Feabhsaíonn Cistanche Ionfhabhtú Duán mar gheall ar Lupus Erythematosus Sistéamach
Mar 13, 2022
Déan teagmháil le:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Le haghaidh Cuid 1, cliceáil anseo le do thoil.
PLÉ
Is é briseadh lamháltais i gcoinne antaiginí núicléacha sainmharccórasach lupuserythematosus, agus sa bhreis ar chealla B, meastar go bhfuil ról lárnach ag cealla T uath-imoibríocha ina phaitigineas. Mar sin féin, mar bhrath (uathoibríoch) antaigin-shonrachCD4móide Cruthaíonn T cealla fós dúshlán mór i dtaighde uathdhíonachta, go dtí seo, is beag atá ar eolas faoi antaigin-imoibríoch núicléach CD4móideT cealla icórasachlupuserythematosus.
Le déanaí, modhanna núíosacha chun CD4 antigen-sonrach a bhrath agus a áireamhmóideTá cealla T forbartha. Baineann cur chuige na leabharlainne T-chealla leas as leathnú polachlónúil roimhe seo ar chealla T le gur féidir clóin T-chealla annamha a bhrath atá sainiúil don antaigin. Tugann an straitéis seo íogaireacht ard agus ceadaíonn sé oibriú le méideanna teoranta cealla. Ag baint úsáide as an teicníc seo, bhíomar in ann cealla T imoibríocha a léiriú i gcoinne 5 antaiginí núicléacha canónacha in othair le gníomhachacórasachlupuserythematosus. Is iad na míbhuntáistí a bhaineann le braite leabhar-bhunaithe, seachas a bheith dian ar shaothar, nach féidir eisfhás nó caillteanas clón áirithe le linn an leathnaithe, na céime agus na roghanna teoranta maidir le hanailís feinitíopach ar na cealla a eisiamh.
Tá comhchíteiméadracht caighdeánach teoranta ag líon na n-imeachtaí inbhraite, rud a chuireann srian le hanailís samplaí don daonra le minicíochtaí os cionn 0.01 faoin gcéad de ghnáth. Léirigh ár mbreathnóireacht ag baint úsáide as an leabharlann T-chealla go bhfuil minicíocht scaipeadh CD4 uath-imoibríochmóideB'ionann cealla T le haghaidh uathantaigin ar leith in othair a raibh flare galair orthu agus w20 cealla i milliún cill, arb ionann é agus minicíocht 0.002 faoin gcéad; dá bhrí sin, a bhrath autoantigen-CD4 ar leithmóideTá cealla T ag baint úsáide as comhchíteiméadracht chaighdeánach neamh-ionramháilte beagnach dodhéanta. Bhí Bacher et al. tugadh isteach réamhshaibhriú CD4móideT cealla atá imoibríoch d’antaiginí ar leith sula sealbhaítear iad ar chomhchíteiméadracht, ar a dtugtar an modh ARTE. Glacadh leis an gcur chuige seo chun CD4 a bhaineann go sonrach le hantaigin núicléach a bhrathmóideT cealla, bhíomar in ann ár dtorthaí a dhearbhú agus leathnú CD4 antaigin-imoibríoch núicléach a léiriúmóideT cealla gníomhachacórasachlupuserythematosus. Go háirithe, ní raibh minicíocht na gcealla T imoibríoch le trasthyretin agus C. Albicans difriúil idir rialuithe sláintiúla agus othair lecórasachlupuserythematosusle gníomhaíocht galair éagsúla. Dá bhrí sin, an leathnú faoi dearauath-imoibríochT ceallais dócha nach bhfuil sé mar thoradh ar hipirghníomhaíocht ghinearálta neamhghníomhachcórasachlupuserythematosusach de leathnú cealla T antaigin-shonracha.
