Freagraí Dichotomous ar Hypoxia Féatais Ainsealach Mar thoradh ar Fhéinitíopa Réamhchinnte Aosaithe Ⅰ
Nov 29, 2023
Go hachomair
Ag baint úsáide as próitéamaíocht ón mbun aníos agus an duán mar pharaidím, tuairiscímid peirspictíocht lánpháirtithe ar na freagraí ceallacha ar hypoxia féatais ainsealach, ag nochtadh meicníochtaí bunúsacha de theoiric ríomhchlárú féatais na ngalar fásta atá infheidhme go príomha maidir le gach orgán eile sa chorp. An fíochán sainiúil agus serum biomarker proficuirfidh sé chun cinn forbairt cineálacha cur chuige teiripeacha nua chun gníomhú in aghaidh an fheinitíopa ar aosú roimh am is cosúil go bhfuil baint aige le ríomhchlárú féataisgalair ainsealacha.
Buaicphointí
• Spreagann hypoxia féatais ainsealach athruithe forleathana i léiriú próitéine.
• Cuireann macasamhlú agus aistriúchán faoi chois srian le foirmiú nephrons nua.
• Cosáin iolrachafeinitíopa aosaithe a réamhshocrúcheana féin le linn forbartha.
• Sineirgíocht infldamáiste amatory, deisiú neamhéifeachtach, agus meitibileacht athraithe.
• Flúirse laghdaithe de phróitéiní frith-agingklotho agus sirtuin 6 i lucha agus i ndaoine.
Méadaíonn srian ar fhás ionútarach de bharr hypoxia an riosca docardashoithíoch, duánach, agus eilegalair ainsealacha i ndaoine fásta, rud a léiríonn fadhb mhór sláinte poiblí. Mar sin féin, níl mórán ar eolas faoi na meicníochtaí féatais a chuireann galair ar na daoine seo. Ag baint úsáide as samhail luiche a bhí bailíochtaithe roimhe seo de hypoxia féatais agus próitéamaíocht ón mbun aníos, tréithrímid freagairt na duáin féatais ar strus ainsealach hipocsamach. Léiríonn duáin féatais freagairt dhéchosach ar hypoxia ainsealach, a chuimsíonn ar thaobh amháin oiriúnuithe ceallacha a chothaíonn marthanacht (glycolysis, autophagy, agus DNA laghdaithe agus sintéis próitéin), ach ar na próisis eile a chothaíonn feinitíopa cosúil le seangacht (insíothlú cealla athlastacha). , damáiste DNA, agus iomadú laghdaithe). Go tábhachtach, laghdaíonn hypoxia ainsealach freisin léiriú na próitéiní antiaging klotho agus Sirt6, meicníocht a chaomhnaítear go héabhlóideach idir lucha agus daoine. Nuair a thógtar sinn le chéile, nochtaimid gur imeacht ríthábhachtach é aosú réamhchinnte le linn fhorbairt na féataishypoxia ainsealach, ag bunú bonn láidir do hipitéis Barker maidir le cláir féatais ar ghalair aosach. Tá baint ag an bhfeinitíopa seo le próifíl bithmharcála sainiúil i samplaí fíocháin agus serum, atá insaothraithe chun aosú luathaithe a bhrath agus a dhíriú argalair ainsealacha hypoxic daonna.
