Feabhas a chur ar Phróitéamaíocht Barr-Síos As Fíocháin Inchinne Le FAIMSÍ Cuid 1

Teibí

Thug imscrúduithe próitéamacha ar ghalar Alzheimer agus Parkinson léargas luachmhar ar neamhoird néar-mheathlúcháin. Go dtí seo, tá na himscrúduithe seo teoranta don chuid is mó de chur chuige ón mbun aníos, rud a chuir bac ar a mhéid is féidir le duine staid "sláin" próitéine a thréithriú.

Is galar néarmheathlúcháin é galar Alzheimer a bhfuil éifeachtaí dochúlaithe aige ar chuimhne agus ar chumais chognaíoch duine. Cé nach féidir le daoine an galar a leigheas go hiomlán, trí chóireáil chúramach agus trí chosc, is féidir dul chun cinn an ghalair a mhoilliú oiread agus is féidir agus is féidir sláinte fhisiciúil agus mheabhrach an othair a choinneáil.

Tá cuimhne ar cheann de na gnéithe is soiléire a mbíonn tionchar ag othair Alzheimer orthu. Féadfaidh siad dearmad a dhéanamh go minic ar fhaisnéis thábhachtach, mar a n-ainm, ainmneacha a ngaolta, dátaí tábhachtacha, agus mar sin de. Ina theannta sin, féadfar dearmad a dhéanamh freisin ar roinnt ardfhoclóra féinfhoghlama, mar choincheapa teibí agus comhchiallaigh. Mar sin féin, le roinnt oiliúna agus cóireála cognaíocha, is féidir le hothair Alzheimer fós a gcuimhne a choinneáil i roinnt gnéithe.

Cé gur féidir le galar Alzheimer éifeachtaí diúltacha a thabhairt, ba cheart dúinn breathnú air go dearfach. Ar dtús, trí fheasacht agus tuiscint ar an ngalar a mhéadú, is féidir linn é a chosc agus a chóireáil ar bhealach níos fearr. Ar an dara dul síos, is féidir le cúramóirí agus baill teaghlaigh othar Alzheimer a fhoghlaim freisin conas cumarsáid a dhéanamh agus idirghníomhú leo go héifeachtach chun cabhrú le hothair féin-dínit a choinneáil agus maireachtáil go sona sásta oiread agus is féidir.

Go ginearálta, cé gur féidir le galar Alzheimer éifeachtaí dochúlaithe a chur faoi deara ar chuimhne agus ar chumais chognaíoch, ba cheart dúinn dearcadh dóchasach a choinneáil agus iarracht a dhéanamh dul chun cinn an ghalair a mhoilliú trí chóireáil agus bearta coisctheacha. Ag an am céanna, ba cheart dúinn níos mó cabhrach agus tacaíochta a sholáthar dóibh siúd a thugann aire d’othair a bhfuil galar Alzheimer orthu, agus a chruthaíonn pobal níos teo agus níos idirghníomhaí i gcomhpháirt. Is féidir a fheiceáil go gcaithfimid cuimhne a fheabhsú. Is féidir le cistanche cuimhne a fheabhsú go suntasach toisc gur ábhar íocshláinte traidisiúnta Síneach é le go leor éifeachtaí uathúla, agus is é ceann acu cuimhne a fheabhsú. Tagann éifeacht Cistanche ó na comhábhair ghníomhacha éagsúla atá ann, lena n-áirítear aigéad tannic, polaisiúicrídí, gliocóisídí flavonoid, etc. Is féidir leis na comhábhair seo sláinte inchinn a chur chun cinn ar go leor bealaí.

Cliceáil a fhios 10 bealaí chun cuimhne a fheabhsú

Sáraíonn próitéamaíocht ón mbarr anuas (TDP) an teorannú seo; áfach, tá sé teoranta go hiondúil chun breathnú ar na próitéfhoirmeacha is flúirsí de mhéid measartha beag.

Dá bhrí sin, úsáidtear teicnící codáin go coitianta chun castacht na samplaí a laghdú. Anseo, déanaimid imscrúdú ar chodánú céim-gháis trí speictriméadracht soghluaisteachta ian tonnchruth neamhshiméadrach ardréimse (FAIMS) laistigh de TDP.

