Caibidil 1: Fachtóir atá cosúil le Krϋppel 15 a Shochtann Iomadú Cealla Mesangial Glomerular Duánach Trí Réimniú P53 SUMO1 a Fheabhsú
May 12, 2022
Le haghaidh tuilleadh eolais. teagmháiltina.xiang@wecistanche.com
Teibí
Cill Mheangach (MC)iomadúIs príomhghné paiteolaíoch é i roinnt daoine coitiantagalair duánach, lena n-áirítear nephritis proliferative mesangial agus nephropathies diaibéitis. Tá eolas ar fhreagraí MC ar spreagthaigh phaiteolaíocha ríthábhachtach chun na próisis ghalair seo a thuiscint. Chinneamar roimhe seo go raibh fachtóir cosúil le Krüppel 15 (KLF15), fachtóir trascríobh méar since-saibhrithe duáin, ag teastáil chun iomadú MC a chosc. Sa staidéar seo, rinneamar imscrúdú ar an spriocghéin dhíreach agus ar an mbunmheicníocht trína rialaigh KLF15 iomadú meangial. Ar dtús, rinneamar scagadh ar mhionathraitheoir ubiquitin-bhainteach 1 (SUMO1) mar an sprioc tras-scríobhaithe díreach de KLF15 agus rinneamar an toradh seo a bhailíochtú le measúnachtaí ChlP-PCR agus luciferase. Ina theannta sin, léirigh muid gur chuir ró-bhrú KLF15 nó SUMO1 le cobhsaíocht P53, rud a chuir bac ar thimthriall cille MCanna duánach daonna (HRMCanna) agus dá bhrí sin cuireadh deireadh le iomadú cille. Os a choinne sin, níorbh fhéidir le cniogadh SUMO1 i HRMCanna, fiú iad siúd atá ró-léirithe le KLF15, rátaí iomadaithe HRMC a chosc agus SUMOylation P53 a mhéadú. Mar fhocal scoir, léirigh na torthaí gur tháinig laghdú ar leibhéil SUMOylated P53 i cortices duánach na bhfrancaigh múnla frith-Thy 1 le linn tréimhsí iomadú. Léiríonn na torthaí seo an mheicníocht chriticiúil trína ndírítear KLF15 ar SUMO1 chun iomadú MCanna a idirghabháil.
EOCHAIRÍ: KLF15, iomadú cille Mesangial, P53, SUMO1
1| RÉAMHRÁ
Is ionann cealla meangial (MCanna) agus thart ar aon trian de dhaonra na gceall laistigh den glomerulus. Imríonn siad ról tábhachtach i homeostasis trí chothabháil ailtireacht struchtúrach an glomerulus, a tháirgeadh agus a chothabháil an maitrís mesangial, a rialaíonn an limistéar dromchla scagacháin, agus phagocytosing cealla apoptotic nó coimpléisc imdhíonachta.1 I galair glomerular go leor, mar shampla nephritis proliferative mesangial agus nephropathies diaibéitis. , gortaítear MCanna agus déantar athrú mór ar fheinitíopa, rud a fhágann go mbíonn iomadú mesangial neamhrialaithe agus sil-leagan iomarcach maitrís mesangial. fachtóirí athlastacha a scaoileadh, a eascraíonn i scléaróis glomerular agus fiobróis interstitial; damáiste duánach a dhéanamh níos measa agus dul ar aghaidh chuig galar duánach do-aisiompaithe ag an gcéim deiridh.5-Tá sé ríthábhachtach go mbeadh eolas agat ar fhreagairt an MC ar spreagthaigh phaiteolaíocha chun cóireálacha a fhorbairt chun damáiste duán a laghdú de bharr iomadú neamhghnácha MCanna agus moill ar dhul chun cinn. i galar duánach céim deiridh.
Is grúpa fachtóirí trascríobh DNA-ceangailteach zinc-méar iad na fachtóirí atá cosúil le Krüppel (KLFanna). Léiríonn fianaise mhéadaitheach go bhfuil baint ag an teaghlach seo le próisis cheallacha éagsúla, ar nós difreáil cille, athmhúnlú cairdiach, hematopoiesis, agus cinniúint gascheall.8-10 Tá ocht mball déag sa teaghlach KLF, agus tá KLF15 scaipthe go forleathan ina measc. saduán, briseán, croí,ae, agus matáin chnámharlaigh. Léirigh staidéir roimhe seo go bhfuil KLF15 ina phríomh-rialtóir trascríobh i bpróisis éagsúla fiseolaíocha, lena n-áirítear gluconeogenesis,freagraí imdhíonachta, agus difreáil adipocyte.1-14 Tá sé léirithe ag ár staidéar roimhe seo go bhfuil gá le KLF15 chun iomadú MCanna a chosc.15 Bhí sé mar aidhm ag an staidéar seo an spriocghéine dhíreach agus an mheicníocht iartheachtach a shoiléiriú trína rialaíonn KLF15 iomadú mesangial.
