Tionchar Apoptotic Pholaisiúicrídí Cistanche ar leoicéime

Údar:

LI Éan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,et al.

Lár Mhongóil, tSín

Imscrúdú a dhéanamh ar éifeacht apoptotic dePolaisiúicrídí Cistanche( CDP) ar an duineleoicéime géarmhíochainelíne cille cealla Jukat.ModhannaCuireadh measúnacht MTT i bhfeidhm chun éifeacht CDP ar iomadú cille a bhrath, Baineadh úsáid as blotáil an iarthair chun gníomhachtú caspase-9 agus caspase-3 a bhrath, agus tástáladh na móilíní comhartha apoptotic freisin.ＲtorthaíCuireadh bac ar iomadú cille T ag 1 mg / ml agus 2 mg / ml CDP, Spreagadh apoptosis cealla T ag 5 mg / ml CDP, aguslaghdaíodh na slonn de pro-caspase-9 agus pro-caspase-3 go suntasach. Cuireadh bac suntasach ar léirithe na ngabhdóirí dromchla cille CD45 agus CD71 ag 5 mg / ml CDP, Spreagadh fosfarylation EＲK, agus cuireadh bac ar phosphorylation JNK.

Conclúidí

【Eochairfhocail】Polaisiúicrídí Cistanche; Apoptóis; Ｒ glacadóir; caspase-9; caspase-3

Is galar clonal urchóideach é an leoicéime lymphoblastic géarmhíochaine den chóras lymphatic a bhfuil leibhéal ard ilchineálachta inmunophenotype aige. , éasca le hathiompú, agus mar sin de. Faoi láthair, cuimsíonn modhanna cóireála a úsáidtear go coitianta trasphlandú smeara, teiripe ionduchtaithe, imdhíonteiripe, ceimiteiripe comhcheangailte, etc. Mar gheall ar chumas teoranta an chuid is mó de dhrugaí ceimiteiripe chun siadaí a dhíriú agus a mharú, féadfaidh siad damáiste tromchúiseach a dhéanamh don chóras díleá, don chóras fola, cardashoithíoch agus cerebrovascular, etc Agus cóireáil á fháil aige, is minic a bhíonn frithghníomhartha díobhálacha móra ag gabháil leis, agus tá cuid acu fiú marfach. De réir mar a théann ceimiteiripe ar aghaidh, bíonn claonadh ag an gcomhlacht lamháltas a fhorbairt do dhrugaí ceimiteiripe, rud a mhéadaíonn an baol go dtarlóidh galar arís.

Dá bhrí sin, tá an cuardach le haghaidh teiripe leoicéime ard-spriocdhírithe nó teiripe aidiúvach an-éifeachtach anois mar fhócas na n-aird faoi láthair.CistancheTugtar Chagangaoya i Mongóilis. Baineann sé leis an teaghlach Ledangaceae agus an ghéineas Cistanche. Tá sé seadánacha ar fhréamhacha na gcrann Desert agus tá an dea-cháil "ginseng Desert".

I measc príomh-chomhábhair ghníomhacha Cistanche tá gliocóisídí feinileatánóideach, lignans, betainein, stéaróil, aimínaigéid, agus polaisiúicrídí. Frith-athlastach, antiviral, frithocsaídeach, rialáil imdhíonachta agus éifeachtaí eile.

Staidéar a fuarthas amach gopolaisiúicríd Cistanche (CDP),mar cheann dá phríomh-chomhpháirteanna gníomhacha,tá éifeachtaí frith-meall agus inmunomodulatory.Fuair ​​​​na taighdeoirí amach go bhfuil éifeacht marú suntasach ag CDP ar chealla leoicéime K562 agus THP-1, agus mhol siad go bhfuil ról áirithe ag CDP saleoicéime a chosc nó a chóireáil. Ina theannta sin, i cumaisc leigheas traidisiúnta na Síne, cistanche, le haghaidh cóireáil géarmhíochaineleoicéime, CistancheTá ról aige freisin mar cheann de na comhpháirteanna tábhachtacha. Mar sin féin, an mheicníocht shonrach gníomhaíochta deCistanchení fios. Sa pháipéar seo, leithlisiú agus íonúCDP na CistineRinneadh staidéar, agus rinneadh imscrúdú ar éifeacht marú agus ar mheicníocht ghaolmhar CDP ar chilllíne géar leoicéime an duine Jurkat.

