Coscann Calpastatin Gortú Podocyte trí mheán Angiotensin II trí Chothabháil Uathphagy
Mar 17, 2022
le haghaidh tuilleadh eolais:ali.ma@wecistanche.com
Imane Bensaada1,3, Blaise Robin1,3, Joe¨lle Perez2, Yann Salemkour1, Anna Chipont1, Camus Mara1,Mathilde Lemoine1, Lea Guyonnet1, Hele`ne Lazareth1, Emmanuel Letavernier2, Carole He´nique1, Pierre-Louis Tharaux1agus Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, Páras, an Fhrainc; agus2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Páras, An Fhrainc
Tá luach láidir thuarthach na proteinuria i bpaitéisí glomerular ainsealach bunaithe go daingean chomh maith le ról pataigineach angiotensin II chun dul chun cinn galar glomerular a chur chun cinn le bacainn scagacháin glomerular athraithe, gortú podocyte agus scarring glomeruli. Anseo fuaireamar amach go raibh bac ar Hipirtheannas spreagtha angiotensin II ainsealachuathphaigíefflux i glomeruli luch. Mar thoradh ar scriosadh Atg5 (géine a ionchódaíonn próitéin a raibh baint ag uathphagaíocht léi) go sonrach sa podocyte, tharla podocytopathy luathaithe dangio tensin II-spreagtha, albaiminiúir mhéadaithe, agus glomerulosclerosis. Léiríonn sé seo gur príomh-mheicníocht cosanta é autophagy sa podocyte sa riocht seo. Cosc ar ghníomhaíocht calpain spreagtha Angiotensin-II i podocytesuathphaigíeisphléacs. Podocytes ó lucha le léiriú transgenic ar an inhibitor calpain endogenouscaipitilstatinar taispeáint podocyte níos airdeuathphaigíag bunlíne a bhí frithsheasmhach do chosc ar angiotensin II-spleách. Chomh maith leis sin, marthanach autophagy lecaipitilstatindamáiste teoranta podocyte agus albaminuria. Tugann na torthaí seo le tuiscint go bhfuil éifeachtaí pataigineacha ag Hipirtheannas ar an struchtúr agus ar an bhfeidhm glomerular, go páirteach trí ghníomhachtú caipitilin as a dtagann imshuí ar uathphagaíocht podocyte. Nochtann na torthaí seo meicníocht bhunaidh a chuireann bac ar Hipirtheannas trí mheán angiotensin II an t-uathphagy trí earcaíocht chailciam-spreagtha ar calpain le hiarmhairtí pataigineacha i gcás éagothroime.caipitilstatinghníomhaíocht. Dá bhrí sin, cosc a chur ar laghdú caipitilin-mediated iuathphaigíd’fhéadfadh gur straitéis theiripeach nua a bhfuil gealladh fúthu do nephropathies a bhaineann le gníomhaíocht ard córais renin-angiotensin.
EOCHAIRFHOCAL: angiotensin II;uathphaigí; caipitilstatin; Hipirtheannas; podocyte
Ráiteas Aistritheach
Mar gheall ar an ról ríthábhachtach atá ag autophagy i bhforbairt anduángalair, modhnú cógaseolaíochta deuathphaigía d'fhéadfadh a bheith ina straitéis geallta chun go leor a chosc agus a chóireáilduántinneas. Ag an am céanna, fuarthas amach go n-imríonn róghníomhaíocht ar ghníomhaíocht chaipitil i podocytes drochthionchar ar fheidhm podocyte ach níor aithníodh a meicníochtaí díobhálach gníomhaíochta. Anseo, cuirimid fianaise ar fáil go nascann calpain gníomh díobhálach angiotensin II leis an imshuí díobhálachuathphaigíi podocytes agus molann siad go bhféadfadh cosc ar chalpitin a bheith ina sprioc teiripeach dóchasach do ghalair podocyte go páirteach trí chothabháil uathphagaíochta podocyte.
Cliceáil chunCistanche deserticola ma le haghaidh galar duáin ainsealach
Tá Hipirtheannas sa dara háit amháin maidir le diaibéiteas mar phríomhchúis le hainsealaí forásachaduánIs fachtóir riosca neamhspleách é galar 1–3 agus fiú ardú measartha i mbrú fola le haghaidh galar duáin deiridh.4 Tá méadú ag teacht ar líon na staidéar turgnamhach tar éis béim a chur ar thábhacht na podocytes i bhforbairtduángortú. Tagann caillteanas forásach podocytes agus athruithe microvascular le feiceáil go luath le meath feidhme na duáin i nephropathy hipirtheannas turgnamhach.5 In othair, léiríodh go raibh eisfhearadh urinary de podocytes inmharthana ina marcóir íogair agus sonrach le haghaidh preeclampsia,6,7 agus bhí othair le nephrosclerosis suntasach. dlús níos ísle podocytes glomerular ná mar a rinneduándeontóirí.8,9 Ina theannta sin, tá ról pataigineach angiotensin II (AngII) chun dul chun cinn an ghalair glomerular a chur chun cinn bunaithe go maith, ní hamháin i gcoinníollacha hipirtheannas ach freisin i roinnt galar glomerular.10–21
Is é an toradh a bhíonn ar Hipirtheannas glomerular ná síneadh ribeach glomerular, damáiste endothelial, agus scagachán próitéine glomerular ardaithe is cúis le titim glomerular agus glomerulosclerosis. Déanann sé gníomh díreach freisin ar struchtúir glomerular, rud a fhágann go bhfuil freagraí rialála comharthaíochta dírithe ar chúiteamh. Cothaíonn córas gníomhachtaithe sistéamach agus áitiúil renin-angiotensin-aldosterone (RAAS) hipearpláis mesangial agus sintéis fachtóirí tréscaoilteachta soithíoch. Ag an am céanna, taispeánann podocytes comharthaíocht cailciam22,23 agus athraíonn a gcruth ar receptor cineál 1 AngII (AT1) – spreagadh spleách.24–28 Éiríonn na meicníochtaí oiriúnaitheacha seo maladaptive san fhadtéarma, rud a fhágann glomerulosclerosis ar deireadh. Déanann AT1 idirghabháil ar rannpháirtíocht shuntasach RAAS maidir le brú fola agus hoiméastáis salainn agus uisce. Úsáidtear coscairí einsímí a athraíonn angiotensin agus bacóirí AT1 go cliniciúil chun Hipirtheannas agus cliseadh croí in othair a chóireáil. Suimiúil go leor, léiríonn an dá blockers freisin éifeacht cosanta arduánfeidhm.
Léiríodh go raibh uathphagaíocht riachtanach chun hoiméastáis cheallacha a chothabháil, go háirithe i gcealla iarbhítíocha29,30 agus go háirithe i podocytes.31–34ÚtphagyIs córas díghrádaithe é a bhaineann le líosómach é do phróitéiní cíteaplasmacha fadsaoil agus orgánailíne mífheidhmiúla35,36 agus baineann sé le forlámhú próitéiní agus orgánaill in uathphagosomes. Tá foirmiú uathphagosomes ag brath ar ionduchtú roinnt géinte lena n-áirítear Map1lc3a/b, Beclin 1, agus Clibeanna. 37 Tá fianaise ag dul i méid go bhfuil dírialú an chosáin uathphagaigh bainteach le pataigineas aosú na duáin agus go leor eile.duángalair mar ghéarghortú duán, galar duán ilchisteach, aosú, agus nephropathy diaibéitis.31,32,38–41
Rialachán nauathphaigíi podocytes, fiseolaíocha agus, thar aon rud eile, i gcomhthéacs paiteolaíocha, nach bhfuil ar eolas go maith. Léirigh muid le déanaí go bhfuil autophagy podocyte neamhspleách ar an sprioc mheicniúil de rialáil rapamycin (mTOR) i gcoinníollacha fiseolaíocha, rud a fhágann gur eisceacht é an cineál cille seo.42 spreagann gníomhachtú AT1 sintéis próitéin agus láimhdeachas próitéine i gcealla. Mar sin, rinneamar réasúnaíocht go bhféadfadh tionchar a bheith ag gníomhachtú an RAAS ar spreagadh láimhdeachais próitéine agus ar phróitostasis.
Sa staidéar reatha, dhíríomar ar ról an AngIIsignaling i podocyteuathphaigírialachán. D’aithníomar na caipéisí próitéisí gníomhachtaithe cailciam a dhéanann idirghabháil ar éifeacht blocála ainsealach AngII ar phodocyteuathphaigí. Thairis sin, fuair muid amach go bhfuil an inhibitor calpain endogenouscaipitilstatinbhí sé in ann cosc a chur ar chosc ar chosc ar autophagy ag brath ar AngII agus gortú podocyte le linn Hipirtheannas.
Nochtann na torthaí seo meicníocht bhunaidh a chuireann cosc ar Hipirtheannas trí mheán AngIIuathphaigítrí earcú caipitilin de bharr cailciam le hiarmhairtí pataigineacha i gcás éagothroime de bharr gníomhaíochta caipitilstatin.
MODHANNA
Ainmhithe
CalpastatinChuir an Dr. E. Letavernier lucha trasgenacha (CSTTg) ar fáil go cineálta.43 Gineadh lucha a raibh cur isteach sonrach podocyte acu ar an ngéin Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) mar a cuireadh síos cheana31 trí lucha Nphs2.cre44 a thrasnú le Atg5lox/lox lucha45 ar chúlra C57BL6/J. Nphs2.cre Baineadh úsáid as lucha Atg5lox/lox agus fireannaigh bruscair rialaithe, idir 10 agus 12 sheachtain d'aois, sa staidéar seo. Spreag insileadh sc AngII (Sigma-Aldrich, A9525) an tsamhail hipirtheannas ag dáileog de 1 mg/kg/nóim ar feadh 4 go 6 seachtaine trí mhionphumpaí osmotic (Alzet Corp, samhail 2006). Ionchlannaíodh caidéil sc ar an gcúl idir na lanna gualainn agus na cromáin. Fuair lucha forlíonadh salainn (3 faoin gcéad NaCl) i mbia. Úsáideadh lucha Atg5lox/lox (cineál fiáin [WT]) mar rialuithe i ngach staidéar. Le haghaidh salann aicéatáit deoxycorticosterone (DOCA) leis an múnla laghdaithe nephron, chuaigh lucha fireann fásta faoi nephrectomy chlé aontaobhach. Dhá sheachtain tar éis nephrectomy, fuair siad millíní DOC leis an 21-scaoileadh lae (Taighde Nuálaíoch) ionchlannú sc Cuireadh an dara millín ionchlannú 3 seachtaine tar éis an chéad ionchlannú. Fuair gach lucha 0.9 faoin gcéad NaCl in uisce óil ad libitum agus maraíodh iad tar éis 6 seachtaine de riarachán DOC.46 Rinneadh turgnaimh de réir threoirlínte tréidliachta na Fraince agus iad siúd a cheap an Comhphobal Eorpach le haghaidh úsáide turgnamhacha ainmhithe (L358-86/ 609EEC) agus d’fhaomh Aireacht Taighde na Fraince agus coiste eitice taighde na hollscoile áitiúil (APAFIS-7646 agus -22373) iad.
