Tiomáineann Fo-aonad Catalaíoch Próitéin Kinase (DNA-PKcs) atá ag brath ar DNA Dul Chun Cinn Galar Duán Ainsealach i Lucha Fireann

Gortú duáincuireann sé tús le difreáil epithelial agus myofigníomhachtú broblast le linn andul chun cinn galar duáin ainsealach. Anseo, táimidfind gur signi é slonn DNA-PKcsficantly méadaithe safíocháin duáin an dá galar duáin ainsealachothair agus lucha fireannde bharr bac aontaobhach ureteralagusgortú ischemia-reperfusion aontaobhach. In vivo, leagadh DNA-PKcs nó cóireáil lena specific inhibitor NU7441 bac ar anforbairt galar duáin ainsealachi lucha fireann. In vitro, DNA-PKcs deficaomhnaíonn ciency feinitíopa cille epithelial agus inhibitsfigníomhachtú broblast a tharlódh trí fachtóir fáis-béite 1 a athrú. Ina theannta sin, léiríonn ár dtorthaí go gcuireann TAF7, mar fhoshraith féideartha DNA-PKcs, le gníomhachtú mTORC1 trí léiriú RAPTOR a upregulating, rud a chuireann athchlárú meitibileach chun cinn ina dhiaidh sin i gcealla epithelial gortaithe agus myo.fibroblasts. Le chéile, is féidir DNA-PKcs a bhacadh chun athchlárú meitibileach a cheartú trí chomharthaíocht TAF7/ mTORC1 igalar duáin ainsealachagus feidhmíonn sé mar sprioc féideartha le haghaidh cóireálagalar duáin ainsealach. 

Cliceáil anseo chun FOGHLAIM FAOI FHOIRMIÚ Luibhe Cistíneach DOGALAR Ainsealach Duán

Galar duáin ainsealach(CKD) tionchar ar 10% de dhaoine fásta ar fud an domhain1. Cuireann CKD ualach mór ar shláinte an phobail ar fud an domhain, mar go bhfuil dóchúlacht ard ann chun dul ar aghaidh chuigegalar duánach céim deiridh(ESRD), óna dteastaíonn scagdhealú nó trasphlandú duáin1,2. Tá fiobróis interstitial duánach ar cheann de na príomhthréithe paiteolaíocha de CKD2–4 . Tá go leor de na gnéithe pathfiseolaíocha de fiobróis duánach roinnte ag galair shnáithíneacha eile, amhail cioróis an ae agus cardiomyopathies5. Níl aon chóireálacha éifeachtacha ann do CKD, rud a chuireann béim ar an ngá práinneach le tuiscint níos fearr ar na meicníochtaí paiteolaíochaCKD faoi bhun.

I duáin gortaithe, is éard atá i gceist le fiobróis interstitial léiriú neamhghnácha ar fhachtóirí próibrotach, mar shampla fachtóir fáis-béite 1 (TGF- 1) a athrú, difreáil epithelial agus gníomhachtú myofibroblast2. Mar phríomh-idirghabhálaí fiobróis interstitial, ní hamháin go ngníomhaíonn TGF léiriú géinte fibrotic, lena n-áirítear -smooth muscle actin (-SMA), fibronectin (FN) agus collagens, ach cuireann sé chun cinn freisin athchlárú meitibileach éifeacht Warburg de cealla duáin6,7. Le déanaí, léirigh fianaise atá ag teacht chun cinn an gaol idir dírialú meitibileach agus fiobróis interstitial, ag nochtadh go dtarlaíonn athchlárú meitibileach i gcealla duáin (cealla epithelial tubular duánach8,9 agus myofibroblasts10) le linn gortú duáin agus go gcuireann sé le forbairt CKD. Cruthaíonn athchlárú meitibileach i gcealla duáin laghdú suntasach ar ocsaídiú aigéid shailligh (FAO) agus aistriú meitibileach chuig glicealú, ag cur le insíothlú cille imdhíonachta agus fiobróis idirstitial7,11,12. Ina theannta sin, léirigh sonraí cliniciúla go ndéantar dírialú ar mheitibileacht agus bealaí athlasadh in othair CKD7. Má dhéantar EBT a athbhunú nó trí ghliogalú a chosc trí mhodhanna géiniteacha nó cógaseolaíochta, maolaítear fiobróis i múnlaí ainmhithe éagsúla den fhiobróis duánach11,13–15.

