Laghdaíonn Farnesyltransferase Inhibitor LNK-754 Diostrófaíocht Axonal Agus Laghdaíonn sé Paiteolaíocht Amyloid i Lucha Cuid 2

Íomháú beo de néaróin

Le haghaidh turgnaimh íomháithe beo, ullmhaíodh néaróin mar atá thuas agus plátáilte i miasa bun gloine 35mm (MatTek # P35G-1.{4}}C) ar feadh 7 lá sa chultúr. Cuireadh 10nM LNK-754 nó lonafarnib le meáin choinníollach ansin, caitheadh ​​le cultúir rialaithe le DMSO mar fheithicil. Tar éis 48 uair an chloig de chóireáil, cuireadh meáin choinníollach ó phlátaí comhthreomhara neamhchóireáilte néaróin in ionad na meáin chumarsáide. Cuireadh 25nM de LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) leis na meáin oiriúnaithe, agus goraíodh néaróin ar feadh 30 nóiméad ag 37 céim .

Is cuid thábhachtach den néarchóras iad néaróin, atá in ann faisnéis a fháil, a phróiseáil agus a tharchur, agus is bunús ábhartha iad d’intleacht agus iompar an duine. Is ráthaíocht thábhachtach é díolúine don chorp daonna chun seasamh in aghaidh galair. Féadann sé pataiginí agus cealla neamhghnácha a aithint agus a scriosadh agus sláinte an chomhlachta a chothabháil.

Léiríonn taighde go bhfuil nasc láidir idir néaróin agus an córas imdhíonachta. Is féidir le néaróin tionchar a imirt ar an gcóras imdhíonachta trí éagsúlacht neurotransmitters a scaoileadh, mar shampla norepinephrine, epinephrine, etc. Is féidir leis na neurotransmitters seo gníomhaíocht na gcealla imdhíonachta a athrú, iomadú agus feidhm na gcealla imdhíonachta a fheabhsú, agus díolúine an chomhlachta a fheabhsú. Ag an am céanna, is féidir leis an gcóras imdhíonachta difear a dhéanamh freisin ar fheidhm na néaróin trí bhealaí éagsúla. Is féidir le cealla imdhíonachta éagsúlacht cítocíní agus hormóin a chur faoi deara, rud a chuireann isteach ar fhás, ar fhorbairt agus ar fheidhm néaróin trí bhealaí imdhíonachta.

Ina theannta sin, is féidir le fachtóirí síceolaíochta agus sóisialta tionchar a imirt ar dhíolúine agus ar fheidhm néarónach. Is féidir le mothúcháin diúltacha cosúil le strus, imní, agus dúlagar tionchar diúltach a imirt ar an gcóras imdhíonachta agus ar néaróin, ag laghdú díolúine an chomhlachta. Is féidir le mothúcháin dearfacha, caidreamh sóisialta dearfach, agus stíl mhaireachtála shláintiúil forbairt shláintiúil díolúine agus néaróin a chur chun cinn.

Mar achoimre, tá caidreamh idirghníomhach agus comhthacúil idir néaróin agus imdhíonacht. Is féidir le sláinte mheabhrach a chothabháil, ag tabhairt aghaidh ar an saol go dearfach, agus nósanna maireachtála maithe a ghlacadh díolúine an chomhlachta agus forbairt shláintiúil néaróin a chur chun cinn. Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid ár gcuimhne a fheabhsú. Is féidir le Cistanche deserticola feabhas suntasach a chur ar chuimhne, mar is féidir le Cistanche deserticola cothromaíocht neurotransmitters a rialáil freisin, mar shampla leibhéil acetylcholine agus fachtóirí fáis a mhéadú. Tá na substaintí seo an-tábhachtach don chuimhne agus don fhoghlaim. Ina theannta sin, is féidir le feoil sreabhadh fola a fheabhsú freisin agus seachadadh ocsaigine a chur chun cinn, rud a d'fhéadfadh a chinntiú go bhfaigheann an inchinn cothaithigh agus fuinneamh leordhóthanach, rud a fheabhsóidh beogacht agus seasmhacht na hinchinne.