1.1 Príomh-imoibrithe agus ionstraimí

Ceannaíodh púdar Cistanche ó Sichuan WecistancheCeannaíodh Group Co, Ltd, líne cille leoicéime géarmhíochaine daonna Jurkat ó bhanc cille Institiúid Bitheolaíochta Cille Shanghai, ceannaíodh thiazole gorm (MTT) agus sulfáit dodecyl sóidiam (SDS) ó Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., ceannaíodh séiream bó féatais (FBS) ó Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., caspase ina bhfuil cistéin-3, caspase-9, CD71, CD45, kinase aimín-teirminéil Fosfarylated c-Jun (lch -JNK) agus ceannaíodh antasubstaintí kinase (p-ERK) extracellular comhartha-rialaithe ó Cell Signaling Technology, SAM, agus ceannaíodh antasubstaintí actin ó Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Leictriceimiceach Ceannaíodh an tsubstráit luminescence (ECL) ó Thermo Cuideachta Eolaíochta na Stát Aontaithe, agus imoibrithe eile a bhí de ghrád anailíseach intíre. Gel-View 6000 móide stáisiún oibre íomhá Chliste (táirge Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.), micreascóp fluaraiseachta bun os cionn Revolve FL (táirge Echo Laboratories, USA), léitheoir micreaphláta EPOCH (táirge Beijing Bo Teng Instrument Co., Ltd).

1.2 Scaradh agus íonú CDP Tóg 500 g dePúdar sliocht Cistanche, soak é i eatánól 95 faoin gcéad thar oíche, é a scagadh le uige, an t-iarmhar scagaire a bhailiú, é a fhiuchadh le huisce te ag 60 céim ar feadh 2 h / am, iomlán de 3 huaire. Tar éis an deireadh, cuireadh na scagáití le chéile trí huaire, comhchruinnithe faoi bhrú laghdaithe go 2/3 den toirt bunaidh, chuir siad 3 huaire an méid eatánóil 95 faoin gcéad, agus lig sé seasamh ag 4 céim thar oíche. An lá dár gcionn, lártheifneoir ag 4 000 r/nim ar feadh 10 nóiméad, bailigh an deascán, bain próitéin trí mhodh Sevag, deascán le eatánól absalóideach, reo-tirim chun CDP a fháil.

1.3 Saothrú cille Stóráladh an ghéarlíne cille leoicéime daonna i nítrigin leachtach i saotharlann Jurkat. Nuair a úsáideadh iad, rinneadh na cealla a aisghabháil go tapa i ndabhach uisce 37 céim agus saothraíodh iad i meán RPMI1640 (ina raibh 100 U/ml peinicillin agus 100 U/ml streiptimícíní) le 10 faoin gcéad FBS. Saothraíodh na cealla i goradán cille 37 céim, 5 faoin gcéad CO2, a rith gach 2 go 3 lá, agus rinneadh na turgnaimh nuair a chuaigh na cealla isteach sa chéim fáis logartamach.

