Laghdaíonn Coscóir ASK1 NQDI-1 Strus Ocsaídeach agus Néar-apoptóis Trí Chosán Comharthaíochta ASK1/p38 Agus JNK i Luath-ghortú Inchinne Tar éis Hemorrhage Fo-arachnoid i bhFrancaigh Cuid 1

Teibí. Is príomhphróisis phaiteolaíocha iad strus ocsaídiúcháin agus neuroapoptosis tar éis hemorrhage subarachnoid (SAH). Rinne an staidéar seo measúnú ar éifeachtaí frith-ocsaídiúcháin agus frith-apoptotic neuroprotective na comhartha apoptosis a rialaíonn kinase 1 (ASK1) inhib- itor eitile-2,7-dé-ocsó-2,7-dihydro-3H-naphtho(1,2, 3-de) quinoline1-carboxylate (NQDI-1) i gortú inchinne go luath (EBI) tar éis SAH i múnla francach. Baineadh úsáid as 191 francach san iomlán agus tionscnaíodh an tsamhail SAH trí úsáid a bhaint as polladh monafiliméid. Baineadh úsáid as blotáil an Iarthair ina dhiaidh sin chun leibhéil slonn ingenous próitéiní a bhrath. Baineadh úsáid as imdhíonfluaraiseacht ansin chun logánú néarcheallach ASK1 a dhearbhú. Rinneadh measúnú ar fheidhm néareolaíoch gearrthéarmach ag baint úsáide as na scóir leasaithe Garcia agus an tástáil iarmhéid bhíoma 24h tar éis SAH, ach rinneadh measúnú ar fheidhm néareolaíoch fadtéarmach ag baint úsáide as an tástáil rotarod agus tástáil lúbra uisce Morris. Rinneadh measúnú ar apoptosis na néaróin ag staining TUNEL agus rinneadh measúnú ar strus ocsaídiúcháin trí staining dihydroethidium 24 h tar éis SAH. D’ardaigh leibhéil slonn próitéine fosfarlaithe (p-)ASK1 agus ASK1 tar éis SAH. Instealladh intracerebroventricularly NQDI-1 1h tar éis SAH agus léirigh feabhsuithe suntasacha i bhfeidhm néareolaíoch gearrthéarmach agus fadtéarmach araon agus laghdú suntasach ar strus ocsaídiúcháin agus apoptosis néareolaíoch. Mar thoradh ar instealladh NQDI-1 tháinig laghdú suntasach ar leibhéil slonn próitéine de p-ASK1, p-p38, p-JNK, 4 hidroxynonenal, agus Bax agus mhéadaigh sé go suntasach na leibhéil léirithe próitéine de heme oxygenase 1 agus Bcl-2. Mar thoradh ar úsáid an choscóra p38 BMS-582949 nó an t-inhibitor JNK SP600125 tháinig laghduithe suntasacha ar leibhéil abairt próitéine p-p38 nó p-JNK, faoi seach, agus laghdú suntasach ar strus ocsaídiúcháin agus apoptosis neuronal; áfach, níor léirigh na coscairí seo éifeacht ar leibhéil slonn próitéine p-ASK1 nó ASK1. Mar fhocal scoir, d'fheabhsaigh cóireáil le NQDI-1 feidhm néareolaíoch agus laghdaigh sé strus ocsaídiúcháin agus apoptosis néarónach in EBI tar éis SAH i bhfrancaigh, b'fhéidir trí chosc ar fhosfaralú ASK1 agus an cosán comharthaíochta ASK1/p38 agus JNK. Féadfar NQDI-1 a mheas mar oibreán féideartha chun cóireáil a dhéanamh ar othair ar a bhfuil SAH.

Is féidir le glycoside cistanche méadú freisin ar ghníomhaíocht SOD i bhfíocháin chroí agus ae, agus laghdaítear go mór an t-ábhar lipofuscin agus MDA i ngach fíocháin, ag scavening go héifeachtach fréamhacha ocsaigine imoibríocha éagsúla (OH-, H₂O₂, etc.) agus a chosaint i gcoinne damáiste DNA a dhéantar. ag OH-radacach. Tá cumas láidir scavenging fréamhacha saor in aisce ag gliocóisídí cistanche feinileatánóideach, cumas laghdaithe níos airde ná vitimín C, feabhas a chur ar ghníomhaíocht SOD i bhfionraí sperm, laghdaigh ábhar MDA, agus tá éifeacht chosanta áirithe acu ar fheidhm membrane sperm. Is féidir le polaisiúicrídí cistanche feabhas a chur ar ghníomhaíocht SOD agus GSH-Px in erythrocytes agus fíocháin scamhóg lucha senescent turgnamhacha de bharr D-galactós, chomh maith le hábhar MDA agus collagen sa scamhóg agus plasma a laghdú, agus ábhar elastin a mhéadú. éifeacht scavenging maith ar DPPH, fadú am hypoxia i lucha senescent, feabhas a chur ar ghníomhaíocht SOD i serum, agus moill a chur ar dhíghiniúint fiseolaíoch na scamhóg i lucha senescent turgnamhach Le díghiniúint moirfeolaíoch cheallacha, tá sé léirithe ag turgnaimh go bhfuil an cumas frithocsaídeach maith ag Cistanche. agus tá an cumas aige a bheith ina dhruga chun galair aosaithe craicinn a chosc agus a chóireáil. Ag an am céanna, tá cumas suntasach ag echinacoside i Cistanche fréamhacha saor in aisce DPPH a scavening agus féadann sé speicis ocsaigine imoibríocha a scavening, cosc ​​a chur ar dhíghrádú collagen saor ó radacach saor in aisce, agus tá éifeacht mhaith deisiúcháin aige freisin ar damáiste anion radacach saor ó thymine.

