Laghdaíonn Farnesyltransferase Inhibitor LNK-754 Diostrófaíocht Axonal Agus Laghdaíonn sé Paiteolaíocht Amyloid i Lucha Cuid 1

Teibí

Cúlra:

Is imeachtaí luatha i bpataiginéis AD iad sil-leagan plaic amyloid agus meath axonal. Cuireann A isteach ar mhicritiúibíní i néaráití dystrophic presynaptic, agus mar thoradh air sin carnadh organelles lagaithe endolysosomal agus uathphagacha a iompraíonn einsím scoilte próitéin réamhtheachtaithe amyloid réamhtheachtaithe (BACE1). Dá bhrí sin, gineann néaráití diostrófacha A 42 agus cuireann siad go mór le sil-leagan plaic.

Is neamhord néareolaíoch é díghiniúint axonal a dhéanann damáiste d'aicson na néaróin, rud a chuireann isteach ar sheoladh nerve. Is líne thábhachtach cosanta í an díolúine don chorp daonna chun seasamh in aghaidh ionradh frídíní agus víris eachtracha. Mar sin, an bhfuil gaol idir díghiniúint aiseach agus díolúine?

Gcéad dul síos, ní galar é degeneration axonal de bharr an chóras imdhíonachta, mar sin ní gá a bheith buartha faoi díolúine a dhéanann difear diúltach air. Cé nach bhfuil an chúis shonrach le meath axonal anaithnid, tugann roinnt staidéir le fios go bhféadfadh baint a bheith ag díghiniúint axonal le freagraí athlastacha sa chóras imdhíonachta. Is meicníocht chosanta den chóras imdhíonachta é an freagra athlastach i gcoinne ionradh pataiginí eachtracha. Mar sin féin, má tá sé róghníomhaithe, déanfaidh sé damáiste athlastach do néaróin agus cuirfidh sé díghiniúint aiseach chun cinn.

Ar an dara dul síos, is féidir le córas imdhíonachta láidir feabhas a chur ar fhriotaíocht an chomhlachta agus an baol ionfhabhtaithe agus galair a laghdú, rud atá tábhachtach go háirithe d'othair a bhfuil degeneration axonal acu. Toisc go bhfuil damáiste déanta do néarchóras na n-othar a bhfuil degeneration axonal acu, tá cumas féin-dheisiúcháin an chomhlachta sách lag. Má tá galair eile orthu, rachaidh an riocht in olcas agus cuirfidh sé isteach ar a gcaighdeán maireachtála. Dá bhrí sin, is féidir le haiste bia sláintiúil agus nósanna maireachtála a chothabháil agus díolúine a fheabhsú cabhrú le riosca galair eile a laghdú. Ag an am céanna, féadann sé freagra imdhíonachta an chomhlachta a fheabhsú agus deisiú axons a chur chun cinn agus seoladh nerve a athchóiriú.

Go hachomair, cé nach bhfuil aon nasc riachtanach idir díghiniúint aiseach agus díolúine, is féidir le córas imdhíonachta sláintiúil an chosaint agus an tacaíocht riachtanach a sholáthar d'othair a bhfuil meath axonal acu. Dá bhrí sin, ba cheart dúinn aird a thabhairt ar an tábhacht a bhaineann leis an gcóras imdhíonachta a chothabháil, ag tosú ó ghnéithe cosúil le aiste bia agus nósanna maireachtála, agus leibhéal imdhíonachta an chomhlachta a fheabhsú go gníomhach chun bunús láidir a leagan le haghaidh sláinte agus fad saoil. Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid cuimhne a fheabhsú, agus is féidir le Cistanche deserticola feabhas mór a chur ar chuimhne toisc gur ábhar íocshláinte traidisiúnta Síneach é Cistanche deserticola a bhfuil go leor éifeachtaí uathúla aige, agus is é ceann acu cuimhne a fheabhsú. Tagann éifeachtúlacht na mionfheoil ó na comhábhair ghníomhacha éagsúla atá ann, lena n-áirítear aigéad, polaisiúicrídí, flavonoids, etc. Is féidir leis na comhábhair seo sláinte inchinne a chur chun cinn ar bhealaí éagsúla.