Deir teoiric Barker maidir le cláir féatais ar ghalair aosach (1, 2) go méadaíonn imeachtaí díobhálacha le linn forbartha an baol go dtarlóidh galair ainsealacha iolracha i ndaoine fásta, lena n-áirítearHipirtheannas,diabéites,galar bacúil scamhógach, nógalar duáin ainsealach(CKD). Inár sochaí atá ag dul in aois go seasta, cuireann na neamhoird seo ualach eacnamaíoch ollmhór i bhfeidhm atá ag dul i méid de réir a chéile mar gheall ar an méadú ar líon na n-othar atá ag fulaingt ó cheann amháin nó níos mó de na neamhoird seo. Ina measc seo,CKDagusgalar duánach céim deiridh(ESRD) ní hamháin gur fachtóirí riosca neamhspleácha iad maidir le galracht cardashoithíoch agus básmhaireacht chardashoithíoch ach gineann siad costais mhéadaitheacha freisin do theiripí athsholáthair duánacha, rud a fhágann gur mórfhadhb sláinte poiblí iad. I measc na straitéisí chun teacht ar an treocht seo, tá ról ríthábhachtach ag soiléiriú na meicníochtaí a cheanglaíonn teoiric Barker agus forbairt CKD. Míniú sochreidte ar an gcaillteanas de réir a chéile ar fheidhm duánach i sliocht meáchain breithe íseal hipitéisíonn bunú ciorcail fí a imrothlaigh idir dromchla scagacháin duánach laghdaithe, ualach oibre méadaithe ar na nephrons atá fágtha, agus damáiste breise sin arís.laghdaítear an cumas scagacháin(Brenner's hypothesis) (3). A common finding in intrauterine growth restriction (IUGR) babies is the reduced number of nephrons formed at the end of kidney development (4). Thus, a low nephron number at birth increases the risk for accelerated functional decline and irreversible renal tissue damage (5, 6). Among all possible intrauterine stress factors, chronic hypoxia due to placental insufficiency or pregnancy at high altitude (>2500 m os cionn leibhéal na farraige-a bhaineann le níos mó ná 2% de dhaonra an domhain (7, 8)) leis na fachtóirí is tábhachtaí agus go cliniciúil chun cur isteach ar an gclár forbartha an suth (9). Mar sin féin, níl tuiscint iomlán fós ar na meicníochtaí móilíneacha trína dtagann hypoxia chuig IUGR agus forbairt duánach suaite agus tá gá le himscrúdú breise. Sa staidéar seo, rinneamar measúnú ar an leibhéal proteome ar na hathruithe móilíneacha sa duán féatais nuair a nochtar an suth luiche forbraíochta do strus ainsealach hipocseach agus thacaigh muid le roinnt príomhthorthaí i samplaí séiream hipocsacha daonna. Cuirimid fianaise shubstaintiúil ar fáil do raon meicníochtaí idirghníomhaithe a ligeann, ar thaobh amháin, maireachtáil na gceall i gcoinníollacha díobhálacha, ach ar an taobh eile, cuireann siad chun cinn líon laghdaithe néaróin agus feinitíopa réamhaibí cosúil le seanchas. Léiríonn muid é sin a thuilleadhDNA géine-shonrachcuireann hypermethylation ach freisin hypomethylation DNA leis an bhfreagra déthomach seo ar hypoxia ainsealach. Mar sin, bunaíonn ár dtorthaí bonn láidir do hipitéis Barker, ag nochtadh raon bealaí a chinneannfeinitíopa ag dul in aoischeana féin le linn forbartha.
NÓSANNA IMEACHTA Turgnamhach