Cliceáil ar Frith-aging Cistanche Para Que Serve

【Le haghaidh tuilleadh eolais: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Eochairfhocail: hemorrhage subarachnoid, NQDI-1, apoptosis a rialaíonn comhartha kinase 1, strus ocsaídiúcháin, apoptosis, gortú inchinne luath

Réamhrá

Is galar tromchúiseach cerebrovascular géarmhíochaine é hemorrhage subarachnoid (SAH) de bharr sreabhadh na fola isteach i spás subarachnoid na hinchinne (1). Mar sin féin, faoi láthair, níl aon drugaí éifeachtacha ar fáil chun damáiste fíocháin inchinn a fheabhsú tar éis SAH tar éis cosc ​​​​a chur ar rebleeding (2). Dá bhrí sin, tá gá go práinneach le tuilleadh staidéir ar mheicníochtaí díobhála inchinne tar éis SAH agus iniúchadh a dhéanamh ar roghanna cóireála cuí chun prognóis SAH a fheabhsú.

Tagraíonn gortú inchinne luath (EBI) do dhamáiste tánaisteach d’fhíochán inchinne de bharr suaitheadh ​​fiseolaíocha iolracha agus raon athruithe paiteolaíocha a tharlaíonn laistigh de 72 h ó thosaigh SAH (3). Sa chéim géarmhíochaine freagartha tar éis SAH, tosaíonn an díobháil le hiontráil líon mór fola isteach sa spás subarachnoid agus ina dhiaidh sin tá sraith díobhálacha paiteolaíocha (4). Toisc go bhfuil mitochondria go háirithe so-ghabhálach do hypoxia agus gortú ischemic, tá dysfunction mitochondrial ar cheann de na gortuithe paiteolaíocha príomhúla a fhulaingítear tar éis SAH (5). Scaoiltear líon mór speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS), rud a fhágann go bhfeabhsaítear strus ocsaídiúcháin agus gníomhachtú an chosáin apoptotic mitochondrial, rud a fhágann gortú agus mífheidhmiú mitochondrial (6). Dá bhrí sin, tá módúlachtaí teiripeacha a laghdaíonn strus ocsaídiúcháin agus apoptosis ríthábhachtach chun prognóis SAH a fheabhsú.

Tá Apoptosis a rialaíonn comhartha kinase 1 (ASK1), ball den teaghlach próitéin 3 kinase mitogen-gníomhachtaithe (MAP3K), i ngníomh ag go leor cineálacha éagsúla strus ceallacha agus tá ról tábhachtach aige i strus ocsaídiúcháin agus apoptosis (7). I gcultúir phríomhúla na néaróin hippocampal luch, aisiompaíonn an fasudil inhibitor Rho kinase - amyloid-spreagtha ingearchló fosfarylated (p-) ASK1, a laghdaíonn apoptosis neuronal i galar Alzheimer (8). Mar is fearr is eol dúinn, áfach, níl measúnú déanta ar na roghanna teiripeacha atá dírithe ar ASK1 tar éis SAH.

Tuairiscíodh go bhfuil eitile-2,7-dé-ocsó-2,7-dé-hidr-3H-nafta(1,2,3-de)quinoline1-carboxylate (NQDI-1) coscaire sonrach ASK1 agus tá sé bailíochtaithe ag baint úsáide as measúnachtaí in vitro kinase (9,10). Thuairiscigh staidéir roimhe seo go bhféadfadh NQDI-1 a bheith éifeachtach i gcóireáil galair iomadúla trí ghníomhaíocht ASK1 a chosc (11,12). Maolaíonn NQDI-1 damáiste mitochondrial de bharr microcystin-LR-spreagtha agus apoptosis i gcealla granulosa ovarian trí chosc ar ghníomhachtú ASK1 (13). Ina theannta sin, is féidir le indomethacin freagairtí easghluaiseachta apoptotic a aslú i gcealla glial trí ghníomhachtú ASK1 ar strus reticulum endoplasmic (14). Dá bhrí sin, féadfaidh an t-inchomhaire ASK1-shonrach NQDI-1 éifeachtaí neuroprotective a bheith aige tar éis SAH trí ghníomhaíocht ASK1 a chosc. meastar gurb iad p38 agus JNK na conairí comharthaíochta iartheachtacha ASK1; is féidir le p38 gníomhachtaithe agus JNK raon foshraitheanna a ghníomhachtú tuilleadh, lena n-áirítear fachtóirí trascríobh núicléacha chomh maith le kinases próitéine agus próitéiní feidhmiúla eile, rud a fhágann go dtiocfaidh strus ocsaídiúcháin agus apoptosis (15).