Ag baint úsáide as sampla ard-castachta díorthaithe ó fhíochán inchinne galar Alzheimer (AD), déanaimid cur síos ar conas is féidir le FAIMS a chur le TDP doimhneacht an chlúdaigh próitéamaí a fheabhsú go láidir.

Mar shampla, d’fhéadfadh cur i bhfeidhm FAIMS le voltais chúitimh sheachtraigh (CV) ag céimniú ag −50, −40, agus −30 CV níos mó ná dúbailt ar mheánlíon na bpróitéfhoirmeacha, na ngéinte agus na seicheamh próitéamaí nach bhfuil iomarcach i gcomparáid le withoutFAIMS.

Fuaireamar amach freisin gur féidir le FAIMS tionchar a imirt ar tharchur próitéfhoirmeacha agus a gclúdach luchta bunaithe ar a méid. Rud atá tábhachtach, chuir FAIMS ar chumas próitéfhoirmeacha slána amyloidbéite (A ) a aithint, lena n-áirítear an leagan A 1-42 a bhí seans maith go comhiomlánú agus atá nasctha go láidir le AD.

Taisceadh sonraí amha agus comhaid ghaolmhara chuig an Cuibhreannas ProteomeXchange tríd an stór sonraí MassIVE le haitheantóir tacair sonraí PXD023607.

RÉAMHRÁ

Le fiche bliain anuas, tá níos mó ná dúbailt tagtha ar mhinicíocht na ngalar néar-mheathlúcháin ar fud an domhain, agus galar Alzheimer (AD) mar an fhoirm is forleithne.1 Dhá speiceas próitéine, peiptídí amyloid béite (A ) agus próitéin a bhaineann le microtubule fosfarylated tau(tau), Tá baint láidir ag 2–5 le AD.

Mar sin, bhí tábhacht ar leith ag baint le proteomecharacterization mionsonraithe AD.6,7 Bhí ról lárnach ag mais-speictriméadracht sna himscrúduithe seo,8 ag cur chuige ón mbun aníos go príomha.9–16

Mar sin féin, cuireann an díleá prótease a theastaíonn le haghaidh anailísí ón mbun aníos bac ar ghabháil staid iomlán próitéine, ar féidir leis a bheith éagsúil de bharr ailléilí géiniteacha, splicing mhalartacha, próiseáil próitéalaíocha, agus modhnuithe iar-aistrithe (dá ngairtear "próitéasfhoirmeacha").17– 20

Déanann cur chuige próitéamaíocha ó bharr anuas (TDP) anailís ar phróitéiní i staid shlán, is mó an dóchúlacht go ngabhfar próitéfhoirmeacha a bhaineann le paiteolaíochtaí áirithe agus ceadaíonn sé nasc níos láidre agus níos dírí idir géinitíopa agus feinitíopa.20–22

Mar shampla, tá TDP thar a bheith feiliúnach chun blúirí próitéalaíocha inghineacha a dhíorthaítear ó phróitéiní cosúil le tau a ghabháil, atá nasctha le paiteolaíocht Alzheimer.23–26 Tá gealltanas mór léirithe ag roinnt feidhmchlár TDP roimhe seo maidir le ilchineálacht brainproteome réigiúnach agus athruithe néarónacha a nochtadh mar fhreagra ar spreagthaigh éagsúla. .27–30

Mar sin féin, is gnách go n-éilíonn TDP samplaí casta teicnící codánúcháin as líne chun castacht an tsampla a laghdú toisc go gcuimsíonn an próitéama daonna roinnt orduithe méide i méid agus flúirse, agus go ginearálta ní réitítear próitéiní go maith le crómatagrafaíocht leacht ardfheidhmíochta cúlchéimnithe (LC).31

Is féidir an codánúchán as líne seo a chur i gcrích le leictreafóiréis ionchuir codáin leachtacha glóthach-meallta, crómatagrafaíocht eisiata méide, crómatagrafaíocht ianmhalartaithe, nó íonú cleamhnais, chun cúpla ceann a ainmniú.22,32-35

Ar an drochuair, is gnách go laghdaítear toradh agus tréchur trí chodánú as líne trí láimhseáil samplach sínte a éileamh.36 Is rogha tarraingteach codánaithe é scaradh ian-chéim gáis ar féidir a thabhairt isteach idir an LC agus toisí MS gan gá le céimeanna láimhseála samplaí breise.