Cliceáil fios bealaí chun feidhm na hinchinne a fheabhsú

Rinneadh íomháú imeacht ama ar néaróin ag baint úsáide as micreascóp réimse leathan Ti2. Thosaigh an íomháú láithreach ag 30 nóiméad agus lean sé ar feadh tréimhse nach faide ná 30 nóiméad. Tógadh nochtadh 1- gach nóiméad, agus rinneadh íomhánna de 20-30 limistéar ar leith in aghaidh an mhias laistigh de 30 nóiméad. Rinneadh cainníochtú faid agus treoluas na gcáithníní LysoTracker agus anailísí kymograph ag baint úsáide as bogearraí NIS Elements agus tá cur síos mionsonraithe orthu thíos. I dturgnaimh ar leith, cuireadh 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) le meáin oiriúnaithe, agus tógadh íomhánna a gabhadh de néaróin bheo ar feadh tréimhse nach faide ná 15 nóiméad ag baint úsáide as micreascóp comhfhócasach Nikon A1 le cuspóir 60X (NA 1.4) agus bogearraí NIS Elements.

Íomháú beo ar fhíocháin inchinne

{{0}}Instealladh ip go laethúil do lucha 5XFAD mí d'aois ar feadh 3 seachtaine agus nuair a críochnaíodh an chóireáil, rinneadh ainéistéisiú ar lucha, agus perfused le tuaslagán ina raibh 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1mM kynurenate , 0.01mM DL-2-Aimín-5-aigéad fosfónopentanoic, glutathione 5mM, glúcós 25mM, 125mM NaCl, 1.4mM NaH2PO4 agus 25mM NaHCO3.

Rinneadh brains a scaradh go tapa ansin in ACSF ocsaiginithe le fuar oighir ina raibh 2.5mM KCl, 85mM NaCl, 1.25mM NaH2PO4, 25mM NaHCO3, {{10}}.5mM CaCl2, 4mM 4 MgCl2, 75mM, glúcós 50uM C6H7NaO6, 0.1mM kynurenate, 0.01mM DL-2-Aimín-5-aigéad fosfónopentanoic agus 5mM glútathione. Fuarthas slisní corónach 300μm ag baint úsáide as microtome creathadh Compresstome VF-200 (Beachtais Ionstraimí) agus ceadaíodh iad a scíth a ligean ar feadh 30 nóiméad le haghaidh aisghabháil ag 32 céim i dtuaslagán ACSF ocsaiginithe ina bhfuil na 2.5mM KCl, 85mM NaCl, 1.25mM NaH2PO4, a leanas. 25mM NaHCO3, 0.5mM CaCl2, 4mM 4 MgCl2, 75mM shiúcrós, 25mM glúcóis, 50uM C6H7NaO6, 0.1mM kynurenate, 0.01mM DL{{58}Aimínaigéad{{59}fónaigéadaigéad.

Aistríodh na slisní ansin chuig miasa bun gloine 35mm (MatTek # P35G-1.5-14C) ina raibh ACSF ocsaiginithe le 25nM LysoTracker-Green agus caolú 1:10,000 de 1mg/ mL Tiazine Red (#S570435, Sigma Aldrich) a bhí comhionann ar shlí eile leis an ACSF a úsáideadh le linn na tréimhse aisghabhála. Deimhníodh inmharthanacht slisne trí úsáid a bhaint as íomháú tréimhsí ama ar fhíocháin. Goradh slisní le LysoTracker-Green agus Tiazine Red ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra agus ansin rinneadh íomhánna de réigiúin cortical inchinne láithreach sa réiteach céanna ag céim 32 ar mhicreascóp comhfhócasach Nikon A1 le cuspóir 60X (NA 1.4) agus bogearraí NIS Elements do nach faide ná 30 nóiméad.