Turgnamh cultúir podocyte bunscoile
Saothraíodh podocytes príomhúla difreáilte mar a thuairiscítear roimhe seo.47,48 Go hachomair, rinneadh an cortex duánach úr-aonraithe a mheascadh agus a dhíleá le collagenase I (Gibco, 17100-017) in Institiúid Cuimhneacháin Pháirc Roswell 1640 (Life Technologies, 61870-044). Ansin cuireadh fíocháin trí strainers cille 70 mm agus 40 mm (BD Falcon, 352340 agus 352350). Baineadh Glomeruli, a chloíonn leis an strainer cille 40 mm, le saline maolánach fosfáite (PBS; Life Technologies, 10010023) þ 0.5 faoin gcéad de shéiream albaimin bó-ainmhithe (Eurobio, HALALB07-65) a instealladh faoi bhrú agus ansin nite faoi dhó iad. i PBS. Plátáladh glomeruli úrscoite i 6-miasa tobair in Institiúid Cuimhneacháin Pháirc Roswell 1640 (Gibco, 61870036) agus forlíonta le 10 faoin gcéad de shéiream lao féatais agus 1 faoin gcéad peinicillin/streiptimícin (Life Technologies, 15140122) chun ligean do phodicítí imeacht ó glomeruli agus fás. Fíoraíodh saibhriú podocyte le hanailís blot an Iarthair mar a thuairiscítear roimhe seo31,48,49 (Fíor Forlíontach S1). Saothraíodh podocytes in éagmais nó láithreacht bafilomycin A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) ar feadh 4 huaire. Maidir le turgnaimh imdhíonfhluaraiseachta, cuireadh podocytes príomhúla ar 4 lipéad miasa (Dutcher, 055071). Socraíodh podocytes ansin i paraformaildéad 4 faoin gcéad ar feadh 10 nóiméad agus próiseáladh iad le haghaidh imdhíonfluaraiseacht.
Measúnacht gníomhaíochta Calpain
Cinneadh gníomhaíocht caipitilin intracellular i podocytes príomhúla, mar a thuairiscítear roimhe seo.50–52 Saothraíodh 100,{3}} cill i 24-miasa saothraithe tobair fíocháin in Institiúid Cuimhneacháin Pháirc Roswell 1640 agus forlíonta le 10 faoin gcéad féatais. séiream lao agus 1 faoin gcéad peinicillin/streiptimícin. Tar éis na tréimhse cultúir léirithe, cuireadh tuaslagán décharbónáite Krebs-Ringer HEPES (KRH) (pH 7.4) ina bhfuil 4 mM CaCl2, le nó gan 10 mM inhibitor calpain-1 in ionad an mheán, agus gor é ar feadh 10 nóiméad roimh an cur leis. de 50 mM foshraith caipitilin N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-aimín-4-meitil coumarin (Sigma-Aldrich, S6510). Tar éis 90-tréimhse gorlainne de 90-nóiméad, socraíodh gníomhaíocht calpain mar an difríocht idir fluaraiseacht FL (arna thomhas ag excitation 360 nm agus astú 430 nm) le agus gan coscaire calpain-1.
blot an iarthair
Scratáladh podocytes príomhúla le 80 ml de mhaolán measúnachta rada-imdhíon-réamhshamhlaithe ina raibh fosfatase agus coscaire prótease. Tomhaiseadh tiúchan na bpróitéine leis an BCA Protein Assay Kit (Merck Bithcheimic, 71285). Rinneadh leictreafóiréis fiche microgram de phróitéiní ar glóthach réamhtheilgthe Criterion XT (12 faoin gcéad Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Aistríodh próitéiní chuig membrane défhluairíd pholaivinilideine (Thermo Fischer Scientific, 88518). Tar éis dó bac a chur ar bhainne 5 faoin gcéad i Tris Buffer Saline 0.1 faoin gcéad Tween (TBS-T), goradh na seicní le frith-LC3 polaclónach coinín (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), frith-ATG5 polyclonal coinín (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), frith-Sequestosome polaclónach muice guine 1 (SQSTM1)/P62 (1:10,000, PROGEN, GP62), coinín polaclónach frith-calpain 1 fearann IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), coinín polyclonal frith-calpain 2 aimín críochfort fearann I (1:1000, Abcam, ab39165), luch monaclónach IgG1 frith–calpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biteicneolaíocht, sc-32325), coinín frithphodocin (1:1000, Abcam, ab50339), frith-neifrín muc ghuine (1:500, PROGEN, GP-N2), agus antashubstaint fhrith-thiúbúin mhonaclónach francach (1:5000, Abcam,ab6160). Tar éis níocháin, goraíodh na seicní le antashubstaint a bhí nasctha le sár-raidis sárocsaídáise (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Braitheadh sainchomharthaí trí úsáid a bhaint as an ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) ar ghléas LAS 4000 (Fuji). Baineadh úsáid as anailís dlúisiméadrachta le bogearraí ImageJ (Institiúidí Náisiúnta Sláinte) le haghaidh cainníochtú.
Tomhais brú fola agus measúnuithe fiseolaíocha
Taifeadadh brú fola systolic lucha ag baint úsáide as an modh eireaball cuff (Visitech Systems Inc., BP-2000). Glacadh deich dtomhas ó gach luch, agus ansin socraíodh meánluach. Rinneadh brú fola systolic a thomhas ag bunlíne (12 seachtaine d'aois) agus ansin go seachtainiúil go dtí deireadh na tréimhse cóireála. Cuireadh na lucha go léir i gcliabháin mheitibileach le rochtain saor in aisce ar uisce le haghaidh bailiúchán fuail 6-uair an chloig. Rinneadh anailís speictrophotiméadrach ar thiúchan creatinine urinary agus plasma úiré trí úsáid a bhaint as modh dathmhéadrach (Olympus, AU400). Tomhaiseadh eisfhearadh albaimin urinary ag baint úsáide as measúnacht imdhíonta ar leith atá nasctha le heinsím chun albaimin a chinneadh go cainníochtúil i bhfual luiche (Crystal Chem, 80630).
Histeolaíocht
Duáina lománaíodh agus a socraíodh i 4 faoin gcéad PBS-buffered formalin. Rinne Masson'strichrome codanna leabaithe pairifín (3-mm tiubh) a dhathú chun deilbhíocht na nduán a mheas. Rinneadh neamhghnáchaíochtaí sna duáin a ghrádú ar bhonn láithreacht agus déine neamhghnáchaíochtaí comhpháirte, lena n-áirítear glomerulosclerosis, leathnú mesangial, atrophy tubular nó casts, agus fiobróis. Rinneadh measúnú ar chomhréir na glomeruli sclerotic trí scrúdú dall ar a laghad 50glomeruli in aghaidh anduánalt.
Immunofluorescence staining na hailt duáin agus podocytes bunscoile
Cuireadh bac ar phodicítí príomhúla seasta in TBS-T 3 faoin gcéad albaimin séiream buaibheach agus gor iad thar oíche ag 4 céim le muc ghuine frith-chomhlachtaí príomhúla frith-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) agus frith choinín. -green FL próitéin fluaraiseacha (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Tar éis sruthlú TBS-T, antashubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha fluairafóire FL asal frith-ghuine IgG AF594-antashubstaint chomhchuingeach (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) agus antashubstaint chomhchuingeach frith-choinín IgG AF488-( Cuireadh Invitrogen, A21206) i bhfeidhm. Tógadh íomhánna ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseacha Zeiss 2 troigh, AxioCam HRccamera, agus bogearraí Axiovision 4.3.
Le haghaidh paraifín-leabaithe go foirmiúilin-seasta (FFPE)duáin, dípharaifíníodh codanna (3 mm) agus hiodráitíodh iad agus rinneadh aisghabháil antaigin i maolán citrate téite (pH 6). Ansin rinneadh na hailt a thréscaoilteacht le Triton 0.1 faoin gcéad (Euromedex) agus cuireadh bac orthu in TBS-T 3 faoin gcéad de shéiream albaimin buaibheach roimh gor antashubstainte thar oíche ag 4 C. D’úsáideamar frith-neifrín gabhar (1:100, PROGEN, GP -N2), muc ghuine frith-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), coinín frith-GFP(1:1000, Abcam, ab290), frith-Podocalyxin gabhar (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556), agus antasubstaint frith-Wilm’s Tumor 1 (WT1; 1:100, Abcam, ab192). Ba iad antasubstaintí tánaisteacha ná antasubstaintí comhchuingeacha Alexa488- agus Alexa 568 ó Invitrogen. Bhí dath gorm ar núiclé ag baint úsáide as Hoechst. Gléasadh na sleamhnáin ag baint úsáide as meán gléasta fluaraiseacha (Dako, S3023). Tógadh fótamicrographs le fótamicreascóp Zeiss Axiophot agus bogearraí Axiovision. Baineadh úsáid as cainníochtaí leathtomatic ar Fidsí chun limistéir neifrín-dearfach agus PODXLþ in aghaidh na coda glomerular a chainníochtú ar 30 glomeruli ar a laghad in aghaidh na luiche. Áiríodh podocytenumber mar líon na núicléis WT1þ in aghaidh na coda glomerular ar 30 glomeruli ar a laghad in aghaidh an lucha.
Nós imeachta maidir le micreascópacht leictreon a tharchur
Socraíodh píosaí beaga den cortex duánach (1 mm3) i ngrád glutaraldehyde 3 faoin gcéad (Eolaíochtaí Micreascóip Leictreon) ar feadh 1 go 3 0 lá agus nite faoi thrí i PBS. Iarsocraíodh samplaí in 1 faoin gcéad osmium tetroxide 0.1 M (Eolaíocht Mhicreascópachta Leictreon) i 0.1 M PBS (pH 7.4) agus nite in uisce. Díhiodráitíodh samplaí i ngráid alcóil agus 100 faoin gcéad ocsaíd próipiléine (Eolaíocht Mhicreascópachta Leictreon). Rinneadh insíothlú roisín mar seo a leanas: meascadh Epikote 812 agus ocsaíd próipiléine i gcóimheas 1:1 ar feadh 30 nóiméad agus ansin meascán Epikote 812 agus ocsaíd próipiléine i gcóimheas 1:2 le haghaidh teocht an tseomra thar oíche. Bhí samplaí leabaithe i capsúil geilitín 4 mm i 100 faoin gcéad Epikote 812 agus polaiméirithe in oigheann téite go 60 C. Gearradh ailt ultrathin le ultramicrotome UFC7 (Leica MicrosystemsGmbH) agus cuireadh síos ar mhogalra Gilder Grids 200 (Eolaíocht Mhicreascópachta Leictreach). Bhí siad frithdhaite le haicéatáit úráinile 7 faoin gcéad (Dáilte LFG) agus chiotráite luaidhe Reynold (LFG). Scrúdaíodh samplaí sa mhicreascóp leictreon tarchurtha JEM1011 (JEOL) le ceamara Orius SC1000 CCD (Gatan), a oibrítear le bogearraí Digital Micrograph (Gatan) lena fháil.
