Clónáil, Aithint Fheidhmeach Agus Anailís Léirithe ar Chalcone Synthase Ó Cistanche Tubulosa

Coimriú: Cuspóir Staidéar a dhéanamh ar fheidhm an tsintéise cailcóin ó Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) agus patrún léirithe na géine CtCHS i bláthanna bána, dearga agus corcra.

Modhanna Clónáladh an ghéin CtCHS trí RT-PCR agus rinneadh anailís bhithfhaisnéisíochta. Aistríodh an plasmid pET-28a-CtCHS isteach san Escherichia coli chun léiriú próitéine a spreagadh trí IPTG. Goradh próitéin athchuingreach CtCHS leis na foshraitheanna p-coumaroyl CoA agus malonyl CoA, agus b'é HPLC agus MS a bhraith na táirgí. Aistríodh an pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plasmid isteach sa phrótaplast de Arabidopsis thaliana chun logánú focheallach na próitéine CtCHS a bhreathnú. An patrún slonn CtCHSgene i bláthanna naC. tubulosale trí dhath braitheadh ​​​​qRT-PCR.

Torthaí Clónáladh géine CtCHS. Ba é fad an fhráma léitheoireachta oscailte (ORF) ná 1173 bp, ag ionchódú 390 aimínaigéid, agus ba é meáchan móilíneach na próitéine ná 42 8000. Chuimsigh CtCHS na hiarmhair chatalaíoch Cys164, His303, Asn336, a caomhnaíodh i synthase chalcone. Cuireadh an CtCHSprotein in iúl in E. coli agus íonaithe chun an próitéin athchuingreach a fháil. D’fhéadfadh próitéin CtCHS p-coumaroyl CoAand malonyl CoA a chatalú chun cailcón naringenin a tháirgeadh. Logánaíodh próitéin CtCHS go príomha sa chiteaplasma. Tá géine CtCHS curtha in iúl go soiléir i mbláthanna corcra agus dearga, agus bhí na leibhéil slonn coibhneasta 8.44 agus 3.21 uair níos airde ná mar a bhí i bláthanna bána, faoi seach.

Conclúid Clónáladh géine CtCHS ó bhláth naC. tubulosaagus cuireadh próitéin in iúl. Tá feidhm synthase chalcone ag CtCHSprotein, agus tá léiriú géine CtCHS níos airde i bláthanna níos dorcha, rud a léiríonn go bhféadfadh CtCHSgene dath bláthanna C. tubulosa a rialáil, rud a leagann bunús le haghaidh tuilleadh taighde ar anmeicníocht rialaithe dath bláthanna C. tubulosa.

Eochairfhocail:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; synthase chailcín; anailís ar ghníomhaíocht einsím; logánú focheallach; anailís léiriú

Cliceáil anseo chun Sliocht CISTANCHE ORGÁNACHA NÁDÚRTHA A FHÁIL LE 30% ECHINACOSIDE AGUS 12% ACTEOSIDE

Seirbhís Tacaíochta Wecistanche-An t-onnmhaireoir cistanche is mó sa tSín:

Ríomhphost:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Teil:+86 15292862950

Siopa Le Tuilleadh Sonraí Sonraíochtaí:

https://www.xjcistanche.com% 2fcistanche-siopa

An biosintéiseachcosán flavonoidsTosaíonn leis an cosán feinilpropanoid.Feiniolalainínthiontú ar dtús go aigéad cinnamic faoi nagníomh amóinialyase feiniolalainín(PAL), agus tá 4-hiodrocsailiú le haigéad cinnamic ag aigéad cinnamic. Déanann an einsím (aigéad cinnamic-4-hydroxylase, C4H) agus 4-coumaratecoenzyme A ligase (4-coumaratecoenzyme A ligase, 4CL) an t-imoibriú a chatalú chun 4-coumaroyl-CoA a ghiniúint[11 ]. Déantar móilín amháin de 4-coumaroyl-CoA agus trí mhóilín de malonyl-CoA a chatalú le chalcone synthase (CHS) chun cailcón naringenin a ghiniúint, a bhfuil comhdhúile flavonoid ann. gineann dihydroflavonol 4-reductase, etc. éagsúlacht flavonoids cosúil le isoflavóin, flavonols, anthocyanins, etc. [12]. Mar phríomh-einsím sa chonair biosintéiseach flavonoid, rialaíonn CHS ábhar flavonoids i bplandaí agus tá ról tábhachtach aige freisin maidir le dath bláthanna plandaí a rialáil [13]. Mar shampla, is féidir le tosta géine iar-thscríbhinne Gentiana scabra Bunge CHS bac a chur ar biosintéis anthocyanins agus ina chúis le whitening sonrach lobes corolla [14]. CHS géine tosta Actinidia erianthaBenth. Laghdaíonn CHS an t-ábhar anthocyanin i peitil agus déanann na peitil dearg. Éiríonn dath na peitil níos éadroime[15]. Mar sin, sa staidéar seo, rinneadh géine CtCHS a chlónáil ó bhláthanna Cistanche tubulosa, agus rinneadh anailís bhithfhaisnéisíochta, léiriú agus íonú procaryotic, anailís ar ghníomhaíocht einsímeach, anailís logánaithe subcellular agus anailís slonn i dtrí dhath bláthanna air chun iniúchadh a dhéanamh ar fheidhm CtCHS. Baineadh úsáid as próitéin agus patrún slonn géine CtCHS chun réamhscrúdú a dhéanamh ar an ngaol idir dath bláthanna CtCHS agus Cistanche tubulosa, a leag an bonn le haghaidh staidéar a dhéanamh ar mheicníocht rialálaDath bláth Cistanche tubulosa.

1 Ábhair agus uirlisí

1.1 Ábhair

Bailíodh bláthanna Cistanche tubulosa ó Yutian County, Hotan Prefecture, Xinjiang i mí na Bealtaine 2018. Leanadh an prionsabal randamach le linn samplála, agus roghnaíodh bláthanna Cistanche tubulosa le stádas fiseolaíoch maith agus airde comhsheasmhach plandaí. Ghlac an tOllamh Tu Pengfei ó Scoil Chógaisíochta Ollscoil Peking trí shraith de Cistanche tubulosa le trí dhath bláthanna de bhán, dearg agus corcra agus d’aithin iad mar Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Bhí siad reoite go tapa i nítrigine leachtach agus ansin a iompar go Beijing i stóráil oighear tirim. ceannaíodh cealla atá inniúil go ceimiceach E. coli DH5 ó Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., agus ceannaíodh cealla atá inniúil go ceimiceach E. coli BL21 (DE3) ó Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET{4}}a, pCAMBIA1300-35S-GFP Ceannaíodh an veicteoir ó Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Ceannaíodh Malonyl-CoA ó Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -cheannaíodh chalcone ó Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., agus ceannaíodh naringenin ó Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Ionstraimí

Speictreafótaiméadar Nanodrop 2000C (Cuideachta Thermo Fisher, SAM); ionstraim PCR grádán (Cuideachta Eppendorf, an Ghearmáin); Ionstraim PCR cainníochtúil fluaraiseachta CFX 96, íomháóir glóthach UVP, ionstraim leictreafóiréis glóthach, ionstraim leictreafóiréis próitéin (Cuideachta BioRad, SAM); EnSpire

Léitheoir micreaphláta (PerkinElmer Company, SAM); gorlann teocht tairiseach (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D oscillator lán-teocht mór-acmhainn (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Ascaltóir teocht tairiseach folctha uisce (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Binse oibre ultra-ghlan AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); steirilitheoir gaile ardbhrú (TOMY Company, an tSeapáin); Ionstraim uisce íon Milli Q (Millipore, Stáit Aontaithe Mheiriceá); LC-20Crómatagraf Chéim leachta ardéifeachtúlachta (Cuideachta Shimadzu, an tSeapáin); Mais-speictriméadracht ardtaifigh UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, USA); Micreascóp comhfhócasach léasair FV1200 (Cuideachta Olympus, an tSeapáin).