Tá speictriméadracht soghluaisteachta ian tonnchruth neamhshiméadrach ardréimse (FAIMS) an-oiriúnach don tasc seo nuair a tugadh isteach le déanaí an fheiste FAIMS Pro, a cheadaíonn a dhearadh modúlach soghluaiseacht ian a ionchorprú go héasca ar roinnt ionstraimí reatha Orbitrap.37

Scarann ​​FAIMS, dá ngairtear speictriméadracht soghluaiseachta difreálach freisin, iain i ngás iompróra bunaithe ar theaglaim fachtóirí ar nós méid, luchta, orshape trí thonnchruth neamhshiméadrach a thabhairt isteach le réimsí leictreacha ard agus ísle.38 Chun imbhualadh na n-ian leis na réimsí leictreacha a chosc. leictreoid, diall i gcosán an iain a thugtar isteach trí voltas cúitimh DC (CV) a chur i bhfeidhm,39 a cheadaíonn an t-ian sin a tharchur go roghnaíoch.38

Tá cur i bhfeidhm FAIMS ar anailís shlán próitéine teoranta den chuid is mó do chomhréiritheoirí próitéiní aonair nó teaglaim bheaga de phróitéiní a scaradh; 40–45

áfach, cuireadh FAIMS i bhfeidhm le déanaí ar anailísí próitéine slána agus dúchasacha ag baint úsáide as anailís dromchla eastósctha leachta.46–50Anseo, cuirimid anailís FAIMS-TDP i bhfeidhm ar shampla fíocháin uile ó cortex tosaigh medial (MFC) othar Alzheimer.

Cheadaigh scanadh thar raon CV de −50 go −20 CV le céimniú seachtrach dúinn a fháil amach cén tionchar a bhíonn ag modhnú FAIMS CV ar shaintréithe na n-ian a tharchuirtear tríd an aonad FAIMS sorcóireach, agus conas is féidir leas a bhaint as an ngaol seo chun díriú ar phróitéfhoirmeacha bunaithe ar mhéid.

Mhéadaigh FAIMS-TDP sainaithint próitéfhoirmeach níos mó ná dhá oiread ag CV amháin i gcomparáid le gan FAIMS agus d’éascaigh ceistiú próitéfhoirmeacha atá ábhartha do ghalair néar-mheathlúcháin, lena n-áirítear -, -, agus -synúicléiní, PARK7, isoforms splice tau, agus roinnt próitéfhoirmeacha A slán.

Le chéile, déanann an obair seo cur síos ar conas is féidir sainaithint níos fearr a dhéanamh ar phróitéfhoirmeacha agus ar chuimsiú próitéamaigh go hiondúil trí chodánú gás-chéim le FAIMS sa TDP.

MODHANNA

Ullmhúchán Samplach

Fuarthas an sampla MFC ó Ionad Galar Alzheimer Ollscoil Rush. Daoine scothaosta bunaithe sa chlinic a chláraigh le gearáin chuimhne agus/ordementia ó 1992 go 2005 a bhí sna rannpháirtithe.

Rinneadh measúnú orthu ag Clinic Cuimhne an Rush maidir le néaltrú féideartha agus comhaontaíodh deonú inchinne mar chuid de chroílár cliniciúil Lárionad Galar Alzheimer an Rush. D'fhormheas Bord Athbhreithnithe Institiúideach Ionad Leighis Ollscoil Rush an staidéar.

Tar éis báis, thug an neasghaol toiliú le haghaidh uathóipse. Ba é catagóir diagnóiseach cognaíoch foriomlán an othair ná néaltrú Alzheimer gan aon chúiseanna eile le lagú cognaíocha,51 agus ba é 230 nóiméad an t-eatramh iarbháis.

