Caibidil2: Fachtóir Krϋppel-cosúil 15 Sochtann Iomadú Cealla Mesangial Glomerular Duánach Trí Réimniú P53 SUMO1 a Fheabhsú

Le haghaidh tuilleadh eolais. teagmháiltina.xiang@wecistanche.com

3 TORTHAÍ

3.1|Géinte ceangailteach KLF a scagadh trí ChIP-Seq i MCanna glomerular duánach príomhúla

Chun na géinte comhpháirtíochta díreach ceangailteach de KLF15 a aithint, rinneamar anailís ChlP-Seq agus ar deireadh rinneamar scagadh ar 2478 géinte. Nocht GO anailís ar na géinte seo tríd an uirlis ag an suíomh gréasáin www.uniprot.org (Fíor 1A, B) téarmaí feidhm mhóilíneach a bhaineann le géinte 1941, téarmaí comhpháirteanna ceallach a bhaineann le 1662 géinte agus téarmaí próisis bitheolaíochta a bhaineann le 1766 genes. Ós rud é go raibh sé mar aidhm againn a fháil amach conas a théann KLF15 i bhfeidhm ar MCanna, dhírigh muid ar ghéinte a bhaineann le próisis cille. I measc na 1315 géinte a bhaineann le próiseas cille, fuarthas amach go raibh 74 géinte rannpháirteach i bpróisis timthriall cille; go sonrach, ghlac na géinte seo páirt i dtimthriall cille miotóiseach, trasdul céim na timthriall cille agus próisis eile (Fíor 1C, D). Ina theannta sin, rinneamar anailís ar na géinte a bhí páirteach i bhfás agus fuaireamar amach go raibh baint acu le fás forbraíochta, fás cille agus cineálacha eile fáis (Fíor 1E).

3.2|Géinte a rialaítear go difreálach a scagadh i KLF15-ró-shochtadh MC glomerular duánach ag baint úsáide as SILAC agus LC/MS

Aithníodh 1357 próitéin mar thoradh ar anailís SILAC agus LC/MS ar HRMCanna a rinne ró-léiriú ar KLF15 i gcomparáid le cealla tuismitheora. D’úsáideamar DAVID agus IPA chun na fearainn GO agus conairí saibhrithe na próitéiní cainníochtaithe a d’aithin SILAC a fháil. Is díol suntais é go raibh go leor téarmaí a bhain le feidhm bhitheolaíoch próitéiní i measc na 30 téarma GO saibhrithe is fearr, lena n-áirítear rialáil an phróisis meitibileach aimínaigéad cheallacha, coimpléasc proteasome, ceangailteach próitéine, agus téarmaí trascríobh agus aistriúcháin, a bhfuil dlúthbhaint acu go léir leis. uileláithreacht (Fíor 2A). Léiríonn Fíor 2B na 30 téarma cosáin is mó saibhrithe go suntasach. Bhain roinnt téarmaí próisis bhitheolaíocha, lena n-áirítear na téarmaí galair proteasome agus néar-mheathlúcháin, le uileláithreacht freisin.

Cliceáil chun eolas a fháil faoicistéirar díol le sonraí

3.3|Anailís bhithfhaisnéisíochta ar ghéinte ceangailteacha KLF a d’fhéadfadh a bheith bainteach le iomadú glomerular duánach MC

Chun iniúchadh a dhéanamh ar na géinte ceangailteacha KLF a bhféadfadh baint a bheith acu leoglomerular duánachIomadú MC, rinneamar anailís bhithfhaisnéisíochta ar shonraí ChIP-Seq agus ar shonraí SILAC-LC/MS. Scrúdaíodh caoga a dó géin (Tábla 2 agus Fíor 2C), agus cúig cinn de na géinte seo, lena n-áirítear SUMO1, fachtóir coisctheach imirce macrophage (MIF), fachtóir tionscnaimh eocaryotic (EIF), fachtóir fáis cosúil le insulin (IGF) agus reticulocalbin (RCN). ), bhí dlúthbhaint acu leiomadú cille. Ós rud é gur thug anailísí GO agus cosán ar na próitéiní arna léiriú go difreálach le fios go raibh baint ag na géinte scagtha go príomha leis an bpróiseas uibítíneachta, tháinig muid ar an gconclúid go bhfuil SUMO1, ball den teaghlach próitéine atá cosúil le ubiquitin (UBL), rannpháirteach i modhnú iar-aistriúcháin cosúil le uileláithreach mar spriocghéine KLF15.