Turgnamh MTT 1.4 Tógadh cealla Jurkat sa chéim fáis logartamach, lártheifneoirithe chun millíní cille a fháil, agus áiríodh iad ag 5 × 105 cealla / ml. Glac 96-pláta saothraithe cille tobair, ionaclaithe 100 ul cill i ngach tobar, agus ansin cuir meán iomlán 100 ul RP-MI1640 mar ghrúpa rialaithe; roinneadh an grúpa turgnamhach ina 3 ghrúpa, ar dtús ag baint úsáide as meán RPMI1640 chun tiúchain éagsúla CDP a ullmhú, agus ansin ag cur 100 ul de mheán RP-MI1640 le gach tobar. Baineadh úsáid as cealla ul Jurkat agus tuaslagán CDP 100 ul chun an tiúchan deiridh CDP a dhéanamh ag 1, 2, agus 5 mg / ml, faoi seach. Bunaíodh gach grúpa le 5 thoibreacha dhúblacha agus gor iad i gorlann cille 37 céim ar feadh 48 h. Tar éis an goir, cuir 20 ul de MTT (tá tiúchan an tuaslagáin stoic 5 mg/ml) isteach i ngach tobar, cuir ar ais isteach sa gorlann cille é, agus lean ar aghaidh ag gor ar feadh 4 h, agus ar deireadh cuir 100 ul de 20 faoin gcéad leis. SDS chun formazan a dhíscaoileadh ag 37 céim thar oíche, agus é a úsáid an lá dár gcionn. Braitheadh ​​léitheoir microplate an absorbance ag 570 nm de gach grúpa, agus ríomhadh an ráta coiscthe de thiúchan éagsúla CDP ar iomadú cille Jurkat de réir foirmle.

Tógadh 1.5 cealla Jurkat blotting an Iarthair sa chéim fáis logartamach agus síolaíodh i 6-pláta tobair ag dlús 2 × 105 cealla / ml, 500 ul / tobar, agus cuireadh meán iomlán 500 ul RPMI1640 leis an rialú. grúpa. Socraigh 3 ghrúpa turgnamhacha, grúpaí cóireála polaisiúicríde 1, 2, agus 5 mg/ml, CDP

Tuaslagtha i RPMI1640 meán iomlán roimh ré, cuireadh 500 ul de chealla agus 500 ul de thuaslagán CDP de thiúchan éagsúla leis an 6-pláta tobair agus goraíodh iad ag 37 céim ar feadh 48 h. Tar éis an chultúir, bailíodh fionraí cille gach grúpa, lártheifneoirithe ag 1 500 r/min ar feadh 5 nóiméad chun millíní cille a fháil, agus nite dhá uair le saline maolánach fosfáite réamh-fhuaraithe (PBS). Tar éis níocháin, cuireadh 20 ul de mhaolán lysis cille le gach grúpa, agus cuireadh na cealla ar oighear ar feadh 30 min. Baineadh próitéin iomlán agus coigeartaíodh an tiúchan cille ag baint úsáide as modh Bradford. Tógadh 20 ug de phróitéin ó gach grúpa le haghaidh leictreafóiréis glóthach SDS-polyacrylamide (PAGE), agus aistríodh an próitéin chuig membrane fluairíd pholaivinilideéin (PVDF) trí leictreaphróisiú. Cuireadh bac le púdar bainne neamhshaille ag teocht an tseomra ar feadh 1 uair an chloig, cuireadh antasubstaintí caspase frith-dhaonna coinín agus caspase{{{500 leis ag cóimheas caolaithe 1:1 000, gortha ag teocht an tseomra ar feadh 1 h, sruthlaithe 3 huaire le fosfáit maolán Tween (PBST) shaker (10 nóiméad/am), cuir peroxidase horseradish (HRP)-lipéadaithe antashubstaint tánaisteach (1:1 000), gor ar feadh 1 h ag teocht an tseomra, sruthlaigh 3 huaire le PBST, sruthlaigh 1 uair le PBS, cuir foshraith ECL leis, agus úsáid Baineadh úsáid as an stáisiún oibre íomhá Chliste le haghaidh íomháithe, agus rinneadh comparáid idir na hathruithe banna de gach grúpa chun staidéar a dhéanamh ar apoptosis cealla Jurkat arna spreagadh ag CDP. Chun próitéiní a bhaineann le cosán apoptosis a bhrath, bhí an cultúr cille agus na coinníollacha cóireála CDP mar an gcéanna thuas. Tar éis an imoibrithe, bhí na cealla lysed le haghaidh cainníochtú próitéine. Aistríodh an próitéin chuig membrane PVDF ag SDS-PAGE agus electroporation. Tar éis blocáil le púdar bainne bearrtha ar feadh 1 h, cuireadh antasubstaintí frith-CD71, CD45, p-JNK agus p-ERK (1:1 000), agus gor iad ag teocht an tseomra ar feadh 1 h. Goradh an antashubstaint thánaisteach lipéadaithe HRP (1:1 000) ar feadh 1 h, agus ar deireadh, baineadh úsáid as an stáisiún oibre íomháithe cliste le haghaidh íomháithe chun staidéar a dhéanamh ar na móilíní comharthaíochta gaolmhara de apoptosis cille Jurkat de bharr CDP. Cuireadh scála liath ar na bannaí turgnamhacha a d'eascair as sin le hÍomhá J (1.8.0).