Galar Cistanche-duáin
Eagar imoibrithe slabhra cainníochtúil polaiméaráise
Rinneadh glomeruli úrscoite a reoite in imoibrí QIAzol Lysis (Qiagen) ag -80 céim . Próiseáladh eastóscadh RNA iomlán ag baint úsáide as an modh feanól-bhunaithe de réir mholtaí an mhonaróra. Rinneadh cDNA a shintéisiú ag baint úsáide as an RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401), agus rinneadh imoibriú slabhra polaiméireáis fíor-ama (PCR) ag baint úsáide as Array PCR Custom RT2 Profiler (Qiagen, CLAM36771C) le RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Ritheadh na plátaí PCR cainníochtúla ar thimthriallóir StepOnePlus Bithchórais Fheidhmeach. Tá rialú cáilíochta i ngach eagar le haghaidh éifeachtúlacht trascríobh droim ar ais agus éilliú DNA géanóm. Rinneadh anailís chainníochtúil PCR trí úsáid a bhaint as modh 2-DDCT le cabhair ón Ionad Anailíse Sonraí GeneGlobe (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) agus cuireadh in iúl é mar an t-athrú huaire Log2 i slonn géine.
In anailís próitéamaíche silico
In silico rinneadh réamh-mheastachán ar shuíomh scoilte caipitilin le DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), agus CaMPDB (http:// calpain.org/) uirlisí ar líne. Fuarthas seicheamh aimínaigéad próitéin luch ó Uniprot (https://www.uniprot.org). Atosaítear na torthaí i dTáblaí Forlíontacha S1 agus S2.
Anailísí staidrimh
Léiríonn gach graif luachanna aonair agus meán ±SEM. Rinneadh anailís staitistiúil ag baint úsáide as bogearraí GraphPad Prism, leagan 9. Rinneadh comparáid idir an 2 ghrúpa ag baint úsáide as t-tástáil parametricStudent nuair a d’éirigh le samplaí sna tástálacha normáltachta Anderson-Darling agusD’Agostino agus tástáil F le haghaidh comhionannais athraithis. Seachas sin, baineadh úsáid as tástáil neamhparametric Mann-Whitney. Rinneadh comparáid idir grúpaí iolracha trí úsáid a bhaint as anailís 1-bealach nó {2-bhealaigh ar athraithis agus tástáil iolrach comparáide ina dhiaidh sin le ceartúchán Simak. Measadh go raibh luachanna P < 0.05="" suntasach.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>
Fíor 1|Angiotensin II (AngII) D aiste bia ard-salainn (HSD)-coscann Hipirtheannas spreagtha glomerularuathphaigí. (a–c) Imdhíonfluaraiseacht Podocalyxin (PODXL; dearg) agus P62 (glas) i glomeruli (a,a0 ) ó lucha de chineál fiáin (WT), (b,b0 ) ó lucha WT tar éis 6 seachtaine de AngII þ HSD, agus (c,c0 ) ó lucha Nphs2.cre Atg5lox/lox a thaispeánann carnadh P62 i podocytes le linn Hipirtheannas agus in ATG a bhaineann go sonrach le podocyte{{1{{12 }}}}lucha easnamhacha. Léiríonn na cinn saighde poncanna P62þ in WT in (a0 ). Cuireadh dath ar núicléí le Hoechst (gorm). Léiríonn fopháirteanna figiúr le príomh-mhéadú níos airde. Barraí=50 mm. (d) Cainníochtú gaolmhar ar limistéar P62þ arna shloinneadh mar chéatadán den limistéar glomerular. n=4 lucha WT agus n=5 WT le AngII þ HSD, agus lucha Nphs2.cre Atg5lox/lox. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. Tástáil Mann-Whitney: *P=0.0159. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.duán-idirnáisiúnta.org.
TORTHAÍ
AngII D Hipirtheannas cothaithe ard-salann chosc ar uathphagacht podocyte
Cuireann podocytes ardleibhéal i láthairuathphaigíin vivo, mar a léirítear le léiriú láidir GFP i lucha transgenic le comhleá GFP go LC3 (lucha GFP-LC3), príomhmharcóir autophagy (Fíor Forlíontach S2A). Is próiseas dinimiciúil é autophagy le foirmiú leanúnach autophagosomes agus díghrádú autophagolysosomes. Mar thoradh ar dhíghrádú autophagosomal a bhlocáil le cloroquine, carnadh poncanna GFPþ, rud a léiríonn eisreabhadh ard autophagic i podocytes (Figiúirí Forlíontacha S2A agus B). Léiríodh deimhniú gur uathphagosomes a bhí sna poncanna GFPþ trí fhluaraiseacht imdhíon-FL dúbailte do GFP agus SQSTM1/P62, próitéin chaperone díghrádaithe aguathphaigí(Fíor Forlíontach S2C agus D). Arís, ba chúis le cóireáil chloroquine carnadh poncanna GFPþ P62þ, rud a léirigh eisphlós uathphagic tábhachtach i podocytes. Mar fhocal scoir, caomhnaíodh eisreabhadh ard autophagic in vitro mar atá léirithe ag léiriú GFP agus P62 i podocytes bunscoile scoite ó lucha GFP-LC3 agus carnadh láidir poncanna GFPþ agus P62þ faoi chóireáil bafilomycin A1, bacainn eile ar dhíghrádú autophagosomal (Fíor Forlíontach S2E–H). .
Rinneadh measúnú ansin ar chumas na Hipirtheannas chun freagraí uathphagacha podocyte a mhodhnú i lucha a insileadh le AngII le haiste bia ard-salann (HSD) ar feadh 6 seachtaine agus i rialuithe neamh-hipertensive. Mar a léirítear i bhFíor 1, d’eascair AngII þ HSD carnadh P62 i glomeruli le carnadh láidir i podocytes, rud a thugann le tuiscint go raibh AngII þ HSD freagrach as podocyteuathphaigíimshuí (Fíor 1a–d). Suimiúil go leor, bhí carnadh P62 i podocytes cosúil leis an gceann a breathnaíodh i lucha a bhí easnamhach le haghaidh uathphagy podocyte (Nphs2.cre Atg5lox/lox lucha). I samhail eile de Hipirtheannas, an tsamhail DOC-salann, thugamar faoi deara freisin carnadh forásach P62 i podocytes feadh thréimhse ama an ghalair (Figiúr Forlíontach S3).
Mar thoradh ar scriosadh Atg5 go sonrach i podocytes tá albaiminiú méadaithe, caillteanas podocyte, agus gortú glomerular i múnla AngII D HSD
Rinneamar scrúdú ansin ar cé acuuathphaigíimshuí i podocytes amháin (Nphs2.cre Atg5lox/lox lucha) isteach ar ghortú glomerular sa tsamhail AngII þ HSD. Dhearbhaíomar ar dtús go raibh Nphs2. cre Atg5lox/lox bhí brú fola gnáth, gnáthduánfeidhm, agus gan aon loit histolaíochta glomerular go dtí 10 mí d'aois, mar a tuairiscíodh roimhe seo (Fíor Forlíontach S4).32 Ansin, Atg5lox/lox (WT) agus Nphs2. cre Atg5lox/ lox bhí lucha insileadh le AngII le HSD ar feadh 6 seachtaine. Rud atá tábhachtach, bhí brú fola systolic cosúil leis an 2 ghrúpa tar éis insileadh AngII le linn an staidéir (Fíor 2a), cé go bhféadfadh sé nach mbeadh an modh eireaball-cuff a úsáidtear chun brú fola a thomhas in ann difríochtaí beaga brú fola a réiteach. Mhéadaigh insileadh AngII le HSD go suntasach an cóimheas idir albaimin fuail-go-creatinine i lucha WT, agus méadaíodh an éifeacht seo go suntasach tuilleadh i lucha Nphs2.cre Atg5lox/lox (Fíor 2b). Hipirtheannas Nphs2.cre Léirigh lucha Atg5lox/lox méadú suntasach ar scléaróis glomerular i gcomparáid le bruscar WT (Fíor 2c–e). I gcomhaontú leis an bpróitéinuria tomhaiste, bhí teilgin phróitéineacha agus dilatation feadánacha i bhfad níos forleithne i lucha le heasnamh podocyte in ATG5 (Fíor 2f–h).
Fíor 2|Mar thoradh ar scriosadh Atg5 go sonrach i podocytes tá méadú suntasach ar albaminuria,duángortú, agus caillteanas podocyte tar éis 6 seachtaine d'insileadh angiotensin II (AngII) D aiste bia ard-salainn (HSD). (a) Brú fola systolic i lucha Atg5lox/lox agus Nphs2.cre Atg5lox/lox le linn 36 lá de AngII þ HSD. n=9 lucha in aghaidh an ghéinitíopa. Cuirtear luachanna i láthair mar mheán±SEM. Anailís déthreo ar athraitheas (ANOVA): ns. I (b–m), n=10 lucha in aghaidh an ghéinitíopa. In (b, g, h,k), cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. (b) AngII þ HSD (ar lean)
Fíor 2|(ar lean) méadú suntasach ar albaiminiúir i Nphs2. cre Atg5lox/lox lucha i gcomparáid le lucha rialaithe Atg5lox/lox. ANOVA déthreo: géinitíopa, P=0.013; am, P{7}}.0018. (c–f) Íomhánna ionadaíocha de chodanna de glomeruli tríchróim le dath Masson ó rialú Atg5lox/lox agus lucha Nphs2.cre Atg5lox/lox tar éis 6 seachtaine de AngII þ HSD. Barraí=50 mm in (c,d). Barraí=100 mm in (e,f). (g,h) Comparáid (g) de chomhréir na glomeruli sclerotic agus (h) de líon na gcaiteachas feadánacha in aghaidh an réimse mhicreascópach. Tástáil Mann-Whitney: **P=0.0026 in (h), ***P=0.0003 in (g). (i,j) Íomhánna ionadaíocha imdhíonfhluaraiseachta de shloinneadh Wilm’s Tumor 1 (WT1; dearg) agus Podocalyxin (PODXL; glas) i glomeruli ó rialú Atg5lox/lox agus Nphs2.cre Atg5lox/lox lucha tar éis AngII þ HSD ar feadh 6 seachtaine. Bhí dhaite núicléí le Hoechst (gorm). Barraí=50 mm. (k) Cainníochtú líon na gceall WT1þ in aghaidh na coda glomerular. Tástáil Mann-Whitney: **P=0.0029 in (l,m). Íomhánna imdhíonfluoraiseachta ionadaíocha de léiriú CD44 (glas) i glomeruli ó rialú Atg5lox/lox agus lucha Nphs2.cre Atg5lox/lox tar éis AngII þ HSD ar feadh 6 seachtaine. Bhí dhaite núicléí le Hoechst (gorm). Barraí=50 mm. (n,o) Micreascóip leictreon tarchurtha ionadaíoch fótamicreagraif de chodanna de glomeruli ó rialú Atg5lox/lox agus lucha Nphs2.cre Atg5lox/lox tar éis AngII þ HSD ar feadh 6 seachtaine, ag taispeáint éadain phróiseas coise podocyte (cinn saighde) i Nphs hipirtheannas2. cre Atg5lox/lox lucha. Barraí=1 mm. n=3 lucha in aghaidh an ghéinitíopa. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.kidney-international.org.