Dearadh Turgnamhach agus Réasúnaíocht Staitistiúil Ba é cuspóir an staidéir taiscéalaíoch seo ná athruithe ar phróitóim na nduán iomlán féatais a dhíorthaítear ó fhéatas IUGR a nochtadh chun an t-eolas ar na meicníochtaí féatais a thugann réamhshuíomh do ghalair ainsealacha beaga do dhaoine fásta agus iad ag iompar clainne a dhoimhniú. Bhí an staidéar bunaithe ar phróifíliú próitéamaíche ón mbun aníos ag baint úsáide as córas nana-LC i dteannta le mais-speictriméadar orbitrap. Chuige sin, úsáideadh sé duáin hipocsacha E18.5 agus sé duáin normocsacha E18.5 ó fhir agus rinneadh anailís orthu i ndúblach i dturgnamh rialaithe ar bhealach dalláilte. D'éirigh le gach macasamhlú, níorbh fhéidir aon toradh turgnamhach a mhacasamhlú. Rinneadh anailís ar na sonraí próitéamaíocht trí úsáid a bhaint as bogearraí MaxQuant 1.5.2.8 (lena n-áirítear inneall cuardaigh Andraiméide agus pacáiste anailíse staitistiúil Perseus) agus cnuasú nótaí feidhmiúla. Maidir le hiarmhairtí fadtéarmacha hypoxia féatais ainsealach ar fheidhm duánach roghnaíodh cúig sliocht fireann hypoxic agus cúig normoxic go randamach agus rinneadh anailís orthu ag 8 mí (tá cúig ainmhí ag teastáil chun laghdú 30% ar GFR in ainmhithe féatais hypoxic a bhrath, bunaithe ar éagsúlacht). de 15%, Alfa=0.05, Cumhacht=0.9). Críochnaíodh an turgnamh in vivo le measúnú ar fhiobróis duánach agus marcóirí séiream tar éis 15 mhí. Chun cuid de phríomhthorthaí na dturgnaimh ainmhithe a bhailíochtú, rinneadh anailís ar shamplaí serum daonna, a bailíodh i staidéir rialaithe roimhe seo ar oibrithe deonacha sláintiúla (10). Rinneadh gach turgnamh in vitro a mheas agus a dhaille le rialuithe cuí. Soláthraítear na sonraí tástála staitistiúla agus turgnamhacha i ngach finscéal fíor. Cuirtear na sonraí go léir i láthair agus cuirtear asluiteach orthu go léir.
Ainmhithe
Ceannaíodh lucha C57BL/6N ó shaotharlanna Janvier, an Fhrainc, agus coinníodh iad ag 23 ◦C agus 5{6 go dtí 60% de thaise i gcliabháin IVC le rochtain saor in aisce ar chow agus uisce agus timthriall 12 h lá/oíche. Rinneadh na turgnaimh ainmhithe go léir de réir dhlí na hEilvéise um leas na n-ainmhithe agus cheadaigh na húdaráis áitiúla iad (Canton of Bern BE96/11, BE105/14, agus BE105/17). Le haghaidh cúplála uainithe, rinneadh seiceáil ar phlocóidí faighne ar mhná i bpórú gach maidin, agus má bhí siad i láthair, socraíodh an pointe ama go dtí an lá iompair (E) 0.5. Sannadh dambaí gravid go randamach do ghrúpa rialaithe normocsa (N=11) nó nochtar iad do hipocsa tairiseach (N=11) ar feadh 7 lá. Le haghaidh ionduchtaithe hypoxia, aistríodh dambaí ag lá iompair E11.5 isteach i mbosca glove hypoxic (Táirgí Saotharlainne Coy), agus laghdaíodh an cion ocsaigine de réir a chéile go 10% laistigh de 3 go 4 h. Choinnigh fean leictreach laistigh den seomra aerchúrsaíocht leordhóthanach. Coinníodh an leibhéal CO2 íseal trí bharrachas CO2 a chealú i gcartáin líonta aol sóide (Sigma, 72073) a bhí ceangailte leis an gcóras aerchúrsaíochta. Glacadh an iomarca taise le gráinneach oráiste glóthach shilice (Sigma, 1.01969), a athraíodh gach lá. Eotanaíodh naoi damba ó gach grúpa ag E18.5, agus bailíodh féatas agus broghais, iad a mheá agus a ullmhú le haghaidh tuilleadh anailíse. Bailíodh fuil féatais ó stoc na bhféatas díchaipitlithe E18.5. Rinneadh duáin féatais a scaradh i PBS ag baint úsáide as steiréóscóp Leica M80. Maidir leis na hanailísí fadtéarmacha, baineadh dhá dhamba ó hypoxia cúpla uair an chloig roimh bhreith, agus baineadh úsáid as an sliocht fireann chun feidhm na duáin (ráta scagacháin glomerular - GFR) a mheas ag 8 mí mar a thuairiscítear (11) agus le haghaidh meastóireachta. fiobróis duánach agus leibhéil serum klotho agus sirtuin 6 ag 15 mhí.
