Fachtóirí Feidhme Frith-Aosaithe Agus Meicníocht Cistanche Deserticola

[Teibí] Cuspóir: Chun iniúchadh a dhéanamh ar anfachtóirí feidhmiúla frith-agingagus meicníocht na substainte inite agus íocshláinteCistanche fásachbunaithe ar chógaseolaíocht líonra agusin vivoturgnaimh ar an múnla-orgánachCaenorhabditis elegans. Modhanna: Spriocanna féideartha na mór-chomhpháirteanna iC. deserticola Bhí siad tuartha ag Bunachar Sonraí Cógaseolaíochta agus Anailíse Chórais Leighis na Síne Traidisiúnta (TCMSP), SwissTargetPrediction, GeneCards, Inheritance Mendelian Online in Man (OMIM), agus bunachair shonraí eile. Cuireadh na spriocanna tuartha isteach in ardán anailíse líonra STRING chun an líonra idirghníomhaíochta próitéine-próitéine (PPI) de na comhpháirteanna gníomhacha agus na spriocanna galair a fháil, chun na príomhspriocanna a scagadh amach. Baineadh úsáid as anailís saibhrithe cosán Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) chun cosáin ghníomhaithe a thuar agus a anailísiú, agus ba é Cytoscape a thóg an líonra conair-sprioc-sprioc-chomhpháirte leigheas-ghníomhach.C. elegansroinnte ina ghrúpa bán agusC. deserticolagrúpaí le tiúchain éagsúla. Réise saoil, cumas atáirgthe, agus cumas aclaíochtaC. elegansbreathnaíodh go díreach. Tá gníomhaíochtaí superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px) agus ábhar malondialdehyde (MDA) agus speiceas ocsaigin imoibríoch (ROS) iC. elegansarna chinneadh ag an measúnú trealamh. Baineadh úsáid as imoibriú slabhra cainníochtúil polaiméaráise fíor-ama (qRT PCR) chun léiriú géinte a bhaineann le saolré agus athrú ar chumas struis a chinneadh.C. elegans. Torthaí: Is féidir leis na fachtóirí feidhme féideartha gníomhú ar75spriocanna a bhaineann le dul in aois, agus8próitéiní croí-sprioc, lena n-áirítear próitéin turraing teasa HSP90- (HSP)90AA1), receptor estrogen (ESR1), GTPase HRas (HRAS), prothrombin (F2), miotalpróitéinasaí maitrís-2 (MMP2), heicsicín-2 (HK2), sucrase-isomaltase (SI) agus maltase-glucoamylase (MGAM), a scagadh amach trí anailís topology. Léirigh anailís KEGG go bhféadfadh cur isteach ar Cistanche deserticola27cosáin lena n-áirítear cosán comharthaíochta estrogen, cosán comharthaíochta ailse, cosán comharthaíochta GnRH, agus cosán comharthaíochta inslin chun moill a chur ar aosú.Cistanche deserticolais féidir leis an meán-am marthanais a leathnú go suntasach agus feabhas a chur ar chumas strus ocsaídiúcháinC. elegans, gníomhaíochtaí SOD, CAT agus GSH-Px a fheabhsú, agus carnadh ROS agus MDA a laghdú, agus cur in iúldaimh-2agusaois-1Bhí laghdú, agus an abairt dedaimh-16agus a spriocghéinte iartheachtacha (fód-3, MTL-1, GST-4,ctl-1agusCTL-2) a mhéadú, chomh maith leskn-1agus géinte a bhaineann le turraing teasa (HSF-1, hsp-16.1agushsp-16.2). Conclúid: Cuirtear an chógaseolaíocht líonra i bhfeidhm chun meicníocht fhéideartha a mhíniúC. deserticolai frith-aging, agus tá sé cruthaithe goC. deserticolais féidir le saolré naC. elegansagus an cumas frith-strus a fheabhsú. Féadfaidh an mheicníocht a bheith bainteach le cosc ​​​​ar an gcosán comharthaíochta inslin agus gníomhachtú na bhfachtóirí trascríobh iartheachtacha deDAF-16agus géinte a bhaineann le turraing teasa, rud a chuireann le cumas strus ocsaídiúcháinC. elegans.