2|ABHAIR AGUS MODHANNA
2.1 |Samhail neifritis frith-Thy1
Leithdháileadh francaigh Wistar fireann (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) a raibh meáchan idir 200 agus 220g orthu go randamach ar na grúpaí rialaithe agus frith-Thy1. Cuireadh gach francach i saoráid cúram ainmhithe faoi thimthriall éadrom/dorcha 12/12 uair an chloig le rochtain saor in aisce ar bhia agus ar uisce. Rinneadh measúnuithe agus idirghabhálacha leasa-bhainteacha le linn an turgnaimh. San iomlán, tá 28 bhfrancach tar éis antashubstaint mhonaclónach frith-Thy1 a instealladh, mar a thuairiscítear roimhe seo, 16 agus cuireadh seacht gcinn le seile (rialuithe). Glanadh glomeruli ó fhíochán cortex duánach trí úsáid a bhaint as modh criathar. Bailíodh séiream le haghaidh leibhéil nítrigine úiré serum agus creatinín a thomhas. Maraíodh francaigh samhail frith-Thy1 ar laethanta O,3,5,7, agus 10, agus baineadh a gcuid glomeruli. Rinneadh na nósanna imeachta leasa ainmhithe agus trialacha go léir i gcomhréir dhlúth leis an Treoir um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Saotharlainne (Comhairle Náisiúnta Taighde na SA, 1996).
2.2 |Cultúr agus cóireáil MC duánach daonna (HRMC).
Ceannaíodh príomh-CBADanna duánacha ó ScienCell (San Diego, CA). Coinníodh HRMCanna ón tríú go dtí an séú sliocht in MC Medium (MsCM; ScienCell) de réir threoracha an déantóra. Le haghaidh turgnaimh, fásadh na cealla go cumar, fás-gabháil i serum laghdaithe (0.5 faoin gcéad FBS) ar feadh 24 uair an chloig, agus roinnte i ngrúpaí turgnamhacha éagsúla.
Le haghaidh cóireála le tiúchain éagsúla glúcóis, gor na cealla i MsCM ina raibh glúcóis 5 mmol/L (glúcós gnáth) nó glúcóis 30 mmol/L (glúcós ard, HG) ar feadh 48 uair ag 37 céim C. Cealla gortha faoi thástáil chomhionann. úsáideadh coinníollacha le glúcóis 5 mmol/L agus mannitol 25 mmol/L in ionad glúcóis 30 mmol/L mar rialuithe osmotic. Le haghaidh cóireála le PDGF-BB, goraíodh na cealla i MsCM ina raibh 20ng/ml PDGF-BB (Córais T&F, Minneapolis, MN) ar feadh 48 uair ag 37 céim C.
2.3|Imdhíon-cheimic (IHC)
Roinneadh fíochán duánach leabaithe pairifín ag tiús 4 μm, agus dathaíodh na hailt le haghaidh IHC. Bhí gor na slisní le 3 faoin gcéad H, O, chun bac a chur ar peroxidase endogenous tar éis deparaffinization. Tar éis aisghabháil agus blocáil antaigin, goradh na slisní le frith-KLF15 (ab81604, Abcam), modhnóir frith-bheag ubiquitin 1 (SUMO1, ab32058, Abcam), agus frith-PCNA (ab92552, Abcam) ag 4 céim C. Ansin goradh na slices le antasubstaint tánaisteach lipéadaithe le horseradish peroxidase ag 37 céim ar feadh 30 nóiméad, agus breathnaíodh an t-imoibriú inmunhistochemical de réir threoracha an mhonaróra le 3,3'-diaminobenzidine (DAB, ORIGINE, CN) mar an gníomhaire crómogenic. . Ina dhiaidh sin, rinneadh na sleamhnáin a fhrithdhaite le hematoxylin-eosin agus íomháíodh iad le micreascóp solais (Olympus). Rinneadh measúnú ar staining immunohistochemical le bogearraí Image J de réir luach meándlúis optúla (AOD).