Cliceáil a fhios 10 bealaí chun cuimhne a fheabhsú

Imscrúdaíodh coscairí Farnesyltransferase (FTI) le déanaí maidir le hathshuí i dtreo cóireáil neamhoird neurodegenerative agus bac a chur ar ghníomhaíocht farnesyltransferase (FTase) chun catalú a dhéanamh ar farnesylation, modhnú iar-aistritheach a rialaíonn próitéiní a bhfuil baint acu le feidhm lysosome agus cobhsaíocht microtubule. In inchinn iarbháis AD, déantar FTase agus a chomharthaíocht iartheachtach a uprialáil. Mar sin féin, ní fios an tionchar a bhíonn ag FTIanna ar phaiteolaíocht amyloid agus néaráití diostrófacha.

Modhanna:

Rinneamar tástáil ar éifeachtaí an FTIR LNK-754 agus lonafarnib sa tsamhail luiche 5XFAD de phaiteolaíocht amyloid.

Torthaí:

I 2-mí d'aois 5XFAD lucha cóireáilte go hainsealaí ar feadh 3 mhí, LNK-754 laghdaigh an t-ualach plaic amyloid, agus tau hipearphosphorylation, agus maolaithe an carnadh BACE1 agus LAMP1 i néaritis diostrófach. In 5-mí d’aois 5XFAD cóireáilte go géar ar lucha ar feadh 3 seachtaine, laghdaigh LNK-754 méid néaraíoch diostrófach agus carnadh LysoTracker-Green in éagmais éifeachtaí ar thaiscí A. D’fheabhsaigh cóireáil ghéarmhíochaine le LNK-754 easnaimh chuimhne agus foghlama i lucha amalóideach HAPP/PS1.

I gcodarsnacht le LNK-754, ní raibh cóireáil lonafarnib chomh héifeachtach maidir le plaiceanna, hipearphosphorylation tau, agus neurites diostrófach a laghdú, rud a d’fhéadfadh a bheith mar thoradh ar chumhacht laghdaithe i gcoinne FTase i gcomparáid le LNK-754. Rinneamar imscrúdú ar éifeachtaí FTIanna ar gháinneáil axonal na n-orgán endolysosomal agus fuaireamar amach go bhfeabhsaigh lonafarnib agus LNK-754 iompar aischéimnitheach aischéimnitheach i néaróin phríomhúla, rud a thugann le fios go bhféadfadh FTIanna tacú le haibiú na n-ionasóim dhéanacha aiseacha isteach i lísisóm. Ina theannta sin, mhéadaigh cóireáil FTI leibhéil LAMP1 i néaróin phríomhúla luiche agus in inchinn lucha 5XFAD, rud a léiríonn gur spreag FTIanna bithghineas na n-orgán endolysosomal.

Conclúidí:

Léirímid sonraí nua a thugann le tuiscint gur chuir LNK-754 chun cinn gáinneáil aiseach agus feidhm na n-urranna endolysosómacha, rud a dtugaimid hipitéis dó laghdaigh diostróife axonal, laghdaigh carnadh BACE1, agus chuir sé bac ar sil-leagan amyloid i lucha 5XFAD. Aontaíonn ár dtorthaí le hobair roimhe seo ag aithint FTase mar sprioc theiripeach chun cóireáil a dhéanamh ar phróitéiníteas agus d’fhéadfadh impleachtaí tábhachtacha teiripeacha a bheith aige maidir le AD a chóireáil.

Eochairfhocail:

Galar Alzheimer, neurites dystrophic, coscairí Farnesyltransferase.

Cúlra

Is galar neurodegenerative forásach é galar Alzheimer (AD) arb é an chúis is coitianta le néaltrú sa daonra atá ag dul in aois agus arb iad is sainairíonna é lagú suntasach san fhoghlaim agus sa chuimhne. Ag an leibhéal móilíneach, is iad gnéithe sainiúla na hinchinne AD ná tógáil plaiceanna amyloid- (A ) agus láithreacht cuimsithe tau hyperphosphorylated.