Tá sé léirithe cheana féin i dtuarascálacha roimhe seo go bhfuiluath-imoibríochT ceallaisteachcórasachlupuserythematosus, go príomha ag baint úsáide as iomadú, táirgeadh cítocine, nó upregulation marcóirí gníomhachtaithe, cé nach féidir a bheith in ann a chainníochtú daonra soiléir de na cealla. Tá an fhianaise is fearr ar mhinicíocht cealla T antaigin-shonracha núicléach ann le haghaidh imoibríocht i gcoinne ribonucleoprotein beag U1, sprioc autoantigen tréith i ngalar fíocháin nascach measctha agus nach bhfuarthas ach i gcodán othar lecórasachlupuserythematosus. U1 ribonucleopróitéin núicléach beag – CD4 imoibríochmóideCinneadh cealla T trí úsáid a bhaint as caolú teorannaithe agus Measúnacht Spota Imdhíonachta Nasctha le Einsím (ELISPOT) agus tuairiscíodh go dtarlódh siad ag minicíocht (40 go 250) 106 cealla T agus (20 go 60) 106 PBMC, faoi seach, atá den chineál céanna. méid mar mhinicíocht na gceall uath-imoibríoch inár staidéar. Inár gcuid oibre, rinneamar imscrúdú ar an imoibríocht i gcoinne roinnt tréithecórasachlupuserythematosus- antaiginí núicléacha gaolmhara. Is díol suntais é, cé gur léirigh gach othar le LN gníomhach minicíochtaí méadaithe CD4 antigen-imoibríoch frith-núicléachmóideCealla T, bhí difríocht idir othair ina spriocphunann, agus díríodh an imoibríocht i gcoinne sraith antaiginí níos leithne i gcomparáid le hothair neamhghníomhachacórasachlupuserythematosus. Ní fios a thábhachtaí atá sé seo faoi láthair. CD4 difriúilmóideFéadfaidh imoibríocht cealla T a bheith bainteach le léirithe cliniciúla áirithe d’imoibríochtaí éagsúla a d’fhéadfadh a bheith iomarcach do phaitigineas an ghalair.
Cosúil le galair uath-imdhíonta eile, bhíomar in ann a léiriú freisin go bhfuil CD4 uath-imdhíonta annmóideT cealla i ndaoine aonair sláintiúla, cé go bhfuil siad ag minicíochtaí i bhfad níos ísle i gcomparáid le hothair a bhfuil lupus erythematosus sistéamach gníomhach acu. Bhí na cealla seo do-bhraite trí chomparáid a dhéanamh ar líon na gcealla gníomhachtaithe le nó gan spreagadh antaigin, fiú le teicnící an-íogaire mar leabharlanna T-chealla nó modhanna ARTE. Mar sin féin, trí chlónáil aonchealla, bhíomar in ann a léiriú go raibh CD4 uathantaigin-sonrach sa chomhartha “cúlra”móideT cealla. Cad iad na teagmhais ar leith mar thoradh ar an sos caoinfhulaingt agus méadú ar mhinicíochtaí deuath-imoibríochT ceallafanann amhantrach; mar sin féin, léiríonn ár gcuid sonraí go bhfuil ról ag leathnú clón uath-imoibríocha i bpataigineas lupus erythematosus sistéamach.