Eochairfhocail:Cistanche deserticola YC Ma; frith-aosú; fachtóirí feidhmiúla; meicníocht ; strus ocsaídiúcháin

Sliocht CISTANCHE LE 75% GLYCOSIDE

Cistanche deserticola YC MaIs ábhar lómhara traidisiúnta leighis na Síne é i mo thír. Tugtar "Desert Ginseng" air. Taifeadadh é den chéad uair i "Shen Nong's Materia Medica" agus tá sé liostaithe mar ghrád barr. Bíonn blas milis, saillte, te sa nádúr, agus filleann sé ar fhadlínte na duáin agus an intestine mór. Creideann leigheas traidisiúnta na Síne go bhfuil na héifeachtaí aige mar duáin yang a chothú, ag athlánú bunúsach agus fola, agus ag moisturizing an intestines agus purgóideach bheith mar thoradh[1]

. In 2018, cuireadh Cistanche deserticola (desert) san áireamh sa "Chatalóg Substaintí go Traidisiúnta Bia agus Ábhair Íocshláinte na Síne" [2], agus tá a luach i bhforbairt táirgí sláinte aitheanta. De réir staitisticí, níl minicíocht Cistanche deserticola in oidis frith-aosaithe agus fadaithe saoil ach amháin i gcás ginseng [3]. Léiríonn taighde cógaseolaíochta nua-aimseartha go bhfuil frithocsaídeach suntasach, frith-aging, frith-tuirse, feabhsú cuimhne agus éifeachtaí eile ag Cistanche deserticola [4], ach níl a fachtóirí feidhmiúla agus a mheicníocht frith-aging fós soiléir. Is orgánach ilcheallach é Caenorhabditis elegans (dá ngairtear néimeatóid anseo feasta) le cúlra géiniteach soiléir, saolré réasúnta gearr, atáirgeadh tapa, agus cultúr éasca. De réir mar a mhéadaíonn a shaolré, taispeánann sé feinitíopa aosaithe cosúil le feinitíopa daoine. Tá géinte, próitéiní agus cosáin chomharthaíochta C. elegans caomhnaithe go mór ag daoine.

Tá homaleolaíocht 60% go 80% aige le géinte daonna. Le blianta beaga anuas, úsáideadh néimeatóidí go forleathan i dtaighde frith-aosaithe ar leigheas traidisiúnta na Síne agus leigheas nádúrtha [5]. Úsáideann an staidéar seo modhanna cógaseolaíochta líonra chun comhábhair ghníomhacha, spriocanna agus bealaí comharthaíochta Cistanche deserticola a thuar maidir le moill a chur ar aosú; ag baint úsáide as néimeatóidí mar orgánaigh mhúnla, trí bhreathnú ar a saolré, atáirgeadh agus táscairí foriomlána eile, déantar na hathruithe ar strus ocsaídiúcháin, ar chumas aclaíochta agus ar a gcaidreamh le saolré a thomhas Léiriú na ngéinte gaolmhara, ag iniúchadh meicníocht Cistanche deserticola maidir le moill a chur ar aosú, agus soláthar faisnéis maidir le sláinte ghaolmhar

Tagairt a sholáthar maidir le forbairt agus cur i bhfeidhm táirgí sláinte.

1 Ábhar

1. 1 Ionstraimí

Micreascóp steirió SMZ-168 (Cuideachta Mótach); micreascóp fluaraiseachta codarsnachta céim inbhéartaithe CKX41 (cuideachta Olympus); Léitheoir microplate Multiskan FC (cuideachta eolaíoch Thermo Fisher); Amplifier géine imoibriú slabhra polaiméaráis Mycycler (PCR), ionstraim PCR cainníochtúil fhluaraiseachta MJ Mini ™ (Cuideachta Bith-Rad).

