Feabhsú ar Éifeachtaí Frith-Angaigineacha Delphinidin Nuair a Chuimsítear Laistigh d'Fheithiclí Beaga Eischeallacha Cuid 1

Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais

Coimriú:(1) Cúlra: Léiríonn an anthocyanin delphinidin airíonna frith-angaigineacha in vitro agus in vivo angiogenesis samhlacha. Mar sin féin, tá droch-ionsú déanta in vivo delphinidin, dá bhrí sin laghdaíonn a bith-infhaighteacht measartha agus a chobhsaíocht a éifeachtaí frith-angaigineacha. Baineann an saothar reatha leas as airíonna beaga feisteáin eischeallacha (EV) chun cobhsaíocht agus éifeachtúlacht an delphinidin a fheabhsú. Nuair a bhíonn sé cuimsithe i sEVanna, cuireann delphinidin bac ar na céimeanna éagsúla den angiogenesis ar chealla endothelial aortach daonna (HAoECs). Cuireadh modh bunaithe ar UHPLC-HRMS i bhfeidhm chun meitibilítí delphinidin laistigh de sEVanna a mheas. Rinneadh measúnacht ar iomadú, táirgeadh ocsaíd nítreach(NO), agus measúnacht Matrigel in HAoECs.(3)Torthaí: Fuarthas Delphinidine, 3-O- -rutinoside, agus Peonidin-3-galactosid araon i delphinidin agus delphinidin-luchtaithe sEVs.sEV-luchtaithe delphinidin méadú ar chumas an delphinidin saor in aisce 2-huaire le haghaidh iomadú endothelial,10-huaire le haghaidh táirgeadh endothelial NO, agus 100-huaire le haghaidh foirmiú ribeach . Mar sin, cuireann delphinidin sEV-luchtaithe éifeachtaí ar na céimeanna éagsúla angiogenesis. (4) Conclúidí: is féidir breathnú ar sEVanna mar chur chuige tuar dóchais inti chun delphinidin a sheachadadh chun díriú ar ghalair a bhaineann le hantaiginí, lena n-áirítear ailse agus paiteolaíochtaí a bhaineann le ró-shoithíochú.

Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh eolais a fháil

Eochairfhocail: delphinidin; cealla endothelial; angiogenesis; vesicles extracellular beaga; ailse ; galair cardashoithíoch

1. Réamhrá

Faightear polyphenols go príomha i mbianna agus deochanna plandaí-díorthaithe agus soláthraíonn siad blas agus dath bianna plandaí. Thairis sin, thuairiscigh staidéir eipidéimeolaíocha laghdú níos mó ar riosca cardashoithíoch agus ailse a bhaineann le aistí bia saibhir i polyphenols [1-3.

Is antocyanin é Delphinidin (2-(3,4,5-trí-hiodrocsaifeinil)cróiméiniliam-3,5,7-triol) a shainaithnítear go flúirseach i nglasraí agus i dtorthaí lí, go háirithe caora agus fíonchaora dearga. Thuairiscigh muid roimhe seo go bhfuil an phróifíl chógaseolaíoch chéanna ag delphinidin mar sliocht iomlán de chomhdhúile polyphenolic fíon dearg chun méadú tiúchan cailciam intracellular agus gníomhachtú tyrosine kinases [3] a chur chun cinn, rud a fhágann go dtiocfaidh táirgeadh ocsaíd nítreach endothelial (NO) tar éis receptor estrogen alfa. (ERo)spreagadh [4]. Ina theannta sin, thuairiscigh muid go ngníomhaíonn delphinidin trí ERo mar mhóilín inmunomodulatory agus frith-athlastach a fhéadfaidh iomadú agus difreáil lymphocyte T a athrú in othair le fachtóirí riosca cardashoithíoch [5].

