Éifeacht Frith-Aosú Urolithin A Ar Oicítí Bólachta In Vitro

Déan teagmháil le do thoiloscar.xiao@wecistanche.comle haghaidh tuilleadh eolais

Coimriú:Bhí baint ag strus ocsaídeach agus mífheidhm miteachondrial leis an meath a bhaineann le haois ar cháilíocht úicítí agus tá straitéisí chun iad a chosc á gceistiú faoi láthair. Is meitibilít nádúrtha é Urolithin A (UA) le héifeachtaí pro-apoptotic agus frithocsaídeacha, atá in ann carnadh mitochondria mífheidhmiúil a chosc i gcealla aois éagsúla. Níor tástáladh UA riamh in úicítí buaibheach. Ba é an aidhm a bhí againn ná staidéar a dhéanamh ar éifeacht UA ar chumas forbartha léiriú coimpléisc cumulus-oocyte (COCs) agus cealla granulosa (GCanna) de ghéinte tábhachtacha a bhaineann le hinniúlacht atáirgthe. Rinneadh measúnú ar dhul chun cinn aibithe núicléach, poitéinseal membrane mitochondrial (MMP), agus inniúlacht forbartha úicítí in aois fiseolaíoch (22 h) agus úicítí in vitro d'aois (30 h de IVM) a fuarthas ó mhná réamhbhreithe agus fásta, arna bhforlíonadh le UA nó nár cuireadh. Ina theannta sin, rinneadh méid mRNA de roinnt géinte (NFE2L2, NQO1, agus mt-DN5) agus líon na gcóipeanna DNA mt-ND5 a chainníochtú i GCanna saothraithe ó mhná réamhbhreithe agus aosacha, arna bhforlíonadh le UA nó ná bíodh. Dhearbhaigh ár staidéar an éifeacht dhochrach a bhaineann le haosú úicítí ar dhul chun cinn aibithe núicléach, MMP, inniúlacht forbartha, agus leibhéil léiriú géine. Cóireáil UA le linn aibithe in vitro feabhsaithe (lch<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

KSL01

Cliceáil anseo le do thoil chun tuilleadh eolais a fháil

Eochairfhocail:úicít; ag dul in aois ; Urolitin A; teicneolaíochtaí atáirgthe cuidithe

1. Réamhrá

Tá meath ar chumas atáirgthe baineann ar cheann de na chéad fheidhmeanna fiseolaíocha a bhfuil drochthionchar ag dul in aois orthu agus mar sin meastar gur fadhb sláinte atá ag teacht chun cinn ar fud an domhain é [1,2]. Chomh maith le roinnt fadhbanna paiteolaíocha, tá an laghdú a bhaineann le haois ar thorthúlacht na mban curtha i leith go príomha le laghdú ar chúlchiste ovarian na n-úicítí [1,3-5] in éineacht le meath ar a gcáilíocht atá ag brath ar am [2]. Is féidir leis an bpróiseas meathlaithe seo tarlú mar gheall ar nochtadh na n-úicítí do mhicrea-thimpeallacht ovarian aosta roimh ovulation. Ina theannta sin, is minic go mbíonn an gaiméit baineann faoi réir aosú iar-ovulation nuair nach dtarlaíonn an próiseas toirchithe laistigh den tréimhse réise is fearr is féidir, agus go bhfanann an t-úicít neamhthoirchithe san ubhagán nó in vitro roimh inseamhnú ar feadh tréimhsí fada [6] Lagú Is fachtóir ríthábhachtach é cáilíocht úicítí a bhaineann le teip na dteicneolaíochtaí atáirgthe cuidithe (EALAÍN) toisc gurb é a cháilíocht an príomhchinntitheach d’acmhainneacht forbartha an suth tar éis toirchithe [7,8]. Tuairiscíodh go minic go gcuireann asincrónach ovulation agus úicítí aosta isteach ar rath na gclár táirgthe inseamhnaithe saorga agus suthanna sa láir, san eallach agus sa chaoirigh, rud a chiallaigh go bhfuil caillteanais eacnamaíocha tábhachtacha[1,9,10]. Dá bhrí sin, tá sé ríthábhachtach staidéar a dhéanamh ar na meicníochtaí is bun le haosú úicítí, chun cineálacha cur chuige teiripeacha níos fearr a dhearadh chun torthúlacht a tharrtháil i roinnt speiceas, lena n-áirítear daoine, agus freisin mar uirlis le haghaidh feabhsú géiniteach beostoic.cisteanche wirkungNí mór aird ar leith a thabhairt ar fheabhas a chur ar chumas forbartha úicítí ó eallach prepubertal, a úsáidtear go minic chun gnóthachan géiniteach a luathú agus eatraimh ghiniúna a ghiorrú.