1. 2 Leigheas a thástáil

Bailíodh Cistanche deserticola ó bhunáit plandála Dea-Chleachtais Talmhaíochta Cistanche deserticola (GAP) i gContae Yutian, Xinjiang. D'aithin an taighdeoir Zhang Tiejun ó Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co., Ltd é mar Cistanche deserticola YC Ma; Eistir aigéad dé-eitile 2ʹ,7ʹ-dichlorodihydrofluorescein (DCFH DA), 2% NaN3 (Cuideachta Sigma); Imoibrí Trizol, trealamh sintéise cDNA, SYBR Green Kit (Takara Bioengineering Co., Ltd.); trealamh superoxide dismutase (SOD), trealamh catalase (CAT), trealamh glutathione peroxidase (GSH Px), trealamh malondialdehyde (MDA) (Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.); imoibriú slabhra cainníochtúil polaiméaráise fluaraiseachta (qRT PCR) Rinneadh na primers riachtanacha a shintéisiú ag Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd., agus tá na seichimh primer léirithe i dTábla 1.

1.3 Néimeatóidí

Tháinig na 10 gcineál géiniteacha éagsúla néimeatóidí a úsáideadh sa turgnamh ar fad ó Ionad Géineolaíochta Caenorhabditis. Tá an fhaisnéis mhionsonraithe léirithe i dTábla 2.

2 Modh

2.1 Fachtóirí feidhmiúla agus spriocanna Cistanche deserticola a scagadh

Trí athbhreithniú a dhéanamh ar an litríocht agus tréithriú roimhe seo an ghrúpa taighde seo ar an ngrúpa ábhar Cistanche deserticola a chomhcheangal, rinneadh na príomh-chomhábhair cheimiceacha agus na comhpháirteanna fola a scagadh amach [{{{0}}]. Tarraing an struchtúr cumaisc i mbogearraí ChemDraw 19.0, cuir isteach é i mbunachar sonraí SwissTargetPrediction (http://new.swisstargetprediction.ch/), agus bain úsáid as an modh meaitseála pharmacophore droim ar ais chun torthaí fíorúla scagtha a fháil. Ag an am céanna, baineadh úsáid as Ardán Bunachar Sonraí Cógaseolaíochta agus Anailíse Chórais Leigheas na Síne Traidisiúnta (TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php). Úsáid feidhm chuardaigh UniProtKB i mbunachar sonraí UniProt (http://www.uniprot.org/) agus Athbhreithnithe

Déanann Swiss-Prot na próitéiní a scagadh, an speiceas a theorannú go "daonna", agus spriocphróitéin an chomhdhúil a cheartú don ainm géine. Comhtháthaigh spriocthorthaí an dá bhunachar sonraí chun spriocleabharlann ionchasach de chomhdhúile a fháil.

2.2 Anailís thuarthach ar spriocanna a bhaineann le haosú

Bain úsáid as bunachair shonraí GeneCards (https://www.genecards.org/) agus OMIM (https://omim.org/) chun cuardach a dhéanamh leis na heochairfhocail “old, senile, decrepit, senescence, feeble, caducity”, áit a bhfuil GeneCards Genes le Scrúdaíodh scór níos mó ná nó cothrom le 10%, cumascadh torthaí an dá bhunachar sonraí, cuireadh deireadh le géinte dúblacha, agus fuarthas spriocanna a bhaineann le dul in aois ar deireadh. Ansin comhcheangail spriocanna na bhfachtóirí feidhme faoi mhír 2.1 leis na spriocanna thuasluaite a bhaineann le haosú, tóg an crosbhealach, agus tarraing léaráid Venn.