Cliceáil anseo chun eolas a fháil ar éifeacht Cistanche ar Éifeacht frith-meall agus Frith-ailse

1.6 Anailís staitistiúil SPSS21. Úsáideadh bogearraí 0 le haghaidh t-tástáil agus anailís athraithis

2 thorthaí feidhm Cistanche arleoicéime

2.1 Leibhéal iomadú cille

D’éirigh le haonrú an CDP, le níos mó ná 9{2{{20}} cion siúcra agus níos lú ná 5 faoin gcéad cion próitéine. Ba é an ráta coiscthe ar iomadú cille sa ghrúpa CDP 1 mg/ml ná ( 19. 1 ± 2. 1 ) faoin gcéad, agus bhí sin sna grúpaí CDP 2 mg/ml agus 5 mg/ml (44. 2 ± 5. 2 ). ) ) faoin gcéad agus ( 47. 8 ± 4. 4) faoin gcéad , rud a léiríonn gur féidir le CDP bac suntasach a chur ar iomadú cealla Jurkat ar bhealach dáileog-spleách. 2.2 I gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe (0.62±0.04, 0.56±{{40}}.0 }}7), bhí na heinsímí caspase-9 agus caspase{{30}} mar thoradh ar an leibhéal apoptosis i gcealla Jurkat cóireáilte le CDP 5 mg/ml. pro-form pro-caspase-9 ( 0. 09 ± 0. 02) agus pro-caspase-3 ( {{ 63}} laghdaíodh go suntasach 12 ± 0. 01), agus bhí na grúpaí CDP 1 mg/ml agus 2 mg/ml i bhfad níos lú éifeachtaí do pro-caspase-3 i gcealla. Ní raibh aon éifeacht shuntasach ag ábhar Caspase-9 (0.58±0.04, 0.51±0.01) agus pro-caspase-3 (0.48±0.04, 0.44±0.05), is é sin, íseal Níor tharraing an tiúchan CDP apoptosis de chealla Jurkat, ach go príomha bac ar iomadú cille, mar a thaispeántar i bhFíor 1.

1-4: grúpa tagartha,

Grúpa CDP 1 mg / ml, grúpa CDP 2 mg / ml, grúpa CDP 5 mg / ml; mar an gcéanna leis an bhfigiúr seo a leanas

Fíor 1 Tionchar CDP ar caspase-9 agus caspase-3 i gcealla Jurkat

Tionchar polaisiúicrídí Cistanche Tionchar ar leoicéime

2.3 Ba iad na leibhéil slonn coibhneasta CD71 agus CD45 sa ghrúpa rialaithe gabhdóirí apoptosis ná 1.00±0.04, {{10}}.54± 0.{{20}}2. D'fhéadfadh an grúpa CDP 5 mg/ml bac suntasach a chur ar CD71 (0.05±0.02). 01) agus CD45 ( 0. 13 ± {{40}}. 03); D'fhéadfadh grúpaí CDP 1 mg/ml agus 2 mg/ml bac a chur ar léiriú CD71 (0. 52 ± 0. 06, 0. 43 ± 0. 07) go pointe áirithe Ní raibh aon éifeacht shuntasach ar léiriú CD45 (0.51). ±0.01, 0.48±0.02). Féach Fíor 2.