2 Modhanna turgnamhacha

2.1 eastóscadh RNA agus sintéis cDNA.

Bhí bláthanna Cistanche tubulosa meilte i nítrigine leachtach agus ansin faoi réir measúnacht eastósctha RNA.

Baineadh úsáid as trealamh (Norgen, Cat 17200) RNA iomlán, braitheadh ​​NanoDrop 2000C an tiúchan agus an caighdeán RNA, agus roghnaíodh samplaí RNA le cóimheas A260/A280 idir 1.8 agus 2.1 le haghaidh tras-scríobh droim ar ais chun cDNA a shintéisiú. Baineadh úsáid as transcriptase droim ar ais M-MLV (Promega, M170B) chun an RNA iomlán cáilithe a aisiompú go cDNA. Rinneadh na hoibríochtaí turgnamhacha de réir na dtreoracha.

2.2 Clón géine CtCHS

Bunaithe ar shonraí transcriptome bláthanna Cistanche tubulosa dár ngrúpa taighde [16], rinneadh scagadh amach ar CtCHS le fráma léitheoireachta iomlán oscailte, agus úsáideadh bogearraí SnapGene chun primers sonracha a dhearadh bunaithe ar an seicheamh géine (Tábla 1). Rinneadh aimpliú PCR trí úsáid a bhaint as cDNA bláth Cistanche tubulosa mar theimpléad. Ba é an córas aimplithe ná 2 × Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, primers in aghaidh an tsrutha agus anuas (10 μmol/L) 2 μL an ceann, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Ba iad na coinníollacha imoibrithe ná: réamh-dhínádúrú ag 95 céim ar feadh 3 nóiméad; 25 timthriall dínádúraithe ag 95 céim ar feadh 15 s, annealing ag 55 céim ar feadh 15 s, agus síneadh ag 72 céim ar feadh 1 nóiméad; síneadh imoibriú ag 72 céim ar feadh 5 nóiméad. Braitheadh ​​an táirge PCR le leictreafóiréis glóthach agarose 1%, agus úsáideadh an trealamh íonú DNA (Novizan, Cat DC301-01) le haghaidh aisghabháil glóthach, agus ansin íonaíodh an DNA aisghafa le trealamh clónála tapa (Novizan, Cat). C601-01). Ceanglaíodh an blúire DNA leis an veicteoir pCE2TA/Blunt-Zero, a chlaochlú go cealla inniúla Escherichia coli DH5, agus tar éis é a shaothrú thar oíche ag 37 céim , roghnaíodh tréithchineálacha clón aonair agus seoladh chuig an gcuideachta iad le haghaidh seicheamhú.

Tábla 1 Seichimh primer

2.3 Anailís bhithfhaisnéisíochta

Úsáid bogearraí ProtParam ar líne chun anailís a dhéanamh ar airíonna fisiceacha agus ceimiceacha próitéine; uirlis ar líne Prot Scale a úsáid chun hidreafaileacht/hidreafóbacht próitéine a anailísiú; úsáid a bhaint as uirlis ar líne SOPMA chun struchtúr tánaisteach próitéine a thuar; úsáid a bhaint as bogearraí anailíse ar líne SWISS-MODEL chun struchtúr treasach próitéine a thuar; bain úsáid as bogearraí ar líne TMHMM Déan struchtúr trasmembrane na próitéine a thuar; bogearraí DNAMAN a úsáid chun homaleolaíocht CtCHS a chur i gcomparáid le seichimh aimínaigéad CHS de speicis eile; úsáid a bhaint as bogearraí MEGA-X chun crann phylogenetic a thógáil, ag baint úsáide as ceartú comharsan (NJ) agus Poisson Déantar an t-achar éabhlóideach a ríomh ag baint úsáide as modh Bootstrap, agus is é 1000 uair an líon athrá Bootstrap.