2.3 Tógáil líonra idirghníomhaíochta próitéine-próitéine (PPI).

Ionchuir an sprioc trasnaithe faighte isteach san ardán sonraí STRING 11.5 (http://string-db.org/), teorannaigh an speiceas go "Homo sapiens", is é 0.900 an leibhéal muiníne is airde den scór idirghníomhaíochta, agus an líonra PPI a fháil. Sábháil na sonraí i bhformáid .TSV agus iompórtáil isteach i Cytoscope

3. 8.0 bogearraí, coigeartaigh an méid nód agus doimhneacht dath leis an luach céime chun an líonra PPI de chomhábhair ghníomhacha Cistanche deserticola agus spriocanna galair a fháil. Roghnaíodh pointí a raibh a dtrí pharaiméadar céime, idirghaolmhaireachta agus cóngarachta go léir níos airde ná an t-airmheán mar spriocanna lárnacha, agus fuarthas 8 sprioc lárnach san iomlán tar éis an scagtha.

2. 4 Bith-anailís Ontology Géine (GO) agus Géinte agus Géinte Kyoto

Úsáideann anailís saibhrithe cosáin Encyclopedia of Groups (KEGG) bunachar sonraí OmicsBean (http://www.omicsbean.cn/login/) chun anailís fheidhmiúil GO agus anailís saibhrithe cosáin KEGG a dhéanamh ar na spriocanna trasnaithe, a shórtáil de réir luach P, agus Déan anailís ar na cosáin mar thoradh air.

2.5 Ábhair íocshláinte-comhpháirteanna-spriocanna-tógáil líonra cosáin

Ábhair íocshláinte, comhpháirteanna, spriocanna, agus cosáin a allmhairiú isteach i mbogearraí Cytoscope 3.8.0 chun líonra ábhar íocshláinte-comhpháirt-sprioc-chonair íocshláinte Cistanche deserticola a thógáil.

2.6 Cultúr néimeatóidí

Saothraíodh néimeatóidí ag 20 céim ag baint úsáide as meán NGM (ina bhfuil 0.750 g de NaCl, 0.625 g de tryptone agus 4.250 g de agar i 250 ml d'uisce dúbailte driogtha). Baineadh úsáid as Escherichia coli aimridithe OP50 (65 céim , 45 min) mar fhoinse bia agus scaipeadh go cothrom ar dhromchla mheán cultúir NGM. Úsáid tuaslagán lysis (5% NaClO, 5 mol·L–1 NaOH) chun na néimeatóidí a shioncronú, agus saothraigh na néimeatóidí sioncronaithe go dtí an chéim L4 i gorlann 20 céim. Roghnaíodh néimeatóidí céim L4 go randamach agus roinneadh iad i ngrúpa rialaithe (meán NGM) agus grúpaí riaracháin Cistanche deserticola le comhchruinnithe mais éagsúla le haghaidh turgnaimh.

2.7 Ullmhúchán drugaí

Tóg 10 g de Cistanche deserticola ábhar íocshláinte, cuir uisce driogtha de réir an chóimheas ábhar-leachtach de 1:10, aife agus sliocht faoi dhó, 2 h gach uair, le chéile na sleachta uisce, scagaire agus díriú go dtí triomacht faoi. brú laghdaithe. Bain úsáid as uisce driogtha steiriúil chun tuaslagán máthar a ullmhú le mais tiúchan 50 mg·mL–1 (bunaithe ar mhéid an amhdhruga). Úsáid meán saothraithe NGM chun réitigh a ullmhú le mais-tiúchan deiridh de 0, 25, 50, 75, 100, 200, agus 500 ug·mL–1 le húsáid níos déanaí.

2.8 Tástáil tocsaineachta

Aistríodh néimeatóidí N2 chuig miasa petri ina raibh mais-tiúchain éagsúla de Cistanche deserticola (0, 25, 50, 100, 200, 500 ug·mL–1), 100 i ngach grúpa. Áiríodh lá an riaracháin mar lá 0. Athraigh an meán ina bhfuil leigheas úr gach lá agus taifead bás néimeatóidí chun raon dáileog sábháilte Cistanche deserticola a fháil.