Mar fhocal scoir, léirigh muid go léiríonn delphinidin airíonna frith-angaigineacha, in vitro agus samhlacha angiogenesis in vivo araon, agus laghdaíonn sé fás siadaí in vivo melanoma [6-10]. Go deimhin, cuireann delphinidin bac ar iomadú cille endothelial trí rannpháirtíocht cyclin D1- agus cosáin cleithiúnacha A [6,7]. Thuairiscigh muid freisin go bhféadfadh baint a bheith againn idir cosc ​​ar bhithgenesis mitochondrial de bharr VEGF tríd an gcosán Akt ag delphinidin agus a éifeacht frith-angaigineach [8]. Thairis sin, laghdaíonn delphinidin fás meall de chealla meall melanoma in vivo trí ghníomhú go sonrach ar iomadú cille endothelial. Tugann an mheicníocht le tuiscint go bhfuil baint idir cosc ​​ar iomadú VEGF-spreagtha trí chomharthaíocht VEGFR2, MAPK, PI3K, agus ag leibhéal trascríobh ar fhachtóirí CREB/ATF1, agus cosc ​​ar phopsphodiesterase2[9]. Níos suimiúla, laghdaigh dáileoga arda de delphinidin neovascularization i múnla in vivo de angiogenesis spreagtha ag ischemia ag baint úsáide as samhail francach de ligature artaire femoral [10]. Le chéile, léiríonn na sonraí seo gur cumaisc geallta é delphinidin chun cosc ​​​​a chur ar phaiteolaíochtaí a bhaineann le neamhoird cardashoithíoch agus tumorigenesis.

Mar sin féin, níl an delphinidin chomh láidir chun na héifeachtaí tairbhiúla seo a chothú i gcomparáid le sleachta polyphenol iomlán fíon dearg, go háirithe maidir le vasodilatation NÍL-idirghabhála a bhíonn ag brath ar endothelium [11]. Go deimhin, tá delphinidin íogair ó thaobh éadrom agus cobhsaí ach amháin ag pH<3; therefore,="" it="" degrades="" rapidly="" under="" physiological="" conditions.="" moreover,="" delphinidin="" is="" poorly="" absorbed,="" and="" thus="" its="" modest="" bioavailability="" and="" stability="" reduce="" its="" effects="" both="" in="" vitro="" and="" in="" vivo.="" the="" measurement="" of="" delphinidin="" and="" its="" conjugated="" metabolites="" in="" plasma="" indicates="" its="" low="" bioavailability="" [12].="" hence,="" it="" is="" important="" to="" find="" new="" strategies="" to="" enhance="" delphinidin="" bioavailability="" and="">

Straitéis amháin chun fadhbanna den sórt sin a shárú is ea úsáid a bhaint as veisteanna eischeallacha (EVanna) mar chóras seachadta drugaí. Fuaireamar amach le déanaí gur nanastruchtúir iad EVanna, lena n-áirítear EVanna móra agus beaga (sEVanna), a thagann ó airíonna éagsúla urrann focheallach, ag sárú teorainneacha na nanafhoirmlithe clasaiceacha. Laghdaíonn sEVanna éagobhsaíocht agus imdhíon-ghineacht, feabhsaíonn siad bith-infhaighteacht agus sprioc-roghnaíocht [13]. Tugann roinnt tuarascálacha faoin scór ar éifeachtaí cosanta na EVanna a scaoiltear ag cealla atá cóireáilte le polyphenols. Go deimhin, laghdaigh sEVanna saibhrithe le miR-21 ó chealla a ndearnadh cóireáil orthu le curcumin fás cille meall agus angiogenesis, ceartaigh tréscaoilteacht endothelial, agus laghdaigh inmharthanacht cille línte cille ailse éagsúla [14]. Ina theannta sin, chuir miR-16-sEVs saibhrithe ó chealla a chóireáiltear le epigallocatechin gallate fás siadaí [15].