Sna céimeanna luatha, asymptomatic de AD, carnann A san inchinn ar feadh níos mó ná fiche bliain nó níos faide roimh thús lagú cuimhne [1-3]. Dá bhrí sin, bhí laghdú leibhéil A inchinn mar fhócas lárnach na straitéisí cóireála le haghaidh AD [4]. Faoi láthair, is é an t-aon teiripe modhnuithe galair atá ceadaithe go coinníollach ag an FDA ná antashubstaint frith-A a ghlanann foirmeacha comhiomlánaithe A ón inchinn [5], ag dearbhú gur cur chuige tuar dóchais inti é díriú ar A san inchinn maidir le cóireáil AD.

Mar sin féin, theip ar an chuid is mó de na trialacha cliniciúla atá dírithe ar A mar gheall ar imní sábháilteachta nó éifeachtúlachta, agus tá béim curtha anois ar spriocanna atá bunaithe ar hipitéisí éagsúla AD, lena n-áirítear iomadú tau, athlasadh, dyshomeostasis cailciam, agus fachtóirí neurovascular [4, 6, 7 ]. Ina theannta sin, tá suim ag méadú i bpoitéinseal teiripeacha bealaí díghrádaithe lysosomal a ghníomhachtú mar mhodh chun próitéiní pataigineacha a laghdú, gné atá coitianta ar fud galair néar-mheathlúcháin [8-12].

Tá dea-dhoiciméadú déanta ar mhífheidhm fhairsing ar bhealaí endolysosomal agus uathphagacha mar imeacht luath de phaitigineas AD. Tá go leor loci géiniteach so-ghabhálacht AD nasctha le hiompar endolysosomal subcellular agus feidhm lysosome [13], agus carnann organelles endolysosomal agus autophagic méadaithe san inchinn AD laistigh de neurites dystrophic [14, 15].

Is cosúil go gcuirtear tús le neurites dystrophic ar ghortú néarónach, agus in AD tá sé beartaithe gurb é seo díchobhsú microtubules ag A [16]. Mar thoradh air seo bíonn swelling axonal fócasacha a chuireann isteach ar ghnáthbhealaí gáinneála agus díghrádaithe na bpríomhphróitéiní a bhfuil baint acu le táirgeadh A, lena n-áirítear BACE1 [16, 17]. Mar thoradh air sin, gineann dystrophies A 42 agus cuireann siad go mór le taisceadh plaic extracellular agus diostróife axonal [18], ag cur tús le cosán beathaithe ar aghaidh as a dtagann caillteanas synaptic, neurodegeneration, agus easnaimh chognaíoch [16].

D'fhéadfadh straitéisí teiripeacha a fheabhsaíonn iompar agus gníomhaíocht organelles endolysosomal agus autophagic cosc ​​a chur ar diostróife neuritic díghrádú próitéiní pataigineacha a chothú, agus a bheith ina meicníocht ríthábhachtach chun leibhéil BACE1 agus A in AD a laghdú.

De réir mar a leanann an cuardach le haghaidh cóireáil éifeachtach AD, tá méadú suntasach tagtha ar líon na ndrugaí athshuite i dtrialacha cliniciúla le haghaidh AD mar go bhfuil fadhbanna sábháilteachta agus éifeachtúlachta ar eolas ag drugaí a ndearnadh measúnú cliniciúil orthu, rud a chuir dlús leis an bpróiseas forbartha drugaí [7, 19]. Le blianta beaga anuas, d’aithin staidéir FTIanna mar aicme drugaí a d’fhéadfaí a athúsáid chun galair néar-athlúcháin a chóireáil.

Cuireann FTIanna bac ar farnesylation, modhnú iar-aistrithe a rialaíonn próitéiní ina ndéantar pyrophosphate farnesyl a mhodhnú go comhfhiúsach d'iarmhair cistéin i bpróitéiní ina bhfuil móitíf CAAX [20]. Dearadh FTIanna ar dtús chun bac a chur ar ghníomhaíocht Ras oncogenic trí chosc a chur ar a réamhbhreith ach scoireadh iad i dtrialacha cliniciúla le haghaidh cóireála ailse tar éis teacht ar bhealaí malartacha prenylation Ras [21, 22].