I meicníochtaí móilíneacha athchláraithe meitibileach, gníomhaíonn an sprioc mamaigh de rapamycin (mTOR), arb é kinase próitéin serine / threonine cíteaplasma é, chun meitibileacht cille a mhodhnú agus homeostasis meitibileach a chothabháil16,17. Sainmhíníodh dhá choimpléasc feidhme ar leith de mTOR de réir a próitéiní ceangailteacha. Idirghníomhaíonn coimpléasc MTOR 1 (mTORC1) lena rialtóir sonrach RAP TOR agus tá sé íogair do rapamycin18,19. Tá coimpléasc mTOR 2 (mTORC2) á rialú ag RICTOR20. Cuireann gníomhachtú ainsealach mTORC1 athchlárú meitibileach chun cinn i gcoinníollacha paiteolaíocha éagsúla, lena n-áirítear fiobróis duánach interstitial 9, 21-23, ach tá na meicníochtaí a rialaíonn an gníomhachtú seo, go háirithe i fiobróis interstitial, fós anaithnid den chuid is mó.

Tá kinase próitéin DNA-spleách (DNA-PK), coimpléasc trimeric comhdhéanta d'fho-aonad catalaíoch (DNA-PKcs) agus dimer hetero Ku70/80, i ngníomh ag sosanna DNA snáithe dúbailte (DSBs)24,25 nó ROS26. Feidhm aithnidiúil de DNA-PK is ea an nascadh deiridh neamhhomalógach (NHEJ) a idirghabháil, a cheanglaíonn DSBanna ríomhchláraithe a cruthaíodh le linn athmheascadh V(D)J agus a bhfuil ról lárnach aige in athchumadh limficítí25. Mar thoradh air sin, cuireann sócháin i DNA-PKcs bac ar fhorbairt limficítí T agus B, mar gheall ar easnamh recombination V (D) J27,28. Mar sin féin, ní raibh an mhoilliú fáis nó an ardmhinicíocht d’fhorbairt liomfóma cille T le feiceáil i lucha cnagála DNA-PKcs28. Cé gur braiteoir DNA DSB é, tá roinnt airíonna neamhghnácha ag DNA-PKcs, mar shampla carnadh i gcealla go leibhéal i bhfad níos airde ná an méid is dócha a bheidh ag teastáil le haghaidh NHEJ29. Ina theannta sin, tá DNA-PKcs suite sa núicléas agus sa chiteaplasma30. I gcomhaontú lena n-airíonna neamhghnácha, léiríonn fianaise le déanaí go bhfuil feidhmeanna breise ag DNA-PKcs seachas NHEJ31. Mar shampla, cuireann fosfarylation DNA-PKcs-idirghabhála ar an bhfachtóir trascríobh USF-1 chun cinn sintéis aigéid shailligh arna spreagadh ag inslin32, agus cuireann DNA-PKcs meath meitibileach chun cinn le linn aosaithe33. Tá taighde ar fheidhmeanna neamh-NHEJ DNA PKcs, mar mheitibileacht agus aosú, díreach tar éis dul chun cinn, agus tá roinnt ceisteanna fós gan freagairt31. Ina theannta sin, mar cheann de na kinases a bhaineann le fosphoinositide 3-kinase (PI3K), fuarthas amach go rialaíonn DNA-PK gníomhachtú mTOR34.