Léirigh méideanna méadaithe na fianaise go bhfuil HG ar cheann de na fachtóirí móra a spreagann forbairt nephropathy diaibéitis, agus cuireann sé iomadú MC agus sintéis maitrís méadaithe in vitro.25A staidéar roimhe seo léirithe go bhfuil PDGF-BB riachtanach le haghaidh iomadú MC roimh an bhforbairt. de glomerulosclerosis i glomerulonephritis turgnamhach.26 Tar éis a dhearbhú go raibh MCanna spreagtha ag HG nó PDGF-BB in vitro, bhraith muid athruithe i léiriú KLF15 agus SUMO1 ag an RNA agus próitéin araon

leibhéil agus fuarthas amach go raibh treochtaí comhchosúla ag na móilíní seo (Fíor 2D-l). Ar deireadh, chinneamar gurb é SUMO1 an spriocghéine de KLF15.

3.4|Suas-rialaíonn KLF15 slonn géine SUMO-1 trína cheangal le réigiún tionscnóra 16 bp CACCCA-SUMO-1 agus móitíf C móide A-saibhir

D’úsáideamar an tsraith MEME(http://meme-suite.org/tools/meme) chun na móitífeanna ceangailteacha KLF de na 52 ghéinte scagtha ó shonraí KLF15 ChlP-Seq a shaintréithe agus d’aithníomar an móitíf ceangailteach KLF (Fíor 3A). Chomh maith leis sin, rinneamar anailís bhreise ar níos mó ná míle bonn in aghaidh an tsrutha ón tionscnóir SUMO1 agus fuarthas amach go bhféadfadh KLF15 seicheamh 16 bp (núicléatídí -205~-199) a aithint agus a cheangal lena n-áirítear - CACCCA-(Fíor 3B). Dhearbhaigh ChIP-PCR go bhfuil KLF15 ceangailte leis an tionscnóir SUMO1, agus léirigh na torthaí léiriú i bhfad níos airde ar SUMO1 sa ghrúpa antasubstainte frith-KLF15 ná sa ghrúpa rialaithe cúlra (Fíor 3C).

Ina theannta sin, rinneamar measúnacht tuairisceora dé-luciferase chun an caidreamh spriocdhírithe idir SUMO1 agus KLF15 a dhearbhú. Léirigh an grúpa tionscnóra de chineál fiáin SUMO1 gníomhaíocht luciferase níos airde ná an veicteoir pGL3 agus grúpaí mutant i HRMCanna, agus méadaíodh an ghníomhaíocht go suntasach trí ró-bhrú KLF15. Rinneadh na feabhsuithe i ngníomhaíocht luciferase a aisiompú trí aistriú le plasmid a léirigh an réigiún tionscnóra mutant (Fíor 3D). Nuair a chuirtear le chéile iad, tugann na sonraí seo le fios gur sprioc tras-scríobhaithe díreach é SUMO1 de KLF15.