Fíor 3|Sloinneadh calpain agus gníomhaíocht i podocytes. (a) Anailís ar bhloic thiar ar an slonn calpain-1, calpain-2, agus calpain-4 i podocytes príomhúla. Feidhmíonn léiriú tubulin mar normalú. (b) Rinneadh gníomhaíocht chalpain a thomhas ar phodicítí príomhúla a ndearnadh cóireáil orthu nó nár cóireáladh le angiotensin II (AngII; 100 nM) ar feadh 24 uair an chloig le calpeptin (10 mM) nó gan é. n=5 turgnaimh neamhspleácha. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. Anailís aontreo ar athraitheas (ANOVA): cóireáil, P=0.0035. Triail chomparáide iolrach Sidak: *P=0.0128 le haghaidh AngII in aghaidh an bhunlíne, ##P=0.0056 le haghaidh AngII þ calpeptin versus AngII. (c) Rinneadh gníomhaíocht chalpáin a thomhas ar phodicítí príomhúla ó chineál fiáin (WT) nócaipitilstatinlucha transgenic (CSTTg) cóireáilte nó nár chóireáil le AngII (100 nM) ar feadh 24 uair an chloig. n=7 turgnaimh neamhspleácha. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. ANOVA débhealaigh péireáilte le haghaidh cóireála: géinitíopa, P=0.0483. Triail chomparáide iolrach Sidak: ***P=0.0009 le haghaidh WT AngII i gcoinne bunlíne, *P=0.0420 le haghaidh CSTTg AngII versus bunlíne, #P=0.0424 do WT in aghaidh CSTTg AngII. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.duán-idirnáisiúnta.org.
Tháinig laghdú suntasach ar líon na podocyte in aghaidh an glomerulus i Nphs2. cre Atg5lox/lox lucha cóireáilte le AngII þ HSD (Fíor 2i–k). Gortú podocyte i lucha Nphs2.cre Atg5lox/lox le insileadh AngII þ Chuaigh HSD ar aghaidh fiú go glomerulosclerosis fócasach agus deighleogach mar a léirítear trí mharcáil gníomhachtaithe na cille epithelial parietal (PEC) CD44 i glomeruli (Fíor 2l agus m). D’aithin anailís micreascópachta leictreon athruithe suntasacha a bhaineann le heasnamh ATG5 ar insileadh ainsealach AngII le HSD, lena n-áirítear éifeachtúlacht próisis coise i Nphs hipirtheannas2. cre Atg5lox/lox lucha. I gcodarsnacht leis sin, níor aimsíodh mórán lochtanna ultrastruchtúracha i podocytes ó lucha WT fiú tar éis 10 seachtaine d’insileadh AngII le HSD (Fíor 2n agus o), rud a thugann le fios go bhfuil gníomhaíocht uathphagach na podocytes ag teastáil chun a gcuid friotaíochta in aghaidh damáiste de bharr AngII þ HSD. San iomlán, léirigh ár dtorthaí go bhfuil i múnla AngII þ HSD,uathphaigícuireann cosc le gortú agus caillteanas podocyte agus spreagann sé glomerulosclerosis fócasach agus deighleogach ina dhiaidh sin.
Gníomhaíonn AngII D HSD gníomhaíocht calpain i podocytes a chuireann le himshuíomh uathphagy
De réir mar a fuarthas amach go raibh gníomhaíocht caipitilin (i) á cur i ngníomh ag AngII i roinnt cineálacha cille agus (ii) go scoilt sé roinntuathphaigípróitéiní a bhaineann leis,53 n'fheadar an bhféadfaí imshuí uathphagaí idirghabhála AngII þ HSD- a chur i leith gníomhaíocht mhéadaithe caipitilin arna spreagadh ag AngII. Fuaireamar amach ar dtús gur léirigh podocytes príomhúla na 3 fhoirm uileláithreach de chalpairí (Fíor 3a). Léirigh muid ansin gur spreag AngII gníomhaíocht calpain i podocytes príomhúla. Cuireadh bac ar an ardú seo ar ghníomhaíocht calpain mar gheall ar choscóir roghnach calpain (Fíor 3b). D'úsáideamar luch cnag isteach le breisecaipitilstatinslonn trasghéine (as a leanann laghdú ar ghníomhaíocht chaipitilin)43 chun ról caipitilin in AngII þ HSD-idirghabhálaithe a mheasúnúduángortú agus imshuí autophagy. Léirigh podocytes príomhúla ó lucha CSTTg laghdú ar ghníomhaíocht calpain mar fhreagra ar AngII i gcomparáid le podocytes ó lucha rialaithe (Fíor 3c). Mar sin,caipitilstatintháinig laghdú ar ró-eisiúint i podocytes ar ghníomhachtú calpain trí mheán AngII.
Rinneamar measúnú eileuathphaigíleibhéil i podocytes ó lucha CSTTg. Ghineamar lucha CSTTg leis an transgene GFP-LC3. LC3-Cheadaigh tuairisceoir GFP uathphagosomes a chomhaireamh mar phoncanna GFPþ/P62þ. Carnfaidh P62 i gcomhiomláin i gcealla nuair a chuirtear bac ar eisreabhadh uathphagic. Ag an stát basal, chomhaireamhamar níos lú poncanna GFPþ P62þ (Fíor 4a, b, agus e) agus níos lú carnadh P62 (Fíor 4c, d, agus f) i podocytes de lucha CSTTg GFP-LC3 ná i podocytes de ghnáth-lucha GFP-LC3. , rud a thugann le tuiscint go bhfuil méadú ar eisphléacs uathphagic i podocytes lucha le flúirse ard calpastatin.
Fíor 4|Meastóireacht ar eisreabhadh uathphagic i podocytes decaipitilstatinlucha trasghéineacha (CSTTg). (a,b) Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha de léiriú próitéine fluaraiseachta FL glas (GFP) (glas) agus P62 (dearg) i glomeruli ó 12- lucha seachtaine GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3. Léiríonn na cinn saighde uathphagosomes GFPþ P62þ. (c,d) Íomhánna ionadaíocha imdhíonfhluaraiseachta den slonn P62 (glas) agus Podocalyxin (PODXL; dearg) i glomeruli ó 12- lucha seachtaine GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3. Léiríonn fopháirteanna figiúr le príomh-mhéadú níos airde. Bhí dhaite núicléí le Hoechst (gorm). Barraí=50 mm. (e) Cainníochtú líon na poncanna LC3þ P62þ in aghaidh na podocyte. Tástáil Mann-Whitney: **P= 0.0065. (f) Cainníochtú achair P62þ in aghaidh na coda glomerular. Tástáil Mann-Whitney: *P=0.0420. I (e,f), n=5 lucha GFP-LC3 agus n=8 CSTTg GFP-LC3 lucha. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.duán-idirnáisiúnta.org.
Is féidir monatóireacht a dhéanamh ar eisreabhadh uathphagóideach trí thiontú na foirme cíteaplasma de LC3, LC3-I, a thomhas go dtí an fhoirm autophagosomal scoilte agus fosfatidylethanolamine-chúpláilte de LC3, LC3-II, ar an blot Thiar . Léirigh podocytes ó lucha CSTTg comhshó méadaithe LC3-I go LC3-II agus laghdaigh slonn P62, i láthair agus in éagmais bafilomycin A1 (Fíor 5a agus b), rud a thugann le fios eisilteacht uathphagic méadaithe i podocytes le ró-léiriú calpastatin. Ar deireadh, bhí carnadh poncanna GFPþ P62þ i podocytes tar éis riarachán cloroquine níos tábhachtaí i lucha CSTTg GFP-LC3 ná i lucha GFP-LC3, rud a dheimhníonncaipitilstatinspreagann ró-eisbhrú eisphléacs uathphagic i podocytes in vivo (Fíor 5c–e). San iomlán, tugann ár gcuid sonraí le tuiscint go spreagann AngII gníomhaíocht calpain i podocytes, gouathphaigía chuireann bac ar chalpitin i podocytes, agus gur leor cosc a chur ar ghníomhaíocht chalpitin inghineach trí ró-eisbhrú caipitilstatin chun eisreabhadh uathphagic i podocytes a spreagadh.
Tá lucha CSTTg cosanta ar ghortú podocyte de bharr AngII D HSD
Níor léirigh lucha CSTTg aonduánathrú go dtí 12 mhí d'aois ar a laghad (Fíor Forlíontach S5). Rinneamar anailís ar ghortú podocyte i lucha CSTTg le linn cóireála AngII þ HSD. Cé gur fhorbair lucha WT glomerulosclerosis éadrom agus gortú podocyte tar éis 4 seachtaine de Hipirtheannas, mar a léirítear le léiriú neamhghnácha podocalyxin agus neifrín, léirigh lucha CSTTg níos lú loit glomerular sclerotic (Fíor 6a agus b) agus léiriú podocalyxin agus neifrín leasaithe (Fíor 6c-h) . Breathnaíodh difríochtaí den sórt sin i feinitíopa podocyte ag céim nach raibh difríocht idir dlús na núicléis podocyte idir lucha WT agus lucha CSTTg hipirtheannas (Fíor 6i-k).
Fíor 5|Blocáil díghrádú autophagosomal dheimhnigh méadú efflux autophagic podocyte icaipitilstatinlucha trasghéineacha (CSTTg). (a) Anailís blot thiar ar an slonn LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62, agus ATG5 i podocytes príomhúla ó lucha de chineál fiáin (WT) nó CSTTg. Feidhmíonn léiriú tubulin mar normalú. Cuireadh cóireáil ar phodocytes nó níor cuireadh cóireáil orthu le bafilomycin A1 (BafA1; 100 nM) ar feadh 4 huaire roimh ghabháil saothraithe. (b) Cainníochtú na gcóimheas LC{{1{0}}II/tubulin agus P62/tubulin. n=10 lucha WT agus n=8 lucha CSTTg. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. Anailís débhealaigh ar athraithis péireáilte le haghaidh cóireála: le haghaidh LC3-II/tubulin: géinitíopa, P=0.{{30}}008; cóireáil, P < 0.0001;="" le="" haghaidh="" p62/tubulin:="" géinitíopa,="" p="0.0884;" cóireáil,="" p="">< 0.0001.="" triail="" chomparáide="" iolrach="" sidak:="" le="" haghaidh="" lc3-ii/tubulin:="" ***p="">< 0.0001="" le="" haghaidh="" wt="" móide="" bafa1="" i="" gcoinne="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0.0001="" le="" haghaidh="" csttg="" móide="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" le="" haghaidh="" wt="" þ="" bafa1="" in="" aghaidh="" csttg="" þ="" bafa1;="" le="" haghaidh="" p62/tubulin:="" ***p="">< 0.0001="" i="" gcás="" wt="" móide="" bafa1="" in="" aghaidh="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0.0001="" i="" gcás="" csttg="" móide="" bafa1="" in="" aghaidh="" csttg="" þ="" bafa1.="" (c,d)="" íomhánna="" imdhíonfhluaraiseachta="" ionadaíocha="" de="" léiriú="" próitéine="" fluaraiseachta="" fl="" glas="" (gfp;="" glas)="" agus="" p62="" (dearg)="" i="" glomeruli="" ó="" 12-="" lucha="" seachtaine="" gfp-lc3="" agus="" csttg="" gfp-lc3.="" léiríonn="" fopháirteanna="" figiúr="" le="" príomh-mhéadú="" níos="" airde.="" bhí="" dhaite="" núicléí="" le="" hoechst="" (gorm).="" barraí="50" mm.="" cuireadh="" cóireáil="" ar="" lucha="" le="" cloroquine="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" huaire="" roimh="" marú.="" léiríonn="" na="" cinn="" saighde="" uathphagosomes="" gfpþ="" p62þ.="" (e)="" cainníochtú="" líon="" na="" poncanna="" lc3þ="" p62þ="" in="" aghaidh="" na="" podocyte.="" n="5" lucha="" in="" aghaidh="" an="" ghéinitíopa.="" cuirtear="" luachanna="" i="" láthair="" mar="" cheapacha="" aonair="" agus="" mar="">±SEM. T-tástáil gan péire le SD comhionann: *P=0.0302. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.duán-idirnáisiúnta.org.