San obair seo, léiríonn ár dtorthaí go ndéanann DNA-PKcs idirghabháil ar ghníomhachtú comharthaí RAPTOR/mTORC1 trí fosfarylation de fhachtóir 7 (TAF7) a bhaineann le próitéin atá ceangailteach le bosca TATA i CKD. Ceartaíonn cosc ​​DNA-PKcs athchlárú meitibileach i gcealla epithelial gortaithe agus miofibroblasts i CKD. D’fhéadfadh DNA-PKcs feidhmiú mar sprioc féideartha nua chun cóireáil a dhéanamh ar CKD.

Torthaí

Méadaítear DNA-PKcs i duáin othar CKD agus i lucha le fiobróis duánach

Rinneadh anailís ar ghníomhaíocht DNA-PKcs trí staining imdhíon-histochemical de uathfhosfarú S2056 i DNA-PKcs (p-DNA-PKcs) i bhfíocháin duáin shláintiúla agus daonna CKD. Baineadh úsáid as na codanna nontumor de shamplaí nephrectomy mar fhíocháin duáin "sláintiúla", a bailíodh ó othair le carcinoma cille duánach. Léirigh na torthaí go raibh p-DNA-PKcs beagnach do-bhraite sna gnáthfhíocháin duáin seo, ach méadaíodh leibhéil próitéin p-DNA-PKcs go suntasach i bhfíocháin duáin daonna CKD (Fíor 1a). Chun ábharthacht ghníomhaíocht DNA-PKcs agus fiobróis duánach in vivo a chinneadh, rinneadh anailís ar léiriú fibronectin (FN), géine ríthábhachtach a bhaineann le fiobróis duánach, trí staining inmunhistochemical, agus rinneadh staining dearg Sirius freisin chun anailís a dhéanamh ar an méid fiobróis interstitial. in othair CKD (Fíor 1a). Nocht ár dtorthaí comhlachas dearfach idir na leibhéil próitéine de p-DNA-PKcs agus an méid fiobróis interstitial (P=0.005, Fíor. 1b, c). Ina theannta sin, rinneadh anailís freisin ar leibhéil slonn DNA-PKcs ag baint úsáide as tacair sonraí micrea-eagar CKD daonna a foilsíodh roimhe seo (Nephroseq). Fuaireamar amach gur tháinig méadú suntasach ar leibhéil mRNA DNA-PKcs faoi níos mó ná 1.6-huaire i bhfíocháin bithóipse duánach 48 othar CKD i gcomparáid le rialuithe (Fíor Forlíontach 1a), rud a léirigh comhghaol suntasach dearfach leis an méid fiobróis duáin in othair (Fíor Forlíontach 1b). Ina theannta sin, léirigh torthaí comh-staining immunofluorescence de p-DNA-PKcs le Lotus tetragonolobus lectin (LTL) (marcóir tubule duánach) nó -SMA (marcóir myofibroblasts) go raibh DNA-PKcs uasrialaithe sa dá chealla epithelial feadánacha agus myofibroblasts de na fíocháin duáin ó othair CKD (Fíor 1d, e). Léirigh anailís ar bhunachar sonraí seicheamhaithe RNA aonchealla duánach atá ar fáil ar líne (http://humphreyslab.com/SingleCell/) 35 go ​​raibh mRNA DNA-PKcs curtha in iúl go forleathan i gcealla duán agus uasrialaithe i nduáin dhiaibéiteacha daonna i gcomparáid leis na duáin rialaithe (Fíor Forlíontach). .1c).

Chun an nasc idir gníomhaíocht DNA-PKcs agus forbairt fiobróis duán a aithint tuilleadh, rinneamar scrúdú ar shloinneadh agus ar ghníomhaíocht DNA-PKcs in dhá mhúnla luiche de fiobróis duánach, bac aontaobhach ureteral (UUO) agus ischemia-reperfusion aontaobhach (UIR). Léirigh staining inmunohistochemical de p-DNA-PKcs go raibh p-DNA PKcs spreagtha go mór ar an lá 3 i gcomparáid le rialuithe sham sa tsamhail UUO, agus méadaíodh leibhéil próitéin p-DNA-PKcs tuilleadh de réir mar a d'fhorbair fiobróis duáin ó lá 3 go lá. 14 (Fig. 1f). Léirigh torthaí blot an Iarthair agus qRT-PCR go raibh leibhéil próitéine iomlána agus mRNA de DNA-PKcs uasrialaithe go suntasach freisin i bhfíocháin duáin lucha UUO i gcomparáid le rialuithe sham (Fíor 1g agus Fíor Forlíontach Fig. 1e). Chonacthas torthaí comhchosúla i lucha UIR (Fíor 1h agus Fíor Fhorlíontach 1d, f). Spreag an nasc féideartha idir DNA-PKcs agus CKD sinn le himscrúdú breise a dhéanamh ar ról agus impleachtaí meicniúla DNA PKcs i CKD.