Is féidir le Cistanche díolúine a fheabhsú

Sa staidéar reatha, bhaineamar leas as airíonna sEV chun cobhsaíocht agus éifeachtúlacht chosc angiogenesis spreagtha delphinidin-luchtaithe delphinidin araon a fheabhsú ag baint úsáide as cealla endothelial aortach daonna (HAoECs). Cinneadh freisin ar ábhar Delphinidin i dtéarmaí meitibilítí laistigh de na EVs seo.

2. Ábhair agus Modhanna

2.1.Cultúr na gCeall

Bhí HAoECanna (Promocell, Heidelberg, an Ghearmáin) saothraithe ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO2 i meán fáis cille endothelial MV2 (Promocell) arna fhorlíonadh le 1 faoin gcéad peinicillin / streiptimícin (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, An Fhrainc). Trypsinized cealla ag cumar 70/80 faoin gcéad agus úsáideadh iad idir pasáistí 3 agus 6 le haghaidh gach turgnaimh.

Ceannaíodh líne ceall dendritic JAWS II ón mBailiúchán Cultúir de Chineál Meiriceánach (CRL-1194; ATCC; Manassas, VA, USA). Fásadh cealla JAWS II ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO, i meán cultúir iomlán comhdhéanta de mheán riachtanach alfa íosta (Lonza; Basel, an Eilvéis) ina raibh ribonucleosides agus deocsiribonucleosides agus forlíonta le serum bó féatais 20 faoin gcéad (FBS)(Gibco, Life). Teicneolaíochtaí; Grand Island, NY, SAM), 4 mM L-glutamine (Lonza), piriúváit sóidiam 1 mM (Lonza), 1 faoin gcéad peinicillin / streiptimícin (peinicillin / -streptomycin, Sigma-Aldrich) agus 5ng/mL murine GM-CSF (Miltenyi Biotec; San Diego, CA, SAM). Trypsinized cealla ag cumar 70/80 faoin gcéad agus úsáideadh iad idir pasáistí 8 agus 16 le haghaidh gach turgnaimh.

2.2.sEVislisation

Síolaíodh cealla JAWS II ag dlús de chealla céime 5 × 10 i bhfleascán saothraithe cille T175 i meán fáis iomlán, agus tá ocras orthu i FBS roimh aon leithlisiú. Lártheifníodh meán cille ag 300 × g agus 2000 × g ar feadh 10 nóiméad chun cealla agus smionagar cille a bhaint, faoi seach. Lártheifneoiríodh an comhleanúnach dá bharr ag 20,000× g ar feadh 30 nóiméad chun EVanna móra a eisiamh. Lártheifneoiríodh an comhshnáthán ag 200,000×g (uaslártheifneoir Optima MAX-XP agus rótar MLA-50, Beckman Coulter, Villepinte, An Fhrainc) ar feadh 2 uair an chloig chun SEVanna a milleánú. Ansin, nitear sEVanna i saline maolánach fosfáit (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41.8 mM, pH=7.4) agus le déanaí-rifuged ag 200,000 × g ar feadh 2 h. Ar deireadh, athchuireadh sEVpellets i 1 ml de PBS agus stóráiltear iad ag 4 céim go dtí go n-úsáidfí iad ina dhiaidh sin. Cinneadh an méid sEVanna trí úsáid a bhaint as modh Lowry, le serum-albaimin buaibheach (Sigma-Aldrich) mar gur úsáideadh na sEVanna caighdeánacha ag 10 ug/mL.