Fíor 6 |Calpastatincuireann ró-eisiúint cosc ar ghortú podocyte trí mheán an angiotensin II (AngII) D aiste bia ard-salainn (HSD). (a,b) Íomhánna ionadaíocha de chodanna de glomeruli trichrome-daite Masson ó lucha de chineál fiáin (WT) agus de lucha trasgenacha calpastatin (CSTTg) tar éis 6 seachtaine de AngII þ HSD. Barraí=50 mm. (c,d,f,g) Íomhánna ionadaíocha imdhíonfhluaraiseachta den slonn (c,d) Podocalyxin (PODXL) agus (f,g) nephrin (NPHS1) i lucha WT agus CSTTg tar éis 6 seachtaine de AngII þ HSD agus (e) ,h) cainníochtaí gaolmhara. Barraí=50 mm. (i,j) Íomhánna ionadaíocha imdhíonfhluaraiseachta de shloinneadh Wilm’s Tumor 1 (WT1; glas) agus PODXL (dearg) i glomeruli ó lucha WT agus CSTTg tar éis 6 seachtaine de AngII þ HSD agus (k) cainníochtú gaolmhar ar líon na WT1þ cealla in aghaidh an ailt glomerular. Bhí dhaite núicléí le Hoechst (gorm). Barraí=50 mm. In (e,h,k), cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. n=9 lucha WT agus n=7 lucha CSTTg. T-tástáil gan péire agus SD comhionann aici: **P=0.0095 in (e), *P=0.0249 in (h), P=0.7891 in (k). Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.duán-idirnáisiúnta.org.
Ar an gcaoi chéanna, tar éis 6 seachtaine de Hipirtheannas, chuir lucha GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3 díobháil podocyte i láthair ach bhí loit níos suntasaí i lucha GFP-LC3 (Fíor 7). Bhí an cóimheas albaimine-go-creatinine urinary níos airde i lucha GFP-LC3 tar éis 4 seachtaine de AngII þ HSD (Fíor 7a). Ní raibh an líon podocyte difriúil idir an 2 ghéinitíopaí, ach tháinig laghdú suntasach ar léiriú neifrín i lucha GFP-LC3 (rialú) (Fíor 7b-e). Comhghaolú lecaipitilstatin- cosaint meánach, léirigh an anailís ultrastructural éifeacht próiseas coise podocyte éadrom agus fócasach i lucha GFP-LC3 cóireáilte le AngII þ HSD le caomhnú níos fearr ar eiseadh an phróisis chos i lucha CSTTg, cé go ndearnadh cainníochtú domhanda ar líon na bpróiseas coise in aghaidh an íoslaigh glomerular ní raibh fad an membrane (GBM) difriúil go staitistiúil, is dócha toisc go bhfuil gortú podocyte fócasach agus deighilte inár múnla (Fíor 7f–h). Díol suntais, macrophages agus T-limficítí insíothlú iduáinNí raibh difríocht idir na grúpaí (Fíor Forlíontach S6). Nuair a chuirtear le chéile iad, léirigh na torthaí sincaipitilstatingortú podocyte de bharr AngII þ HSD a chosc.
Athshocraíonn ró-eisbhrú calpastatin eisphlós uathphagic i podocytes ó lucha tar éis cóireála AngII D HSD
Mar fhocal scoir, ní raibh a fhios againn cé acucaipitilstatin- cosaint glomerular trí mheán na samhla AngII þ HSD baint acu le cothabháil uathphagy i podocytes. Díol spéise é, cuireadh cosc ar charnadh P62 de bharr AngII þ HSD i podocytes i lucha CSTTg agus GFP-LC3 CSTTg (Fíor 8a–d), rud a thugann le fios gur chuir calpastatin cosc ar imshuí ar phodocyte.uathphaigí. Is fiú a thabhairt faoi deara, bhí líon na lipéadú poncanna GFPþ P62þ ar uathphagosomes cosúil le podocytes ó lucha hipirtheannas GFP-LC3 agus GFP-LC3 CSTTg, rud a thugann le tuiscint gur spreag AngII þ HSD moilliú ar eisreabhadh uathphagóideach podocyte seachas gabháil iomlán (Fíor 8e g).
Tuar suíomh scoilteachta caipitilin i bpróitéiní podocyte in silico
D’úsáideamar roinnt uirlisí in silico chun spriocanna féideartha caipitilin i bpodocytes a thuar (Táblaí Forlíontacha S1 agus S2). Rinneadh comparáid idir trí bhunachar sonraí ar líne: GPS-CCD,54 CaMPDB,55, agus DeepCalpain.56 In anailís shilico shainaithníodh roinnt próitéiní podocyte, nifrín agus podicín ina measc, a d'fhéadfadh a bheith scoilte ag caipitilin. Mar sin,caipitilstatin-d'fhéadfaí cosaint glomerular trí mheán a nascadh le laghdú ar ghníomhaíocht einsímeach calpain, rud a fhágann go laghdaítear díghrádú roinnt próitéiní podocyte.
Ina theannta sin, 3 ar a laghaduathphaigíis spriocanna díreacha de chuid calpains iad próitéiní gaolmhara. Tá ATG5 scoilte ag calpains, rud a fhágann suaitheadh i bhfoirmiú coimpléasc ATG5.57,58 Chuir riarachán coscairí calpain in vivo cosc freisin ar scoilteacht an phróitéin uathphagy Beclin-1.59 In silico analysis of tacaíonn an suíomh scoilteachta toimhdeach ar phróitéiní a bhaineann le hútarphagy leis an hipitéis go bhféadfadh calpain uathphagaíocht a rialáil trí scoilteacht einsímeach de phróitéiní uathphaga.
Feidhm cistanche-duáin
léiriú mRNA ar reticulum endoplasmic (ER) agus marcóirí struis ocsaídiúcháin i glomeruli ó lucha atá cóireáilte le AngII móide HSD
Rinneamar measúnú ar strus reticulum endoplasmic (ER) agus strus ocsaídiúcháin trí PCR cainníochtúil i glomeruli le linn cóireála AngII þ HSD (Tábla 1). Ag bunlíne, níor thugamar faoi deara aon athrú ar léiriú mRNA de ghéinte anailísithe i glomeruli ó lucha WT agus Nphs2.cre Atg5lox/lox (Fíor Forlíontach S7). Tar éis 6 seachtaine de Hipirtheannas, glomeruli ó Nphs2. léirigh lucha cre Atg5lox/lox próifílí mRNA éagsúla de ghéinte an strus ER agus cosáin struis ocsaídiúcháin le léiriú méadaithe Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1, agus Hsp90b1 i gcomparáid le WT glomeruli, rud a thugann le fios gouathphaigíbhí ídiú i podocytes i bhfabhar AngII þ strus ER de bharr HSD agus strus ocsaídiúcháin. Os a choinne sin, chuir glomeruli ó lucha CSTTg íosrialú i láthair ar roinnt géinte de na cosáin struis ocsaídiúcháin agus strus ER chomh maith le laghdú ar léiriú roinnt géinte pro-apoptotic (Fíor 9).
Nuair a chuirtear le chéile iad, léiríonn na torthaí sincaipitilstatind'fhéadfadh ró-expression gortú glomerular a chosc trí laghdú a dhéanamh ar ER de bharr AngII þ HSD agus strus ocsaídiúcháin.
PLÉ
Sa staidéar seo, léirigh muid go bhfuil i AngII þ HSD-spreagtha Hipirtheannas, autophagy podocyte downregulated suntasach. Ina theannta sin, bhí lucha le scriosadh sonrach podocyte Atg5 níos mó seans maith go glomerulosclerosis spreagtha ag AngII þ HSD agus caillteanas podocyte, rud a léiríonn gouathphaigíi podocytes cuireann sé cosc ar fhorbairt nephropathy hipirtheannas, ag cur béime ar an ról ríthábhachtach atá ag uathphagaíocht i ngortú podocyte de bharr AngII þ HSD. Is beag atá ar eolas faoi na spreagthaigh eischeallacha a rialaíonn uathphagaireacht cheallacha, agus cuireann na torthaí seo solas ar rialáil pathfiseolaíoch uathphagaireacht podocyte ag AngII.
I bhformhór na glomerulopathies daonna, is sainmharc de ghortú glomerular as a dtagann proteinuria é ídiú próisis chos podocyte. Is dócha go mbeidh ról riachtanach ag uathphagaíocht i bhfeidhmiú podocyte a chothabháil toisc go léiríonn na cealla sin a bhfuil difreáil chríochfoirt acu rátaí arda deuathphaigífiú in éagmais strus. Léirigh staidéar roimhe seo go gcuireann AngII autophagy chun cinn trí speicis imoibríocha ocsaigine a ghiniúint i líne cille podocyte murine atá neamhbhásaithe go coinníollach.60 Tá táirgeadh speiceas ocsaigine imoibríoch go deimhin ina ionduchtóir ginearálta autophagy i go leor cineálacha cille agus is iad na cúiseanna atá leis an neamhréireacht sin lenár dtorthaí. doiléir. Murab ionann agus an staidéar deiridh seo, d’úsáideamar podocytes saothraithe bunscoile murine a choinníonn slonn podocin agus neifrín agus cuir chuige in vivo agus ní línte cille murine. Deimhnímid i dtuarascálacha roimhe seo go léiríonn podocytes postmitotic leibhéal neamhghnách ard comhábhairuathphaigí. Tá gá le méid méadaithe LC3-II a thomhas tar éis spreagadh AngII i láthair nó in éagmais coscairí líseasómacha chun a chinneadh an bhfuil méadú nó bac ar eisreabhadh uathphagic. Rinne staidéir roimhe seo faillí ar an bhfeiniméan seo.60
Fíor 7 |Calpastatincuireann ró-eisbhrú cosc ar ghortú podocyte trí mheán angiotensin II (AngII) D aiste bia ard-salainn (HSD) i lucha glasa próitéin fluaraiseacha FL (GFP)–LC3. (a) AngII þ D’eascair méadú suntasach ar albaiminiúria i lucha GFP-LC3 i gcomparáid le lucha CSTTg (calpastatin transgenic) GFP-LC3. n=8 go dtí 13 lucha in aghaidh an ghéinitíopa. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. Anailís déthreo ar athraitheacht: géinitíopa, P=0.0429; am, P=0.0165. Triail chomparáide iolrach Sidak: *P=0.0453 do lucha GFP-LC3 i gcoinne CSTTg GFP-LC3 ag lá 28. (b,c) Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha de shloinneadh Wilm’s Tumor 1 (WT1; glas) agus neifrín (NPHS1) (dearg) i glomeruli ó 18- lucha seachtaine GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3 tar éis 6 seachtaine d’insileadh AngII þ HSD. Bhí dhaite núicléí le Hoechst (gorm). Barraí=50 mm. Cainníochtú (d) limistéar NPHS1þ in aghaidh na coda glomerular agus (e) líon na gceall WT1þ in aghaidh na coda glomerular i 18-lucha seachtaine GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3 tar éis 6 seachtaine d'insileadh AngII þ HSD. n=19 lucha GFP-LC3 agus n=25 lucha CSTTg GFP-LC3. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. T-tástáil gan péire agus SD comhionann aici: **P=0.0010 in (d), P= 0.1158 in (e). (f,g) Íomhánna micreascóip leictreon tarchurtha de glomeruli ó lucha GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3 tar éis 6 seachtaine ó AngII þ HSD. Léiríonn na cinn saighde ísliú phróiseas na coise. Barraí=1 mm. (h) Cainníochtú líon na bpróiseas coise in aghaidh an mhicriméadar de scannán íoslaigh glomerular (GBM). n=3 lucha in aghaidh an ghéinitíopa. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán-SEM. Léiríonn gach ceap an meánlíon podocytes in aghaidh an mhicriméadar GBM ar 1 fhad leanúnach de GBM. T-tástáil gan péire le SD comhionann: P=0.7512. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.duán-idirnáisiúnta.org.
