Clónáil, Aithint Fheidhmeach agus Anailís Slonn Synthase Chalcone Ó Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Torthaí agus anailís

3.1 Clón géine CtCHS

Rinneadh ceithre sheicheamh a bhfuil nótaí orthu mar "chalcone synthase" a scagadh amach ag baint úsáide as sonraí tras-sgrìobhaidh bláthanna Cistanches tubulosa. Trí chomparáid Blast NCBI, fuarthas amach nach raibh ach seicheamh amháin fad iomlán na géine CHS agus go raibh FPKM níos mó ná 10. Dearadh primers sonracha bunaithe ar an seicheamh seo, agus fuarthas blúire de thart ar 1200 bp trí aimpliú PCR ag baint úsáide as. Cistanches tubulosa bláth cDNA mar theimpléad (Fíor 1). Aisghabhadh glóthach an táirge PCR agus ceanglaíodh é leis an veicteoir pCE2TA/Blunt-Zero. Bhí na torthaí seicheamhaithe comhsheasmhach leis an anailís tras-scríbhinne. Ainmníodh an ghéin CtCHS. Is é fad an tseichimh ná 1173 bp agus ionchódaíonn sé 390 aimínaigéid.

Seirbhís Tacaíochta Wecistanche-An t-onnmhaireoir cistanche is mó sa tSín:

Ríomhphost:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Teil:+86 15292862950

Siopa Le Tuilleadh Sonraí Sonraíochtaí:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Anailís bhithfhaisnéisíochta ar CtCHS

3.2.1 CtCHS airíonna fisiceacha agus ceimiceacha agus anailís ar an bhfearann ​​​​trasmembrane

Baineadh úsáid as na bogearraí ar líne ProtParam chun anailís a dhéanamh ar airíonna fisiceacha agus ceimiceacha na próitéine atá ionchódaithe ag géine CtCHS. Ionchódaíonn CtCHS 390 aimínaigéid, is é an fhoirmle mhóilíneach C1908H3041N511O562S22, is é an mais mhóilíneach choibhneasta 42 836.54, is é an pointe isoelectric teoiriciúil 5.85, agus tá sé éagobhsaí. Is é an comhéifeacht II ná 43.24, ar próitéin éagobhsaí é, agus is é −0.052 an meán hidreafhile iomlán (GRAVY), ar próitéin hidrophilic é. Baineadh úsáid bhreise as an uirlis ar líne Prot Scale chun anailís a dhéanamh ar hidreafaileacht/hidreafóbacht próitéine. Léirigh torthaí na hanailíse gurb é 2.422 (342) an luach uasta a bhí ag hidreafaileacht/hidreafóbacht próitéin CtCHS agus ba é -2.489 (119) an t-íosluach. Tá níos mó iarmhair aimínaigéad hidrofilic ag an slabhra peptide aimínaigéad atá ionchódaithe ag géine CtCHS ná iarmhair aimínaigéad hidreafóbach, agus mar sin is próitéin hidrofilic é. Baineadh úsáid as na bogearraí ar líne TMHMM chun struchtúr trasmembrane na próitéine a thuar. Níl aon fhearann ​​trasmembrane ag próitéin CtCHS.

Fíor 1 Aimpliú PCR ar ghéine CtCHS

3.2.2 Struchtúr tánaisteach agus struchtúr treasach próitéin CtCHS a thuar

Baineadh úsáid as an uirlis ar líne SOPMA chun struchtúr tánaisteach próitéine a thuar. Taispeántar na torthaí i bhFíor 2-A. Is ionann 44.87% -helices, 31.03% cornaí randamach, 15.64% slabhraí leathnaithe agus 8.46% -sheets mar struchtúr tánaisteach próitéin CtCHS. struchtúr leibhéal. Baineadh úsáid as na bogearraí anailíse ar líne SWISS-MODEL chun struchtúr treasach an phróitéin a thuar, agus úsáideadh struchtúr criostail ríse CHS1 mar theimpléad chun struchtúr tríthoiseach próitéin CtCHS a thuar. Taispeántar na torthaí i bhFíor 2-B. Is é an comhsheasmhacht idir Cistanche tubulosa CtCHS agus rís CHS1 ná 83.55%.

