha. Sa staidéar seo, rinneamar iniúchadh ar ghéarthocsaineacht WPCD agus ar éifeacht dhiúltach WPCD ar fheidhmíocht fáis lucha ar feadh 110 lá. Léirigh torthaí géarthocsaineachta WPCD nach raibh aon difríocht shuntasach ag meáchan coirp, innéacs thymus, nó innéacs Spleen. Bhí luach LD50 WPCD níos mó ná 5000 mg in aghaidh an kg meáchan coirp. Le linn na breathnadóireachta turgnamhacha a rinneadh ina dhiaidh sin ar na lucha, níor aimsíodh aon fo-iarsmaí nó iompar neamhghnácha i lucha. Thug na torthaí seo le fios go raibh WPCD sábháilte.

Mar fhocal scoir, sa staidéar seo, léirigh WPCD, polaisiúicríd amh a bhaintear as an deserticola C. ó Xinjiang, roinnt airíonna aidiúvach. Mar shampla, d'fheabhsaigh WPCD freagraí Th1 agus Th2 trí DCanna a ghníomhachtú, freagairtí antashubstainte a mhéadú, agus táirgeadh cítocín a fheabhsú. Ina theannta sin, rinneamar iniúchadh ar mheicníocht éifeachtúlacht WPCD trí anailís a dhéanamh ar aibiú agus feidhm DCanna trí chonair TLR4 in vitro. Sna lucha a ndearnadh cóireáil orthu le WPCD amháin, níor tugadh faoi deara aon fho-iarmhairt soiléir. Mar sin, bhí gníomhaíocht imdhíon-spreagthach níos airde ag WPCD i bhfreagraí imdhíonachta ceallacha agus greannacha. Is meascán de roinnt comhdhúile iad aidiúvach. D'fhéadfadh éifeachtaí tairbhiúla níos mó a bheith ag meascán de roinnt amhshleachta ná ag sliocht planda amháin. Is gá iniúchadh córasach a dhéanamh ar shleachta WPCD, a n-éifeachtúlacht agus a sábháilteacht a thástáil, agus meicníochtaí a n-éifeachtaí a shoiléiriú.

TUBULOSA CISTANCHE NÁDÚRTHA CHUN DÍOLÚINE A FHEABHSÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%