Comhaireamh Glomerular
Le haghaidh staining imdhíonfhluaraiseachta iomláin na nduán E18.5, cuireadh an prótacal staining iDisco (12) (https://idisco.info/idisco-protocol/) i bhfeidhm le réamhchóireáil meatánóil ag baint úsáide as antashubstaint antainephrin (T&D AF3159). Úsáideadh am goir n=1 lá agus toirt tuaslagáin 1.6 ml do na céimeanna ábhartha. Suiteáladh na duáin i 8-sleamhnáin seomra gloine tobair (Thermo Fisher, 154534) agus rinneadh iad a íomháú láithreach ag baint úsáide as micreascóp digiteach IMIC (FEI, Cineál 4{001) le solas Polychrome V foinse, rialtóir ceamara Orca-R2 ó Hamamatsu (C10600), agus bogearraí Live Acquisition (FEI, leagan 2.6.0.14). Rinneadh anailís ar na céadta micreamhéadar Z-cruachta de dhuán dhaite lán-dhaite E18.5 leis na bogearraí próiseála íomhá foinse oscailte Fiji (ImageJ, leagan 2.0.0-rc69/1.52i, https:// imagej.net/ Fidsí). Sa bhreiseán TrackMate v3.8.0, socraíodh an brathadóir Downsample LoG go 80.0 picteilín don trastomhas blob measta le 16-tairseach picteilín agus fachtóir downsampling 2. Cuireadh líon na spotaí in aghaidh an fhráma leis chun líon na glomeruli a ríomh in aghaidh na duáin. Roghnaíodh achar 100 μm idir frámaí chun comhaireamh dúbailte glomeruli comhionann in íomhánna as a chéile a sheachaint, nuair a chuirtear meántrastomhas glomerular de 80 μm san áireamh.
Measúnú Trascutaneous ar Scagachán Glomerular Cinneadh an GFR in ainmhithe comhfhiosacha mar a thuairiscítear roimhe seo (11). Go hachomair, déantar imréiteach plasma FITC-sinistrin (Fresenius-Kabi, LI9830076) a thomhas trasna an chraiceann trí úsáid a bhaint as dé-óidí astaithe solais le huasmhéid astaithe do FITC ag 470 nm agus fóta-óid a bhrath an solas fluaraiseacha le híogaireacht uasta ag 525 nm. Déantar an laghdú ar dhéine fhluaraiseachta le himeacht ama a thiontú ina GFR ansin.
Rinneadh RT-qPCR Iomlán RNA a aonrú ag baint úsáide as imoibrí TRIzol (Invitrogen 15596026) de réir phrótacal an mhonaróra. Cinneadh tiúchan agus cáilíocht RNA le speictreafótaiméadar Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific), agus tras-scríobhadh 1000 ng isteach i cDNA ag baint úsáide as PrimeScript RT Reagent Kit (Takara, RR037A). caolaíodh cDNA go 2 ng/ul, agus rinneadh qPCR le taiscéalaí UPL lipéadaithe FAM (Roche) chomh maith le primers géine-shonracha comhfhreagracha agus meascán TaqMan Fast Universal PCR Master (Applied Biosystems, 4352042) ar Chóras PCR Fast Fíor-Ama 7500. (Bithchórais Fheidhmeacha). Rinneadh anailís sonraí le Microsoft Excel. Baineadh úsáid as an modh 2(−ΔCt) chun na leibhéil slonn choibhneasta do RT-qPCR a ríomh. Tá seichimh taiscéalaithe agus primer liostaithe i dTábla Forlíontach S1.