2.4 |Feascadh imdhíon-chromaitín (ChlP) le seicheamh comhthreomhar (ChIP-Seq)
Rinneadh ChIP ag baint úsáide as Kit IP Chromatin Simplí ChlP Plus (Coirníní Maighnéadacha; Teicneolaíocht Comharthaíochta Cille) de réir phrótacal an mhonaróra. Go hachomair, rinneadh ró-léiriú ar HRMCanna le KLF15 nó scramble ag dlús cille de 2.0×10³cells/mL agus trasnasctha le formaildéad 1.7 faoin gcéad i PBS ar feadh 5 nóiméad ag teocht an tseomra (RT ). Bhí lysed cealla tras-nasctha a fháil ar an codán núicléach, a sonicated i 1 × Maolán sliseanna. Soiléiríodh na lysates trí lártheifneoiriú ag 9300×g ar feadh 10 nóiméad ag 4 chéim . Goradh samplaí crómatin le ceachtar antashubstaint frith-KLF15 (ab81604, Abcam) nó antasubstaint frith-LGG (rialú cúlra) thar oíche ag 4 céim . Gabhadh na coimpléisc a bhí ceangailte le hantasubstaintí trí gor le coirníní maighnéadacha próitéin G. Ullmhaíodh leabharlanna ChlP-Seq le haghaidh seicheamhú ag baint úsáide as Trealamh Ullmhúcháin Samplach TruSeq ChlP (Illumina). Cuireadh na leabharlanna faoi sheicheamhú comhthreomhar le seicheamhóir HiSeq2500(Illumina) ag baint úsáide as an bprótacal fad seicheamhaithe 50 bp aon-deireadh. Tiontaíodh sonraí amh maidir le seicheamhú den chéad ghlúin eile (NGS) go comhaid FASTQ ag baint úsáide as bogearraí CASAVA (leagan 1.8.2), agus rinneadh gach tacar sonraí a ailíniú leis an genome tagartha daonna (UCSC hg19) ag baint úsáide as an Burrows-Wheeler Aligner (leagan 0.7.12). ).17 Rinneadh buaicghlao ChIP-Seq ag baint úsáide as an gclár MACS2 (leagan 2.0.1) leis na paraiméadair réamhshocraithe ach luach aq de 0.05, leis na sonraí ionchuir le haghaidh dealú.18 Buaic-chomparáid leis an rialú scrofa (na cealla tuismitheora). agus rinneadh samplaí overexpression le Diffbind, pacáiste R, ag baint úsáide as an algartam DeSeq2, agus measadh go raibh ráta fionnachtana bréagach de 0.1 suntasacht. bogearraí ROSE.2 céim Rinneadh na buaiceanna ChIP-Seq a anótáil leis an bpacáiste R ChlPpeakAnno, agus sainmhíníodh tionscnóirí mar réigiúin saibhrithe KLF laistigh de 1kb den suíomh tosaithe trascríobh.21 An ghéin leis an suíomh tosaithe trascríobh is gaire don c sainmhíníodh iontráil gach forfheabhsaithe mar spriocghéine an fhorfheabhsaithe sin.
2.5|PCR fíor-ama cainníochtúil ChIP (ChlP-PCR)
Bhí an nós imeachta ChlP-PCR cosúil leis an nós imeachta a gcuirtear síos air thuas. Baineadh úsáid as chip DNA ó chealla frith-KLF15 cóireáilte antasubstainte chun an comhlachas idir KLF15 agus SUMO1 a bhrath. Bhí DNA ó chealla frith-LGG cóireáilte mar an rialú. Baineadh úsáid as DNA íonaithe chun anailís a dhéanamh ar réigiún proximal tionscnóra SUMO1 trí PCR fíor-ama ar ABI PRISM 7600 ag baint úsáide as SYBR GreenER qPCR Supermix. Ba iad seo a leanas na primers SUMO1: ar aghaidh: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3'; droim ar ais:5'-TCGGTTAACCAGCACCCTTG-3'. Ríomhadh an t-aimpliú coibhneasta ar sheicheamh tionscnóra na géine ag baint úsáide as {{18} }}Modh ActT, agus rinneadh normalú i gcoinne caolú 1:100 ar an DNA ionchuir.