2.4 CtCHS slonn prócarótach agus íonú

Dear primers le suíomhanna srianta BamHⅠ agus XhoⅠ bunaithe ar an seicheamh CtCHS, agus déanann PCR na blúirí sprice comhfhreagracha a mhéadú. Díleádh an pET{0}}veicteor agus an spriocbhlúire trí úsáid a bhaint as endonucleases BamHI agus Déantar an brú clónáilte a sheicheamhú, agus baintear an plasmid tar éis seicheamhú ceart. Aistríodh an plasmid pET-28a-CtCHS arna fhíorú trí sheicheamhú go cealla inniúla Escherichia coli BL21 (DE3). Déan tagairt don mhodh Ding Ning et al. [17] le isopropil

Baineadh úsáid as -D-thiogalactopyranoside (IPTG) chun slonn próitéine a aslú ag teocht íseal agus íonaíodh é trí cholún crómatagrafaíochta cleamhnais Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Díríodh an phróitéin trí lártheifneoiriú i bhfeadán ultrascagacháin (Millipore, 30 000) agus díshailleadh í. Stóráil i maolán 20 mmol/L KPB (pH 8.0, ina bhfuil 1 mmol/LEDTA) agus stóráil i gcuisneoir −80 céim le haghaidh stórála fadtéarmach.

2.5 Anailís ar ghníomhaíocht einsímí CtCHS

Córas imoibrithe einsímí CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS athchuingreach próitéin 20 μL, i Tar éis imoibriú i ndabhach uisce ag 37 céim ar feadh 12 uair an chloig, baineadh an meascán trí huaire le 800 μL d'aicéatáit eitile, a thriomú trí shreabhadh nítrigine, agus ansin tuaslagtha i 100 μL de meatánól. Úsáid crómatagrafaíocht leacht ardfheidhmíochta chun an táirge a bhrath. Is iad na coinníollacha colún deiridh LP-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), teocht an cholúin 30 céim, toirt sampla 10 μL, agus uisce (A) agus aicéataitrile (B) mar an sreabhadh. Céim, grádán elution: 0~10

min, 30% B; 10~20 nóiméad, 30%~60% B; 20~25 nóim, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 nóim, 80%~100% B; 35-40 nóim, 100% B; 40-46 nóim, 100%-30% B. Is é 1 mL/nóiméad an ráta sreafa toirtmhéadrach agus tá an braite ag tonnfhad 290 nm.

Úsáideadh UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS le haghaidh tuilleadh braite. Ba iad coinníollacha na céime leachta ná colún Uiscí Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1.7 μm), teocht an cholúin 40 céim , naringenin- rialuithe chalcone agus naringenin. Is é 4 μL toirt luchtaithe an táirge, agus is é 7 μL líon luchtaithe an táirge imoibrithe einsíme. Úsáidtear uisce (A)-aicéatóintríle (B) mar chéim shoghluaiste. Is é an grádán elution: 0 go 5 min, 30% B; 5 go 15 nóim, 30 %-60 % B; 15-20 nóim, 60%-100 %B; 20-25 nóim, 100% B; 25-31 nóim, 100%-30% B. Is é 0.3 mL/nóiméad an ráta sreafa toirtmhéadrach. Is iad na coinníollacha mais-speictriméadracht ná foinse ian electrospray, nítrigin mar ghás iompróra, brú gáis sheath 3.5 MPa, brú gáis cúnta 1.0 MPa, brú spraeála 3500 V, teocht ribeach 350 céim, teocht teasa gáis chúnta 200 céim, modhanna ian dearfacha agus diúltacha, scanadh Is é an raon ian m/z ná 100-1500, is é 35 000 taifeach iomlán MS, is é 17 500 an taifeach dd-MS2, (N)

CE/céim céimnithe socraithe go 35, 60.