Antaigin núicléach-imoibríoch CD4 a scaiptearmóideTáirgeadh cealla T go príomha IFN-g agus, go pointe níos lú, IL-17 agus IL-10. Tugann an phróifíl chitocine seo mar aon leis an gcomhghaol lag/gan aon chomhghaol le táirgeadh uath-antasubstainte le fios go bhfuil ról antaigin-imoibríoch núicléach CD4móideNí fhéadfaidh cealla T a bheith mar sholáthraí eisiach cabhrach cille B. Tá sé léirithe go bhfuil IFN-g fíor-riachtanach i bpataigineas LN. Tá sé léirithe cealla Th1 a earcú isteach saionfhabhtaithe duánfíochán icórasach lupuserythematosus, cealla T antaigin-imoibríoch núicléach a dhéanamh mar phríomhiarrthóirí chun ionradh a dhéanamh ar anduáin, áit a dtiocfadh siad trasna ar a n-uathantigen gaolmhar uileláithreach. Tá cur síos déanta ar chealla T urinary roimhe seo chun gníomhaíocht galair a léiriú agus feinitíopa na gcealla infhéitheach a scáthánú i LN20,33; dá bhrí sin, d'úsáideamar cealla T urinary mar seachfhreastalaí doduánT cealla. Nocht cealla T urinary inathraitheacht srianta TCR, atá ag teacht le breathnuithe iduánbithóipsí, rud a léiríonn saibhriú clóin T-chealla áirithe saionfhabhtaitheduánfíochán. I measc cealla T urinary, bhíomar in ann cealla T antaigin-imoibríocha núicléacha a bhrath, agus saibhríodh a minicíocht i gcomparáid le cealla T i gcúrsaíocht. Dá bhrí sin, is cosúil go bhfuil cealla imoibríocha antaigin núicléacha rannpháirteach go díreach i iomadú damáiste orgán áitiúil.
Go hachomair, léirímid anseo go bhfuil antaigin núicléach-imoibríoch CD4móideTá cealla T leathnaithe neamhghníomhachcórasachlupuserythematosus; go feinitíopach is cealla Th1 T a tháirgeann IFN-g den chuid is mó agus ionnaíonn siadionfhabhtaithespriocorgáin ar nós anduán.
Is féidir le Cistanche an ionfhabhtú a sheachaint ar anduánmar gheall arcórasachlupuserythematosus.
MODHANNA
Tugtar modhanna mionsonraithe in Ábhar Forlíontach.
Ábhair agus samplaí fola agus fuail
Fuarthas samplaí fola ó 17 duine sláintiúil, 12 othar neamhghníomhachcórasachlupus erythematosus(córasachlupuserythematosusScór DAI<10), and="" 20="" patients="" with="" active="">córasachlupuserythematosus(córasachlupuserythematosusDAI score >10). Ina theannta sin, fuarthas samplaí fuail ó 12 othar le gníomhachcórasachlupuserythematosusagus LN. Bhí a dtoiliú feasach tugtha ag na hábhair go léir ar bhonn an fhormheasa eiticiúil a fuair an bord athbhreithnithe institiúideach agus na húdaráis eitice ag Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07, agus EA 1/036/16). ). Ullmhaíodh PBMCanna agus cealla urinary ag baint úsáide as grádán dlúis FicollHypaque.
Antasubstaintí agus citeiméadracht a leanúint
Ag brath ar na turgnaimh, rinneadh roinnt móilíní dromchla a dhaite ar chealla spreagtha antigen i gcomhcheangail éagsúla de na antasubstaintí monaclónacha seo a leanas: frith-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69, agus -CD154; chun idirdhealú a dhéanamh idir cealla beo agus marbha, tá an trealamh Aqua BEO/DEAD (Life Technologies Ltd.,Paisystemachlupuserythematosus, RA) a úsáideadh.
Chun an urrann cille intracellular a stainiú, socraíodh cealla le paraformaildéad 2 faoin gcéad (v/v) ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra agus tréscaoiltear iad le Réiteach Permeabilizing BD FACS 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); rinneadh na hantaiginí seo a leanas a dhathú go hincheallach trí úsáid a bhaint as prótacal caighdeánach: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10, agus IL-17.
Fuarthas samplaí ar BD FACSCanto II agus BD LSRFortessa (BD Biosciences) ar chitomhéadair ag an Áis Chroí-Chítiméadrachta Sreabhadh Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin trí úsáid a bhaint as bogearraí BD FACSDiva (BD Biosciences). Rinneadh anailís ar shonraí citeiméadrachta sreafa ag baint úsáide as bogearraí FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).