Ceapadh go n-imríonn coscaire ASK1 NQDI-1 éifeachtaí neuroprotective agus go laghdaíonn sé strus ocsaídiúcháin agus neuroapoptosis tríd an gcosán comharthaíochta ASK1 / p38 agus JNK in EBI tar éis SAH i bhfrancaigh.

abhair agus modhanna

Ainmhithe turgnamhacha.Cheadaigh an Coiste Eitice um Ainmhithe Turgnamhach na hOllscoile Láir Theas na turgnaimh ainmhithe (faomhadh uimh. 2019sydw0104). Bhí 191 francach fireann Sprague-Dawley (SD) ar mheá 280-320 g lonnaithe i dtimpeallacht teochta tairiseach (21-23˚C) agus taise (45-50 faoin gcéad ) le timthriall solais / dorcha 12/12-h. agus bhí rochtain saor in aisce aige ar uisce agus ar bhia. Rinneadh na turgnaimh ainmhithe go léir de réir threoirlínte Taighde Ainmhithe: Tuairisciú In Vivo Experiments (16) agus rinne na hInstitiúidí Náisiúnta Sláinte (NIH) Treoir um Chúram agus Úsáid Ainmhithe (17) iad. Nuair a shroich francaigh pointe ama réamhshocraithe an turgnaimh nó nuair a chomhlíon siad critéir áirithe le haghaidh eotanáis [caillteanas iomlán appetite ar feadh 24 h nó droch-goile (50 faoin gcéad faoi bhun an gnáth) ar feadh 3 lá, neamhábaltacht ithe nó ól, nó measadh go raibh siad á n-ól. gar don bhás (iompar féindhíobhálach, staidiúir neamhghnácha, anacair riospráide, etc.)], cuireadh na francaigh i bhfeiste eotanáis dé-ocsaíd charbóin le ráta díláithrithe toirte CO2 socraithe ag 30 faoin gcéad / nóim (18). Deimhníodh an bás le scor den análú agus buille croí agus dilation na ndaltaí. Cuireadh conablaigh na bhfrancach ar fad i málaí agus reoite chun iad a dhiúscairt ar bhealach neamhdhíobhálach don chomhshaol.

Múnla SAH. The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >Measadh gur shásaigh 8 measúnú ar scór grádaithe SAH na riachtanais thurgnamhach agus gur shamhail rathúil a bhí ann. Bhí an nós imeachta don ghrúpa sham cosúil le nós imeachta an ghrúpa SAH, cé is moite de nár thángthas ar an mballa artaireach ag an tsreang 4-0 proline. Rinneadh monatóireacht ar an riospráid, ar an ráta croí, ar dhath an chraicinn, agus ar an athfhleasc pedal gach 5 nóiméad le linn na gcéimeanna aisghabhála máinliachta agus ainéistéiseach. Astu seo, fuair 23 francach bás agus fágadh 8 bhfrancach as an áireamh, agus forlíontar na básanna agus na heisiaimh seo le francaigh nua a ndearnadh múnla SAH orthu.

Déine SAH.Rinneadh measúnú ar dhéine SAH agus úsáid á baint as scór grádaithe SAH 24 h tar éis SAH (20). Roinneadh taobh ventral an fhíocháin inchinn ina 6 réigiún, gach ceann díobh rátáilte 0-3 ag brath ar an méid téachtáin fola agus cé chomh maith agus a doiléiríodh na soithigh fola: Léiríonn scór 0 nach bhfuil clot ar bith, Léiríonn 1 méid beag clot, léiríonn 2 méid measartha clot ach tá soithí móra ag an mbonn cloigeann fós inaitheanta, agus léiríonn 3 líon mór clot agus soithí neamh-inaitheanta ag bun an cloigeann. Rinneadh na sé scór réigiúnacha a achoimriú chun scór iomlán (0-18) a ríomh, áit ar léirigh scóir níos airde hemorrhage níos déine. Measadh go raibh SAH éadrom ag francaigh le scór grád iomlán SAH níos lú ná nó cothrom le 8, eisiata ó thurgnaimh ina dhiaidh sin, agus cuireadh francaigh nua-mhúnlaithe ina n-ionad.

Riaradh drugaí.Chun go bhféadfaí na tiúchain drugaí i bhfíochán inchinn a rialáil níos cruinne go neamhspleách ar an ae agus fachtóirí eile, riaradh na siRNAs agus NQDI-1 trí instealladh intracerebroventricularly (21). Tar éis ainéistéiticithe (ionduchtú, 3 faoin gcéad isoflurane; cothabháil, 2 faoin gcéad isoflurane), socraíodh na francaigh ar ghaireas stereotacsach inchinn. Socraíodh an microinjector leis an bregma ag 1.0 posterior, 1.5 ar dheis, agus 3.3 mm ar doimhneacht. Rinneadh an siRNA ASK1 (cat. uimh. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) nó rialú Scr siRNA (cat. uimh. 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a thuaslagadh in uisce dí-ianaithe steiriúil 5 µl saor ó núicléas ag tiúchan de 500 pmol agus riar 48 h roimh SAH. Ba iad seo a leanas na seichimh ASK1 siRNA: Sense 5'‑CGG CAGACAUUGUAUCAAtt‑3' agus antisense 5'‑UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc‑3'. Baineadh úsáid as tiúchan agus dáileoga drugaí a tuairiscíodh i staidéar comhchosúil (22) agus intuaslagthacht NQDI-1 chun na tiúchain a úsáideadh sa staidéar reatha a chinneadh. Instealladh trí dháileog de NQDI-1 (1, 3, agus 10 µg/kg; Selleck Chemicals) nó tuaslagán feithicle i dtoirt iomlán 5 µl/rat 1 h tar éis SAH. D’fhéadfadh an BMS-582949 (100 mg/kg; Selleck Chemicals), SP600125 (30 mg/kg; Selleck Chemicals), agus réitigh feithicle an bacainn fola-inchinn a thrasnú agus tugadh iad go hin-inchinn 1 h tar éis SAH (23,24).