2.6|Lipéadú cille agus lipéadú cobhsaí iseatóp de réir anailís aimínaigéid i gcultúr na gceall (SILAC)
Síolaíodh cealla ag comhluadar 15 faoin gcéad sa mheán iomlán cuí (do HRMCanna: MsCM). Tá cur síos déanta ar na nósanna imeachta maidir le lipéadú agus SILAC i dtaighde roimhe seo.22 Go hachomair, tar éis iad a la-belled le lísín éadrom (13C, lipéadaithe) nó trom (15N, lipéadaithe) agus éadrom (1c-lipéadaithe) nó trom (lipéadaithe 15N). ) arginine, aistríodh cealla le ró-eisbhrú KLF15 plasmid nó plasmid rialaithe. Tar éis cóireála, rinneadh na cealla a trypsinized agus a chomhaireamh chun millíní cille de 2 × 10'chealla/riocht a fháil, agus cuireadh na cealla faoi réir anailíse SILAC ag baint úsáide as mais-speictriméadracht. Rinneadh na millíní cille troma agus éadroma a líseáil i maolán rada-imdhíonachta sníofa le coscairí próitéáis agus fosfatase ag baint úsáide as pléascanna gearra 15-dara sonication. Rinneadh na lysates a lártheifneoiriú ag 14,000 rpm ar feadh 20 nóiméad. Tar éis lártheifneoraithe, bailíodh na súithíní, agus tomhaiseadh an tiúchan próitéine ag baint úsáide as anailísí aimínaigéad Hitachi L-8900. Ullmhaíodh slánchoda de 200ug próitéine ó na samplaí, comhcheangailte, agus deascadh ag baint úsáide as modh deascadh meatánól-clóraform. Athchóiríodh na millíní próitéine i 8 mol/L úiré/0.4 mol/L maolán décharbónáite amóiniam, laghdaíodh iad le 45 mmol/L DTT ar feadh 30 nóiméad ag 37 céim C, ailcileáilte le hiodoacetamide 100 mmol/L ar feadh 30 nóiméad sa dorchadas ag RT. agus díleáite le Lys-C protease (1:20 w/w) thar oíche (~16 uair an chloig) ag 37 céim . Caolaíodh an díolaim Lys-C a thuilleadh agus díleádh é le trypsin (1:20 w/w) ar feadh 8 n-uaire ag 37 céim . Díshalannadh an díolama le colún MacroSpin (The Nest Group, Inc) agus triomaíodh é i dtiúchantóir SpeedVac. Saibhríodh na peiptídí díshaillte ansin le fosfapeiptíde ag baint úsáide as roisín dé-ocsaíde tíotáiniam leabaithe i 10 leid μL （Glygen Corp）. Forchoimeádadh na flowthroughs, agus bhí na peptides saibhrithe eluted ag baint úsáide as cóimheas 1:33 hiodrocsaíd amóiniam leis an uisce. Athchóiríodh na codáin sruth-thriomaithe agus elution SpeedVac-triomaithe i maolán A (0.1 faoin gcéad formicacid in uisce) agus cuireadh faoi réir anailíse mais-speictriméadrachta crómatagrafaíochta-tandem (LC/MS).
2.7| Measúnacht tuairisceora dé-luciferase
Fuarthas tionscnóir de chineál fiáin SUMO1(NM_001005781) daonna le 1604bp (-1474nt- plus 129nt) lena n-áirítear an suíomh ceangailteach féideartha ({7}}nt--199nt) trí PCR a úsáid a mhéadú agus a fhochlónáil isteach i pGL3-bunúsach veicteoir(Cat.# E1751 Promega) le suíomhanna einsím srianta SacI agus Bgl ll, darb ainm pGL3-WT-SU. Chomh maith leis sin, rinneadh an suíomh ceangailteach-CACCCA-laistigh de thionscnóir SUMO1 a mhionathrú go -CGTTTG-, darb ainm pGL3-MT-SU. Bhí an cDNA fad iomlán KLF15 daonna a fuarthas ó GeneCopoeia i Plasmid (pReceiver-M94). Aistríodh an ró-eisbhrú KLF15 plasmid agus pGL3-WT-SU nó pGL3-MT-SU isteach i gcealla HEK293T le himoibrí Lipofectamine 2000. Rinneadh na samplaí a chomhaistriú ansin le plasmid pRL-TK(Cat #E2241, Promega) ag léiriú Renilla luciferase. Tar éis 24 uair an chloig de aistriú, bhí na cealla lysed. Scrúdaíodh leibhéil ghníomhaíochta Firefly agus Renilla luciferase ag baint úsáide as córas measúnaithe tuairisceora dé-luciferase (Biotek).