Fíor 2 Éifeacht CDP ar léiriú gabhdóirí ar dhromchla membrane cille

2.4 Conairí a bhaineann le apoptóis

Ba iad na leibhéil slonn choibhneasta p-JNK agus p-ERK sa ghrúpa tagartha ná 1.20±0.08 agus 0.21±0 .03, faoi seach. Spreag an grúpa CDP 5 mg/ml apoptosis agus laghdaigh sé go suntasach an leibhéal fosfarylation de JNK. ( 0. 32 ± 0. 04) , méadú suntasach ar an leibhéal fosfarylation de ERK ( 1. 13 ± {0. 05); Mhéadaigh 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP an leibhéal fosfarylation de JNK ( 1. 12 ± {{ 35}}. (0. 54 ± 0. 04, 0. 63 ± 0. 02). Féach Fíor 3.

Fíor 3 Éifeacht CDP ar fhosfarylation JNK agus ERK

3 Plé

Le blianta beaga anuas, fuair staidéir go bhfuil éifeacht coisctheach áirithe ag CDP ar línte cille leoicéime, ach níl an meicníocht shonrach gníomhaíochta ar eolas fós.

I bpróiseas apoptóis, tá caspase-9 ar cheann de na móilíní comharthaíochta in aghaidh an tsrutha sa phróiseas apoptosis atá ag brath ar caspase. Tar éis comharthaí a spreagadh, déantar hidrealú ollmhór ar pro-caspase-9 chun foirm gníomhachtaithe de caspase scoilte-9 a tháirgeadh, a leanann ar aghaidh ag tarchur comharthaí apoptotic síos chun an próiseas apoptosis a chur chun cinn. Is móilín caspase de chineál éifeachtóra é Caspase agus is príomh-mhóilín comharthaíochta é i bpróiseas apoptóis ceallach caspase-spleách. Tá sé ann freisin i bhfoirm pro-einsím (pro-caspase-3) faoi ghnáthchoinníollacha. Nuair a chuirtear i ngníomh é trí hidrealú, déantar cuid mhór caspase scoilte a tháirgeadh. -3, líseoidh sé éagsúlacht de phríomh-mhóilíní próitéine i gcealla agus ar deireadh spreagfaidh sé apoptosis. Baineann CDP leis na polaisiúicrídí gníomhacha de mhacramóilíní bitheolaíocha agus ní féidir leo dul isteach i gcealla go saor tríd an scannán cille. Mar sin, spreagann CDP apoptosis trí thionchar a dhéanamh ar léiriú agus ar dháileadh na ngabhdóirí ar dhromchla seicní cille Jurkat, rud a tharchuireann comharthaí chuig an taobh istigh de chealla, agus ar deireadh gníomhachtaítear an teaghlach caspase. próitéin, as a dtiocfaidh apoptosis cille. Léiríonn an staidéar seo nach gcothaíonn tiúchan íseal CDP apoptosis de chealla Jurkat, ach go gcuireann sé bac ar iomadú cille go príomha. Is éard atá i CD71, ar a dtugtar receptor transferrin freisin, receptor glycoprotein transmembrane cineál II a bhfuil baint aige le hionsú iarainn agus rialáil fás agus forbairt cille. Tá CD71 in iúl go mór in othair le leoicéime géarmhíochaine agus tá baint aige le friotaíocht príomhúil drugaí, is é sin, léiriú CD71. Dá airde an luach, is measa an éifeacht a bheidh ag an gcéad cheimiteiripe. Mar sin, tá CD71 ar cheann de na marcóirí le haghaidh diagnóis chúnta. Cuirtear CD45 in iúl ar dhromchla gach cineál leukocytes, ar a dtugtar freisin antigen coitianta leukocyte. Baineann sé le glycoprotein transmembrane cineál I agus tá dlúthbhaint aige le forbairt agus idirdhealú cealla T. Tá leibhéil léirithe difriúla ag CD45 agus cineálacha allosteric i gcineálacha éagsúla leoicéime, ionas gur féidir é a úsáid mar cheann de na marcóirí le haghaidh diagnóis dhifreálach agus imdhíon-fhéinitíopáil leoicéime. Úsáidtear antashubstaint mhonaclónach CD45 go forleathan i gcóireáil leoicéime, go háirithe leoicéime atá frithsheasmhach in aghaidh drugaí. Friesen et al. fuarthas amach go radanúiclídí