Ullmhúchán Samplach d'Anailís LC-MS/MS Rinneadh duáin féatais fhireann scoite (n=3 do gach grúpa) a aonchineálú i maolán samplach (7.5 M úiré, 1.5 M thiorea, 4% CHAPS, 0.{{ 18}}5% SDS, 100 mM dithiotreitol (DTT)) ag baint úsáide as bata ultrasonaic. Rinneadh tiúchan próitéine a chinneadh trí mheasúnacht Bradford (Bio Rad-Saotharlanna). Cuireadh prótacal díleá in-ghlóthach i bhfeidhm mar a thuairiscítear roimhe seo (13, 14). Go hachomair, lódaíodh 80 ug de gach sampla ar SDS-PAGE, rud a chuir ar ár gcumas an sampla a réamhraonadh chun a chastacht a laghdú. Tar éis é a shocrú le 50% meatánóil / 10% aigéad aicéiteach, nite agus íogrú na glóthacha le 0.02% Na2S2O3. Rinneadh glóthacha a dhaite ansin le 0.1% AgNO3 ar feadh 10 nóiméad, sruthlaithe agus forbraíodh iad le 3% Na2CO3/0.05% formaildéad. Gearradh gach banda próitéine ina cheithre shlisne ansin agus cuireadh i ndán é. Nuair a laghdaíodh iad le DTT agus ailciliú le hiodoacetamide (IAA), rinneadh na próitéiní a dhíleá go heinsímeach ag baint úsáide as Trypsin/Lys-C (grád MS; Promega Corporation). Tar éis díleá, bhí na peptides eluted, a thriomú, agus a stóráil ag −20 ◦C go dtí anailís LC-MS/MS.
Anailís LC-MS/MS
Mar a thuairiscítear roimhe seo (13), athdhéantar samplaí peiptíde i 5 ul 30% aigéad formach (FA) ina raibh 10 fmol gach ceann de cheithre pheptídí caighdeánacha sintéiseacha agus caolaíodh iad le 40 ul céim shoghluaiste A (97.9% H2O, 2% ACN, 0.1% FA). Peptídí sintéiseacha [Glu1-Fribrinopeptide B – EGVNDNEEGFFSAR; M28 – TTPAVLDSDGSYFLYSK; HK0 – VLETKSLYVR; HK1 – VLETK(ε-AC)SLYVR] i ngach sampla mar rialú cáilíochta inmheánach chun monatóireacht a dhéanamh ar chobhsaíocht chórais LC-MS. Rinneadh deich micrilítear den tuaslagán seo a instealladh ansin isteach i gcóras nana-LC Dionex Ultimate 3{{{{{{000}) i dteannta le mais-speictriméadar orbitrap QExactive atá feistithe le foinse ian nanaspray (Thermo Fisher Scientific). Mar chéim réamhchruinnithe, luchtaíodh peptides ar réamhcholún 2 cm × 75 μm C18 Pepmap100 (Thermo Fisher Scientific) ag ráta sreafa 10 ul/nóim ag baint úsáide as céim shoghluaiste A. Leachtú peptídí ón réamhcholún go 50 cm × 75 μm Pepmap100 Baineadh amach colún anailíseach (Thermo Fisher Scientific) agus scaradh ina dhiaidh sin ag ráta sreafa de 300 nl/nóim ag baint úsáide as grádán de 8% go 40% céim soghluaiste B (80% ACN, 19.9% H2O, 0.1% FA) thar 235 min. Baineadh amach mais-bhrath speictriméadrach, ag déanamh scananna MS sa raon ó m/z 400 go 1400 ag taifeach 70,000 (ag m/z =200). Baineadh amach scanadh MS/MS ar na 12 ian is flúirsí trí ilroinnt HCD ag 30% de fhuinneamh imbhuailte normalaithe agus rinneadh anailís orthu san orbitrap ag taifeach 17,500 (ag m/z =200). Rinneadh anailís ar na samplaí go léir i ndúblach. Taisceadh na sonraí próitéamaice mais-speictriméadrachta don ProteomeXchange Consortium (http:// proteomecentral.proteomexchange.org) trí stór comhpháirtíochta PRIDE (15) leis an aitheantóir tacair sonraí PXD018999 agus 10.6019/PXD018999.