3.2.3 Comparáid seicheamh agus anailís agus cur i bhfeidhm crann fíogéiniteach

Déanann bogearraí DNAMAN comparáid homaleolaíochta idir CtCHS agus seichimh aimínaigéad CHS de speicis eile. Taispeántar na torthaí i bhFíor 3-C. Tá seicheamh aimínaigéad CtCHS comhsheasmhach le Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) agus Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) agus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Tá na seichimh aimínaigéad CHS an-chosúil, agus is iad na cosúlachtaí ná 90.93%, 90.68%, 90.18%, 89.42%, 89.42%, agus 81.61%.

Sliocht CISTANCHE ORGÁNACHA NÁDÚRTHA LE 30% ECHINACOSIDE AGUS 12% ACTEOSIDE

Ina theannta sin, léirigh ailíniú seicheamh iolrach freisin go ndearna CtCHS iarmhair chatalaíoch Cys164, His303, agus Asn336 a chaomhnú. Chun seasamh éabhlóideach Cistanche tubulosa CtCHS i dteaghlach CHS planda a thuiscint tuilleadh, baineadh úsáid as bogearraí MEGA-X chun crann fíolaigineach a dhéanamh idir próitéiní CtCHS agus CHS de phlandaí eile. Léirítear na torthaí i bhFíor 3-DE lewisii AHJ80976.1) Tá dlúthbhaint ag ElCHS.

3.3 CtCHS slonn prócarótach agus íonú

Claochlaíodh an plasmid pET-28a-CtCHS go brú slonn E. coli BL21 (DE3), agus spreag léiriú próitéine ag IPTG ag teocht íseal. Rinneadh an próitéin a íonú trí úsáid a bhaint as colún crómatagrafaíochta cleamhnas ian nicil, agus fuarthas an próitéin íonaithe faoi 10% SDSPAGE. Léirítear na torthaí i bhFíor 3. Bhí an banna próitéin CtCHS le feiceáil gar do 40,000, atá comhsheasmhach le mais mhóilíneach choibhneasta próitéin CtCHS de 42,800.

3.4 Anailís ar ghníomhaíocht einsímí CtCHS

Chun feidhm CtCHS a shainaithint, goradh an phróitéin CtCHS íonaithe le malonyl-CoA, 4-coumaroyl-CoA agus aimsíodh na táirgí trí úsáid a bhaint as HPLC agus MS. Faoi choinníollacha nádúrtha, tá naringenin-chalcone éagobhsaí i dtuaslagán agus déantar é a chiorclú go naringenin go héasca. Dá bhrí sin, roghnaíodh naringenin-chalcone agus naringenin mar rialuithe caighdeánacha.

Taispeántar torthaí tástála HPLC i bhFíor 4-A agus B. Tá am coinneála an táirge imoibrithe einsíme cosúil leis an gcaighdeán naringenin. Tá an ionsú uasta ag an dá cheann ag 289 nm sa speictream ionsú UV, atá difriúil ó am coinneála naringenin-chalcone. Bhí an t-am agus an speictream ionsú UV difriúil, ach mar rialú diúltach, ní raibh naringenin, cailcón agus naringenin sa táirge tar éis próitéin CtCHS díghníomhaithe ardteochta a gor leis an tsubstráit. Le tuilleadh braite trí mais-speictriméadracht, léirigh an mais-speictream den chéad leibhéal (Fíor 4-C, D) go bhfuil [MH]-buaic m/z271.060 97 ag an táirge imoibriúcháin einsíme, cé go bhfuil [MH] ag naringenin. ]-buaic m/z 271.060 91.