2.3. Delphinidin á lódáil

Ullmhaíodh Delphinidin in uisce ag pH{{{0}} le {{10}.1 faoin gcéad DMSO chun an tiúchan de 1{0 ug/mL a bhaint amach. Cuireadh na sEVanna leis (2 mg), agus corraíodh an réiteach agus ansin vortexed ar feadh 10 nóiméad. Tar éis 2 h ultralártheifniúcháin ag 200,000×g, athdhéantar an millín a fuarthas i 1 ml de 0.1 faoin gcéad DMSO nó PBS. Tomhaiseadh ionsúiteacht Delphinidin ag 530 nm, agus rinneadh cuar caighdeánach le tiúchain éagsúla (0.1 go 10 ug/mL) de delphinidin in aisce. Ba é an céatadán d’éifeachtúlacht luchtú sEVanna ná 9 faoin gcéad , neamhspleách ar an tiúchan de delphinidin a úsáideadh (sonraí nach bhfuil léirithe). Mar sin, coigeartaíodh an méid delphinidin chun an tiúchan inmhianaithe (0.1 go 5 ug/mL) a fháil laistigh de 10 ug/mL sEVs. Chun delphinidin saor in aisce a bhaint, nitear na vesicles seo faoi dhó.

2.4. Anailís Rianaithe Nanacháithníní (NTA)

caolaíodh samplaí sEV i NaCl steiriúla0.9 faoin gcéad , agus rinneadh anailís ar dháileadh méide ag baint úsáide as NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, RA). Taifeadadh físeáin. Chinn bogearraí NTA an dáileadh méide ag baint úsáide as cothromóid Stokes-Enstein.

2.5. Micreascópacht Leictreonach Tarchuir

Socraíodh sEVanna den chéad uair thar oíche ag 4 céim le 2.5 faoin gcéad glutaraldehyde (LFG Distribution, Lyon, An Fhrainc) i 0.1 M PBS. Ansin, nite sEVanna dhá uair i PBS faoi 100, 000 × g lártheifneoiriú le haghaidh 70 min.sEVs a thaisceadh ar ghreillí copair ar feadh 2 nóiméad agus a dhaite go diúltach le 20 μL d'aicéatáit úráinil 5 faoin gcéad (caolaithe in eatánól 50 faoin gcéad). ） ar feadh 30 s. Breathnaíodh ansin greillí le micreascóp Jeol JEM 1400 (Jeol, Croissy sur Seine, an Fhrainc) a fheidhmíonn ag 120 keV.

2.6. Meitibilítí Delphinidin a chinneadh laistigh de sEVanna

Seo a leanas an t-ullmhúchán samplach - cuireadh meatánól 250 μL (MeOH) le 10ug sEVs athdhéanta i PBS, agus cuireadh samplaí faoi ultrasonaic 20 nóiméad. Cuireadh dhá chéad ul de MeOH leis tuilleadh, agus rinneadh samplaí a lártheifneoiriú (10, 000 × g, 10 nóim, 4 céim ) agus galaithe i comhchruinnitheoir miVac duo (Genevac Ltd., Ipswich, RA). Athdhéantar an sliocht tirim le 200 μL uisce grád LC-MS ina bhfuil 1 faoin gcéad aigéad formach. Cuireadh an meascán faoi dara lártheifneoiriú(10,000× g, 5 min, 4 céim) roimh chromatagrafaíocht leachta ultra-ardfheidhmíochta i dteannta le hanailís mais-speictriméadrachta ardtaifigh (UHPLC-HRMS) chun anailís a dhéanamh. meitibilítí delphinidin le mais tomhais cruinn.

Baineadh amach an scaradh crómatagrafach le colún Kinetex@ 1.7 μm XB C18,150×2.1 mm mar aon leis an gcolún comhfhreagrach SecurityGard C18 (Feiniméan). Is éard a bhí i gcéimeanna móibíleacha ná HO i gcainéal A agus aicéataitrile i gcainéal B, agus bhí 0.1 faoin gcéad d'aigéad formach iontu araon. Seo a leanas an grádán elution (A∶B, o/ø)∶ coinnigh na coinníollacha tosaigh 95:5 ar feadh 2 nóiméad, agus grádán líneach ina dhiaidh sin ó 95:5 go {{17}:100 thar tréimhse 6 nóiméad, coinnigh tú ag 0:100 ar feadh 3 nóiméad, fill ar na coinníollacha tosaigh 95:5 agus coinnigh na coinníollacha seo ar feadh 3.5 nóiméad. Úsáideadh ráta sreafa tairiseach de 0.300 mL/nóim; ba é an méid insteallta 10 μL.