Feidhm néareolaíoch gearrthéarmach.Baineadh úsáid as scór modhnaithe Garcia agus an scór comhardaithe bhíoma chun an fheidhm néareolaíoch gearrthéarmach 24 h tar éis SAH a mheas. Roinneadh scór mionathraithe Garcia i sé chatagóir mar seo a leanas: Gluaiseacht dheonach, gluaiseacht dheonach géaga, síneadh forepaw, cumas dreapadóireachta, freagraí somatosensory, agus freagairt tentacle, gach ceann acu a scóráil ina n-aonar agus achoimriú chun scór iomlán idir 3-18 a thabhairt. (25). Measadh go léiríonn scóir níos airde feidhm néareolaíoch níos fearr. Maidir le scór comhardaithe an léasa, cuireadh francaigh ar léas ar feadh 1 nóiméad agus rinneadh scór ó 0-4 a mheasúnú bunaithe ar an bhfad a shiúileadh (26). Measadh go léiríonn scóir níos airde feidhm néareolaíoch níos fearr.

Feidhm néareolaíoch fadtéarmach.Rinneadh turgnaimh réamh-oiriúnaithe Rotarod ar fhrancaigh ag baint úsáide as an treoluas agus an luasghéarú tosaigh céanna roimh shamhaltú SAH. Cuireadh na francaigh ar thástálaí barra rothlach Rotamex (Columbus Instruments) le haghaidh tástála Rotarod ar laethanta 7, 14, agus 21 tar éis SAH (27). Ar dtús, socraíodh an luas Rotarod tosaigh go 5 réabhlóid in aghaidh an nóiméid agus an luasghéarú go 2 réabhlóid in aghaidh na 5 soicind. Tar éis na francaigh a chur ar, taifeadadh latency titim na francaigh. Bhí cead ag na francaigh scíth a ligean ansin ar feadh 1 u. Ar deireadh, tástáladh latency titim na francaigh arís ag an luas tosaigh de 5 réabhlóidí in aghaidh an nóiméid agus luasghéarú 2 réabhlóidí in aghaidh na 5 soicind. Measadh go léiríonn latency titim níos faide comhordú mótair níos fearr sa francach. Ag seachtaine 4 tar éis samhaltú SAH, baineadh úsáid as tástáil lúbra uisce Morris chun cuimhne foghlama agus treoshuíomh spásúil na francaigh a mheas (27). Rinneadh an cleachtadh foghlama maidir le snámh agus aimsiú ardáin suite faoi dhromchla an uisce ó lá 1 go lá 5 ar sheachtain 4 (laethanta 28-33 tar éis SAH) agus taifeadadh an trajectory snámha, latency éalaithe, agus fad snámha. Ar an lá deiridh, baineadh an t-ardán le haghaidh tástála, agus taifeadadh ruthag snámha, fad snámha agus fad ceathrúna an taiscéalaithe ar feadh 60 soicind.

MÁ staining.Tar éis perfusion seicheamhach de 4˚C saline agus 4˚C, 4 faoin gcéad paraformaldehyde ón gcroílár chun fuil a bhaint as an bhfíochán inchinn, fuarthas fíochán inchinn slán. Tar éis díhiodráitithe grádáin shiúcrós, gearradh an fíochán inchinn ina chodanna 10-µm i suíomh corónach agus stóráladh é ag -20˚C. Baineadh úsáid as staining IF chun measúnú a dhéanamh ar chomhlonnú ASK1 le cealla nerve. Cuireadh bac ar ailt fíocháin reoite ag baint úsáide as séiream asail 5 faoin gcéad (cat. uimh. G1217-5ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) ar feadh 2 h ag teocht an tseomra agus gor thar oíche ag 4˚C le príomhantasubstaintí mar a leanas: Frith-ASK1 (luch; 1:200; cat. uimh. 67072-1-Ig; ProteinTech Group, Inc.), frith-NeuN (coinín; 1:200; cat. uimh. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) , móilín oiriúntóra ceangailteach cailciam frith-ianaithe-1 (Iba-1; coinín; 1:200; cat. uimh. 10904-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), agus próitéin aigéadach snáithíneach frith-glial (GFAP; sicín; ; 1:200; cat. uimh. ab4674; Abcam). Ansin goradh na codanna fíocháin ar feadh 2 h ag teocht an tseomra leis na hantasubstaintí tánaisteacha fluaraiseacha comhfhreagracha mar seo a leanas: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H móide L) (cat. uimh. 715-585-150; 1:500; ; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H móide L) (cat. uimh. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), agus Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H móide L) (cat. uimh. 703-545-155; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Ina dhiaidh sin, rinneadh iad a dhaite le haghaidh núicléis cille ag baint úsáide as 2 µg/ml DAPI (cat. uimh. G1012-100ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra. Rinneadh measúnú ar na codanna ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseachta Olympus BX53 (Olympus Corporation) agus gabhadh íomhánna.