3.5 |Scáileán ar P53 mar an tsubstráit SUMOylation de SUMO1

Cuirtear modhnuithe SUMO in iúl go forleathan mar mhodhnuithe iar-aistriúcháin in eukaryotes. Tugtar SUMOylation freisin ar chomhchuingeach inchúlaithe ar na modhnuithe seo ar phróitéiní tsubstráit, a bhfuil ról tábhachtach aige maidir le feidhmeanna na spriocphróitéiní a rialáil agus a ghlacann páirt bhreise i bpróisis bhitheolaíocha éagsúla, mar shampla iompar núicléatóplasmach, rialachán tras-scríbhinne, apoptosis, cobhsú próitéin, freagraí strus agus dul chun cinn timthriall cille.27 Chun iniúchadh a dhéanamh ar na móilíní comharthaíochta iartheachtach atá comhchuingeach go díreach le SUMO1, rinneamar anailís líonra ar SUMO1 ag baint úsáide as bunachar sonraí an IPA, agus léirigh na sonraí go bhféadfadh SUMO1 comhchuingeach díreach a dhéanamh le P53, APP, JUN agus AKT, i measc nithe eile. próitéiní (Fíor 4A-C). Ar dtús roghnaigh muid P53 mar mhóilín iartheachtach de SUMO1 toisc gur próitéin aithnidiúil é a bhfuil dlúthbhaint aige le iomadú cille.28.29 Ina theannta sin, d'úsáideamar bogearraí SUMOsp chun seichimh ionchasacha SUMOylation de speicis éagsúla P53 a thuar agus fuaireamar amach go raibh an seicheamh SUMOylation ag P53. Fíor 4D）. Chun a chinneadh an bhfuil P53 modhnaithe go deimhin ag SUMOylation, rinneamar aistriú go neamhbhuan ar HRMCanna le ró-eisiúint SUMO1 plasmid nó SUMO1 siRNA. Nocht na torthaí IP agus blot an Iarthair treochtaí in athruithe slonn SUMO1-P53 agus P53 a bhí ag teacht leis na hathruithe i SUMO1 (Fíor 4E-J). Léiríonn na sonraí seo gur substráit SUMOylation de SUMO1 é P53.

3.6|Cuireann KLF15 bac ar iomadú MC trí slonn SUMO1 agus SUMOylation P53 a chur chun cinn

Chun rialáil P53 SUMOylation agus iomadú MC le KLF15 agus SUMO1 a bhunú, rinneamar idirghabháil le slonn KLF15 nó SUMO1 i HRMCanna agus dhéileálamar le HRMCanna le PDGF-BB. I measc HRMCanna cóireáilte PDGF-BB, léirigh cealla a aistríodh leis an ró-expression plasmid KLF15 léiriú níos airde ar SUMO1-P53, P53, KLF15 agus SUMO1 ná cealla a aistríodh leis an plasmid rialaithe KLF15. Fuarthas na hathruithe céanna ar SUMO1-P53, P53 agus SUMO1 i gcealla ró-shochtadh SUMO1 a aistríodh le plasmid, agus níor athraíodh slonn KLF15 sna cealla seo (Fíor 5A-F). Tá PDGF-BB ar cheann de na fachtóirí fáis is éifeachtaí de MCanna ar cuireadh síos orthu go dtí seo, agus breathnaíodh freagairt iomadúil HRMCanna ar PDGF-BB. Mar a léirítear i bhFíor 5G, H, tháinig méadú suntasach ar chéatadán na gcealla EdU-dearfach trí riaradh PDGF-BB athchuingreach. Léirigh torthaí staining EdU gur chuir an ró-eisiúint KLF15 agus SUMO1 araon bac ar iomadú cille spreagtha PDGF-BB (Fíor 5G, H).

Chun léargas breise a fháil ar róil KLF15 agus SUMO1 in iomadú HRMCanna, d’aistrigh muid cealla a raibh siRNA SUMO1 amháin acu nó rinneamar iad a chomhaistriú le SUMO1 siRNA agus ró-eisbhrú KLF15 plasmid. Ní dhearna laghdú-rialáil SUMO1 difear do léiriú KLF15, ach is léir gur laghdaíodh leibhéil slonn SUMO1-P53 agus P53 tar éis aistriú siRNA SUMO1 (Fíor6A-C). Ina theannta sin, nuair a cuireadh bac ar léiriú SUMO1, cuireadh leibhéil slonn SUMO{1-P53 agus P53 faoi chois fiú i gcealla a bhí ró-léiriú ar KLF15 (Fíor 6D-F). Ansin, rinneadh measúnú ar iomadú MC ag baint úsáide as measúnacht staining EdU. Chuir SUMO1 RNAi feabhas ar éifeacht iomadúil PDGF-BBon HRMCs, agus bhí níos mó cealla EdU-dearfacha ag an ngrúpa a bhí comh-aistrithe leis an overexpression KLF15 plasmid agus SUMO1 siRNA ná an grúpa a chomhtransfected leis an plasmid overexpression agus an siRNA rialaithe seicheamh hibrideach (Fíor 6G, H). . Dá bhrí sin, déanaimid an tátal go gcuireann KLF15 iomadú MC faoi chois trí fheabhas a chur ar P53 SUMOylation.