Is féidir le clib CD45 mAb apoptosis a aslú i línte cille leoicéime atá frithsheasmhach in aghaidh drugaí trí phróitéiní teaghlaigh caspase a ghníomhachtú (lena n-áirítear caspase-3, caspase-8, agus caspase-9). Cothaíonn CDP apoptosis de chealla Jurkat, ar dtús trí ghníomhú ar na gabhdóirí dromchla membrane cille CD45 agus CD71, a dhéanann difear do shloinneadh agus dáileadh an dá, comharthaí apoptosis a tharchur isteach sna cealla, agus ar deireadh gníomhachtú caspase-9 agus caspase{{8 }}, ag spreagadh apoptosis. Mar sin féin, tá caspase-9 agus caspase-3 suite le sruth ón gcosán apoptotic, agus ní mór móilíní comharthaíochta in aghaidh an tsrutha a fhiosrú tuilleadh. Sa staidéar seo, d'eascair CDP ag tiúchan de 5 mg/ml apoptosis de chealla Jurkat agus é ag cur bac ar léiriú CD45, a bhí cosúil leis an antasubstaint mhonaclónach CD45 a thuairiscítear thuas. Mar sin, ó thaobh na ngabhdóirí CD45 agus CD71 a bhaineann le apoptosis,Cistanchetá poitéinseal áirithe aige chun leoicéime a chóireáil nó a chóireáil aidiúvach.Cuirtear córais kinase próitéine atá gníomhachtaithe le mitogen (MAPKanna) in iúl i ngach cealla eucaryotic.

Táibléad Cistanche chun Córas Díolúine um Chóireáil leoicéime a fheabhsú

Is cosán tarchurtha faisnéise an-tábhachtach é a stiúrann aistriú comhartha spreagtha extracellular chuig an intracellular agus atá comhdhéanta de kinases próitéin serine / threonine, lena n-áirítear ERK, JNK, agus p38MAPK. Is lasca de ghníomhaíochtaí saoil cille iad a phosphorylation agus dephosphorylation agus tá baint acu le Agus an próiseas fás cille, iomadú, difreáil, gníomhachtú agus apoptosis a rialáil. Tugann an staidéar seo le fios go bhfuil baint ag dífhosfarlú JNK le apoptosis cille T a chothaítear le CDP, cé go bhfuil baint ag fosfarylation ERK leis an dá phróiseas sa mhéid is go gcuireann CDP bac ar iomadú cille agus go n-eascraíonn sé apoptosis.

I gcrích,CDP na CistineTá éifeacht cíteatocsaineach aige ar chilllíne leoicéime T-limficíteach Jurkat, rud a léiríonn go gcuireann tiúchan íseal (faoi bhun 2 mg/ml) bac ar iomadú cille, agus go gcothaíonn tiúchan arda (5 mg/ml) apoptosis.CDP na Cistineasdaíonn sé apoptosis i gcealla Jurkat go príomha trí thionchar a dhéanamh ar chealla agus iad a athrú.

Tarchuireann léiriú gabhdóirí CD71 agus CD45 a bhaineann le apoptosis ar an dromchla membrane comharthaí chuig an taobh istigh de chealla, rud a fhágann go bhfuil fosfarylation ERK agus JNK dephosphorylation, agus ar deireadh gníomhachtú caspase-9, rud a ghníomhaíonn caspase{{4}. } apoptosis a aslú.