Dihydroethidium (DHE) staining.Rinneadh staining DHE chun strus ocsaídiúcháin na hinchinne a mheas (28). Goradh rannóga fíocháin inchinne reoite le 2 µmol/l DHE (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ag 37˚C ar feadh 30 nóiméad sa dorchadas. Tar éis staining do núicléis cille ag baint úsáide as 2 µg/ml DAPI ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra, rinneadh measúnú ar na codanna ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseachta Olympus BX53. Roghnaíodh sé rannóg san iomlán ó gach fíochán inchinn go randamach agus roghnaíodh sé réimse i ngach rannóg go randamach le haghaidh íomháithe. Áiríodh líon na gceall DHE-dearfach ag baint úsáide as bogearraí ImageJ 1.4 (Institiúidí Náisiúnta Sláinte) agus rinneadh an meán a ríomh agus a ghlacadh mar na céatadáin deiridh do gach cuid den fhíochán inchinne.

staining TUNEL.Baineadh úsáid as staining TUNEL chun céatadán na néaróin apoptotic (29) a mheas. Cuireadh bac ar ailt fíocháin reoite ag baint úsáide as serum asal 5 faoin gcéad ar feadh 2 h ag teocht an tseomra agus gortha thar oíche ag 4˚C le frith-NeuN antashubstainte príomhúil (coinín; 1:200; cat. uimh. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc. .). Goradh na hailt fíocháin ansin leis an antashubstaint thánaisteach fluaraiseacha Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H móide L) (cat. uimh. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) ar feadh 2 h. ag teocht an tseomra. Rinneadh staining TUNEL ag baint úsáide as trealamh Measúnaithe TUNEL Apoptosis One Step (cat. uimh. C1090; Institiúid Biteicneolaíochta Beyotime) de réir phrótacal an mhonaróra. Ar deireadh, bhí na hailt fíocháin dhaite le haghaidh núicléis cille ag baint úsáide as 2 µg/ml DAPI ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra. Roghnaíodh láithreacha comhairimh TUNEL go randamach agus ríomh néaróin TUNEL-dearfach do gach cuid ag baint úsáide as an modh thuasluaite le haghaidh comhaireamh DHE.

Blotting an Iarthair (WB).Baineadh úsáid as WB chun leibhéil slonn próitéine a leathchainníochtú. Tar éis perfusion de 4˚C saline ón gcroílár chun fuil a bhaint as an bhfíochán inchinn, fuarthas fíochán inchinn slán. Thuairiscigh staidéir roimhe seo go n-eascraíonn samhail SAH, a tharlódh trí phuncture endovascular ar an taobh clé, go bhfuil beagán claonta i dtreo imeachtaí fuilithe agus go bhféadfadh sé a bheith sách dian i dtéarmaí damáiste d'fhíochán inchinne taobh clé (30). Mar sin, baineadh úsáid as an bhfíochán inchinne ar an taobh clé chun measúnú a dhéanamh ar an damáiste paiteolaíoch tar éis samhaltú SAH. Baineadh próitéiní fíocháin inchinne ag baint úsáide as réiteach lysis RIPA (cat. uimh. P0013B; Institiúid Biteicneolaíochta Beyotime) de réir phrótacal an mhonaróra. Chinn an measúnú BCA (cat. uimhir. P0012; Institiúid Biteicneolaíochta Beyotime) tiúchan próitéine na samplaí agus rinneadh é a choigeartú ina dhiaidh sin go 5 µg/µl trí mhéideanna éagsúla uisce driogtha dúbailte a chur leis. Cuireadh na samplaí próitéine 5 µl de 5 µg/µl le gach lána agus scartha na samplaí próitéine seo ar glóthacha 10 faoin gcéad le leictreafóiréis SDS-PAGE agus aistríodh iad chuig seicní PVDF. Cuireadh bac ar na seicní ar feadh 2 h ag teocht an tseomra ag baint úsáide as bainne púdraithe neamh-saille 5 faoin gcéad (cat. P0216-300g; Institiúid Biteicneolaíochta Beyotime). Goradh na seicní thar oíche ag 4˚C le príomhantasubstaintí mar seo a leanas: Frith-p‑ASK1 (Ser‑83; 1:1,000; cat. uimh. MA5-28020; Thermo Fisher Scientific, Inc. .), frith-ASK1 (1:1,000; cat. uimh. 8662; Cell Signaling Technology, Inc.), frith-p‑p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1 ,000; cat. uimh. 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), frith‑p38 MAPK (1:1,000; cat. uimh. 8690; Teicneolaíocht Chomharthaíochta Cille, Inc.), kinase próitéine frith-fospho-stress-acti- vated/Jun-aimín-críochfort kinase (phospho-SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1,000; cat. uimh. 9255; Comharthaíocht Cille Technology, Inc.), frith-SAPK/JNK (JNK; 1:1,000; cat. uimh. 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), frith-4 hiodrocsainonenal (4-HNE; 1:1 ,000; cat. uimh. ab46545; Abcam), frith-heme oxygenase 1 (HO-1; 1:1,000; cat. uimh. 82206; Cell Signaling Technology, Inc.), frith-Bcl‑2 (1:1,000; cat. uimh. 26593-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), frith-Bax (1,1{000; cat. uimh. 60267-1‑Ig; ProteinTech Group, Inc.) agus frith‑ -actin (1:2,000; cat. uimh. 4970; Teicneolaíocht Chomharthaíochta Cille, Inc.). Ina dhiaidh sin tugadh gor leis na hantasubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha sár-rádai-ruadhaire cuí ar feadh 2 h ag teocht an tseomra: Frith-luch gabhar IgG-HRP (cat. uimh. sc-2005; 1:5,000; Biteicneolaíocht Santa Cruz , Inc.) nó gabhar frith-choine IgG-HRP (cat. uimh. sc‑2004; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), agus léiríodh na bandaí sonracha ag baint úsáide as trealamh ECL (cat. uimh. P0018AS; Institiúid Biteicneolaíochta Beyotime) agus íomhánna á n-úsáid ag baint úsáide as córas UVP Che Studio PLUS (Analytik Jena GmbH). Rinneadh anailís densitometric coibhneasta ar bhannaí WB ag baint úsáide as bogearraí ImageJ 1.4 (NIH) agus normalaíodh na leibhéil slonn próitéine i gcoinne -actin.