Agus comparáid á dhéanamh idir an speictream MS2 (Fíor 5-E, F), tá buaicphointí sainiúla ag m/z 107, 151, agus 177 ag táirge imoibriúcháin einsím CtCHS agus naringenin araon, atá ag teacht leis an tuarascáil litríochta [19], rud a thugann le fios go bhfuil coimpléasc chailcín ag CtCHS. Le gníomhaíocht einsímeach, féadann sí imoibriú malonyl-CoA agus 4-coumaroyl-CoA i naringenin-chalcone a chatalú.

3.5 Anailís logánú focheallach

Chun staidéar a dhéanamh ar ról próitéin CtCHS i gcealla, rinneadh an plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a thógáil agus a chlaochlú ina phrótaplastaí Arabidopsis thaliana chun a logánú focheallach a urramú. Léirítear na torthaí i bhFíor 5. Mar rialtán, dáileadh an próitéin pCAMBIA1300-35S-GFP sa núicléas agus sa chiteaplasma, agus dáileadh an próitéin comhleá pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS go príomha i an cíteaplasma, rud a thugann le fios go bhféadfadh an próitéin CtCHS feidhmiú i gcíteaplasma cealla plandaí. Feidhm.

3.6 Anailís ar phatrún slonn CtCHS

Baineadh úsáid as qRT-PCR chun léiriú coibhneasta CtCHS i bláthanna Cistanche deserticola a bhrath le trí dhath: bán, corcra agus dearg. Léirítear na torthaí i bhFíor 6. Bhí léiriú CtCHS i bláthanna corcra agus dearga i bhfad níos airde ná mar a bhí i bláthanna bána. chainníocht. I gcomparáid le bláthanna bána, tá leibhéal léirithe CtCHS i bláthanna corcra 8.44 uair níos airde, agus tá leibhéal léirithe CtCHS i bláthanna dearga 3.21 uair níos airde. Léiríonn na torthaí seo go bhféadfadh baint a bheith ag athruithe i leibhéil slonn CtCHS leis an difríocht i ndath bláthanna Cistanche deserticola. Dá airde an leibhéal cainte, is amhlaidh is dorcha an dath bláthanna. , dá ísle an leibhéal cainte, is éadroime an dath bláthanna.

****P＜0.000 1Fíor. 6 Leibhéal cainte coibhneasta CtCHS i bláthanna le dathanna éagsúla

4 Plé

Tá CHS aeinsím eochair sa chonair biosintéiseach flavonoidagus tá baint aige le úe rialáil dath bláthannai go leor plandaí. Mar shampla, dath bláthDianthus chinensisL.[20] agus Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] go bhfuil tionchar ag CHS orthu go léir. smacht.Cistánacha tubulosatá trí dathanna bláthanna den chuid is mó: bán, dearg, agus corcra, ach níor tuairiscíodh a mheicníocht rialaithe dath bláthanna fós. Sa staidéar seo, rinneadh géine CtCHS a chlónáil ag baint úsáide as RT-PCR trídanailís sonraí transcriptome na bláthanna Cistanches tubulosa, agus a

Anailís bithfhaisnéisíochtaagus léirigh na torthaí go bhfuil cosúlacht ard agus dlúthchaidreamh géiniteach ag CtCHS le seicheamh aimínaigéad ElCHS de Physalis nigra (AHJ80976.1). Is synthase polyketide cineál III (PKSIII) é CHS, agus fuair staidéir go bhfuil triad catalaíoch Cys-His-Asn caomhnaithe ag CHS [23]. Sa staidéar seo, léirigh anailís ailínithe seicheamh aimínaigéad go bhfuil CtCHS tar éis iarmhair chatalaíoch Cys164, His303, agus Asn336 a chaomhnú, rud a thugann le fios go bhféadfadh feidhm tipiciúil chalcóin synthase a bheith ag CtCHS.