Mar sin féin, tá go leor foshraitheanna FTase ann [23-25], rud a fhágann go ndéantar meastóireacht ar FTIanna le haghaidh raon leathan neamhoird, lena n-áirítear galar cardashoithíoch, heipitíteas D, agus progeria [20, 26]. Ina theannta sin, léirigh FTIanna gealltanas i leith galair néar-mheathlúcháin arb iad is sainairíonna iad carnadh comhiomláin próitéine. I múnlaí saothraithe creimirí agus cille de phróitéiníteas, spreagann FTIanna gníomhaíocht líseasómach agus próitéalú próitéiní tocsaineacha a bhaineann go sonrach le galair [8, 9, 27, 28].\

Roimhe seo, léirigh muid gur laghdaigh LNK-754, FTI a tástáladh i dtrialacha ailse, gáinneáil hidrolase lysosomal feabhsaithe, agus laghdaigh comhiomláin alfa-synuclein (-synuclein) i néaróin othar-díorthaithe ag galar Parkinson (PD) agus samhlacha luch PD [8 ].

Thuairiscigh staidéir eile torthaí comhchosúla FTIanna i dtreo comhiomláin próitéine a laghdú; samhlacha cultúir cille PD a chóireáil le FTI-277 laghdaithe -synuclein [28] agus lonafarnib, FTI ceadaithe ag FDA chun cóireáil a dhéanamh ar progeria [29], méadú ar ghníomhaíocht lysosomal agus cuimsiú tau laghdaithe i múnla luch tauopathy [29]. 9]. Ina theannta sin, léirigh staidéar le déanaí gur chuir cnagadh géiniteach FTase néarónach i múnla luch APP / PS1 de AD cosc ​​​​ar ghlúin A [30]. Dhírigh staidéir a rinneadh san am a chuaigh thart a rinne meastóireacht ar FTIanna le haghaidh próitéineapaite ar ról na bhfoshraitheanna FTase i ngníomhaíocht líseasóim agus uathphagaireacht.

Mar sin féin, is eol freisin go gcuireann FTI cobhsaíochta microtubule (MT) chun cinn agus sineirgíonn siad le drugaí cobhsaithe MT chun aicéitiliú tubulin a fheabhsú, trí chosán Ras-neamhspleách [31-33]. Cuireann cobhsú MT bac ar phaiteolaíocht AD i lucha APP/PS1 [34], agus faoi láthair tá roinnt gníomhairí cobhsaithe MT á n-imscrúdú go cliniciúil le haghaidh cóireáil AD [35]. Mar sin, tugann fianaise shubstaintiúil le fios go bhféadfadh FTIanna leas a bhaint as galair arb iad is sainairíonna iad meicníochtaí mífheidhmiúla hoiméastáis próitéine ar nós AD. Mar sin féin, ní thuigtear go hiomlán na spriocanna agus na cosáin a nascann farnesylation próitéine le comhiomláin próitéine laghdaithe i galair néar-mheathlúcháin.

Sa staidéar seo, rinneamar measúnú ar cibé an féidir le cóireáil chógaseolaíoch le FTIanna feabhas a chur ar phaiteolaíocht AD a bhaineann le A. Rinneamar measúnú ar éifeachtaí LNK-754 agus lonafarnib, dhá FTI ar a dtugtar chun comhiomláin próitéine a laghdú i neamhoird neurodegenerative, ar ualach plaic agus neurites diostrófach i múnla luch 5XFAD de phaiteolaíocht amyloid. Soláthraíonn ár dtorthaí léargais ar na conairí a bhfuil tionchar ag coiscthe FTase orthu agus tacaíonn siad go láidir le himscrúdú breise ar athúsáid FTIanna mar theiripeach le haghaidh AD agus galair néar-mheathlúcháin eile arb iad is sainairíonna iad tiomsú comhiomlánaithe próitéine.

abhair agus modhanna

Cóireáil ainmhithe agus drugaí

Rinne Coiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe na hOllscoile (IACUC) an obair ainmhithe ar fad. Tugadh gnáth-aiste bia chow creimire agus uisce ad libitum do lucha agus cuireadh san áireamh iad le timthriall caighdeánach 12-uair an chloig solais/dorcha. Coinníodh lucha 5XFAD ar chúlra C57BL6 (Jackson Laboratories) trí lucha fireann C57BL6 hemizygous transgene-dearfach a thrasnú le lucha C57BL6 baineann transgene-diúltach (Jackson Laboratories).