2.9 Turgnamh struis

Aistríodh néimeatóidí N2 go cealla ina raibh mais-tiúchan éagsúil de Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1

) sa mhias petri, 100 i ngach grúpa. Áiríodh lá an riaracháin drugaí mar lá 0. Cuireadh meán cultúir úra ina bhfuil drugaí in ionad gach lá. Rinneadh turgnamh struis ar an 7ú lá de riaradh drugaí. Sa turgnamh strus ocsaídiúcháin, aistríodh néimeatóidí ó gach grúpa go meán NGM (cuireadh 10 μL de 30% H2O2 le gach 10 mL de mheán NGM), agus taifeadadh maireachtáil néimeatóidí gach 30 min. Sa turgnamh strus teasa, bhí na néimeatóidí faoi lé go leanúnach go dtí 35 céim agus saothraithe, agus taifeadadh stádas marthanais na néimeatóidí gach 2 h.

2. 10 Turgnamh lúbthachta coirp

Glac néimeatóidí N2, grúpáil iad agus tabhair na cóireálacha céanna atá in 2.9. Ar an 3ú agus an 7ú lá tar éis riarachán drugaí, rinneadh turgnamh lúbthachta coirp. Tógadh 20 néimeatóidí ó gach grúpa, agus braitheadh ​​agus taifeadadh líon lúbadh coirp na néimeatóidí laistigh de 30 s.

2. 11 Turgnamh caidéil pharyngeal

Glac néimeatóidí N2, grúpáil agus riar iad faoi na coinníollacha céanna le 2.9, cuir 1 néimeatóid i ngach mias petri, agus socraigh 5 comhthreomhar le haghaidh gach tiúchan maise. Breathnaigh faoi steirémhicreascóp ar laethanta 0, 3, agus 7 den riarachán. Breathnaíodh minicíocht shlogtha na néimeatóidí ar feadh 60 s gach uair agus taifeadadh líon na gcaidéal pharyngeal.

2.12 Turgnamh atáirgeadh

Tóg néimeatóidí N2 céim L1 agus cuir sa mheán cógas-dhrugaí iad agus saothraigh go dtí an chéim L4 iad. Ansin, aistrigh iad go meán nua ina bhfuil drugaí le tiúchan mais éagsúla gach lá, agus tomhais líon na n-uibheacha a leagann na néimeatóidí. Na plátaí d'aois ina bhfuil uibheacha a chur ar Tar éis saothrú ar feadh 48 h ag 20 céim , cinneadh ar líon na sliocht . Tá 1 néimeatóid i ngach mias petri, agus socraítear 5 chomhthreomhar do gach olltiúchan.

2.13 Carnadh lipofuscin a chinneadh

Tóg néimeatóidí N2, grúpáil agus riar na cóireálacha céanna atá i 2.9, le 100 néimeatóidí i ngach grúpa. Rinneadh turgnaimh tomhais Lipofuscin ar an 7ú agus 11ú lá de riarachán drugaí. Roghnaíodh 35 néimeatóidí go randamach agus cuireadh ar leatháin agarose 2%, ainéistéiseach le 2% NaN3, agus úsáid micreascóp fluaraiseachta (ba é an tonnfhad solais excitation 360 ~ 370 nm, agus an solas astaithe (Tonnfhad: 420 ~ 460 nm) Breathnaigh ar an gorm uathfhluaraiseacht sa néimeatóid, agus úsáid bogearraí imageJ 1.51 chun déine an fhluaraiseachta a chainníochtú.