2.8 |ullmhú RNA, sintéis cDNA, agus anailís RT-qPCR
Baineadh úsáid as TRlzol (Invitrogen) ar an RNA iomlán agus rinneadh é a íonú ag baint úsáide as Kit RNeasy Mini (Qiagen) de réir threoracha an déantóra. Gineadh cDNA ag baint úsáide as trealamh sintéise cDNA céad-snáithe ProtoScript (New England Biolabs. Rinneadh PCR cainníochtúil ag baint úsáide as Power SYBR Green Master Mix(Life Technologies).Tá na seichimh oligonucleotide a úsáidtear le haghaidh RT-qPCR ar fáil i dTábla 1).
2.9 |Measúnú ar iomadú ceall
Cuireadh SUMO1 cDNA(NM_003352.8) daonna fad iomlán a fuarthas ó OriGene Technologies (Beijing, an tSín) isteach sa pCMV6-Iontráil plasmid (CAT#: RC200633). Rinneadh anailís ar iomadú cille le Kit Íomháú Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555(Invitrogen) de réir threoracha an déantóra. Go hachomair, goraíodh cealla i 6-pláta tobair saothraithe agus aistríodh iad le plasmid rialaithe KLF15 (Scramble, an grúpa VECTOR), plasmid ró-eisbhrú KLF15 (mar an gcéanna thuas, an grúpa KLF15), veicteoir slonn do SUMO1 (an grúpa VECTOR), plasmid ró-eisbhrú SUMO1 (an grúpa SUMO1), siRNA rialaithe diúltach (an grúpa SI CON), SUMO1 siRNA (grúpa SI SUMO1), plasmid ró-eisbhrú KLF15 le SUMO1 siRNA (an grúpa KLF15 móide SI SUMO1) nó ró-eisbhrú KLF15 plasmid le siRNA rialaithe diúltach (an KLF15 móide SICONgroup) ar feadh 24 uair an chloig. Ansin, cuireadh meán in ionad an mheáin arna fhorlíonadh le 20 ng/ml PDGF-BB ar feadh 48 uair an chloig, agus cuireadh tiúchan EdU optamaithe de 10 μmol/L leis thart ar 12 uair an chloig roimh spreagadh PDGF-BB. Tar éis cóireála, socraíodh na cealla le 4 faoin gcéad formaildéad, tréscaoilteach le 0.5 faoin gcéad Triton X-100, nite le 3 faoin gcéad BSA i PBS, gortha le cocktail athghníomhaithe Click-iT⑧ ar feadh 30 nóiméad ag RT, agus gortha le Maolán gníomhaíochta DAPire ar feadh 10 nóiméad ag RT agus é á chosaint ó sholas. Breathnaíodh na cealla le micreascópacht fhluaraiseachta (Olympus, Tóiceo, an tSeapáin). Ansin dhaiteadh núicléis na gceall iomadú dearg.
2. 10|Anailís blot an Iarthair agus imdhíon-réamhshamhlú (IP)
Rinneadh na cealla a liostáil trí úsáid a bhaint as maolán RIPA (Thermo Scientific), agus rinneadh an phróitéin iomlán sna sáithíní a chainníochtú trí úsáid a bhaint as trealamh measúnaithe próitéin BCA (Thermo Scientific). Rinneadh anailís blot an Iarthair agus IP mar a thuairiscítear roimhe seo.23.24 Úsáideadh antashubstaint frith-KLF15 (AV32587, Merk), frith-SUMO1antibody (S8070,Merk) agus frith- -actin(A5316,Sigma) le haghaidh anailís blot an Iarthair. Baineadh úsáid as antasubstaint frith-P53 (P5813, Merk) le haghaidh anailíse IP.
2.11 |Anailís bhithfhaisnéisíochta
Léirigh iarrthóirí ó ChIP-Seq nó SILAC saibhriú faoi dhó ar a laghad ar na rialuithe. Rinneadh anailís Géine Ontology (GO) leis an mBunachar Sonraí le haghaidh Anótála, Amharcléiriú, agus Fionnachtain Chomhtháite (DAVID; leagan 6.7). Coigeartaíodh P-luachanna do thástáil hipitéis iolrach ag baint úsáide as modh Benjamini-Hochberg. Catagóirí atá saibhrithe go suntasach i bhfo-onteolaíocht na feidhme agus conairí KEGG le P-luach coigeartaithe<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">
2.12|Anailís staidrimh
Rinneadh na turgnaimh go léir i dtrí chóip, agus cuirtear na torthaí in iúl mar mhodh ± SEs. Rinneadh anailís ar na sonraí go léir trí úsáid a bhaint as bogearraí SPSS (ver.20.0; SPSS Inc) agus cuireadh iad i gcomparáid le t-tástáil an Mhic Léinn nó ANOVA aontreo. A P-luach<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">