Eastóscadh inchinn agus imdhíonadh

Rinneadh lucha a ainéistéisiú trí instealladh ion-beireatóineach de xylazine (15mg/kg) agus cetamine (100mg/kg), bréifnithe le saline maolánach fosfáit (1XPBS) le fluairíd feinilmeitilsulfonile (20ug/ml), leupeptin (0.5ug/ ml), orthovanadáit sóidiam (20μM), agus dithiothreitol (0.1mM), agus baint inchinne ina dhiaidh sin. I ngach maolán a úsáidtear le haghaidh eastóscadh próitéin bhí manglam coscaire próitéáis III (#535140, Millipore) agus coscaire fosfatase Stop (#78420, Thermo Fisher Scientific). Rinneadh fíocháin Hemibrain a mheá agus a aonchineálú de láimh ag baint úsáide as homogenizer dounce 1:10 (w / v) in 1XPBS.

Tar éis aonchineálú, lártheifneoiríodh lysates ag 20,8{{10}}0g ar feadh 30 nóiméad ag 4 chéim . Baineadh an codán intuaslagtha (supernatant), agus athchóiríodh an millíní trí phíopáil i maolán measúnachta radioimmunoprecipitation (RIPA) [50mM Tris, 0.15M NaCl, 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (IGEPAL), 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0. % deocsacolaáit sóidiam ag pH8] chun gor ar oighear ar feadh 30 nóiméad.

Rinneadh na samplaí a sonicated (Misonix XL{{{0}}) ar feadh 20 soicind ar oighear agus ansin lártheifneoiriú ag 20,800g ar feadh 30 nóiméad ag 4 céim . Baineadh an codán intuaslagtha RIPA (supernatant), agus athchuireadh an millíní i guanidine 5M (pH 8.0) chun anailís a dhéanamh ar phróitéiní dothuaslagtha. Bhí gach sampla sonicated ar feadh 20 soicind ar an oighear, rothlú ar feadh 1 uair an chloig ag teocht an tseomra, agus ansin lártheifneoiriú ag 20,800g ar feadh 30 nóiméad ag 4 céim . Baineadh úsáid as measúnacht aigéad bicinchoninic te (BCA) (#23225, Thermo Fisher Scientific) chun tiúchan próitéine gach sampla a thomhas.

Maidir le blotaí an iarthair, lódaíodh 20ug de phróitéin gach sampla ar glóthacha 4-12% NuPAGE (Invitrogen) agus scartha iad le maolán MOPS faoi choinníollacha laghdaithe agus dínádúraithe. Aistríodh na próitéiní go membrane défhluairíd pholaivinilideéin agus forbraíodh iad ag baint úsáide as Pierce ECL (cemiluminescence feabhsaithe; Thermo Fisher Scientific). Rinneadh na comharthaí forbartha a léirshamhlú ag baint úsáide as ProteinSimple FCR (FluorChem R) agus rinneadh na comharthaí ceimiceacha ina dhiaidh sin a chainníochtú ag baint úsáide as bogearraí AlphaView (ProteinSimple). Rinneadh anailís ar gach blot ag baint úsáide as an uirlis Ceartúchán Cúlra Áitiúil ach amháin an blot HDJ-2, a ndearnadh anailís air ag baint úsáide as an uirlis Background Link i gcomhar le Il-réigiúnach Cúlra Ceartúchán (bogearraí AlphaView).

A 42 ELISA

Chun aonchineálacht A 42 a thomhas i hemibrain ó lucha 5XFAD, úsáideadh Measúnacht Einsím-Ceangailte-Immunosorbent (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) atá ar fáil ar bhonn tráchtála de réir threoracha an déantóra chun anailís a dhéanamh ar ghuainidín agus A 42 intuaslagtha le PBS i hemibrains. Chun A 42 a thomhas in inchinn lucha HAPP/PS1, baineadh úsáid as ELISA a bhí ar fáil go tráchtála (h amyloid 42 ELISA ardíogair, Te Genetics Company, Zurich, An Eilvéis). Rinneadh an ELISA de réir phrótacal an mhonaróra.