Aitheantas Próitéin agus Saor ó Lipéad
Cainníochtú (LFQ) Aithint próitéiní, cainníochtú gan lipéad (LFQ) chomh maith le hanailísí staidrimh ag baint úsáide as bogearraí MaxQuant 1.5.2.8 lena n-áirítear inneall cuardaigh Andromeda agus pacáiste anailíse staidrimh Perseus (16, 17), sreabhadh oibre a úsáidtear go coitianta. le haghaidh próiseála agus measúnú staitistiúil ar shonraí próitéamaíocht gunna gráin. Aithníodh próitéiní trí úsáid a bhaint as bunachar sonraí UniProt le haghaidh próitéiní matán (leagan 170428 le 16,854 iontráil, teoranta d'iontrálacha athbhreithnithe amháin), lamháltas mais peiptíde 25 ppm, lamháltas meaitseála MS/MS de 2{{21 }} ppm, agus uasmhéid de dhá scoilteanna caillte le trypsin mar protease. Áiríodh leis na critéir chuardaigh freisin carbamidomethylation cistéin mar mhodhnú seasta, ocsaídiú meitiainín chomh maith le haicéitiliú próitéin N-críochfort mar mhodhnuithe athraitheacha, agus íosmhéid de dhá shainaithint peiptíde in aghaidh an phróitéin, ceann amháin díobh uathúil ar a laghad. Ina theannta sin, rinneadh meaitseáil idir ritheanna ag baint úsáide as fuinneog ama meaitseála 5 nóim agus fuinneog ama ailínithe 15-nóiméad. I gcás peptides agus próitéiní araon, cuireadh ráta fionnachtana bréagach (FDR) de níos lú ná 0.01 i bhfeidhm. Chun anailís staitistiúil a dhéanamh, rinneadh comparáidí frithpháirteacha idir samplaí duánach normocsacha agus hipocsaíocha chun grúpaí próitéine a chinneadh, a bhí go mór suas nó síos-rialaithe ar hypoxia. Chuige sin, trí úsáid a bhaint as pacáiste anailíse staidrimh Perseus, ríomhadh difríochtaí i luachanna LFQ. Rinneadh athruithe ar luachanna flúirse próitéine idir samplaí duán normocsacha agus hipocsacha a chinneadh le t-tástáil dhá thaobh le p < 0.05 agus íosmhéid de dhifríocht raidhse dhá thaobh. Rinneadh gach próitéin a chomhlíonann na critéir seo a mheas sa staidéar seo. Ina theannta sin, chun béim a chur ar na héifeachtaí rialála is láidre ar hypoxia, próitéiní a rialaítear go suntasach le FDR domhanda<0.05 as determined by a permutation-based method were analyzed.
Anótáil Fheidhmeach agus Cnuasú
Baineadh úsáid as an mbunachar sonraí acmhainní ontology géine (18-20) agus an t-ardán DAVID (21) (https://david.ncifcrf.gov). Gineadh líonraí próitéine ag baint úsáide as an mbunachar sonraí STRING (22). Mapáladh luachanna cainte difreálacha idir duáin an ghrúpa rialaithe normocsacha agus hipoxic E18.5 le Heatmapper (23) (http://www.heatmapper.ca).
Imdhíon-cheimic
Athhiodráitíodh rannóga fíocháin PFA-leabaithe pairifín, agus cuireadh bac ar shárocsaídeas ingenous trí na sleamhnáin a chothú i dtuaslagán 1.5% H2O2 (0.02 M aigéad citreach, 0.{ {40}}6 M Na2HPO4) ag RT ar feadh 15 nóiméad sa dorchadas. Rinneadh aisghabháil antaigin trí fhiuchadh i Tris-EDTA (pH 9) nó maolán d'aigéad citreach ar feadh 20 nóiméad agus ansin fuarú mall go RT. Tar éis blocáil i 2% BSA i PBS ag RT ar feadh 1 h, goradh na hailt le antasubstaintí príomhúla i dtuaslagán blocála o/n ag 4 ◦C (MPO, ab208670; CAV1, ab32577; an dá Abam). Tar éis trí chéim níocháin i PBS, goraíodh na hailt le hantasubstaint thánaisteach frith-choinín comhchuingeach HRP (K4003, Dako EnVision+ System ó Agilent) ar feadh 1 h ag RT. Tar éis trí chéim níocháin i PBS, forbraíodh an comhartha le DAB (Agilent, K3468). Rinneadh na codanna a fhrithdhaite, a dhíhiodráitiú agus a fheistiú le meán Eukitt (Sigma, 03989). Chun 8-OHdG (MOG-100P, JaICA) a bhrath, baineadh úsáid as trealamh braite imdhíonta Vector MOM (BMK-2202) de réir an mhonaróra. Fuarthas íomhánna réimse geala ar mhicreascóp Nikon E600 (cuspóir Plan Fluor ELWD 20 ×/0.45) le rialtóir ceamara DS-UE Digital Sight agus ceamara DS-Ri1 (an bheirt Nikon) ag baint úsáide as bogearraí Nikon NIS Elements 4.0.