ábalta. Rinneadh anailís ar ghníomhaíocht einsímí trí úsáid a bhaint as léiriú procarotic de phróitéin CtCHS in Escherichia coli agus braitheadh ​​HPLC agus MS é. Fuarthas amach gur féidir le próitéin CtCHS 4-coumaroyl-CoA agus malonyl-CoA a chatalú chun naringenin-chalcone a tháirgeadh.

Tá baint ag CHS le sintéis flavonoids i go leor plandaí, ach tá a suíomh subcellular difriúil i speicis éagsúla. Mar shampla, Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Tá EaCHS[26] ar fad lonnaithe sa chiteaplasma, agus tá Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], tá eggplant Solanum melongena L. SmCHS [28] suite sa cíteaplasma agus sa núicléas, agus i bhfíonchaor Vitis vinifera L. VvCHS suite sa cíteaplasma, núicléas agus balla cille [29]. Sa staidéar seo, baineadh úsáid as pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plasmid chun próitéailí Arabidopsis thaliana a chlaochlú agus tugadh faoi deara go raibh próitéin CtCHS logánaithe go príomha sa cíteaplasma, agus go bhféadfadh sé táirgeadh naringenin-chalcone sa chiteaplasma a chatalú carnadh flavonoids a chur chun cinn.

Craobhacha an chonair feinilpropanoid ó 4-coumaroyl-CoA isteach sa chonair sintéise flavonoid agus cosán bithshintéise lignan. Catalaíonn CHS 4-coumaroyl-CoA agus malonyl-CoA chun naringéinin agus cailcón a ghiniúint chun flavonoids a thionscnamh. Is é an cosán bithsintéiseach de chomhdhúile cosúil le cumaisc an chéad einsím eochair sa chonair seo [30]. Dá bhrí sin, tá CHS ard-léirithe tairbheach do phlandaí leibhéil níos airde flavonoids a charnadh agus bláthanna níos dorcha a tháirgeadh. Mar shampla, tá leibhéal slonn CHS i gcineálacha bláthanna corcra de Hosta plantaginea (Lam.) Aschers níos airde ná sin de chineálacha bán-bláth. Hosta HpCHS a chlaochlú go tobac a fháil I gcomparáid le fiáin-cineál tobac, tá plandaí overexpression peitil níos dorcha agus ábhar iomlán anthocyanin níos airde [31].

Sa staidéar seo, tá baint ag leibhéal léirithe na géine CtCHS le dath bláthanna Cistanches tubulosa. Tá sé in iúl go mór i bláthanna corcra dorcha agus bláthanna dearga, agus tá sé íseal i bláthanna bána éadroma. D’fhéadfadh difríocht léirithe CtCHS a bheith mar gheall ar an difríocht i bláthanna Cistanches tubulosa. Ceann de na cúiseanna a bhfuil oireann agus dathanna éagsúla ann. Mar achoimre, rinne an staidéar seo clónáil ar ghéine CtCHS ó Cistanche deserticola flowers agus rinne sé anailís bhithfhaisnéisíochta air. Fuarthas an próitéin athchuingreach CtCHS trí léiriú eisghineach in Escherichia coli. Chruthaigh an anailís ar ghníomhaíocht einsíme gur féidir leis an bpróitéin CtCHS 4-coumaroyl coenzyme a chatalú. Gineann A agus malonyl-coenzyme A naringenin-chalcone. Fuarthas amach go bhfuil géine CtCHS in iúl go mór i bláthanna corcra agus dearg agus íseal i bláthanna bána. Léiríonn na torthaí seo go bhféadfadh géine CtCHS táirgeadh dathanna bláthanna éagsúla a rialáil i Cistanche deserticola, rud atá tairbheach le tuilleadh taighde a dhéanamh ar mheicníocht rialála dath bláthanna Cistanche tubulosa agus soláthraíonn sé tagairt do thaighde ina dhiaidh sin ar ról CtCHS i rialáil dath bláth i Cistanche deserticola.