2.3 Anailís bhithfhaisnéisíochta

Úsáid bogearraí ProtParam ar líne chun anailís a dhéanamh ar airíonna fisiceacha agus ceimiceacha próitéine; uirlis ar líne Prot Scale a úsáid chun hidreafaileacht/hidreafóbacht próitéine a anailísiú; úsáid a bhaint as uirlis ar líne SOPMA chun struchtúr tánaisteach próitéine a thuar; úsáid a bhaint as bogearraí anailíse ar líne SWISS-MODEL chun struchtúr treasach próitéine a thuar; bain úsáid as bogearraí ar líne TMHMM Déan struchtúr trasmembrane na próitéine a thuar; bogearraí DNAMAN a úsáid chun homaleolaíocht CtCHS a chur i gcomparáid le seichimh aimínaigéad CHS de speicis eile; úsáid a bhaint as bogearraí MEGA-X chun crann phylogenetic a thógáil, ag baint úsáide as ceartú comharsan (NJ) agus Poisson Déantar an t-achar éabhlóideach a ríomh ag baint úsáide as modh Bootstrap, agus is é 1000 uair an líon athrá Bootstrap.

2.4 CtCHS slonn prócarótach agus íonú

Dear primers le suíomhanna srianta BamHⅠ agus XhoⅠ bunaithe ar an seicheamh CtCHS, agus déanann PCR na blúirí sprice comhfhreagracha a mhéadú. Díleádh an pET{0}}veicteor agus an spriocbhlúire trí úsáid a bhaint as endonucleases BamHI agus Déantar an brú clónáilte a sheicheamhú, agus baintear an plasmid tar éis seicheamhú ceart. Aistríodh an plasmid pET-28a-CtCHS arna fhíorú trí sheicheamhú go cealla inniúla Escherichia coli BL21 (DE3). Déan tagairt don mhodh Ding Ning et al. [17] le isopropil

Baineadh úsáid as -D-thiogalactopyranoside (IPTG) chun slonn próitéine a aslú ag teocht íseal agus íonaíodh é trí cholún crómatagrafaíochta cleamhnais Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Díríodh an phróitéin trí lártheifneoiriú i bhfeadán ultrascagacháin (Millipore, 30 000) agus díshailleadh í. Stóráil i maolán 20 mmol/L KPB (pH 8.0, ina bhfuil 1 mmol/LEDTA) agus stóráil i gcuisneoir −80 céim le haghaidh stórála fadtéarmach.

2.5 Anailís ar ghníomhaíocht einsímí CtCHS

Córas imoibrithe einsímí CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS athchuingreach próitéin 20 μL, i Tar éis imoibriú i ndabhach uisce ag 37 céim ar feadh 12 uair an chloig, baineadh an meascán trí huaire le 800 μL d'aicéatáit eitile, a thriomú trí shreabhadh nítrigine, agus ansin tuaslagtha i 100 μL de meatánól. Úsáid crómatagrafaíocht leacht ardfheidhmíochta chun an táirge a bhrath. Is iad na coinníollacha colún deiridh LP-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), teocht an cholúin 30 céim, toirt sampla 10 μL, agus uisce (A) agus aicéataitrile (B) mar an sreabhadh. Céim, grádán elution: 0~10

min, 30% B; 10~20 nóiméad, 30%~60% B; 20~25 nóim, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 nóim, 80%~100% B; 35-40 nóim, 100% B; 40-46 nóim, 100%-30% B. Is é 1 mL/nóiméad an ráta sreafa toirtmhéadrach agus tá an braite ag tonnfhad 290 nm.