Dearadh turgnamhach

Athruithe slonn agus logánú ceallach ASK1 tar éis SAH. San iomlán go randamach 36 francach do shé ghrúpa (n=6/grúpa) mar a leanas: i) Sham-oibrithe (sham), ii) 3 h tar éis an SAH, iii) 6 h tar éis an SAH, iv ) 12 h iar‑SAH, v) 24 h iar‑SAH agus vi) 72 h iar‑SAH. Baineadh úsáid as WB chun athruithe ar leibhéil slonn próitéine ASK1 agus p-ASK1 a mheas. Roinneadh 4 fhrancach breise san iomlán i ngrúpaí sham (n=2) agus SAH 24 h (n=2) agus úsáideadh staining IF chun comhlonnú ASK1 a mheas.

Éifeachtaí teiripeacha coscaire ASK1 NQDI-1 ar fheidhm néareolaíoch gearrthéarmach agus fadtéarmach tar éis SAH. Roinneadh 30 francach i 5 ghrúpa (n=6/grúpa) mar seo a leanas: i) Sham, ii) SAH móide feithicil, iii) SAH móide 1.0 µg /kg NQDI‑1, iv) SAH móide 3.0 µg/kg NQDI‑1 agus v) SAH móide 10.0 µg/kg NQDI‑1. Baineadh úsáid as na scóir chomhardaithe Garcia modhnaithe agus bhíoma chun measúnú a dhéanamh ar fheidhm néareolaíoch gearrthéarmach 24 h tar éis SAH. Bunaithe ar mhéid an fheabhsaithe néareolaíoch gearrthéarmach, measadh gurbh é 3.0 µg/kg NQDI-1 an grúpa dáileoige is oiriúnaí agus úsáideadh an dáileog seo de NQDI-1 i dturgnaimh ina dhiaidh sin. Roinneadh 30 francach i 3 ghrúpa (n=10) mar a leanas: i) Seam, ii) SAH móide feithicil, agus iii) SAH móide NQDI-1. Baineadh úsáid as turgnamh rotarod chun measúnú a dhéanamh ar fheidhm néareolaíoch fadtéarmach ar laethanta 7, 14, agus 21 tar éis SAH, agus rinneadh tástáil lúbra uisce Morris ag seachtaine 4 tar éis SAH chun measúnú a dhéanamh ar fheidhm néareolaíoch fadtéarmach.

Éifeachtaí teiripeacha coscaire ASK1 NQDI-1 ar strus ocsaídiúcháin agus apoptosis. Roinneadh 12 francach san iomlán i 3 ghrúpa (n=4/grúpa) mar a leanas: i) Seam, ii) SAH móide feithicil, agus iii) SAH móide NQDI-1. (THE) rinneadh staining chun measúnú a dhéanamh ar strus ocsaídiúcháin agus baineadh úsáid as staining TUNEL chun apoptosis neuronal a mheas 24 h tar éis SAH.

Ról cosán comharthaíochta ASK1/p38 agus JNK in éifeachtaí teiripeacha NQDI-1. Roinneadh 48 francach in 8 ngrúpa (n=6/grúpa) mar seo a leanas: i) Sham, ii) SAH, iii) SAH móide feithicil, iv) SAH móide NQDI-1, v) SAH móide scrofa (Scr) cur isteach gearr (si)RNA, vi) SAH móide ASK1 siRNA, vii) SAH móide BMS-582949 agus viii) SAH móide grúpaí SP600125. Instealladh an siRNA ASK1, an t-inhibitor p38 BMS-582949, agus an t-inhibitor JNK SP600125 chun a mheas an raibh baint ag ASK1, p38, agus JNK le héifeachtaí neuroprotective NQDI-1.