Dul chun cinn CKD i lucha trí mheán DNA-PKcs

Ansin, chruthaíomar lucha cnagála DNA-PKcs inar leagadh amach an ghéin ionchódaithe DNA-PKcs Prkdc ag baint úsáide as CRISPR/cas9 mar a thuairiscítear sna Modhanna (Fíor Forlíontach 2a). Rinne géinitíopáil idirdhealú ar lucha heitrisigeacha DNA-PKcs (+/-) agus homaisigeach (−/-) agus lucha de chineál fiáin (WT), mar a léirítear i bhFíor Fhorlíontach 2a. Níor aimsíodh Prkdc mRNA (Fíor Fhorlíontach. 2c) agus leibhéil próitéin DNA-PKcs (Fíor 2e) i bhfíocháin duáin de lucha DNA-PKcs -/ -, rud a thugann le fios go n-éireoidh le baint amach DNA-PKcs i lucha. Chun éifeacht na straitéise cnagála DNA-PKcs ar dhamáiste duánach agus fiobróis a mheas, cuireadh lucha fireanna DNA-PKcs−/-/− fásta (6-8 seachtaine d’aois) agus lucha fireann rialaithe WT faoi UUO agus eotanaíodh iad 7 lá tar éis máinliachta. Léirigh staining PAS go raibh an méid atrophy feadánacha agus dilatation a tharlódh de bharr UUO feabhsaithe go mór i lucha DNA-PKcs - / - i gcomparáid le rialuithe WT (Fíor 2a). Feabhsaíodh fiobróis duánach go mór freisin i lucha DNA-PKcs -/ - i gcomparáid le lucha WT, mar a breathnaíodh, agus cainníochtaithe ag staining Masson (Fíor 2b). Léirigh íomhánna de lipéadú imdhíonachta do thaisceadh collaigine interstitial I agus -SMA go laghdaíodh an dá mharcóirí clasaiceacha próifíle go suntasach sna duáin UUO de lucha DNA-PKcs - / - i gcomparáid le rialuithe WT (Fíor 2c, d). Laghdaíodh leibhéil próitéin marcóirí próibrotach, lena n-áirítear FN agus -SMA, go suntasach freisin sna duáin UUO de lucha DNA-PKcs -/ -, mar a anailísíodh ag blot an Iarthair (Fíor 2e). Léirigh anailís QRT-PCR gur laghdaigh leagadh amach DNA-PKcs i lucha go mór na leibhéil léirithe de ghéinte ríthábhachtacha fiobróis duán, lena n-áirítear Col1a1, Col3a1, Fn1, agus Acta2, a bhí uasrialaithe go mór sna duáin UUO. Ag teacht le fiobróis laghdaithe, laghdaigh knockout DNA PKcs leibhéil mRNA den mharcóir gortú duáin KIM-1 a tharlódh de bharr UUO (Fíor Forlíontach 2c). Ina theannta sin, tá athlasadh ina shainmharc mór ar fhiobróis duánach agus tá ról tábhachtach aige maidir le pataigineas na fiobróis duánach. Mar sin, rinneamar anailís ar mharcóirí a bhaineann le athlasadh, lena n-áirítear na cytokines Il1 , Il6, Tnf , agus Mcp1, ag qRT-PCR. Sa tsamhail UUO, fuaireamar amach gur laghdaíodh go suntasach an t-uasrialú cítocíní athlastacha a tharlódh de bharr UUO mar gheall ar knockout DNA-PKcs (Fíor Forlíontach 2c). Toisc go léiríonn staidéir chliniciúla agus samhlacha ainmhithe araon comhghaol láidir idir macrophages agus méid na fiobróis duánach, rinneadh measúnú ar fhíocháin mhacrophages inUUOkidney insíothlaithe le staining imdhíon-histocheimiceach don mharcóir macrophage F4/80. Léirigh na híomhánna go leor macrophages infiltrated i duáin bac de lucha WT 7 lá tar éis UUO, a bhí laghdú suntasach ag DNA-PKcs knockout (Fig. 2f). Suimiúil, DNA-PKcs