3.7|Tá comhghaol diúltach idir slonn domhanda SUMO1 agus P53 i MCanna glomerular agus iomadú MC i nephritis Thy-1 francach

Is múnla clasaiceach é nephritis Anti-Thy1 de glomerulonephritis mesangial proliferative féin-theoranta le céim iomadúil agus céim téarnaimh. Chuireamar antashubstaint Thy1 isteach i bhfrancaigh Wistar chun an múnla seo a chruthú. Níl aon athrú suntasach ag an dá nítrigine úiré serum agus creatinín idir francaigh rialaithe agus na francaigh samhail (Fíor S1). Breathnaíodh iomadú mesangial marcáilte agus carnadh ECM le linn na céime iomadaithe (laethanta 5 agus 7) i francaigh mhúnla, agus tháinig laghdú ar líon na MCanna le linn na céime téarnaimh ar an lá 10 (Fíor 7A). Braitheadh ​​​​muid freisin na hathruithe slonn sa marcóir iomadú cille PCNA ag IHC (Fíor 7A, B). Méadaíodh leibhéil PCNA ar lá 5, buaicphointe ar lá 7 agus laghdaigh sé ar lá 10 (Fíor 7F). Léirigh anailís blot an Iarthair go raibh léiriú próitéin P53, SUMO1 agus KLF15 i glomeruli scoite níos ísle sna grúpaí múnla ná sa ghrúpa rialaithe (Fíor 7C, D), ag teacht leis na torthaí inmunhistochemical (Fíor 7E, F). Léiríonn na torthaí seo go bhfuil baint ag iomadú neamhghnácha MCanna i bhfrancaigh múnla frith-Thy1 le léiriú íseal-leibhéil KLF15 agus SUMO1. Má chuirtear isteach ar léiriú na móilíní seo táthar ag súil go laghdófar an feinitíopa paiteolaíoch i bhfrancaigh.

4 PLÉ

Tá anglomeruliis aonaid scagacháin anduán. Is féidir cur isteach ar fheidhm glomerular a bheith mar thoradh ar phaiteolaíocht glomerular bunscoile nó is féidir é a bheith tánaisteach do ghalair sistéamach. Chonacthas athruithe mesangial tar éis gortú glomerular lena n-áirítear hyperiomadú MCanna agus táirgeadh iomarcach ECM (leathnú mesangial) agus táirgeadh chemoattractant do chealla athlastacha. Dá bhrí sin, is cur chuige nua teiripeach é modhnú freagraí MC, go háirithe iomadú neamhghnácha. Is próitéin é KLF15 a imríonn ról rialála mar fhachtóir trascríobh trí cheangal a dhéanamh ar sheichimh DNA ar leith. Thuairiscigh go leor staidéir go bhfuil baint ag KLF15 le rialú iomadú cille. Mar shampla, fuarthas amach go bhfuil KLF15 rannpháirteach i gcosc ar bhealaí comharthaíochta a bhaineann le iomadú MC,15,30 ach níor tuairiscíodh a spriocghéine díreach sa litríocht. Mar sin, bhain an staidéar seo go príomha le comhscagadh ar leibhéil trascríobh agus aistriúcháin chun spriocghéine díreach KLF15 a shainaithint.