Anailís staitistiúil. Cuireadh na sonraí i láthair mar an meán ± diall caighdeánach agus fuarthas sonraí turgnamhacha WB i 6 mhacasamhlú neamhspleácha, agus rinneadh staining DHE agus staining TUNEL mar 4 mhacasamhlú neamhspleácha. Rinneadh anailís ar shonraí ag baint úsáide as SPSS leagan 17 (SPSS, Inc.). Rinneadh measúnú ar shonraí ó thástáil uisce gcathair ghríobháin Morris agus úsáid á baint as ANOVA measctha/ bearta débhealaigh arís agus arís eile ANOVA, agus an tástáil iar hoc LSD ina dhiaidh sin. Tástáladh sonraí ó na turgnaimh a bhí fágtha le haghaidh dáileadh normalach ag baint úsáide as gnáththástáil dáilte Shapiro-Wilk agus ANOVA aontreo ina dhiaidh sin agus triail chomparáid iolrach post hoc Tukey ina dhiaidh sin. Rinneadh graif a bhreacadh le GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.). p<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Torthaí

Básmhaireacht agus déine SAH. Úsáideadh 191 francach SD san iomlán sa staidéar reatha, agus fágadh 8 bhfrancach as an áireamh mar gheall ar SAH éadrom amháin (scór grádaithe SAH Níos lú ná nó cothrom le 8). As na francaigh SD a úsáideadh sna turgnaimh, bhí 34 francach sa ghrúpa sham agus chuaigh 149 francach faoi shamhaltú SAH. Ní bhfuair aon francaigh sa ghrúpa sham; áfach, fuair 23 francach bás tar éis samhaltú SAH (ráta básmhaireachta 15.4 faoin gcéad ) (Táblaí SI-V). I gcomparáid leis an ngrúpa sham, bhí clotanna sa spás subarachnoid lonnaithe go príomha in aice le fáinne Willis agus ar an dá thaobh den artaire basilar tar éis samhaltú SAH (Fíor 1 A). Níor léirigh an scór grádaithe SAH 24 h samhaltú iar-SAH aon difríocht shuntasach i déine hemorrhage idir na grúpaí neamh-sham agus difríocht shuntasach idir sham agus gach grúpa neamhsham (Fig. 1 B).

Athruithe slonn próitéine agus logánú ceallach ASK1 tar éis SAH. Mhéadaigh leibhéil slonn próitéine ASK1 agus shroich buaicphointe ag 24 h san inchinn tar éis SAH (Fíor 1C agus D). Mar sin féin, níor léirigh an cóimheas idir an slonn próitéine de p-ASK1/ASK1 aon difríocht shuntasach (Fíor 1C agus E). Léiríodh logánú ceallacha ASK1 le néaróin NeuN-dearfach, microglia Iba-1-dearfach, agus astrocytes GFAP-dearfach sa ghrúpa sham agus SAH 24 h (Fíor 1F-H).

Feabhsaíonn coscaire ASK1 NQDI-1 feidhmeanna néareolaíocha gearrthéarmacha 24 h tar éis SAH. Rinneadh NQDI‑1 (1, 3, agus 10 µg/kg) a instealladh infhéitheach go háirithe 1 h tar éis SAH. Bhí scóir chomhardaithe Garcia agus léasa modhnaithe i bhfad níos ísle ag francaigh a bhí faoi shamhaltú SAH 24 h tar éis samhaltú SAH; Mar sin féin, mar thoradh ar na trí dháileog de NQDI-1 tháinig feabhas suntasach páirteach ar fheidhm néareolaíoch gearrthéarmach (Fíor 2A agus B). Bhí na scóir leasaithe Garcia i bhfad níos airde sa ghrúpa SAH móide NQDI-1 (3.0 µg/kg) i gcomparáid leis an ngrúpa SAH móide NQDI-1 (1.0 µg/kg); níor léiríodh aon difríochtaí suntasacha staitistiúla, áfach, i gcomparáid leis an ngrúpa SAH móide NQDI-1 (10.0 µg/kg) (Fíor 2A agus B), a thug le tuiscint gur tharla méadú breise ar an tiúchan de NQDI-1 gan a thuilleadh feabhsuithe a fháil ar an bhfeidhm néareolaíoch gearrthéarmach tar éis SAH. Mar sin, measadh gurbh é NQDI-1 (3.0 µg/kg) an tiúchan éifeachtach optamach agus úsáideadh é i dturgnaimh ina dhiaidh sin.

Feabhsaíonn coscaire ASK1 NQDI-1 feidhmeanna néareolaíocha fadtéarmacha tar éis SAH. Ag baint úsáide as luasanna tosaigh de 5 nó 10 rpm don tástáil Rotarod, laghdaíodh latency titim go suntasach sa ghrúpa feithiclí SAH móide i gcomparáid leis an ngrúpa sham, cé go raibh an latency titim fada fada tar éis instealladh intracerebroventricular NQDI-1 i gcomparáid leis an SAH móide feithicle. grúpa (Fíor 2C agus D). Ina theannta sin, le linn laethanta 1-5 de chéim traenála thástáil lúbra uisce Morris ag seachtain 4 tar éis an SAH, léirigh an grúpa feithiclí SAH móide latency éalaithe i bhfad níos faide agus fad snámha i gcomparáid leis an ngrúpa sham, ach léirigh cóireáil NQDI-1 a laghdú suntasach i gcomparáid leis an ngrúpa feithiclí SAH móide (Fíor 2E-G). Sa chéim tástála nuair a baineadh an t-ardán ciorclach faoi uisce, níor breathnaíodh aon difríochtaí suntasacha i dtreoluas snámha idir na trí ghrúpa (Fíor 2H). Bhí fad an cheathrú taiscéalaithe i bhfad níos giorra sa ghrúpa feithiclí SAH móide i gcomparáid leis an ngrúpa sham agus chuir cóireáil NQDI-1 go mór leis an am taiscéalaíochta i gcomparáid leis an ngrúpa feithiclí SAH móide (Fíor 2I).