Imdhíonfluaraiseacht fíochán inchinn luch

Tar éis perfusion, baineadh brains amach agus socraíodh hemibrains i 10% formalin agus ina dhiaidh crióchoimeád i dtuaslagán siúcrós 30% in 1XPBS. Baineadh úsáid as microtome reo sleamhnáin chun 30-μm de chodanna corónacha nó saighdeacha a bhaint. Cuireadh codanna go sraitheach i bpláta tobair 12- i dtuaslagán cryoprotective (1xPBS, 30% siúcrós, agus 30% glycol eitiléine) agus stóráiltear iad ag −20 céim go dtí go n-úsáidfí é. Rinneadh staining imdhíonfluaraiseachta trí na hailt a ní trí huaire i 1XTBS ar dtús agus ansin codanna gortha i glicín 16 mM i 1XTBS ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra. Tar éis 3 nite breise in 1XTBS, cuireadh bac ar ailt i séiream gabhar 5% i 0.25% Triton X-100 in 1XTBS ar feadh 2 uair ag teocht an tseomra.

Ansin goradh na hailt thar oíche in antasubstaintí príomhúla i dtuaslagán de 0.25% Triton X-100, 1% albaimin séiream buaibheach, agus 1XTBS ag 4 chéim . Rinneadh imdhíonadh tánaisteach ansin le hantasubstaintí tánaisteacha lipéadaithe asail AlexaFluor ag tiúchan 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). Baineadh úsáid as ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) chun rannóga a fheistiú sula ndéanfaí é a íomháú ar mhicreascóp leathan-réimse Ti2 nó ar mhicreascóp comhfhócasach scanadh léasair Nikon A1 le haghaidh cainníochtú íomhá ag baint úsáide as bogearraí Nikon NIS Elements le haghaidh éadála.

D’fhan na socruithe fála go léir mar a chéile idir géinitíopaí agus fuarthas gach íomhá laistigh den tréimhse íomháithe chéanna do thurgnaimh aonair (Ionad Ardmhicreascópachta Ollscoil an Iarthuaiscirt agus Ionad Íomháú Nikon).

Cainníochtú íomhá

Brains luch

Rinneadh cainníochtú imdhíonfhluaraiseachta ar imdhíonacht fíocháin inchinne luiche ar 3-5 rannóg in aghaidh an ainmhí, ó chomhordanáidí Bregma de thart ar -0.94 go −2.55mm, a íomháíodh ag baint úsáide as cuspóir 10X ar mhicreascóp réimse leathan Ti2. Rinneadh anailísí cainníochtaithe, lena n-áirítear tairseacha méide agus déine, ag baint úsáide as Bogearraí Nikon NIS-Elements (Ionad Íomháithe Nikon Ollscoil Northwestern).

Ag brath ar an gcomhartha, socraíodh tairseacha ag baint úsáide as an uirlis Anailís Ghinearálta bunaithe ar mhéid réad, cruth agus codarsnacht, agus ansin cruthaíodh maisc dhénártha do gach cainéal agus réigiún spéise. Rinneadh tairseacha ar leithligh ar gach cainéal chun comharthaí spéise a leithlisiú tríd an gcóimheas comhartha-go-torann a bharrfheabhsú agus deireadh a chur le comharthaí cúlra neamhshonracha. Chun limistéar clúdaithe LAMP1, BACE1, nó LysoTracker-Green a ríomh, chomh maith le tomhais déine fluaraiseachta LAMP1 agus Lysosensor i néaróin phríomhúla, rinneadh réigiúin spéise a rianú de láimh ag baint úsáide as NIS-Elements agus cruthaíodh ciseal dénártha do gach réigiún spéise.

Chun an cóimheas idir LAMP1 agus A 42 a ríomh, normalaíodh limistéar LAMP1 i néaráití diostrófacha go dtí limistéar A 42 ar bhonn plaic aonair agus cainníochtaíodh na meánchóimheasa in aghaidh na luiche idir grúpaí cóireála. Rinneadh anailís ar chomhéifeacht comhghaoil ​​Pearson do BACE1 agus LAMP1 ag baint úsáide as NIS-Elements ar bhonn plaic ar réamh-mheastacháin uasta déine na n-íomhánna 30μm Z-cruach a glacadh ag baint úsáide as micreascóp comhfhócasach scanadh léasair Nikon A1 le méid céime 1μm.