einsímeach
Cinneadh cainníochtú leibhéil Lactate Lactate i duáin E18.5 tar éis díphróitéiniú an tsampla le colúin casadh ag baint úsáide as an trealamh einsímeach MAK064- 1KT (Sigma), de réir an mhonaróra.
Staidéar Daonna
Cheadaigh Coiste Eitice Institiúid Teicneolaíochta Chónaidhme na hEilvéise (EK 2011-N-51) an staidéar ar ábhair dhaonna agus rinneadh é de réir Dhearbhú Heilsincí. Go hachomair, fuarthas toiliú feasach ó naonúr ísealchríche sláintiúil gan tobac (ochtar fear, agus baineannach amháin). Rinneadh measúnú seicheamhach ar na hoibrithe deonacha seo le haghaidh paraiméadair iolracha fiseolaíocha roimh, le linn, agus tar éis 4-seachtaine gan bhriseadh ag airde ard, mar a tuairiscíodh roimhe seo (10).
Cultúr na Cille
Rinneadh cealla tubular proximal príomhúla (pPTCanna) a leithlisiú ó {{0}} go dtí 4- duán fireann seachtaine d’aois C57BL/6N mar a cuireadh síos orthu roimhe seo (24). Go hachomair, fuarthas blúirí feadánacha cóngaracha trí fhíochán cortical duáin a dhíleá le collagenase agus scagachán ina dhiaidh sin trí membrane méid pore 250 μm agus 80 μm. Saothraíodh PTCanna i DMEM/F12 (Gibco, 21041-025) arna fhorlíonadh le 15 mM HEPES, 0.55 mM NaPyruvate, 1% NEAA, agus forlíontaí meán fáis cille epithelial duánach (REGM) (Lonza, CC-4127) . Tar éis an chomhlí, scoilteadh pPTCanna uair amháin ag baint úsáide as réiteach Accutase (Sigma, A6964) agus athphlátáilte. Le haghaidh hypoxia, rinneadh cultúr cille ag ocsaigin 1% ar feadh 48h; saothraíodh rialuithe normocsacha ag 19% ocsaigine.
ELISA
Cinneadh leibhéil serum Klotho nó Sirt6 trí úsáid a bhaint as na feisteáin seo a leanas le haghaidh samplaí luiche (CSB-E14362m, teicneolaíocht Cusabio agus OKCD02892, Bitheolaíocht Córais Aviva) agus samplaí daonna (CSB E17018h agus CSB-E13235h; teicneolaíocht Cusabio araon) tar éis na bprótacail a cuireadh ar fáil. Bailíodh fuil féatais luch ó stoc na bhféatas díchaipitlithe E18.5. Rinneadh sampláil ar fhuil luch ó ainmhithe fásta ón vena saphena. Fuarthas samplaí serum daonna ó staidéar roimhe seo (10).
Bisulfite PCR
Baineadh DNA ó E18.5 hypoxia nó ainmhithe atá cóireáilte le normoxia le trealamh fola agus fíocháin Qiagen agus tiontaíodh bisulfite ag baint úsáide as Kit Bisulfite EpiTect ó Qiagen de réir threoracha an mhonaróra. Baineadh úsáid as fiche nanogram de DNA comhshóite mar theimpléad in imoibriú PCR le AmpliTaq Gold (Invitrogen). Dearadh na primers seo a leanas le MethPrimer 2.0: Klotho, blúire 248 bp (−234/+14 de TSS), Kl_BS_F (TAG TTT TAG GAA GGT AAA GGG AGT G) agus Kl_BS_R (AAC AAT AAT TAT CCA AAA CAA AC) (25); Mki67, blúire 497 bp (~1 kb in aghaidh an tsrutha ó TSS), Mki67_BS_F (TTG GAA GAA TAT TGA TTT AGG AA), agus Mki67_BS{{20} }R (ACC TAT AAA CTC CCT CTC CAA AAA T). Lamháladh táirgí PCR isteach i veicteoir pCR{4-TOPO-Vector ag baint úsáide as Kit Clónála TOPO TA le haghaidh seicheamhú (Invitrogen) agus claochlú go baictéir DH10 iad. Cuireadh Cluain Eois le haghaidh seicheamhú (Microsyth Seqlab GmbH). Rinneadh cigireacht, ailíniú, léirshamhlú, agus staitisticí le huirlis chainníochtaithe QUMA le haghaidh anailíse methylation (26).