Laghdaíonn coscaire ASK1 NQDI-1 strus ocsaídiúcháin agus apoptosis néarónach 24 h iar-SAH. Rinneadh leibhéal an strus ocsaídiúcháin a thomhas ag baint úsáide as staining DHE agus rinneadh measúnú ar chomhréir na néaróin apoptotic ag baint úsáide as céatadán na néaróin TUNEL-dearfach 24h tar éis SAH. Bhí céatadán na gceall DHE-dearfach i bhfad níos airde sa ghrúpa feithiclí SAH móide i gcomparáid leis an ngrúpa sham agus tháinig laghdú suntasach ar chóireáil NQDI-1 i gcomparáid leis an ngrúpa feithiclí SAH móide (Fíor 3A agus). Bhí céatadán na néaróin TUNEL-dearfach i bhfad níos airde sa ghrúpa feithiclí SAH móide i gcomparáid leis an ngrúpa sham. Mar sin féin, tháinig laghdú suntasach ar chéatadán na néaróin TUNEL-dearfach tar éis cóireála le NQDI-1 i gcomparáid leis an ngrúpa feithiclí SAH móide (Fíor 3B agus D).

Feabhsaíonn ASK1 siRNA, BMS-582949, agus SP600125 feidhmeanna néareolaíocha gearrthéarmacha 24 h iar-SAH. I gcomparáid leis an ngrúpa SAH móide Scr siRNA nó grúpa feithiclí SAH móide, léirigh riarachán ASK1 siRNA, BMS-582949 nó SP600125 feabhas suntasach ar an scór comhardaithe Garcia modhnaithe agus léas (Fíor 4A agus B).

Laghdaíonn NQDI-1 strus ocsaídiúcháin agus apoptosis tar éis SAH trí fosfarú laghdaithe ASK1, p38, agus JNK. Bhí leibhéil slonn próitéine ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE, HO-1, Bax, agus Bcl-2 i bhfad níos airde tar éis SAH i gcomparáid leis an ngrúpa sham; áfach, ní raibh difríocht shuntasach idir an cóimheas p-ASK1/ASK1 (Fíor 5A-M). Níor chothaigh instealladh feithicle nó Scr siRNA difríochtaí suntasacha i leibhéil slonn na próitéine i gcomparáid leis an ngrúpa SAH. I gcomparáid leis an ngrúpa feithiclí SAH móide, ba chúis le cóireáil ag baint úsáide as NQDI-1 laghdú suntasach ar leibhéil slonn próitéine p-ASK1/ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE, agus Bax, ach leibhéil slonn próitéine de H.O. -1 agus Bcl-2 méadaithe go suntasach. I gcomparáid leis an ngrúpa SAH móide Scr siRNA, tháinig laghdú suntasach ar leibhéil slonn próitéine ASK1 tar éis instealladh ASK1 siRNA. Mar thoradh ar chóireáil le siRNA ASK1 freisin tháinig laghdú suntasach ar leibhéil slonn próitéine p-p38, p-JNK, 4-HNE, agus Bax agus méadú suntasach ar abairt HO-1 agus Bcl-2 i gcomparáid leis an SAH móide Scr siRNA grúpa.

laghdaíonn inhibitor p38 BMS-582949 na leibhéil slonn próitéine de p-p38 ach ní dhéanann sé difear do leibhéil slonn próitéine p-ASK1, ASK1, nó p-JNK. Léirigh cóireáil leis an inhibitor p38 BMS-582949 laghdú suntasach ar leibhéil slonn próitéine de p-p38, 4-HNE, agus Bax agus freisin méadú suntasach ar léiriú próitéine de HO-1 agus Bcl-2 i gcomparáid leis an ngrúpa feithiclí SAH móide; áfach, níor léirigh leibhéil slonn próitéine ASK1, p-ASK1/ASK1 agus p-JNK aon difríochtaí suntasacha (Fíor 6A-M). Laghdaíonn inhibitor JNK SP600125 an leibhéal slonn próitéine de p-JNK ach ní dhéanann sé difear do leibhéil slonn próitéine p-ASK1, ASK1, nó p-p38. Ba chúis le cóireáil le coscaire JNK SP600125 laghdú suntasach ar leibhéil slonn próitéine p-JNK, 4-HNE, agus Bax agus méadú suntasach ar leibhéil slonn próitéine HO-1 agus Bcl-2 i gcomparáid leis an ngrúpa feithiclí SAH móide; áfach, níor athraíodh go suntasach leibhéil slonn próitéine ASK1, p-ASK1/ASK1, agus p-p38 (Fíor 7A-M).

【Le haghaidh tuilleadh eolais: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】