Úsáideadh UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS le haghaidh tuilleadh braite. Ba iad coinníollacha na céime leachta ná colún Uiscí Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1.7 μm), teocht an cholúin 40 céim , naringenin- rialuithe chalcone agus naringenin. Is é 4 μL toirt luchtaithe an táirge, agus is é 7 μL líon luchtaithe an táirge imoibrithe einsíme. Úsáidtear uisce (A)-aicéatóintríle (B) mar chéim shoghluaiste. Is é an grádán elution: 0 go 5 min, 30% B; 5 go 15 nóim, 30 %-60 % B; 15-20 nóim, 60%-100 %B; 20-25 nóim, 100% B; 25-31 nóim, 100%-30% B. Is é 0.3 mL/nóiméad an ráta sreafa toirtmhéadrach. Is iad na coinníollacha mais-speictriméadracht ná foinse ian electrospray, nítrigin mar ghás iompróra, brú gáis sheath 3.5 MPa, brú gáis cúnta 1.0 MPa, brú spraeála 3500 V, teocht ribeach 350 céim, teocht teasa gáis chúnta 200 céim, modhanna ian dearfacha agus diúltacha, scanadh Is é an raon ian m/z ná 100-1500, is é 35 000 taifeach iomlán MS, is é 17 500 an taifeach dd-MS2, (N)

CE/céim céimnithe socraithe go 35, 60.

2.6 Logánú focheallach de phróitéin CtCHS

Bunaithe ar an seicheamh CtCHS agus ar phrionsabal na clónála gan uaim, dearadh primers le láithreáin gearrtha einsím Kpn Ⅰ agus BamH Ⅰ, agus rinneadh na blúirí sprice comhfhreagracha a aimpliú le PCR. Díleádh an plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP le endonucleases srianta Kpn Ⅰ agus BamH Ⅰ, agus ceanglaíodh an sprice agus an veicteoir tríd an trealamh clónála gan uaim ( Novizan, Cat C115-01), agus ansin aistríodh é isteach i gcealla inniúla E. coli DH5. , roghnaigh tréithchineálacha clón amháin le haghaidh seicheamhú, agus bain plasmid as na tréithchineálacha cearta. Aistríodh na plasmids pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS agus pCAMBIA1300-35S-GFP go prótaplastaí Arabidopsis thaliana ag baint úsáide as PEG4000, agus saothraíodh iad faoi sholas íseal ar feadh 8 go 10 u. Breathnaíodh logánú focheallach próitéin CtCHS faoi mhicreascóp comhfhócasach léasair.

2.7 Anailís ar phatrún slonn CtCHS

Dearadh primers cainníochtúla fluaraiseacha fíor-ama ag baint úsáide as DNAMAN bunaithe ar an seicheamh CtCHS, le F-bosca mar an géine tagartha inmheánach. Taispeántar na seichimh primer i dTábla 1. Braitheadh ​​​​PCR cainníochtúil fluaraiseachta fíor-ama an abairt choibhneasta CtCHS i bláthanna Cistanche tubulosa de dathanna éagsúla. Úsáid TransStart Green qPCR SuperMix (lán ór, AQ101-02) le modh ruaime fluaraiseachta SYBRGreen a thomhas. Córas imoibrithe: 2 × TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, primers in aghaidh an tsrutha agus le sruth (10 μmol/L) 0.2 μL an ceann, úsáideadh teimpléad cDNA 0.5 μL, 4.1 μL d'uisce saor ó nucleotidase don imoibriú ag baint úsáide as modh dhá-chéim. Bhí an nós imeachta imoibrithe bunaithe ar mhodh Dong Xianjuan et al. [18]. Bhí 3 mhacasamhlú bhitheolaíocha i ngach sampla, agus rinneadh an turgnamh trí huaire. Rinneadh anailís ar na sonraí turgnamhacha ag baint úsáide as Excel, ríomhadh an slonn coibhneasta CtCHS ag baint úsáide as an modh 2−ΔΔCt, agus úsáideadh GraphPadPrim 8 chun anailís suntas a dhéanamh agus histeagraim a tharraingt.