Fuarthas mais-speictrim scanadh iomlán agus spriocdhírithe SIM i mód ianúcháin dearfach, ag baint úsáide as taifeach 70, 000 Leithead Iomlán ag Leath-Uasmhéid (FWHM) le sprioc rialaithe gnóthachain uathoibríoch (AGC) de 3 × 10 céim iain agus uas-instealladh ian. am (IT) de 200 ms. Fuarthas turgnaimh MS/MS atá ag brath ar shonraí i mód sonraí-spleách'Top5.

Rinneadh monatóireacht ar mheitibilítí a tuairiscíodh sa litríocht [16-18]:Deilfinidin, aildéid, aildéid phloraglucinol, aigéad galic, cailcón, petunidin-3-galactosíd, petunidin-3-arabinoside, petunidin {{4} }O-rutinoside, delphinidin-3-arabinoside, delphinidin-3-galactosid, delphinidin 3-O-(6-coumaroylglucoside),delphinidin 3-O- - rutinoside, ciainidín-3-galactosíd, ciainidín 3-O- -rutinoside, Peonidin-3-galactosíd agus malvidin-3-galactoside.

Rinneadh calabrú laethúil ionstraimí trí fheiste calabraithe deimhneach/diúltach Pierce LTO Velos ESI a insileadh mar a mhol an monaróir. Baineadh úsáid as bogearraí Xcalibur 2.2 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, SAM) chun sonraí a fháil, agus úsáideadh bogearraí TraceFinder 3.0 (Thermo Fisher Scientific) chun sonraí a phróiseáil.

2.7. Measúnacht Inmharthanachta Cille

Síolaíodh 1 × 104 HAoEC ar phláta tobair 96- agus saothraíodh iad ar feadh 24 h agus déileáladh leo le delphinidin （1 go 10 ug/mL）. Ansin, 5 ug/mL de 3-（4,5-dime-thylthiazol-2-il）-5-（3-carboxymethoxyphenyl)-2-({ {15}}sulffheinile)-2Cuireadh H- tetrazolium (imoibrí MTS, Promega, WI, SAM) isteach i ngach tobar agus gor é ag 37 céim ar feadh 120 nóiméad. Tomhaiseadh an t-ionsúite ar speictreafótaiméadar CLARIOstar (BMG LABTECH, Ortenberg, an Ghearmáin) ag 490 nm.

2.8. Measúnacht Iomadú

Rinneadh measúnachtaí ar iomadú agus úsáid á baint as trealamh Measúnachta Iomadaithe Cealla CyQUANT (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAM) de réir mholtaí an déantóra. Go hachomair, síolaíodh cealla 1.5 × 10* i 96-phláta tobair. Cuireadh serum-staradh ar na cealla ar feadh 2 h agus ansin déileáladh leo le delphinidin, sEVanna dúchasacha nó sEVanna luchtaithe le delphinidin ag tiúchan éagsúla. Tar éis 24 h goir, nite cealla le PBS, agus cuireadh tuaslagán dath-ceangailteach. Goradh cealla ag 37 céim ar feadh 30 nóiméad. Baineadh úsáid as léitheoir micreaphláta fluaraiseacha (CLARIOstar9, BMG LABTECH, Ortenberg, an Ghearmáin) le scagairí le haghaidh excitation 485 nm agus astú 530 nm chun fluaraiseacht a thomhas.