Ullmhúchán linne antaigin agus antaigin
D’úsáideamar na hantaiginí seo a leanas chun CD4 a spreagadhmóideCealla T sa mheasúnú leabharlainne cealla T: {{0}}.5 mg/ml de phróitéin athchuingreach SNRPD1 (SmD1) daonna (Biorbyt Ltd., Cambridge, RA), 50 ng/ml de phróitéin athchuingreach SNRP70 (RNP70) daonna (Abcam Plc., Cambridge, RA), 0.5 mg/ml de phróitéin histone nádúrtha daonna (Abcam Plc.), 0.5 mg/ml de SS daonna -A/Ro próitéin athchuingreach (ar fáil go cineálta ag Euroimmun AG, Lübeck, an Ghearmáin), 0.5 mg/ml de SS-B/La daonna an próitéin athchuingreach (ar fáil go cineálta ag Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, an Ghearmáin), 1 mg/ml de SEB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, an Ghearmáin), 1 mg/ml de PepTivator Candida albicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, an Ghearmáin), agus 0.5 mg/ml de phróitéin athchuingreach trasthyretin daonna (ATGen, Seongnam, An Chóiré Theas). ).
Leabharlanna T-chealla imeallacha agus urinary Glacadh leis an bprótacal chun leabharlanna T-chealla aimplithe forimeallacha agus fuail a ghiniúint agus rinneadh é a oiriúnú mar a thuairiscítear roimhe seo.14 Brieflfly, 200,000 forimeallach CD4móidecealla T nó 500 go 2000 CD4 urinarymóideAonraíodh cealla T ag baint úsáide as frith-CD4 daonnamóideMicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) de réir threoracha an mhonaróra. An íonacht CD4móideRinneadh codán T-chealla a sheiceáil go rialta agus úsáid á baint as cíteiméadracht leantach ar bhonn CD3móideCD4móide expression, where the purity always reached >99 faoin gcéad agus 70 faoin gcéad go 75 faoin gcéad le haghaidh samplaí fola imeallacha agus urinary, faoi seach. Ag an am céanna, ullmhaíodh cealla cur i láthair antigen trí chealla CD3 a bhailiú ó PBMCanna tar éis ídiú le CD3 MicroBeads frith-daonna (Miltenyi Biotec GmbH) agus cryopreserved. Tar éis 1 go 2 sheachtain de chultúr, codáin de CD4 amplifiedmóideDáileadh cealla T ar 96-phlátaí toibreacha, ag brath ar líon na n-antaiginí a bhí le hanailísiú. Sula spreagtar iad leis na hantaiginí, cuireadh cealla ar foscadh ar feadh 4 lá ar a laghad. Ar lá an spreagtha, leáigh cealla léirithe antaiginí agus dáileadh iad isteach i gcultúr T-chealla i gcóimheas idir 1 chill léirithe antaigin agus 100 CD4 ar a laghad.móideT cealla. CD4móideÁiríodh leabharlanna T-chealla le haghaidh rialú diúltach (cealla neamhspreagtha) agus rialú dearfach (cealla spreagtha le SEB) sna turgnaimh i gcónaí. CD4móide Spreagadh cealla T leis an antigen ar feadh 4 lá, agus socraíodh iomadú ag baint úsáide as prótacal caighdeánach [3 H] -thymidine.
D'fhreagair soinneáin T-chealla aimplithe ar bhealach difriúil do na hantaiginí a léirigh CPM scintilliúcháin an-ilchineálach; mar sin, bhí gá le normalú na tairsí iolraithe arna chinneadh mar scór z sonrach don deontóir. Ríomhadh an scór z mar 5 dhifríocht de 75ú agus 25ú peircintíl os cionn CPM airmheánach na micrishaothraithe neamhspreagtha. D'fheidhmigh cealla i micreachultúr spreagtha le SEB mar rialú dearfach. Díol suntais, microcultures le innéacs spreagtha SEB de<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="">móideRíomhadh cealla T trí úsáid a bhaint as líon na micrishaothraithe diúltacha de réir dháileadh Poisson agus cuireadh in iúl iad in aghaidh an 1 milliún cill, mar a thuairiscítear roimhe seo. Tá úsáid dáileadh Poisson bunaithe ar an dóchúlacht go mbeidh 1CD4 ar a laghad annmóideTá cill T i láthair i micrishaothrú amháin de leabharlanna T-chealla nuair a aimsíodh an comhartha radaighníomhach tar éis spreagadh antigen-sonrach.