Rinneadh gach céim de láimhsiú samplach le réamhchúraimí BSL{{{{{}}}}. Aistríodh 33 mg de fhíochán MFC a bhí stóráilte ag −80 céim go feadáin 1.5 mL LoBind Eppendorf (Eppendorf, Cat # 022431081) agus cuireadh 0.5 mL de mhaolán homogenization comhdhéanta de 8 M úiré, 10 mMamóiniam décharbónáite (ABCM), agus 10 mbomóiniam. tris(2-carboxyethyl)fosfín (TCEP) ag pH7.5.

Baineadh aonchineálú amach trí chur isteach fisiciúil trí pestle millíní ríomhaire boise-tiomáinte a chur i bhfeidhm ar feadh 30 s (BioVortexer le SpiralPestle; Biospec 1083 agus 1017), sula gcuirtear 0.5 mL de mhaolán aonchineálaithe ag teocht an tseomra leis.

Ansin goradh an sampla ag 37 céim ar feadh 60 nóiméad ag 1200 rpm ag baint úsáide as ThermoMixer chun eastóscadh agus dínádúrú próitéiní ceallacha a cheadú. Rinneadh an t-ábhar dothuaslagtha úiré a scriosadh le lártheifneoiriú ag 18,000g ar feadh 20 nóiméad ag 22 céim, agus ansin cuireadh an t-ábhar a bhí mar thoradh air le 3 mL de mhaolán níocháin (WB; 8 M úiré, 10 mM ABC, pH7 .5) laistigh de scagaire scoite meáchan móilíneach 4 mL 100 kDa (MWCO) chun speiceas mór MW a bhaint.

Tar éis 1 h de lártheifneoiriú ag 22 céim agus 5000g, ba é an toirt retenate 200 μTalamh ba é an toirt scagáit 3.8 mL. Aistríodh 3.8 mL den scagáit chuig scagaire MWCO 3 kDa chun éillithe beaga-mhóilín agus peiptídí MW íseal a bhaint.

Rinneadh an MWCO scagaire 3 kDa a lártheifneoiriú ag 22 céim agus 7300g ar feadh 1 h, ag tabhairt toirt retenate de 200 μL. Rinneadh 200μL de retenate ón scagaire 100 kDa MWCO a ní arís eile trína chaolú go 4 mLwith WB agus é a scagadh arís tríd an scagaire céanna.

Cuireadh an t-sreabhadh tríd seo leis an scagaire 3 kDa MWCO céanna mar a luadh thuas agus dhírigh sé uair amháin eile.

Aistríodh an 200 μL deiridh de retenate ón nigh scagaire 3 kDa MWCO chuig feadán LoBindEppendorf 1.5 ml. Chun an sampla a aigéadú, cuireadh 10 μL d'aigéad formach (FA) 10% leis, rud a d'eascair tiúchan FA 0.5% sa sampla deiridh.

Rinneadh an sampla a lártheifneoiriú ag 18,000g ar feadh 15 nóiméad chun an t-ábhar deasctha a bhaint roimh an tiúchan próitéine a thomhas ag baint úsáide as an measúnú ar aigéad bicinchoninic (BCA).

Ullmhaíodh caighdeáin séiream buaibheach in 8 M úiré, 10 mM ABC, agus0.5% FA chun cuntas a thabhairt ar aon ranníocaíochtaí maolánacha a d’fhéadfadh a bheith ann don mheasúnacht BCA. Cinneadh gurbh é an tiúchan próitéine faoin measúnú BCA ná 1.1 mg/mL, a fhreagraíonn don táirgeacht deiridh de 0.22 mg de phróitéin iomlán aisghafa sa sampla ∼200 μL. Bhí an sampla ann. caolaithe go 0.5 mg/mL le WB ina bhfuil 0.5% FA agus a stóráil ag −80 céim go dtí anailís LC-MS.

Ba cheart dúinn a thabhairt faoi deara gur tháinig torthaí míthreoracha BCAassay agus LC-MS mar gheall ar roinnt comhpháirteanna mhanglaim a choinneáil ag an scagaire 3KMWCO mar thoradh ar thurgnaimh tosaigh (sonraí neamhfhoilsithe) ag baint úsáide as manglam coscaire protease/fosfatase traidisiúnta laistigh dár maolán homogenization.