Chun an cóimheas idir LysoTrackerGreen agus Tiazine dearg a ríomh, normalaíodh limistéar LysoTracker-Green i néaráití diostrófacha go dtí limistéar Tiazine Red ar bhonn plaic aonair agus rinneadh an meánchóimheas in aghaidh na luiche a chainníochtú idir grúpaí cóireála. Úsáideadh ceithre chuid corónacha ó chomhordanáidí Bregma de thart ar −1.70 go −2.55mm chun achar nó déine gach comhartha i ngach réigiún inchinn faoi seach a ríomh do gach luch. Rinneadh anailís ar achar clúdaithe le plaic agus ar mhéid plaic ag baint úsáide as an meán de chúig chuid in aghaidh na luiche ó chomhordanáidí Bregma de thart ar −0.94 go −2.55mm. Rinne duine a bhí dall ar ghrúpaí cóireála agus ar ghéinitíopaí roghnú alt, sealbhú íomhá, rianú íomhá agus cainníochtú.

Néaróin phríomhúil

Chun imdhíonadh LAMP1 a chainníochtú i néaróin phríomhúla luiche seasta, rinneadh somas a rianú de láimh bunaithe ar mhoirfeolaíocht ag baint úsáide as NIS-Elements, agus cruthaíodh masc dénártha do gach réigiún spéise agus cainéal. Baineadh úsáid as tairseacha chun comharthaí LAMP1 a bharrfheabhsú agus idirdhealú a dhéanamh idir LAMP1 i néaráití, lena n-áirítear dendrites agus axons araon, trí phicteilíní de LAMP1 deimhneach a aonrú le haghaidh picteilíní feadáin.

Eisiatar na comharthaí cille soma LAMP1 ó limistéar iomlán LAMP1 chun anailís a dhéanamh ar vesicles LAMP1 i néaráití. Chun anailís a dhéanamh ar shoghluaisteacht LysoTracker-Green i néaróin, rinneadh íomhánna a chainníochtú trí úsáid a bhaint as NISElements. Rianaíodh luas agus fad na gcáithníní LysoTrackerGreen iomlán i ngach fráma ag baint úsáide as an ngné rianaithe tairiscint uathoibrithe i NIS-Elements. Socraíodh tairseach agus cuireadh i bhfeidhm é ar gach scannán bunaithe ar mhéid agus ar dhéine fhluaraiseachta na gcáithníní LysoTracker-Green chun torann cúlra a dhíchur.

Maidir le giniúint kymograph, rinneadh íomháú teagmhais ama de néaróin shingil ar mhicreascóp comhfhócasach 60X agus aithníodh axons go moirfeolaíoch. Rinneadh céatadán minicíochta na gcáithníní a ghluaiseann i dtreo anterograde nó retrograde, nó ina stad, a chainníochtú trí líon na gcáithníní do gach grúpa a roinnt ar líon iomlán na gcáithníní. Maidir le hanailísí kymograph, sainmhíníodh cáithníní ag gluaiseacht mar a bhfuil luas os cionn 0.1μM/soicind.

Anailís staitistiúil

Baineadh úsáid as bogearraí GraphPad Prism v8 chun anailísí staitistiúla a dhéanamh, lena n-áirítear anailís ar athraithis (ANOVA) le tástálacha posthoc nuair a dhéantar comparáid idir níos mó ná dhá shampla agus t-tástálacha gan péire nuair nach raibh ach dhá shampla á gcur i gcomparáid. Sonraítear sonraí na dtástálacha sonracha lena n-áirítear líon na macasamhla, an cineál tástálacha posthoc, agus luachanna P i bhfíorscéalta. Déantar gach cainníocht a bhreacadh ag an meán±SEM. Críochnaíodh an tábhacht nuair a bhí an luach P níos lú ná 0.05, arna léiriú ag *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com