Rialaíonn KLF15 géinte éagsúla i speicis éagsúla agus i bhfíocháin agus orgáin éagsúla. Sa phróiseas chun iomadú MCanna a rialáil, bíonn tionchar ag KLF15 ar léiriú géinte iolracha agus bíonn sé rannpháirteach i ilbhealaí.131,32 Chun iniúchadh a dhéanamh ar ghéinte sprioc díreach KLF15, d'úsáidamar ChIP-Seg.Klein RH agus a chomhghleacaithe úsáid as ChlP-seq teicneolaíocht chun staidéar a dhéanamh ar rialáil KLF7 ar dhifreáil na gcealla epithelial coirne.33 D'úsáid Ying M et al an teicníc seo chun staidéar a dhéanamh ar éifeacht coisctheach KLF9 ar iolrachas glioblastoma.34I gcomparáid le sliseanna ChlP, cuireann ChIP-Seq ar chumas anailís fhíor-ghéinea iomláin le réiteach níos airde, íogaireacht braite níos airde agus éileamh níos ísle ar mhéid an tsampla.35 D'úsáideamar ChP chun na blúirí DNA a bhí ceangailte go díreach le KLF15 a fháil, agus tar éis comparáide agus anailíse le GenBank, rinneamar scagadh ar 2478 spriocghéin fhéideartha. Trí anailísí GO agus cosáin, shainaithnímid go leor spriocghéin a bhfuil baint acu le timthriall na gceall agus próisis iomadaithe.

Éilíonn turgnaimh ChlP-Seq PCR chun an comhartha braite a aimpliú, agus tá méid áirithe de chlaonadh le linn an phróisis aimpliúcháin dosheachanta. Ina theannta sin, ní fhaigheann ChIP-Seq ach na géinte is féidir le KLF15 a cheangal agus ní thugann sé le fios na hathruithe a tharlaíonn i léiriú na ngéinte seo nuair a athraíonn léiriú KLF15. D’úsáideamar anailís próitéamaíocht SILAC-LC/MS chun na heasnaimh seo a chúiteamh. Soláthraíonn an teicníocht seo faisnéis ar na próitéiní go léir a n-athraíonn a slonn ar rialáil le KLF15, lena n-áirítear na próitéiní a rialaítear go díreach ag KLF15 agus na próitéiní a rialaítear go hindíreach nó a athraíodh go haistrithe. Saothraíodh HRMCanna ag baint úsáide as SILAC, agus rinneadh ró-bhrú ar KLF15 sna cealla trí aistriú plasmid. Bailíodh na próitéiní le haghaidh LC/MS a bhrath, agus fuarthas 1357 próitéin a léiríodh go difreálach. Léirigh anailísí GO agus cosáin go raibh baint ag cuid de na próitéiní a léiríodh go difreálach le uileláithreacht. Trasnaíodh na sonraí géine agus próitéin. Baineadh na géinte nach mbaineann le cuspóir an taighde agus na géinte nach bhfuil rialaithe go díreach ag KLF15; sa deireadh, rinneadh scagadh ar 52 ghéin. Ina measc seo, roghnaíodh na cúig ghéinte a raibh na difríochtaí slonn is soiléire acu agus ba gaire do iomadú. I bhfianaise thorthaí comhcheangailte na hanailíse cosáin, anailís léirithe SUMO1 agus KLF15 maidir le iomadú HRMCanna, ChlP-PCR agus measúnachtaí tuairisceora dé-luciferase, roghnaíodh an próitéin SUMO1 mar spriocghéine KLF15.

Chomh maith le hubiquitin, tá méadú ar líon na bpróitéiní UBL,3637 lena n-áirítear SUMO,38 réamhtheachtaithe néar-ceall in iúl, 8(NEDD8)3940 atá faoi rialú forbartha agus géine 15(ISG15),41 spreagtha ag interferon á shainaithint. Rialaíonn na próitéiní modhnúcháin seo go cumhachtach éagsúlacht de phróisis bhitheolaíocha. Is modhnú iar-aistritheach é suimiú comhfhiúsach SUMO le foshraitheanna, ar a dtugtar SUMOylation, a bhfuil baint aige le sraith próiseas ceallacha, lena n-áirítear iompar núicléach-cítosólach, rialáil tras-scríobhaithe, apoptóis, rialú cobhsaíochta próitéine, freagairtí struis agus dul chun cinn timthriall na gceall.27Is gnách SUMO ceangailte le hiarmhair lísín glacóra de fhoshraitheanna próitéine a chothaíonn seicheamh comhthola agus a chuireann le rialáil idirghníomhaíochtaí próitéine-próitéin chomh maith le rannánú focheallach agus cobhsaíocht próitéin.2 Is féidir le sUMO1, mar bhall den teaghlach SUMOS, cur isteach ar iomadú cille trí fhoshraith a mhodhnú agus próitéiní rialála timthriall cille a chobhsú.43 Dá bhrí sin, in éineacht leis an tuarascáil litríochta agus na torthaí cuimsitheacha scagtha agus anailíse, dhíríomar ar an gcaoi a rialaíonn KLF15 éifeacht SUMO1 ar iomadú cille mesangial.