Ina theannta sin, tá go leor de na coscairí fosfatase agus próitéáis a úsáidtear go coitianta neamh-chomhoiriúnach go ceimiceach le hoibreáin laghdaitheacha amhail TCEP. Ag cur san áireamh na neamh-chomhoiriúnachta seo, agus go mbeifí ag súil go ndíghníomhódh coinníollacha dínádúraithe láidir 8 M urea le TCEP 10 mM an chuid is mó de phróitéisí, chreideamar go ndéanfaí díghrádú próitéalaíoch a íoslaghdú fós faoi na coinníollacha seo.

Anailísí LC-MS/MS agus Socruithe FAIMS

Rinneadh anailís ar shamplaí trí úsáid a bhaint as córas Waters NanoACQUITY UPLC le pasanna soghluaiste comhdhéanta de {{0}}.2% FA in H2O (céim shoghluaiste A) agus 0.2% FA in ACN (soghluaiste céim B).

Bhí an réamhcholún gaisteoireachta (100 μm id, fad 5 cm) agus an colún anailíseach (75 μm id, fad 50cm) ina sciodar pacáilte leis an ábhar pacála C2 (5 agus 3 μm le haghaidh gaiste/anailíseach, faoi seach, 300 Å, Teicneolaíocht Modhanna Scartha) . Lódáladh samplaí isteach i 5 μLloop, a fhreagraíonn do 2.5 ug den mhéid ábhar luchtaithe, agus cuireadh isteach sa cholún gaiste iad le sreabhadh isocratach de 5% b ag 3 μL/min thar 20 min.

Rinneadh an scaradh le grádán 5-50% b thar 180 nóiméad ag 300 nL/nóim. Le haghaidh anailíse MS/MS ar phróitéiní, rinneadh an córas NanoACQUITY a chúpláil le mais-speictriméadar Comhleá Thermo Scientific Orbitrap LumosTribrid atá feistithe le comhéadan FAIMS Pro.

I measc na bparaiméadar foinse bhí voltas leictreaspré de 2.2 kV, teocht aistrithe ribeach de 275 céim, agus aimplitiúid minicíocht raidió tonnadóir ian de 60%. Socraíodh FAIMS de réir taifeach caighdeánach gan sreabhadh gáis iompróra forlíontach arna rialú ag an úsáideoir agus voltas scaipthe de −5 kV (comhionann le réimse scaipthe −33.3 kV/cm),50 agus d’athraigh an CV ag brath ar an turgnamh (dá dtagraítear mar “céimniú seachtrach ").

Socraíodh an Fusion Lumos chuig an modh feidhmchláir "próitéin slán", a íslíonn an brú ceallaN2 díthiomsaithe C-gaiste (HCD) ardfhuinnimh go 2 mTorr, agus bailíodh sonraí mar phróifíl iomlán. Fuarthas sonraí MS1 agus MS2 ag taifeach 120k agus 60k, micreascannáin 3 agus 2, thar raon 500–2,000 m/z agus400–2,000 m/z, agus le Spriocanna AGC de 5 × 106 agus 5 × 105, faoi seach.

Fuarthas MS1 agusMS2 le ham instealladh uasta de 400 ms freisin. Áiríodh le socruithe a bhraitheann ar shonraí rogha de na 6 ian is déine, eisiamh na n-ian níos ísle ná an stát luchta5+, cuimsiú stáit luchta neamhchinntithe, agus eisiamh dinimiciúil tar éis breathnadóireachta amháin ar feadh 30 s.

Rinneadh iain a roghnaíodh le haghaidh MS2 a leithlisiú thar fhuinneog ±1.5 m/z agus ilroinnte trí dhioscadh de bharr imbhuailte (CID) le fuinneamh imbhuailte 35%. D'úsáideamar CID in ionad HCD mar gheall ar an spleáchas níos ísle ar fhuinneamh imbhuailte normalaithe chun speictrim ilroinnte próitéine inmhínithe a bhaint amach, agus mar sin thugamar tosaíocht d'fhairsinge breathnuithe ár bpróitéin thar chumhdach seichimh.52

Bailíodh tacair sonraí do gach CV FAIMS i dtrí chóip. Taisceadh na hamhchomhaid go léir i stór sonraí MassIVE agus is féidir teacht orthu trí aontachas MSV000086696, nó le PXD023607 arProteomeXchange.

For more information:1950477648nn@gmail.com