Modhanna ARTE imeallacha agus urinary leanamar an prótacal a úsáideann an CD154 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec GmbH). Go hachomair, spreagtar cealla ar feadh 7 n-uaire le hantaiginí agus ansin lipéadaíodh iad le hantasubstaintí biotin CD frith-dhaonna agus miocróníní frith-bhiotáin de réir threoracha an déantóra. Lódáladh cealla lipéadaithe ar cholúin MS calabraithe (Miltenyi Biotec GmbH) chun CD154-ceall a shaibhriú. Rinneadh lipéadú cealla a bhfuil eistear N-succinimidyl diacetate carboxyfluorescein (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) orthu tar éis prótacail chaighdeánaigh.
Feabhsaíonn Cistancheduánfeidhmeanna.
Giniúint clón aonchealla
Gineadh clóin aonchealla ó chealla antaigin-imoibríocha, a shaibhríodh le slonn CD154 tar éis prótacal ARTE. Rinneadh CD154-chealla léirithe a scagadh le 30-scagaire ullmhúcháin mm (Miltenyi Biotec GmbH) agus cuireadh ar fionraí iad in 1 ml de 20 faoin gcéad (v/v) salanda fuar-mhaolánach fosfáite, 0.5 faoin gcéad albaimin séiream buaibheach, agus aigéad eitiléinedé-aimínteitrea-aicéiteach 2mM. Ba chealla aonair iad cealla a shórtáil don CD154móideCD69móidefeinitíopa, agus saothraíodh cealla singil sórtáilte i toibreacha aonair de 96-plátaí tobair i láthair na gcealla friothálacha. Coinníodh cultúir chealla ar feadh 3 go 4 lá go dtí go raibh roinnt clón le feiceáil. Lá amháin roimh an athspreagadh, leáigh cealla léirithe antaiginí agus dáileadh iad i gcultúr T-chealla i gcóimheas de
ar a laghad 1 chill i láthair antaigin go 100 CD4móideT cealla. Spreagadh cealla le 1 mg/ml d'antaigin, agus d'fheidhmigh clóin neamhspreagtha mar rialú diúltach.
Anailís ar repertoire TCR bunaithe ar sheicheamhú den chéad ghlúin eile
Rinneadh DNA genomic a leithlisiú ó CD4 forimeallachmóideCealla T agus cealla urinary ag baint úsáide as an trealamh Micrimhilseogra AllPrep DNA/RNA (Qiagen, Venlo, an Ísiltír). Méadaíodh lócas TCR-b ath-chomhcheangailte tar éis an phrótacail mar a thuairiscítear roimhe seo. Próiseáladh léamha ag baint úsáide as IMSEQ, agus cnuasaíodh clóitíopaí comhionanna agus rinneadh anailís bhreise orthu.
Staitisticí
Rinneadh tástálacha staitistiúla le bogearraí GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Cuireadh coigeartú Bonferroni i bhfeidhm le haghaidh comparáidí iolracha. Baineadh úsáid as tástáil Mann-Whitney U agus tástáil céim sínithe Wilcoxon sna turgnaimh le tacar sonraí neamhspleácha agus cleithiúnacha, faoi seach. Tar éis Bonferroni a choigeartú le haghaidh comparáidí iolracha, ceartaíodh ríomh na luachanna criticiúla P toisc go bhfuil sé bunaithe ar líon na gcomparáidí pleanáilte. luachanna P<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="">córasachlupuserythematosusLuachanna DAI in ionad luachanna rangaithe chun tuiscint níos fearr a sholáthar ar an gcomhghaol idir líon na gceall agus gníomhaíocht galair. Le haghaidh anailíse comhghaolaithe, luachanna P<0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="">móideSainmhíníodh cealla T, na minicíochtaí gan chúlra mar nialas. Cuireadh claochlú loga(x þ 1) i bhfeidhm ar an tacar sonraí nuair a chuimsigh sé luachanna nialais. Tá sonraí forlíontacha othar agus sonraí staitistiúla ar fáil i dTáblaí Forlíontacha S1 agus S2.