Inár bprótacal cóireála ainsealach, tionscnaíodh cóireálacha drugaí ag 2 mhí d'aois, an aois ag a bhfuil tús le taisceadh plaic [36, 37]. Sa phrótacal cóireála géarmhíochaine, cuireadh tús le cóireáil drugaí ag 5 mhí d'aois agus ina dhiaidh sin tá taisce plaic agus díghiniúint axonal forleathan [38, 39].

Rinne Link Medicine (Massachusetts USA) LNK{{0}} a shintéisiú agus fuarthas lonafarnib ó Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI). Le haghaidh cóireálacha ainmhithe, ullmhaíodh LNK-745 agus lonafarnib i dtuaslagán téite de 0.5% carboxymethylcellulose (Sigma-Aldrich) mar fheithicil ag tiúchan 0.10mg/mL go dtí go dtuaslagtar é agus go raibh an réiteach tuaslagtha soiléir.

Reoiteadh slánchóipeanna le haghaidh instealladh ag −20 céim agus ansin leáite iad agus stóráiltear iad ag 4 chéim le haghaidh gach seachtain cóireála. Cuireadh cóireáil ar lucha tar éis prótacail bhunaithe arbh eol dó gníomhaíocht lísómach a fheabhsú [8]. Sa phrótacal cóireála ainsealach, rinneadh 2-mí d'aois 5XFAD lucha a instealladh trí instealladh intraperitoneal (ip) le ceachtar feithicil, LNK754, nó lonafarnib go laethúil ag baint úsáide as 29-steallaire insline tomhsaireachta ar feadh 12 seachtaine go dtí go raibh lucha 5 mhí d'aois. Sa réim ghéar-chóireála, 5-cuireadh lucha 5XFAD de mhí d'aois instealladh laethúil ar feadh 3 seachtaine.

Nuair a críochnaíodh na cóireálacha, rinneadh ainéistéiseach agus bréifneach do lucha, agus bailíodh brains le haghaidh tuilleadh anailíse (féach na hailt thíos). Le haghaidh turgnaimh ar shaothrúchán cille, tuaslagadh LNK-754 agus lonafarnib in DMSO agus cuireadh le cultúir néaróin phríomhúla na luiche ag tiúchan 10nM ar feadh 48 uair an chloig. Ba ionann an chóireáil feithicle agus méid comhionann DMSO. Bailíodh cealla agus rinneadh anailís orthu mar a thuairiscítear thíos.

Antasubstaintí

Ba iad na hantasubstaintí a úsáideadh le haghaidh turgnaimh imdhíonfhluaraiseachta ná francach frith-LAMP1 (# 1D4B, DSHB), coinín frith-A 42 (# 700254, Invitrogen), coinín frith-BACE1 (#ab108394, Abcam), tubulin frith-III coinín (#ab18207, Abcam). Le haghaidh imdhíonadh, ba iad na hantasubstaintí a úsáideadh ná frith-aicín coinín (#926–42,210, LI-COR), antip44/42 MAPK coinín (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), frith choinín-44/42 (Erk1/2) (#CS137F5, Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille), frith-LAMP1 coinín (#CS3234, Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille), luch frith-BACE (3D5; Zhao et al., 2007), frith-APP luch (6E10) ( # 803001, BioLegend), frith-p-tau coinín (ser404) (# CS20194, Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille), frith-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), prelamin-A, (#MABPT858, Millipore Sigma) agus frith luch -HDJ-2 (#sc-59,554, Santa Cruz). Baineadh úsáid as antasubstaintí tánaisteacha frith-choine nó -luiche ó Vector Laboratories le haghaidh imdhíonbhlotaí.

Tástáil iompraíochta

Cóireáil ainmhithe agus drugaí

Rinne reMYND, Inc anailísí iompraíochta ag baint úsáide as an tsamhail luch HAPP/PS1 le léiriú néaróin-shonrach ar shóiteán cliniciúil den phróitéin réamhtheachtaithe amyloid daonna mar aon le mutant cliniciúil de presenilin daonna 1 [40]. Taispeánann an luch trasgenach dúbailte seo carnadh spontáineach, forásach A san inchinn, rud a fhágann go bhfuil plaiceanna amyloid laistigh den subiculum, hippocampus, agus cortex ag 6 mhí d'aois. Úsáideadh 48 lucha baineann HAPP/PS1 i gcúlra FVB x C57Bl/6J de 6 mhí d’aois don staidéar seo, i gcomhcheangal le 12 rialtán de chineál fiáin baineann atá comhoiriúnaithe le haois i gcúlra FVB x C57Bl/6J. Riaradh 0.9mg/kg/lá de LNK-754 in aghaidh an bhéil, uair amháin sa lá, ar feadh 12 lá as a chéile. Rinneadh íobairt na n-ainmhithe 2 uair tar éis an dáileog deiridh.