Anseo, d'úsáideamar múnla hipirtheannas bunaithe ar perfusion AngII agus HSD. Taispeánann podocytes gabhdóirí AT1 agus tá siad nochta do pheptídí atá scagtha go héasca ar nós AngII.13,16,26,61–65 Glactar leis go bhféadfadh éifeachtaí ath-chosanta breathnaithe ar chosc ar RAAS a bheith - go páirteach ar a laghad - mar gheall ar imshuí ar an podocyte seo- RAAS ar leith. Mar an gcéanna, dheimhnigh staidéir in vivo éifeacht AngII ar ghortú podocyte agus léirigh spriocdhíriú géine a bhaineann go sonrach le podocyte ar AT1 gur leor gníomhachtú gabhdóirí AT1 sa glomerulus i nephritis lupus turgnamhach chun dlús a chur leis.duángortú in éagmais Hipirtheannas.66,67 Calpain-mediateduathphaigíd'fhéadfaí dírialú inár múnla a nascadh le comharthaíocht dhíreach AngII-AT1 ar phodocytes nó a bheith mar iarmhairt ar Hipirtheannas. D’fhéadfaimis freagra luath a thabhairt don cheist seo. Go deimhin, sa tsamhail DOC-salann, fuair muid freisin carnadh P62 i podocytes ó lucha hypertensive (Figiúr Forlíontach S3). Tugann sé seo le fios go dtarlaíonn imshuí uathphagacha i podocytes sa mhúnla seo, rud a cheaptar a bheith neamhspleách ar AngII.68 Bheadh gá le tuilleadh staidéir a dhéanann measúnú ar ghortú podocyte a bhaineann le gníomhaíocht calpain agus eisilteach uathphagóideach i lucha atá easnamhach do AT1 i podocytes dá ndéanfaí rialachán den sórt sin a shainiú go roghnach. de autophagy podocyte ag brath ar éifeachtaí díreacha nó indíreacha AngII.
Fíor 8 |Calpastatincuireann ró-eisbhrú cosc ar angiotensin II (AngII) D aiste bia ard-salainn (HSD)-spreagthauathphaigílaghduithe ar podocytes. (a,b) Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha den slonn P62 (glas) agus Podocalyxin (PODXL; dearg) i glomeruli ó phróitéin fluaraiseacha FL glas (GFP)–LC3 agus CSTTg (caipitilstatintransgenic) GFP-LC3 lucha tar éis 6 seachtaine de AngII þ HSD. Léiríonn fopháirteanna figiúr le príomh-mhéadú níos airde. Bhí dhaite núicléí le Hoechst (gorm). Barraí=50 mm. (c,d) Cainníochtú achair P62þ in aghaidh na coda glomerular. n{5}} lucha de chineál fiáin (WT) agus n=7 lucha CSTTg i (c), agus n{8}} lucha GFP-LC3 agus n=16 lucha CSTTg GFP-LC3 i (d). Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. Tástáil Mann-Whitney: **P=0.0033 in (c), **P=0.0011 in (d). (e,f) Íomhánna ionadaíocha imdhíonfhluaraiseachta den slonn GFP (glas) agus P62 (dearg) i glomeruli ó lucha GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3 tar éis 6 seachtaine ó AngII þ HSD. Léiríonn fopháirteanna figiúr le príomh-mhéadú níos airde. Léiríonn na cinn saighde uathphagosomes GFPþ P62þ. (g) Cainníochtú líon na poncanna LC3þ P62þ in aghaidh an phodicíte. n=11 lucha GFP-LC3 agus n=16 lucha CSTTg GFP-LC3. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar mheán±SEM. T-tástáil gan péire le SD comhionann: P=0.1014. Chun breathnú ar an íomhá seo a bharrfheabhsú, féach le do thoil ar an leagan ar líne den alt seo ag www.duán-idirnáisiúnta.org.
Tábla 1|Eagar PCR Próifíleora RT2 Saincheaptha
Is próitéisí pro-athlastacha uileláithreach iad calpain-1 agus calpain-2, a bhfuil a ngníomhaíocht á rialú agcaipitilstatin, a n-inhibitor sonrach. Go deimhin, cuireann calpastatin bac go roghnach ar chalpairí agus ar phróteas ar bith eile go dtí seo. Tá gníomhachtú Calpain nasctha le déanaí leduángortú i roinnt comhthéacsanna paiteolaíocha.69,70 Fuarthas amach go raibh an cainéal poitéinseal gabhdóra neamhbhuan iompróra cainéal cailciam C6 a ghníomhachtú calpain-1 i podocytes trí Ca2þ/calcineurin gníomhachtaithe. Mhéadaigh duán na n-othar a raibh glomerulosclerosis fócasach agus deighleogach orthu léiriú cainéil poitéinsil C6 gabhdóra neamhbhuan, méadú ar ghníomhaíocht caipitilin agus calcineurin, agus laghdú ar léiriú na sprice talin calpain-1, rud atá ríthábhachtach do chobhsaíocht cíteischnámharlaigh podocyte.71 cainéil fhéideartha receptor neamhbhuan. Nascann C6 go díreach le calpain-1 agus le calpain-2 freisin. Tá an t-idirghníomhú seo ríthábhachtach chun scoilteacht talin a rialú agus gluaiseacht podocytes a rialú.72
lucha transgenic overexpressingcaipitilstatingo bhfuil siad cosanta ar athmhúnlú soithíoch agus ar athlasadh atá ag brath ar AngII73; in aghaidh athlasadh i múnlaí glomerulonephritis,43 sepsis,74 nó diúltú allagraft75; agus i gcoinne athlasadh a bhaineann le haois.76 Ní dhearnadh iniúchadh ar ghortú podocyte sna lucha seo. Tá Peltier et al. léirigh go raibh ró-léiriú arcaipitilstatincosc ar athlasadh perivascular AngII-spleách sna duáin.43 Mar sin, d'fhéadfaí cosaint duáin i lucha CSTTg a idirghabháil, go páirteach ar a laghad, trí mheicníocht frith-athlastach. Déanaimid measúnú ar insíothlú macrophages agus limficítí inár múnla agus ní bhfuarthas aon difríocht shuntasach iduánathlasadh idir CSTTg agus lucha rialaithe nuair a dhéantar anailís dhomhandaduáninsíothlú leukocyte (Fíor Forlíontach S6).
Bhí baint ag Calpain le déanaí le rialáil autophagy (a ndearnadh athbhreithniú air le déanaí i Weber et al.53) le hairíonna suimiúla agus bithchosanta ar chosc ar chalpitin i gcomhthéacs diaibéitis trí athchóiriú a dhéanamh aruathphaigí.77 Anseo, thuairiscigh muid go bhfuil cosc calipitin trícaipitilstatinoverexpression (i) gortú podocyte a chosc le linn Hipirtheannas agus (ii) ath-aisphágacht i podocytes, rud a léiríonn ról nua díobhálach gníomhachtú calpain le linn Hipirtheannas trí chosc aruathphaigí.
Léiríodh go raibh beagnach gach próitéin ATG scoilte ag calpains in vitro. 78 Anseo chuireamar suas é sinuathphaigírinneadh idirghabháil ar chothabháil i lucha CSTTg hipirtheannas trí chosc ar chalapitin. Chun tacú lenár hipitéis, thaispeáin muid go bhfuil laghdú ar ghníomhaíocht caipitilin podocytes ó CSTTg nuair a thugtar dúshlán dóibh le AngII in vitro (Fíor 3c). Fuaireamar leibhéal próitéin ATG5 méadaithe i podocytes ó lucha CSTTg, rud a thugann le tuiscint gur chuir ró-léiriú caipitilstatin cosc ar scoilteacht ATG5 trí mheán calpain sa chomhthéacs seo (Fíor 5a). I gcodarsnacht leis sin, léiríodh gocaipitilstatin-d'fhéadfadh cosc caipitil trí mheán a bheith neamhspleách ar chosc ar a ngníomhaíocht próitéáis79; mar sin, níorbh fhéidir linn rialáil uathphagaíochta ag caipitilstatin neamhspleách ar ghníomhaíocht einsímeach caipitilin a eisiamh.
Go hachomair, léirigh na torthaí seo ról nár aithníodh roimhe seocaipitilstatini rialáil podocyteuathphaigíagus sholáthair sé ceannasaíocht maidir le himscrúdú a dhéanamh ar straitéisí teiripeacha núíosacha chun maireachtáil podocyte a fheabhsú le linn nephropathies hipirtheannas.
NOCHTADH
Níor dhearbhaigh na húdair go léir aon leasanna iomaíocha.
BUÍOCHAS
Thacaigh an Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) agus Université de Paris leis an obair seo. Thacaigh comhaltacht iarchéime ón Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie le IB. Maoiníodh OL trí dhámhachtain ón bhForas Eorpach um Staidéar ar Dhiaibéiteas (EFSD) arna thacú ag Clár EFSD/Novo Nordisk um Thaighde Diaibéiteas san Eoraip agus deontas ón Société Francophone duDiabète (SFD). Maoiníodh BR agus CH le Deontas Tosaigh 107037 ón gComhairle Eorpach um Thaighde agus ón Aontas Eorpach (P-LT). Thacaigh comhaltacht iarchéime ón Fondation de France le YS.