Chun measúnú breise a dhéanamh ar thionchar DNA-PKcs feadánacha duánach ar fiobróis duánach, rinneamar cill epithelial feadánacha duánach proximal le cnag sonrach DNA-PKcs in vivo trí lucha cnagála CRISPR/cas9 a úsáid (Fíor Forlíontach 2e, f). Tar éis instealladh subcapsular de víreas adeno-ghaolmhar (AAV) ina bhfuil RNA treorach (gRNA) le haghaidh DNA-PKcs ar feadh trí seachtaine, cuireadh na lucha cnagála DNA-PKcs feadánacha duánach proximalacha sainiúla DNA-PKcs faoi réir UUO agus euthanized ag 7 lá tar éis na máinliachta. Léirigh staining inmunofluorescence DNA-PKcs easpa DNA-PKcs i gcealla tubular duánach (Fíor 2h) ach bhí sé fós in iúl i -SMA myofibroblasts dearfach (Fíor Forlíontach 2g) de lucha cas9 instealladh le AAV-gRNA, i gcomparáid le iad siúd i lucha cas9 a cuireadh instealladh AAV gan gRNA do DNA PKcs. Léirigh anailís blot an Iarthair go laghdaíodh leibhéil próitéin DNA PKcs agus marcóirí profbrotic, lena n-áirítear FN agus -SMA, go suntasach freisin sna duáin UUO de lucha cas9 a instealladh le AAV-sgRNA, i gcomparáid leo siúd sa ghrúpa rialaithe (Fíor 2g). . Cosúil leis an tsamhail UUO, bhí lucha knockout DNA-PKcs cosanta freisin ó UIR-spreagtha CKD (Fíor Forlíontach 2h-m). Le chéile, tugann na torthaí seo le tuiscint go maolaíonn scriosadh DNA-PKcs dul chun cinn CKD i lucha.

Chun a chinneadh an leor an ró-eisiúint DNA-PKcs sa duán chun fiobróis duán a thiomáint, seachadadh plasmaidí ró-eisbhrú DNA-PKcs daonna (Addgene: 83317) isteach sna duáin luiche trí mhodh instealladh ardbhrú féitheacha eireaball mar a thuairiscítear i roinnt staidéar roimhe seo36. Tríocha sé huaire an chloig tar éis instealladh plasmid DNA-PKcs, tugadh máinliacht UUO do na lucha ar feadh 7 lá. Le chéile, léiríonn ár dtorthaí gur leor léiriú ectopic DNA-PKcs daonna chun dul chun cinn fiobróis duánach in vivo a thiomáint (Fíor Forlíontach 3).