Rinneadh gach lucha a ghéinitíopáil trí imoibriú slabhra polaiméaráise (PCR) ag aois 3 seachtaine agus fuair siad uimhir aitheantais uathúil, a luaithe a bhí na torthaí PCR ar eolas. Rinne an dara PCR seiceáil faoi dhó ar na lucha go léir sular thosaigh an staidéar. Bhí gach lucha randamach randamach agus aois-mheaitseála. Tugadh uimhir randamach do lucha ar ríomhaire agus leithdháileadh iad go randamach ar chóireáil. Chuir an grúpa cóireála na hainmhithe i gcaighean arís 15 lá roimh thús an staidéir chun cur ar a gcumas eolas a chur ar chomhthéacs nua an chliabháin. Bhí rochtain saor in aisce ag lucha ar uisce réamhscagtha agus steiriúil agus chow luch caighdeánach (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, an Ghearmáin). Stóráladh an bia faoi choinníollacha tirime agus fionnuara i seomra stórála dea-aeráilte. Seiceáladh an méid uisce agus bia go laethúil, soláthraíodh é nuair ba ghá agus athnuadh caighdeán uair sa tseachtain. Bhí lucha lonnaithe ar dtús faoi rithim lae-oíche droim ar ais (14 uair an chloig solais / 10 n-uair an chloig dorchadais) ag tosú ag 7 pm i gcliabháin miotail chaighdeánach den chineál RVS T2 (achar 540 cm2 ).

Tá na cages feistithe le hurláir soladacha agus sraitheanna de bhruscar leapa. Bhí líon na lucha in aghaidh an cháis teoranta ag reachtaíocht áitiúil ar leas ainmhithe. 15 lá roimh thús na cóireála, rinneadh lucha a chur i gcaighean aonair T2 macrolon aeráilte agus a iompar chuig an tsaotharlann le haghaidh acclimation chuig an timpeallacht saotharlainne mar ullmhúchán don chóireáil. Sa tsaotharlann, athraíodh an rithim lae-oíche go 12 uair an chloig solais/12 uair an chloig de dhorchadas, ag tosú ag 7 pm

Maze uisce Morris

Rinneadh Maze Uisce Morris ar laethanta 8-12 den chóireáil, agus íobairt na hainmhithe go díreach tar éis na tástála taiscéalaíochta. Bhí uisce sa linn (soitheach bán, ciorclach 1m ar trastomhas) ag 20 céim le dé-ocsaíde tíotáiniam mar bhreiseán gan bholadh, neamhthocsaineach chun an t-ardán éalaithe a cheilt (1cm faoi leibhéal an uisce). Rinneadh fístapáil agus anailís ar shnámh gach luiche (Ethovision, Teicneolaíocht Faisnéise Noldus, Wageningen, an Ísiltír). Roimh oiliúint, cuireadh gach luch ar bharr an ardáin ar feadh 15 soicind. Le haghaidh tástálacha loingseoireachta áite, cuireadh oiliúint ar lucha chun an t-ardán folaithe a aimsiú i seacht mbloc de thrí thriail thar cheithre lá as a chéile.

Is éard atá i ngach triail tástáil snámha éigeantais 120 soicind ar a mhéad, agus 10 nóiméad scíthe ina dhiaidh sin. Tomhaiseadh an t-am a bhí ag teastáil ó gach luch chun an t-ardán a aimsiú. Bíonn cuar foghlama mar thoradh ar na seacht mbloc as a chéile. 24 uair an chloig tar éis na hoiliúna deiridh, bhí triail taiscéalaithe ag gach ainmhí agus baineadh an t-ardán amach. Ceadaíodh do lucha cuardach a dhéanamh ar feadh 60 soicind, agus tomhaiseadh an t-am cuardaigh ceathrúna agus trasrianta an bhunáit ardáin. Le linn na tástála probe deiridh, ceadaíodh do lucha an suíomh roimhe seo den ardán a chuardach ar feadh 60 soicind tar éis an t-ardán a bhaint.