2.9.NO Measúnacht Táirgthe

Síolaíodh HAoECanna ar 8-sleamhnán tobair (Ibidi, Gräfelfing, an Ghearmáin) ag ráta 3 × 104 cealla in aghaidh an tobair (ie, 3 × 104 cealla / cm²) i 300 μL den mheán. Ag 70-80 faoin gcéad cumar, spreagtar cealla ar feadh 24 h le delphinidin, sEVanna dúchasacha nó delphinidin luchtaithe le sEV. Baineadh úsáid as adenosine triphosphate （ATP） mar rialú dearfach (10 μM, Sigma-Aldrich) chun táirgeadh NÍL a spreagadh. Tar éis 24 h, baineadh meán gach tobair, agus cuireadh an diacetate diaminofluorescein （DAF-2 DA） probe （5 μM ar feadh 30 nóiméad, Santa Cruz Biteicneolaíocht, Santa Cruz, CA, SAM). Ansin, nite na toibreacha le PBS. Socraíodh cealla le paraformaldehyde (4 faoin gcéad , 20 min). Léadh fluaraiseacht le micreascópacht chomhfhócasach (Zeiss, Jena, an Ghearmáin, LSM700). Fuarthas ceithre phictiúr, agus úsáideadh bogearraí ImageJ le haghaidh cainníochtú.

2.10.Measúnacht Mhaitríse

Síolaíodh HAoECanna i toibreacha atá brataithe le Matrigel (glóthach maitrís eischeallacha de sarcoma murine de Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma-Aldrich). Go hachomair, cuireadh 10 μL de Matrigel leachtach i ngach tobar de 15-tobar Ibidi μ- sleamhnán pláta Angiogenesis (lbidi) agus ansin gortha ar feadh 45 nóiméad ag 37 céim chun glóthach a dhéanamh. Ansin síolaíodh agus goradh HAoECanna ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO, ar feadh 45 nóiméad roimh cóireálacha le delphinidin, sEVs dúchasacha nó delphinidin luchtaithe le sEV , ina dhiaidh sin gor de 12 go 14h ag 37 céim agus 5 faoin gcéad CO. Breathnaíodh foirmiú "struchtúir cosúil le ribeach" le micreascóp optúil (Olympus CK40). Bogearraí Íomhá.

2.11.Anailís Staidrimh

Cuirtear torthaí in iúl mar mheán ± SEM. Cinneadh suntasacht na ndifríochtaí idir grúpaí trí anailís ar athraithis (ANOVA), agus ansin tástáil iolrach comparáide Tukey. p-luachanna na<0.05 were="" considered="">

3. Torthaí

3.1.sEV Tréithriú agus Luchtú Delphinidin

I gcomhaontú leis an litríocht, níor spreag delphinidin luchtaithe laistigh de sEVanna athruithe ar mhéid na veicíní, b’ iad 118.7 ± 2.9 agus 111.7± 1.8nm do sEVanna folamh agus sEVanna luchtaithe delphinidin, faoi seach, mar a chinneann Anailís Rianaithe Nanoparticle (Fíor 1A) agus deimhnithe ag anailís micreascópachta leictreon (Fíor 1B). Ina theannta sin, léirigh an dá chineál sEVanna, dúchasacha agus iad siúd atá luchtaithe le delphinidin, marcóirí eiseasómacha amhail ALIX, CD63, agus TSG101 ag leibhéil chomhchosúla (Fíor 1C), ach níor léirigh siad ß-actin, marcóir ar EVanna móra.

Fíor 1. Tréithriú sEVanna.(A) Dáiltí méide sEVanna dúchasacha agus sEVanna arna lódáil le delphinidin bunaithe ar thomhais NTA. (B)Ionadaí Tarchurtha Leictreon Mhicreascópachta íomhá de sEVs dúchasacha agus sEVs luchtaithe le delphinidin. Barra scála=100 nm.(C) Anailís Western Blot a thaispeánann slonn Alix, CD63, TSG101, agus ß-Actin i sEVanna agus sEVanna atá luchtaithe le delphinidin.

Baintear an t-alt seo as Cothaithigh 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378