Maolaíonn cosc ​​ar ghníomhaíocht DNA-PKcs forbairt CKD i lucha

Mar thoradh ar na torthaí seo breithníomar an fhéidearthacht go bhféadfaí coscairí DNA PKcs a úsáid chun cosaint a dhéanamh ar fhiobróis duánach. Chun ár hipitéis a thástáil, déileáladh le lucha fireanna fásta (6-8 seachtaine d'aois) WT go laethúil leis an coscaire DNA-PKcs an-sonrach NU7441 ag tosú 1 lá tar éis máinliacht UUO. NU7441-eothánaíodh lucha cóireáilte agus rialaithe 7 lá tar éis máinliacht UUO, agus rinneadh anailís ar ghníomhaíocht DNA-PKcs trí staining imdhíon-histochemical, agus léirigh na torthaí gur chuir cóireáil NU7441 bac suntasach ar ghníomhachtú DNA-PKcs i bhfíocháin ney kid UUO ( Fíor 3a). Feabhsaíodh an méid atrophy feadánacha agus dilatation a tharlódh UUO go mór tar éis cóireála le NU7441 i gcomparáid le rialú na feithicle, mar a léirítear le staining PAS (Fíor 3b). Léirigh anailísí histeapaiteolaíocha ar smálú Masson laghdú tuairim is 50% ar fhiobróis idir-reannach duánach sna duán bactha (UUO) de lucha cóireáilte NU7441-i gcomparáid le duáin rialaithe feithicle UUO (Fíor 3c). Léirigh íomhánna de staining imdhíonfhluaraiseachta gur laghdaíodh sil-leagan collaigine interstitial I arna spreagadh ag UUO go mór le cóireáil NU7441 (Fíor 3e). Laghdaíodh go suntasach leibhéil próitéin marcóirí próibrotach, lena n-áirítear FN agus -SMA, arna anailísiú ag blot an Iarthair i duáin UUO lucha cóireáilte NU7441- i gcomparáid le rialuithe feithicle (Fíor 3f). Léirigh anailís QRT-PCR gur laghdaigh cóireáil NU7441 go suntasach leibhéil léirithe de ghéinte ríthábhachtacha fiobróis duáin, lena n-áirítear Col1a1, Col3a1, Fn1, agus Acta2, i bhfíocháin duáin lucha UUO i gcomparáid le rialuithe feithicle (Fíor Forlíontach 4a). Ina theannta sin, laghdaíodh insíothlú macrophages i bhfíocháin duáin lucha UUO go mór tar éis cóireála le NU7441 i gcomparáid le rialuithe feithicle (Fíor 3d). Laghdaigh NU7441 freisin leibhéil léirithe marcóirí a bhaineann le athlasadh, lena n-áirítear na cytokines Il1 , Il6, Tnf , agus Mcp1, i bhfíocháin duáin lucha UUO, mar a anailísíodh ag qRT-PCR (Fíor Forlíontach 4a). Ina theannta sin, déileáladh le lucha cnagála DNA PKcs le NU7441 chun scrúdú a dhéanamh ar an seach-sprioc NU7441. Léirigh ár dtorthaí nach raibh aon éifeacht fhrithshnáithíneach soiléir ag NU7441 i lucha cnagála DNA-PKcs (Fíor 3g, h), rud a mhol gníomh sonrach NU7441 ar DNA-PKcs sa suíomh turgnamhach seo.

Leathnaíodh éifeacht chosanta NU7441 i gcoinne gortú duánach de bharr UUO agus fiobróis duánach chuig CKD arna spreagadh ag UIR. Mar a bheifí ag súil leis, thug cóireáil NU7441 cosaint freisin ar ghortú duánach de bharr UIR agus fiobróis i gcomparáid le rialuithe feithicle (Fíor Forlíontach 4b–h). Le chéile, léiríonn na torthaí seo go maolaíonn cosc ​​ar ghníomhaíocht DNA-PKcs ag NU7441, dul chun cinn CKD i lucha.