Cultúr néaróin bunscoile

Rinneadh forebrains a roinnt i dtuaslagán Salann Chothrom Hanks (HBSS) (Thermo Fisher #14185-052) ó lucha C57BL6 (Jackson) a bhí ag iompar clainne ar E15.5 chun néaróin phríomha a fháil. Díleádh forebrain scartha i 2.5% trypsin ag 37 céim ar feadh 20 nóiméad. Baineadh úsáid as pípéad Pasteur tine-snasta chun na néaróin a dhícheangal i HBSS. Plátáladh na néaróin ansin ar phláta sé-tobar polai-L-lísín-brataithe, 2 × 106 néaróin in aghaidh an tobair i meán neurobasal arna fhorlíonadh le 2% B-27, 500μM glutamine, serum capall 10%, agus 2.5μM glutamáit (ar fad ó Thermo Fisher).

Athraíodh na meáin 2 uair níos déanaí go Neurobasal le 2% B-27, 500μM glutamine, agus 2.5μM glutamate. 24 uair an chloig ina dhiaidh sin, athraíodh na meáin go Neurobasal móide 2% B-27 agus 500μM glutamine. Rinneadh leath athruithe meán gach 2-3 lá. Saothraíodh néaróin phríomhúla ar feadh 7 lá agus cuireadh cóireáil orthu le tiúchan feithicle (DMSO) nó 10nM de LNK-754, nó lonafarnib ar feadh 48 uair. Ansin socraíodh néaróin nó rinneadh íomhánna beo díobh mar a thuairiscítear thíos.

Le haghaidh fosúchán, goradh néaróin ar feadh 20 nóiméad i 4% paraformaildéad, 0.12M siúcrós in 1XPBS, tréscaoilteach i 0.5% Triton X-100, agus gortha iad le príomhantasubstaintí thar oíche agus ina dhiaidh sin. antasubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha frith-luiche Alexafuor (Tóraigh Mhóilíneach, 1:1000) agus comh-dhaite le 300nM DAPI. Gléasadh duillín clúdaigh ag baint úsáide as Prolong Gold (Tóraigh Mhóilíneach), agus fuarthas íomhánna ar mhicreascóp comhfhócasach Nikon A1 le cuspóir 60X (NA 1.4) agus bogearraí NIS Elements.

Íomháú beo de néaróin

Le haghaidh turgnaimh íomháithe beo, ullmhaíodh néaróin mar atá thuas agus plátáilte i miasa bun gloine 35mm (MatTek # P35G-1.{4}}C) ar feadh 7 lá sa chultúr. Cuireadh 10nM LNK-754 nó lonafarnib le meáin choinníollach ansin, caitheadh ​​le cultúir rialaithe le DMSO mar fheithicil. Tar éis 48 uair an chloig de chóireáil, cuireadh meáin choinníollach ó phlátaí comhthreomhara neamhchóireáilte néaróin in ionad na meáin chumarsáide. Cuireadh 25nM de LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) leis na meáin oiriúnaithe, agus goraíodh néaróin ar feadh 30 nóiméad ag 37 céim .

Rinneadh íomháú imeacht ama ar néaróin ag baint úsáide as micreascóp réimse leathan Ti2. Thosaigh an íomháú láithreach ag 30 nóiméad agus lean sé ar feadh tréimhse nach faide ná 30 nóiméad. Tógadh nochtadh 1- gach nóiméad, agus rinneadh íomhánna de 20-30 limistéar ar leith in aghaidh an mhias laistigh de 30 nóiméad. Rinneadh cainníochtú faid agus treoluas na gcáithníní LysoTracker agus anailísí kymograph ag baint úsáide as bogearraí NIS Elements agus tá cur síos mionsonraithe orthu thíos. I dturgnaimh ar leith, cuireadh 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) le meáin oiriúnaithe, agus tógadh íomhánna a gabhadh de néaróin bheo ar feadh tréimhse nach faide ná 15 nóiméad ag baint úsáide as micreascóp comhfhócasach Nikon A1 le cuspóir 60X (NA 1.4) agus bogearraí NIS Elements.

For more information:1950477648nn@gmail.com