2. 14 Cinneadh MDA, ábhar ROS agus gníomhaíocht einsím frithocsaídeach

Tóg néimeatóidí N2, grúpáil agus riar na cóireálacha céanna atá in 2.9, le 100 néimeatóidí i ngach grúpa. Ar an 7ú lá tar éis an riaracháin, nitear na néimeatóidí ar mheán cultúir gach grúpa le tuaslagán clóiríd sóidiam 0. 9% agus bailíodh iad i bhfeadán lártheifneora 1. 5 ml, homogenized ar oighear, agus lártheifneoirithe ag 3000 r·min{{{} 10}} ar feadh 10 nóiméad (ga lártheifeacha 42. 5 mm), tóg an comhshó tar éis lártheifneora, agus bain úsáid as trealamh chun gníomhaíochtaí ábhar SOD, CAT, GSH-Px agus MDA a thomhas. Sa turgnamh cinnteoireachta ROS, nitear na néimeatóidí trí huaire le maolán M9, cuireadh iad i dtuaslagán DCFH-DA le tiúchan deiridh de 10 μmol·L–1, agus goraíodh iad ag 37 céim sa dorchadas ar feadh 20 nóiméad, ag croitheadh ​​gach 5. nóim. Ansin nigh dhá uair le maolán M9, agus cuir na néimeatóidí ar sleamhnán gloine. Glac pictiúir ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseachta (tonnfhad solais excitation 485 nm, tonnfhad solais astaithe 520 nm), agus bain úsáid as bogearraí ImageJ 1.51 chun déine fluaraiseachta coibhneasta a mheas.

2. 15 Fachtóir luasghéaraithe lobhaithe-16 (DAF-16), traslonnú núicléach SKN-1 agus SOD-3, glutathione S-transferase-4 (GST{{). 8}}), próitéin turraing teasa-16. 2 (HSP -16. 2) Amharcléiriú ag baint úsáide as néimeatóidí trasghéineacha TJ356 agus LG333 faoi seach do thurgnaimh trasghluaiseacht núicléach próitéin DAF-16 agus SKN-1.

Baineadh úsáid as néimeatóidí trasgenacha CF1553, CL2166, agus TJ375 chun slonn próitéiní SOD-3, GST-4, agus HSP-16.2 a chinneadh. Is ionann grúpáil agus riarachán agus iad siúd faoi 2.9. Ar an 7ú lá tar éis riarachán drugaí, baineadh úsáid as micreascóp fluaraiseachta chun pictiúir de néimeatóidí a ghlacadh i ngach grúpa, agus úsáideadh bogearraí ImageJ 1.51 chun déine fluaraiseachta GFP a chainníochtú.

2. 16 Réimse saoil néimeatóidí mutant a chinneadh

Rinneadh turgnaimh trí úsáid a bhaint as néimeatóidí CF1038, EU1, PS3551, agus DA1116, faoi seach, agus roinneadh iad i ngrúpa rialaithe agus grúpa riaracháin Cistanche deserticola 75 ug·mL–1. Rinneadh ráta marthanais néimeatóidí i ngach grúpa a chomhaireamh gach lá. 2. Turgnamh 17 qRT-PCR: Aistríodh néimeatóidí N2 céim L4 go meán cultúir NGM (ina bhfuil 150 μmol·L–1 pentfluorouracil) ina raibh mais-tiúchan éagsúil de Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1), 20 Goir ag céim ar feadh 6 lá. Baineadh RNA iomlán ó néimeatóidí ag baint úsáide as modh Trizol agus tras-scríobhadh droim ar ais ina cDNA le haghaidh cainníochtú mRNA. Próiseáladh na sonraí ag baint úsáide as an modh 2–ΔΔCt, agus úsáideadh act-1 mar an ghéin thagartha inmheánach.

2. 18 Anailís sonraí

SPSS 19. Baineadh úsáid as bogearraí0 chun anailís staitistiúil a dhéanamh, agus cuirtear na sonraí in iúl mar (-x ± s). Rinneadh anailís ar dhifríochtaí idir grúpaí ag ANOVA aontreo, agus P<0.05 was considered a statistically significant difference.

3. Toradh

3.1 Comhábhair ghníomhacha agus spriocanna féideartha Cistanche deserticola

Trí athbhreithniú a dhéanamh ar an litríocht agus a chomhcheangal le taighde roimhe seo an ghrúpa taighde seo, roghnaíodh 12 chomhpháirt cheimiceacha lena n-áirítear gliocóisídí feinileatánóideach, iridoids agus lignans mar sprioc-chomhdhúile do thaighde cógaseolaíochta líonra. Taispeántar an fhaisnéis shonrach i dTábla 3. Tar éis dúblaigh a bhaint den bhunachar sonraí, fuarthas 86 sprioc san iomlán le haghaidh 12 chomhábhar gníomhacha féideartha.