Staitisticí
Rinneadh anailís staitistiúil agus rinneadh graif le GraphPad Prism leagan 8 ( https://www.graphpad.com ). Rinneadh tástáil ar dhá ghrúpa le haghaidh tábhachta trí thástálacha t dhá eireaball gan phéire le ceartúchán Welch nó gan é (bhí ceartú Welch le haghaidh sonraí a dháiltear go neamhnormálta, bhí tábhacht staitistiúil ag baint le tástáil F ar athraithis, p < 0.05). Rinneadh tástáil ar ghrúpaí iolracha ag baint úsáide as ANOVA aontreo RM le ceartúchán Geisser-Greenhouse agus triail chomparáidí iolracha Dunnett. p luachanna<0.05 were assumed significant. Means with standard deviation (SD) are shown.
Sonraí Foinse
Is féidir na sonraí amh maidir le gach turgnamh nach dtagann as an anailís mais-speictriméadrachta a fháil sa scarbhileog Comhad Sonraí Foinse S1 sa tacar sonraí Forlíontacha. Áirítear leis seo sonraí is bun le Fíor. 1A agus D-H, Fíor. 3E agus F, Fíor. 5 B, Fíor 7D-I, Fíor. 8, agus Fig.
TORTHAÍ
ainsealach
Hypoxia féatais Torthaí i Suthanna Fás-Srianta agus Feidhm Duánach Laghdaithe i Sliocht Aosach Chun dambaí uainithe cúpláilte a nochtadh do hypoxia tairiseach (ocsaigin 10%) ar feadh 7 lá (Fíor 1A), baineadh úsáid as seomra hipocsamach. Cosúil lenár gcuid oibre roimhe seo (27), dambaí in oiriúint go tapa leis an timpeallacht hypoxic, agus ag breithe méid bruscair agus mais placental a bhí cosúil le gothaí rialaithe normoxic (Fíor forlíontach S1, A-C). Mar sin féin, bhí meáchan coirp laghdaithe ag féatas E18.5 hypoxic i gcomparáid le rialuithe normocacha, ag comhlíonadh critéir IUGR (28) (Fíor 1Band Forlíontach Fíor. S1D), agus líon laghdaithe nephron 40% (Fíor 1, C agus D). Ní raibh an laghdú seo mar gheall ar dhíghiniúint nephron (neacróis nó apoptosis) le linn forbairt ionútarach faoi choinníollacha hypoxic mar a tuairiscíodh roimhe seo (27). Ina theannta sin, in ainneoin tréimhse fáis suntasach ghabhála suas 3 seachtaine tar éis breithe, a thuairiscigh muid roimhe seo (27), léirigh sliocht hypoxic fásta feidhm duánach laghdaithe go mór ag 8 mí (Fíor 1E) agus léiriú méadaithe marcóirí fibrotic ag 15 mí (Fig. 1, F–H), ag deimhniú ar an gcaoi sin bailíocht ár gcur chuige mar mhúnla láidir IUGR agus mar léiriú ar theoiric Barker maidir le galair aosach a chlárú faoi fhéatais.
Seirbhís Tacaíochta Wecistanche-An t-onnmhaireoir cistanche is mó sa tSín:
Ríomhphost:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Teil:+86 15292862950
Siopa Le haghaidh Sonraí Breise:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