Gabhaimid buíochas le Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac, agus le foireann ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, Páras, an Fhrainc) as cúnamh i gcúram agus láimhseáil ainmhithe, Nicolas Sorhaindo tomhais forbhithcheimiceach (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat). , Páras, an Fhrainc), agus Alain Schmitt agus Jean-Marc Massefor micreascópacht tarchurtha leictreon (Institut Cochin, Páras, An Fhrainc). Gabhaimid buíochas le Morgane Le Gall (saoráid próitéamaíche Cochin 3P5, Páras, An Fhrainc) as cabhair in anailís in silico. Admhaímid tacaíocht riaracháin ó Véronique Oberweis, ó Bruno Pillard, agus ó Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Páras, an Fhrainc).
ÁBHAR FORLÍONTACH
Comhad Forlíontach (PDF)
Fíor S1. Léiríonn cultúr podocyte bunscoile marcóirí podocyte. Anailís blot an Iarthair ar léiriú na marcóirí podocyte NPHS1 agus NPHS2 i gcultúr podocyte príomhúil ó lucha WT agus CSTTg. Feidhmíonn Tubulin (TUBA) mar rialú luchtaithe. Ionadaí n=4 lucha in aghaidh an ghéinitíopa.
Fíor S2. An leibhéal basal ard de podocyteuathphaigí. (A, B) Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha de léiriú GFP (glas) agus NPHS1 (dearg) i glomeruli ó lucha GFP-LC3 cóireáilte nó nach bhfuil le CQ (8{-mg/kg) 4 huaire roimh an marú. Taispeánann cinn saighde uathphagosomes GFPþ. (C,D) Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha de léiriú GFP (glas) agus P62 (dearg) i glomeruli ó lucha GFP-LC3 cóireáilte nó nach bhfuil le CQ (80mg/kg) 4 huaire roimh an marú. Taispeánann cinn saighde uathphagosomes GFPþ P62þ. Léiríonn (A–D) (0 ) formhéadú níos airde. Bhí dhaite núicléí le Hoechst (gorm). Barra=50 mm. N=4 lucha in aghaidh an choinníll (E–H) Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha den slonn GFP (glas) agus P62 (dearg) i podocytes príomhúla ó lucha GFP-LC3 cóireáilte (F, H) nó nach bhfuil (E, G) ) le Bafifilomycin A1 (100 nM) ar feadh 4 uair an chloig. N=5 lucha in aghaidh an choinníll.
Fíor S3. P62 carnann i podocytes sa tsamhail DOC-salann de Hipirtheannas. (A-C) Íomhánna inmunofluorescence ionadaíocha de léiriú P62 (glas) agus PODXL (dearg) i glomeruli ó lucha WT tar éis 2 go 6 seachtaine de mhúnla DOC-salann. Léiríonn (0 ) formhéadú níos airde. Bhí dhaite núicléí le Hoechst (gorm). Barra ¼ 50 mm. ( D ) Cainníochtú limistéar P62 in aghaidh an limistéir podocyte ( faoin gcéad ). N=5–6 lucha in aghaidh an choinníll. Anailís aontreo ar athraitheacht: am P=0.0059, tástáil chomparáide iolrach Sidak: D42 i gcoinne D14 **P=0.0055, D28 versus D14 P=0.8590.
Fíor S4. Podocyteuathphaigítá sé inchurtha le forbairt podocyte. (A) brú fola systolic, (B) cóimheas albaimin-go-creatinine fuail, agus (C) leibhéil nítrigine úiré fola i lucha Atg5lox/lox agus Nphs2.cre Atg5lox/lox. N=5–6 lucha in aghaidh an ghéinitíopa. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha agus modhanna aonair±SEM. Tástáil Mann-Whitney: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B), agus P=0.6623 (C). (D–E) Íomhánna ionadaíocha de chodanna de glomeruli trichrome-dhaite Masson ó lucha Atg5lox/lox agus Nphs2.cre Atg5lox/lox. (F–G) Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha de léiriú PODXL (glas) agus WT1 (dearg) i lucha Atg5lox/lox agus Nphs2.cre Atg5lox/lox. Bhí dhaite núicléí le Hoechst (gorm). (D–G) Barra=50 mm. N ¼ 6 lucha in aghaidh an ghéinitíopa. (H–I) Fótamicreagraif ionadaíocha de chodanna micreascópachta leictreoin tarchurtha de glomeruli ó lucha Atg5lox/lox agus Nphs2.cre Atg5lox/lox. Barra=1 mm. N=3 lucha in aghaidh an ghéinitíopa.
Fíor S5.Calpastatinní bhíonn tionchar ag overexpressionduánfeidhm ag bunlíne. (A) nítrigin úiré fola agus (B) leibhéil albaimine plasma i 12-lucha seachtaine GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3. N=5 GFP-LC3 agus N=6 CSTTg GFP-LC3. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha agus modhanna aonair±SEM. Tástáil Mann-Whitney: P=0.6623 (A) agus P=0.9307 (B). (C,D) Íomhánna ionadaíocha de chodanna de glomeruli trichrome-dhaite Masson ó lucha GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3. (E–H) Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta ionadaíocha de léiriú PODXL (E, F) agus NPHS1 (G, H) i lucha GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3. (C–H) Barra=50 mm. (I, J) Cainníochtú gaolmhar ar limistéar PODXL agus NPHS1 in aghaidh na coda glomerular. N=5 GFP-LC3 agus N=6 CSTTg GFP-LC3. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha agus modhanna aonair±SEM. Tástáil Mann-Whitney: P=0.1898 (A) agus P=0.8413 (B).
Feidhm cistanche-duáin
Fíor S6.Calpastatinní bhíonn tionchar ag overexpression ar athlasadh domhanda na duáin. Imdhíon-histochemistry ionadaíoch ar an slonn F4/80 (A, B) agus CD3 (D-E) i GFP-LC3 agus CSTTg GFP-LC3 lucha tar éis 6 seachtaine Angiotensin II þHSD. Barra=200 mm. (C, F) Cainníochtú gaolmhar ar limistéar F4/80 agus CD3 in aghaidh anduánalt. N{0}} CSTTg GFP-LC3 agus N=8 lucha GFP-LC3. Cuirtear luachanna i láthair mar cheapacha aonair agus mar acmhainn SEM. Tástáil Mann-Whitney: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
Fíor S7. Podocyteuathphaigídeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
Tábla S1. Réamh-mheastachán in silico ar shuíomhanna scoilteachta caipitilin. Réamh-mheastar suímh scoilteachta calpain i bpróitéiní a bhain le podocyte agus a bhain le hútarphagy le GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP:// calpain.org) agus DeepCalpain Predict (http://deepcalpain. cancerbio.info/help.php). Comhad Forlíontach (Excel)
Tábla Forlíontach S2. Comhad iomlán réamhbhreithe in silico de shuíomhanna scoilteachta caipitilin. Bhí suíomhanna scoilteachta Calpain tuartha i podocyte-bhainteach agusuathphaigípróitéiní a bhaineann le GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org), agus DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Atosaítear suíomhanna scoilteachta tuartha do gach próitéin le haghaidh GPS-CCD agus DeepCalpain Predict.
TAGAIRTÍ
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA, et al. Leitheadúlacht ainsealachduángalair sna Stáit Aontaithe. JAMA. 2007; 298: 2038-2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C, et al. Cé ar cheart díriú orthu le haghaidh scagthástála CKD? Tionchar diaibéiteas, Hipirtheannas, agus galar cardashoithíoch. Am J Kidney Dis. 2009; 53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC, et al. Fachtóirí riosca do ESRD i ndaoine aonair a bhfuil GFR measta caomhnaithe acu le agus gan albaiminiúria: torthaí ón gClár Luath-mheastóireachta Duán (KEEP). Am J Kidney Dis. 2013; 61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, et al. Brú fola ardaithe agus baol galar duánach deiridh in ábhair gan galar duáin bunlíne. Med Intéirneach Arch. 2005; 165: 923-928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S, et al. Tá gortú podocyte mar bhunús ag glomerulopathy na bhfrancach salann-hipirtheannas Dahl agus déantar é a aisiompú ag seachfhreastalaí aldosteróin. Hipirtheannas. 2006; 47: 1084-1093.
6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST, et al. Eisfhearadh podocyte urinary mar mharcóir le haghaidh preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 2007; 196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, et al. Podocyturia roimh phróitéineas agus gnéithe cliniciúla preeclampsia: staidéar ionchasach fadaimseartha. Hipirtheannas. 2013; 61: 1289-1296.
8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, et al. Caillteanas podocyte i nephrosclerosis hipirthearcach daonna. Am J Hipirtheannas. 2009; 22:300–306.
9. Wang G, Kwan BC, Lai FM, et al. Léiriú intrarenal de miRNAs in othair le nephrosclerosis hypertensive. Am J Hipirtheannas. 2010; 23:78-84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, et al. Nephropathies próitéineach ainsealacha: torthaí agus freagairt ar chóireáil i gcohórt ionchasach de 352 othar a bhfuil patrúin éagsúla díobhála duánach acu. Am J Kidney Dis. 2000; 35: 1155-1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, et al. Tá caillteanas podocyte leanúnach ag brath ar Angiotensin II ó glomeruli díchobhsaithe ina chúis le dul chun cinn na céime deiridhduángalar. Duán Int. 2012; 81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. Éifeachtaí bacóirí receptor angiotensin-II ar damáiste podocyte agus apoptosis glomerular i múnla francach de nephropathy diaibéitis turgnamhach streptozotocin-spreagtha. Histochem ar líne. 2011; 113:826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG, et al. Cuireann Angiotensin II le gortú podocyte trí léiriú TRPC6 a mhéadú trí chonair chomharthaíochta aiseolais dearfach arna idirghabháil ag NFAT. Am J Pathol. 2011; 179: 1719-1732.
14. Grúpa Staidéir EUCLID. Triail randamach faoi rialú phlaicéabó de lisinopril in othair normatacha a bhfuil diaibéiteas ag brath ar inslin agus normoalbuminuria nó microalbuminuria. Lancet. 1997; 349: 1787-1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH, et al. Proteinuria, sprioc le haghaidh renoprotection in othair le cineál 2 nephropathy diaibéitis: ceachtanna ó RENTAL. Duán Int. 2004; 65: 2309–2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Ciallaíonn athruithe ar roghnaíocht perm glomerular de bharr angiotensin II mífheidhmiú podocyte agus athshocrú próitéin scairt scoilte. Semin Nephrol. 2004; 24:131–140.