Fíor 3|Maolaíonn cosc ​​ar ghníomhaíocht DNA-PKcs forbairt CKD i lucha UUO. smálú imdhíon-cheimiceach de p-DNA-PKcs sna duáin de lucha atá cóireáilte le NU7441 (40 mg/kg) nó i bhfeithicil atá faoi réir UUO (lá 7), barraí scála: 20 μm. Léiríonn barraí torthaí cainníochtaithe (ciallaíonn ± SD, n=6 lucha de gach grúpa). b staining PAS ar dhuáin lucha atá cóireáilte le NU7441 nó feithicil atá faoi réir UUO, barraí scála: 50 μm. Léiríonn barraí torthaí cainníochtaithe (ciallaíonn ± SD, n=6 lucha de gach grúpa). c smálú mais ar dhuáin lucha atá cóireáilte le NU7441 nó feithicil atá faoi réir UUO, barraí scála: 50 μm. Léiríonn barraí torthaí cainníochtaithe (ciallaíonn ± SD, n=6 lucha de gach grúpa). d smálú imdhíon-hiostaceimiceach de F4/80 sna duáin de lucha atá cóireáilte le NU7441 nó i bhfeithicil atá faoi réir UUO, barraí scála: 20 μm. Léiríonn barraí torthaí cainníochtaithe (ciallaíonn ± SD, n=6 lucha gach grúpa). e Ruaimniú imdhíonfhluaraiseachta COL1A1 sna duáin de lucha atá cóireáilte le NU7441 nó i bhfeithicil atá faoi réir UUO, barraí scála: 20 μm. Léiríonn barraí torthaí cainníochtaithe (ciallaíonn ± SD, n=6 lucha de gach grúpa). f Leibhéil próitéine FN agus -SMA i nduáin lucha atá cóireáilte le NU7441 nó i bhfeithicil atá faoi réir UUO. Léiríonn barraí torthaí cainníochtaithe (ciallaíonn ± SD, n=6 lucha gach grúpa). g Leibhéil próitéine FN agus -SMA sna duáin de lucha DNA-PKcs−/− nó WT atá cóireáilte le NU7441 nó i bhfeithicil atá faoi réir UUO. Léiríonn barraí torthaí cainníochtaithe (ciallaíonn ± SD, n=6 lucha de gach grúpa). h smáthú dearg Sirius ar na duáin de lucha DNA-PKcs−/− nó WT atá cóireáilte le NU7441 nó feithicil atá faoi réir UUO. Léiríonn barraí torthaí cainníochtaithe (ciallaíonn ± SD, n=6 lucha de gach grúpa). Baineadh úsáid as t-tástáil dhá earball gan phéire chun na p-luachanna do a, c, e a fháil. Úsáideadh ANOVA aontreo agus tástáil chomparáidí iolracha Tukey ina dhiaidh sin chun na p-luachanna do b, d, h a chinneadh. Baineadh úsáid as ANOVAanna déthreocha agus triail chomparáidí iolracha Šídák ina dhiaidh sin chun na p-luachanna do f, g a chinneadh. Cuirtear sonraí foinseacha ar fáil mar chomhad Sonraí Foinse.

Caomhnaíonn cosc ​​​​DNA-PKcs feinitíopa cealla epithelial feadánacha agus rialaíonn sé gníomhachtú fibroblast interstitial in vitro

Is imeachtaí lárnacha i bpataigineas CKD2 iad gortú epithelial agus gníomhachtú myofibroblast. Léirigh imdhíonadh gur léir gur spreag spreagadh TGF 1 p-DNAPKcs i gcealla HK-2 (Fíor 4a) agus i gcealla epithelial feadánacha bunscoile (Fíor Forlíontach 5a). Léirigh torthaí blot an Iarthair go raibh leibhéil fosfarylation agus próitéin iomlán DNA-PKcs uasrialaithe go suntasach freisin i gcealla HK -2 cóireáilte TGF 1 nó H2O2 (Fíor 4i agus Fíor Forlíontach 5b). Ina theannta sin, gineadh cealla DNA-PKcs HK-2 ag baint úsáide as CRISPR-Cas9, agus saothraíodh cealla epithelial feadánacha bunscoile WT agus DNA-PKcs. Deimhníodh tógáil rathúil cealla DNA-PKcs knockout HK-2 le blotting an Iarthair (Fíor Forlíontach 5c). Thaispeáin ár dtorthaí gur mhaolaigh bualadh DNA-PKcs nó cosc ​​ar DNA-PKcs ag NU7441 dídhifreáil cealla epithelial duánach, mar a léirítear le leibhéil níos ísle de tháirgeadh FN agus Col1A1 tar éis nochtadh do TGF 1 i knockout DNA-PKcs nó NU{{27 }}cealla cóireáilte (Fíor 4b–d, k, l). Mar sin féin, chuir knockout KU80 dlús le táirgeadh FN arna tharlú ag TGF 1 i gcealla epithelial feadánacha (Fíor 4m). Cosúil leis an tsamhail UUO, níor mhéadaigh cnagáil DNA-PKcs briseadh DNA i gcealla HK-2 a tharlódh ó H2O2 (Fíor Forlíontach 5d). Aithníonn KU70/80 foircinn briste DNA ag DSB ar dtús agus ansin earcaíonn sé DNA-PKcs chun DNA-PK a fhoirmiú atá riachtanach chun DSB a dheisiú trí NHEJ37. Thug na torthaí seo le tuiscint gur chuir DNA-PKcs feabhas ar ghníomhaíocht bhrabóideach na gceall epithelial duánach i CKD neamhspleách ar a fheidhm dheisiúcháin DSB.