CD4 antaigin-imoibríoch núicléachmóidecealla a leathnú go gníomhachcórasachlupuserythematosus, éifeacht cytokines a tháirgeadh, agus infect anduáin,Is féidir le cistanche anduáin.
NOCHTADH
Níor dhearbhaigh na húdair go léir aon leasanna iomaíocha.
BUÍOCHAS
Gabhaimid buíochas le Toralf Kaiser agus Jenny Kirsch (Cítiméadracht Sreafa agus Áis Sórtála Cealla, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) as cúnamh le citeiméadracht flflow agus sórtáil ceall. Soláthraíodh tacaíocht do na staidéir seo trí dheontais ón Deutsche Forschungsgemeinschaft laistigh den Sonderforschungsbereich 650 go GR agus trí dheontais ó Deutsche Gesellschaft für Nephrologie agus Clár Eolaí Cliniciúil Charité-Universitätsmedizin Berlin agus Institiúid Sláinte Beirlín go PE.
ÁBHAR FORLÍONTACH Comhad Forlíontach (PDF)
Fíor S1. CD4 a bhaineann go sonrach le hantaigin núicléach uath-imoibríochmóideBraitheadh cealla T leis an modh leabharlainne cealla T. Fíor S2. CD154móideCD69móideCD4móideTá cealla T scoite amach tar éis spreagtha le hantaiginí núicléacha ó dhaoine sláintiúla CD4 a bhaineann go sonrach le hantaigin bona-fifemóideT cealla.
Fíor S3. Na minicíochtaí CD4 uath-imoibríoch a tháirgeann cítocínmóideCuireadh cealla T i gcomparáid leis an titer na n-antasubstaintí antinuclear (frith-ANA) (A), agus leis an tiúchan na n-antasubstaintí frith-dúbailte DNA snáithe (frith-dsDNA) (B).
Fíor S4. CD4 antigen-imoibríoch núicléachmóideBraitheadh cealla T i bhfual gníomhachcórasachlupuserythematosusothair le LN.
Tábla S1. Sonraí cliniciúla.
Tábla S2. Achoimre ar luachanna airmheánacha.
Modhanna Forlíontacha.
Nuair a bheidh anduánionfhabhtaithe mar gheall ar CD4 antaigin-imoibríoch núicléachmóidecealla ag leathnú go gníomhachcórasachlupuserythematosus, anduánTá feidhm scriosta, úsáidtear cistanche a fheabhsúduánfeidhm.
TAGAIRTÍ
1. Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigens dírithe icórasach lupuserythematosusatá cnuasaithe i dhá dhaonra de struchtúir dromchla ar keratinocytes apoptotic. J Cait Med. 1994; 179: 1317–1330.
2. Arbuckle MR, McClain MT, Rubertone MV, et al. Forbairt autoantibodies roimh thús chliniciúilcórasachlupuserythematosus. N Béarla J Med. 2003; 349: 1526-1533.
3. Suarez-Fueyo A, Bradley SJ, Tsokos GC. T cealla icórasachlupuserythematosus. Curr Opin Immunol. 2016; 43:32-38.
4. Crow MK, DelGiudice-Asch G, Zehetbauer JB, et al. Iomadú cille T a bhaineann go sonrach le autoantigen de bharr an phróitéin ribosomal P2 in othair lecórasachlupuserythematosus. J Clin Infheistiú. 1994; 94:345-352.
5. Engler JB, Undeutsch R, Kloke L, et al. Dímharcáil CD4 uath-imoibríochmóideCealla T trí ídiú cealla T rialála CD25 icórasachlupuserythematosus. Ann Rheum Dis. 2011; 70: 2176-2183.
agus araile.