17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Tréithriú subtypes receptor angiotensin II i podocytes. J Lab Clin Med. 2003; 142:313-321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, et al. Próitéiniúir agus léiriú próitéin scairt podocyte, neifrín, i nephropathy diaibéitis: éifeachtaí ar chosc ar einsím a thiontú angiotensin. Diabetology. 2002; 45: 1572-1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, et al. Éifeachtaí inhibitor einsím a thiontú angiotensin, antagonist receptor angiotensin II agus antagonist cailciam ar podocytes fuail in othair le nephropathy IgA. Am J Nephrol. 2000; 20: 373-379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG, et al. Méadaíonn Angiotensin II an ghníomhaíocht cailciam citosolic i podocytes francach sa chultúr. Duán Int. 1997; 52: 687–693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, et al. Éifeachtaí tairbhiúla fadtéarmacha de chosc ar einsím a thiontú angiotensin in othair a bhfuil proteinuria nephrotic orthu. Am J Kidney Dis. 1992; 20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S, et al. Méadaíonn Angiotensin II an ghníomhaíocht chailciam intracellular i podocytes an glomerulus slán.DuánInt. 2000; 57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG, et al. Modhnaíonn Angiotensin II feidhmeanna ceallacha podocytes. Duán Int Supl. 1998; 67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E, et al. Laghdaíonn stráice léiriú neifrín trí mheicníocht spleách ar angiotensin II-AT(1) i podocytes daonna: éifeacht rosiglitazone. Am J Fisiol Duánach Fisiciúil. 2010; 298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. Síneadh, teannas agus greamaitheacht - meicníochtaí oiriúnaitheacha an chite-chnámharlaigh actin i podocytes. Eur J Cell Biol. 2006; 85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, et al. Gníomhachtú córas angiotensin fíocháin áitiúil i podocytes trí bhrú meicniúil. Duán Int. 2004; 65:30-39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C, et al. Rialaíonn fórsa síneadh timthriallach go roghnach iseatfhoirmeacha fachtóir fáis-béite i gcealla meangialacha francacha saothraithe. Am J Pathol. 1996; 148: 1915-1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Is céim ríthábhachtach é damáiste podocyte i bhforbairt glomerulosclerosis sa francach uni nephrectomized-desoxycorticosterone hypertensive. Cartlann Virchows. 1994; 425: 181-193.
29. Jung HS, Chung KW, Buaite Kim J, et al. Laghdaítear mais béite-chealla pancreatach agus hyperglycemia iarmhartach mar thoradh ar chailliúint autophagy. Metab Cille. 2008; 8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, et al.Útphagytábhachtach i hoiméastáis islet agus méadú cúiteach ar mhais béite-chealla mar fhreagra ar aiste bia ard-saill. Metab Cille. 2008; 8:325–332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, et al. Cosnaíonn uathphagaí cille endothelial agus podocyte go sineirgistíoch ó glomerulosclerosis de bharr diaibéiteas. Útphagy. 2015; 11: 1130-1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C, et al. Bíonn tionchar ag autophagy ar sho-ghabhálacht galar glomerular agus coinníonn sé hoiméastáis podocyte i lucha aosaithe. J Clin Infheistiú. 2010; 120: 1084-1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A, et al. Dhá chineál autophagy sna podocytes in eiseamail bithóipse duánach: staidéar ultrastruchtúrach. J Submicrosc Cytol Pathol. 2006; 38:167–174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, et al. Próiseáiltear MAP-LC3, marcóir autophagosomal geallta, le linn difreáil agus aisghabháil podocytes ó nephrosis PAN. FASEB J. 2003; 17:1165–1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al.Útphagytroideann galair trí fhéin-dhíleá cheallacha. Dúlra. 2008; 451: 1069-1075.
36. Yang L, Li P, Fu S, et al. Cuireann autophagy hepatic lochtach san otracht strus ER chun cinn agus cuireann sé friotaíocht inslin chun cinn. Metab Cille. 2010; 11:467–478.
37. Xie Z, DJ Klionsky. Foirmiú autophagosome: croí-innealra agus oiriúnuithe. Nat Cell Biol. 2007; 9:1102–1109.
38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Braite cothaitheach, uathphagy, agus nephropathy diaibéitis. Diaibéiteas. 2012; 61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, et al. Autophagy: sprioc teiripeach nua le haghaidhduántinneas. Clin Cait Nephrol. 2012; 16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Ról ag teacht chun cinn deuathphaigíi bhfeidhm na duáin, galair agus dul in aois. Útphagy. 2012; 8:1009–1031.
41. Weide T, Huber TB. Impleachtaí autophagy le dul in aois glomerular agus galair. Res Fíochán Cille. 2011; 343:467-473.
42. Bork T, Liang W, Yamahara K, et al. Coinníonn podocytes leibhéil arda basal autophagy neamhspleách ar chomharthaíocht mtor. Útphagy. 2020; 16: 1932-1948.
43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Spreagann gníomhachtú calpain agus secretion gortú glomerular i glomerulonephritis turgnamhach: fianaise ócaipitilstatin- lucha transgenic. J Am Soc Nephrol. 2006; 17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, et al. Sloinneadh podocyte-shonrach de Cre recombinase i lucha trasgenacha. Geineasas. 2003; 35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M, et al. Is cúis le galair neurodegenerative i lucha má chuirtear an t-uathphagy basal i gcealla néaracha faoi chois. Dúlra. 2006; 441: 885–889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O, et al. Rialaíonn an tetraspanin CD9 imirce agus iomadú cealla epithelial parietal agus dul chun cinn galar glomerular. Cumann Nat. 2019; 10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S, et al. Cuireann receptor fachtóir fáis epidermal chun cinn gortú glomerular agus teip duánach i glomerulonephritis crescentic atá ag dul chun cinn go tapa. Nat Med. 2011; 17: 1242-1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, et al. Cothaítear glomerulosclerosis diaibéiteach trí ghníomhú díreach an inteilín-1 ar phodicítí. J Am Soc Nephrol. 2014; 25: 1050-1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O, et al. Fachtóir núicléach erythroid 2-Tiomáineann fachtóir gaolmhar 2 léiriú podocyte-shonrach ar receptor peroxisome iomaitheoir-gníomhachtaithe g riachtanach le haghaidh friotaíochta in aghaidh GN corraitheach. J Am Soc Nephrol. 2016; 27: 172-188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R, et al. Glanann calpain arna scaoileadh ag T limficítí TLR2 chun slonn IL-17 a rialú. J Imdhíon. 2016; 196: 168-181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, et al. na caipitilin/caipitilstatinTá rólanna contrártha ag an gcóras i bhfás agus i scaipeadh meileatach meipitéiseach. PLoS a hAon. 2013; 8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, et al. Calpain cur le deisiú soithíoch i bhfoirm forásach tapa glomerulonephritis: ról féideartha a n-seachtrú. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012; 32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Amhránaí E, et al. Dhá éan feargach a mharú le cloch amháin:uathphaigígníomhachtú trí chaipitil a chosc i ngalar néarmheathlúcháin agus níos faide anonn. Biomed Res Int. 2019; 2019: 4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X, et al. GPS-CCD: clár ríomhaireachtúil nua chun suíomhanna scoilteachta caipitilin a thuar. PLoS a hAon. 2011; 6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, et al. CaMPDB: acmhainn le haghaidh caipitilin agus próitéalú modhnúcháin. Géanóm Eolas. 2010; 22: 202-213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J, et al. Réamhthuar beacht ar shuíomhanna scoilteachta calpain agus a n-easpa de bharr sócháin in ailse. Géinte Tosaigh. 2019; 10: 715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I, et al. Aistríonn scoilteacht Calpain-idirghabhála de Atg5 uathphagy go apoptosis. Nat Cell Biol. 2006; 8:1124–1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G, et al. Rialú na n-uathphagy basal ag calpain1 scoilteachta idirghabhála ATG5.Útphagy. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, et al. Scoilt Beclin-idirghabhálaithe de chuid Calpain-1 agus dírialú uathphaga tar éis gortú isceimic reitineach in vivo. Cealla Bás Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S, et al. Cuireann ANG II chun cinnuathphaigíi podocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 2010; 299:C488–C496.
61. Flannery PJ, Spurney RF. Idirghníomhú an receptor fachtóir fáis eipideirm ag angiotensin II i podocytes glomerular. Nephron Cait Nephrol. 2006; 103:e109–e118.
62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM, et al. Logánú imdhíon-cheimiceach ar ghabhdóir ANG II AT1 i bhfrancach fástaduánag baint úsáide as antashubstaint mhonaclónach. Am J Fisiol. 1997; 273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. Léiriú feidhmiúil ar an gcóras angiotensin renin i podocytes daonna. Am J Fisiol Duánach Fisiciúil. 2006; 290:F710–F719.
64. Gradam Pavenstadt H. Franz Volhard 2000: comharthaíocht angiotensin II sa podocyte. Preas Fola Duán Res. 2000; 23:156–158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. An córas renin-angiotensin aldosterone i podocytes. Semin Nephrol. 2012; 32:377–384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J, et al. Spreagann insileadh Angiotensin II athruithe ar léiriú neifrín agus apoptosis podocyte. Am J Nephrol. 2008; 28:500– 507.
67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P, et al. Méadaíonn gabhdóirí angiotensin glomerular cineál 1 gortú duáin agus athlasadh i nephritis uath-imdhíonachta murine. J Clin Infheistiú. 2009; 119:943-953.
68. Amhrán K, Stuart D, Abraham N, et al. Ní chuireann bailiú renin duct idirghabháil ar Hipirtheannas DOCA-salann nó gortú duánach. PLoS a hAon. 2016;11: 0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D, et al. Ról cosanta an chaipitilin endothelial knockout i lipopolysaccharide-spreagtha géarmhíochaineduángortú trí mhaolú ar chonair p{0}}iNOS agus táirgeadh NO/ROS. Exp Mol Med. 2020; 52:702-712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Tá gníomhaíocht Calpain mar bhunús ag táirgeadh aldosterone arna spreagadh ag angiotensin II i múnla cille adrenal glome rulosa. Inchríneolaíocht. 2015; 156: 2138-2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Nascann an calpain próitéáis spleách ar chailciam gníomhaíocht TRPC6 le gortú podocyte. J Am Soc Nephrol. 2018; 29: 2099-2109.
72. Feirmeoir LK, Rollason R, Whitcomb DJ, et al. Ceanglaíonn TRPC6 le calpain agus gníomhachtaíonn sé, neamhspleách ar a ghníomhaíocht cainéil, agus rialaíonn sé cítea-chnámharlach podocyte, greamaitheacht cille, agus motility. J Am Soc Nephrol. 2019; 30: 1910-1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, et al. Díriú ar an gcóras calpain/calpastatin mar straitéis nua chun athmhúnlú cardashoithíoch a chosc i Hipirtheannas arna spreagadh ag angiotensin II. Circ Res. 2008; 102:720-728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.Calpastatinrialaíonn sepsis polaimhiocróbach trí scaoileadh microparticle procoagulant a theorannú. Am J Respir Crit Care Med. 2012; 185:744-755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M, et al. Ról criticiúil na cothromaíochta caipitilin/calpastatin maidir le géardhiúltú allograft. Eur J Immunol. 2011; 41: 473–484.
76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, et al. Cosnaíonn cosc caipitil ar leith anduáni gcoinne athlasadh. Ionadaí Sci. 2017; 7:8016.
77. Ong SB, Lee WH, Shao NY, et al. Athchóiríonn cosc calpainuathphaigíagus cuireann sé cosc ar ilroinnt mitochondrial i múnla daonna iPSC den líopait deireadh diaibéitis. Ionadaí Gascheall 2019; 12:597–610.
78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. Scoilteacht in vitro na bpróitéiní arda trí phróitéisí báis cille. Útphagy. 2010; 6: 1042-1056.
79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M, et al. Rialú difreálach ar an gcoimpléasc calpain-calpastatin ag an L-fearainn decaipitilstatin. Biochim Biophysis Acta. 2014; 1843: 2583-2591.