Chun imscrúdú a dhéanamh an bhfuil baint ag DNA-PKcs le gníomhachtú agus iomadú fibroblasts interstitial saothraíodh. Léirigh torthaí blot an Iarthair go raibh leibhéil phosphorylated agus próitéin iomlán DNA-PKcs uasrialaithe go suntasach freisin i gcealla F NRK cóireáilte TGF 1 (Fíor 4j). Léirigh imdhíonadh go raibh gníomhaíocht DNA-PKcs thar a bheith suntasach ag cóireáil TGF 1 i gcealla NRK-49F (Fíor 4e) ach cuireadh bac suntasach air ag cóireáil NU7441. Cóireáil cealla NRK-49F le gníomhachtú fibroblast spreagtha TGF 1 agus difreáil myofibroblast le upregulation COL1, -SMA, agus FN, ach an réamhchóireáil le NU7441 go mór blunted an feinitíopa próibrotach (Fíor 4f, g, n). Ina theannta sin, chuir cóireáil NU7441 bac suntasach ar iomadú cille F NRK arna tharlú ag TGF 1 i gcomparáid le rialuithe feithicle, mar atá léirithe ag staining EdU (Fíor 4h). Nuair a chuirtear le chéile iad, léiríonn na sonraí seo go gcaomhnaíonn cosc ​​DNA-PKcs feinitíopa na gceall epithelial feadánacha agus go rialaíonn sé gníomhachtú fibroblast interstitial a tharlódh ag TGF 1 in vitro.

Ina theannta sin, rinneamar scrúdú freisin ar mheicníocht slonn DNA-PKcs spreagtha ag TGF 1-. Gcéad dul síos, fuair muid láithreáin ceangailteach féideartha iolraí de SMAD2 sa réigiún tionscnóir DNA-PKcs trí JASPAR anailís próifílí ceangailteach fachtóir trascríobh 38. Sa dara háit, léirigh torthaí measúnachta luciferase gur mhéadaigh overexpression de SMAD2 gníomhachtú transcriptional DNA-PKcs (Fíor Forlíontach. 5e) . Ina theannta sin, rinneadh anailís freisin ar éifeacht DNA-PKcs ar ghníomhachtú comharthaíochta SMAD. Léirigh na torthaí go raibh bac DNA-PKcs knockout ar ghníomhachtú SMAD2/SMAD3 i múnla luch UUO (Fíor Forlíontach 5f). Mhol na torthaí seo SMAD2/SMAD3 upregulated DNA PKcs abairt, agus DNA-PKcs ngníomh SMAD2/SMAD3 (Fíor Forlíontach. 5g), a bheidh ina lúb dearfach.

Seirbhís Tacaíochta Wecistanche-An t-onnmhaireoir cistanche is mó sa tSín:

Ríomhphost:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Teil:+86 15292862950

Siopa Le haghaidh Sonraí Breise:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Cliceáil ANSEO CHUN Sliocht CISTANCHE ORGÁNACHA NÁDÚRTHA A FHÁIL LE 25% ECHINACOSIDE AGUS 9% ACTEOSIDE DO DUINE