Chun foshraitheanna SUMO1 a aithint, rinneamar anailís líonra ar SUMO1 ag baint úsáide as bunachar sonraí an IPA agus bogearraí SUMOsp. In éineacht le taighde foilsithe ar P53, mhol ár sonraí scagtha tosaigh P53 mar mhóilín iartheachtach de SUMO1 leis an seicheamh SUMOylation YKxD/E. Léiríodh i staidéir roimhe seo gur fhoshraith de SUMOylation a bhí i P53,45 agus chuir comhchuingeach feabhsaithe P53 SUMO1 cobhsaíocht agus gníomhaíocht P53 chun cinn agus se-nescence spreagtha.46 Inár staidéar, chuir trasnaíocht ar léiriú SUMO1 i HRMCanna na treochtaí athraithe céanna chun cinn i SUMO1-P53 agus P53, rud a thugann le fios gur fhoshraith SUMOylation de SUMO1 a bhí i P53.

Tá sé léirithe ag fianaise atá ag teacht chun cinn go n-imríonn SUMOylation agus dí-SUMOylation róil in iliomad galair nephropathic, mar dysgenesis duánach, carcanóma duánach, galar glomerular, apoptosis podocyte, agus hipertónacht medulla duánach, gortú duáin ghéarmhíochaine agus nephrolithiasis.7-51 Chun an t-eolas a shoiléiriú. caidreamh idir KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation agus iomadú MC, rinneamar sraith de chóireálacha aistrithe ar chealla a ndearnadh iomadú spreagtha PDGF-BB orthu. Rinne overexpression KLF15 suas-rialáil léiriú SUMO1, cé nach raibh tionchar ag ró-eisiúint SUMO1 ar léiriú KLF15. Mhéadaigh ró-léiriú KLF15 nó SUMO1 SUMOylation P53 agus chuir sé an-aimhleas ar an iomadú cille a tharlódh le PDGF-BB. Nuair a cuireadh bac ar léiriú SUMO1, cuireadh bac ar SUMOylation P53 freisin, agus chaill KLF15 a éifeacht freasúla ar iomadú cille. In vivo. tháinig méadú de réir a chéile ar iomadú MCanna le géarú nephritis iomadúil mesangial, agus tháinig laghdú suntasach ar léiriú KLF15, SUMO1 agus P53. Ag cur san áireamh na breathnuithe comhtháite i gcealla agus fíocháin, déanaimid an tátal roimh ré go rialaíonn KLF15 SUMOylation P53 trí SUMO1, rud a chuireann cosc ​​ar iomadú MC.

5 CONCLÚIDÍ

Thug roinnt staidéir le fios go bhfuil ról tábhachtach ag KLF15 maidir le iomadú MCanna a rialáil. Sa saothar seo, rinneamar iniúchadh ar na meicníochtaí a bhaineann le iomadú MC faoi chois a dhéanann an fachtóir trascríobh seo. D’aithníomar SUMO1 mar phríomhsprioc KLF15 in MCanna trí anailísí bithfhaisnéisíochta a bhaineann le ChIP-Seq agus SILAC-LC/MS. Ina theannta sin, le cúnamh ó bhunachar sonraí an IPA agus ó bhogearraí SUMOsp, chinneamar go raibh P53 ina fhoshraith dhíreach de SUMO1. Dhearbhaigh turgnaimh in vitro agus in vivo go bhféadfadh KLF15 slonn SUMO1 a chur chun cinn agus an SUMOylation de P53 a chosc ansin ar iomadú MCanna (Fíor S2). Cuireann na torthaí seo le tuiscint ar ról rialála KLF15 in iomadú MC agus cuireann siad bonn teoiriciúil ar fáil chun cóireálacha nua a aimsiú do ghalair duáin a bhaineann le iomadú MC.