Is é ceann de na príomhchúiseanna le lagú inniúlachta forbartha in aois úicítí ná an méadú ar strus ocsaídiúcháin, rud a chothaíonn mífheidhm mitochondrial, damáiste DNA, agus earráidí foirmithe fearsaidí, rud a chuireann isteach ar cháilíocht úicítí [1]. Tá sé bunaithe go maith go bhfuil táirgeadh méadaithe fréamhacha saor in aisce ina chúis le dul in aois cheallacha i roinnt galair ainsealacha agus freisin i mbitheolaíocht atáirgthe, rud a fhágann drochthorthaí torthúlachta [12]. Soláthraíonn an microthimpeallacht ovarian, a chuimsíonn úicítí agus cealla granulosa (GCanna), meicníocht cosanta frithocsaídeach atá in ann coinníollacha ocsaídiúcháin a rialáil agus an t-iarmhéid ocsaídiúcháin / frithocsaídeach a chothabháil [13]. Mar sin féin, le linn an phróisis aosaithe, déantar éifeachtúlacht na gcosaintí frithocsaídeacha chun speicis ocsaigine imoibríocha (ROS) a neodrú a mhaolú, rud a mhéadaíonn leibhéal an strus ocsaídiúcháin. Is cascáid freagartha ceannasach é an fachtóir Núicléach-E{2-(Nrf2 nó NFE2L2), ar a dtugtar freisin mar Nrf2/Kelch-mhaith ECH-choibhneasta próitéin 1 (Keap1), easghluaiseachta freagartha ceannasach ghníomhachtú ag strus ocsaídiúcháin[14]. Is meicníocht cheallacha cosanta é an cosán seo a d'fhorbair cealla chun dul i ngleic le héifeachtaí díobhálacha strus ocsaídiúcháin. Faoi ghnáthchoinníollacha, déantar Nrf2 a rialú go diúltach ag Keap1, a choinnítear sa cíteaplasma, agus a chothabháil ag leibhéil ísle. Nuair a nochtar é d’ocsaídeoirí, dícheanglaítear Nrf2 ó Keapl, rud a fhágann gur féidir é a thrasuíomh sa núicléas mar a nascann sé le seichimh DNA ar leith. Is é an toradh a bhíonn ar na seichimh seo, atá ainmnithe mar eilimintí freagartha frithocsaídeacha (ARE), ná gníomhachtú tras-scríobhach géinte cíteachosanta, mar NAD(P)H:quinone-oxidoreductase-1 (NQO1), heme oxygenase-1 (HMOX1) , agus fo-aonad catalaíoch ligáis glutamáit-cistéin (GCLC)[15,16]. Léiríodh i staidéir roimhe seo go laghdaíonn gníomhachtú chonair chomharthaíochta Nrf{2-Keapl damáiste struis ocsaídiúcháin trí leibhéil frithocsaídeacha a ardú i GCanna daonna agus ovaries luiche[17,18]. Mar sin féin, tá a ról sa phróiseas aosaithe gaiméite baineann fós doiléir, cé go bhfuil sé cruthaithe go soiléir gurb iad mitochondria an príomhshuíomh táirgthe do ROS le linn an phróisis seo [9,10].

KSL02

Is féidir le Cistanche frith-aging

Os a choinne sin, tá baint ag mitochondria le roinnt feidhmeanna ceallacha ríthábhachtacha agus tá siad bunúsach chun freastal ar an éileamh ar tháirgeadh fuinnimh a theastaíonn le linn aibithe úicítí agus forbairt suthach ina dhiaidh sin [19]. Tá baint mhór ag gníomhaíocht mitochondrial inniúil le hábhar níos airde de DNA mitochondrial (mt-DNA) agus giniúint ATP [20], acmhainneacht membrane mitochondrial níos airde [21], agus cothabháil cáilíochta agus cainníocht mitochondria trí mitochondria [22]. Thairis sin, moltar gníomhaíocht mitochondrial a chomhghaolú go díreach le hinmharthanacht suth agus torthaí torthúlachta níos fearr [23]. Tacaíonn fianaise mhéadaithe go spreagann athruithe miteachondrial a bhaineann le haois an t-aosú ovarian agus go laghdaítear inmharthanacht suth agus acmhainneacht ionchlannaithe ina dhiaidh sin. Áirítear leis na hathruithe seo uimhir chóip mt-DNA laghdaithe, giniúint ATP laghdaithe [20], athruithe ar léiriú géine mitochondrial [24, damáiste mt-DNA [25], agus acmhainneacht laghdaithe membrane mitochondrial [26].

KSL03

Spreag cur chuige teiripeacha spriocdhírithe Mitochondria suim mhór i roinnt paiteolaíochtaí a bhaineann le dul in aois mar gheall ar a n-acmhainneacht mhór chun feabhas a chur ar fheidhm mitochondrial [27]. Laistigh den chreat seo, tá sé léirithe ag Urolithin A (UA) - meitibilít nádúrtha a fhaightear tar éis bia cosúil le pomegranates a ionghabháil agus é a thiontú go microbiota an gut - chun carnadh mitochondria mífheidhmiúil le haois a chosc, rud a chothaíonn mitochondria agus go gcothaíonn sé mitochondrial freisin. bithgenesis agus cumas riospráide [28,29]. Tá UA curtha i bhfeidhm mar dhruga teiripeacha a bhfuil gealladh fúthu chun roinnt ailsí a chosc, amhail ailse cholaireicteach agus próstatach[30,31]. Ina theannta sin, tá airíonna frith-athlastacha [32], frith-otracht [33], frithocsaídeach [34] agus frith-aosaithe [35] ag UA freisin.bioflavonoids citrisLe staidéar a rinneadh le déanaí tá aird tugtha ar na héifeachtaí atá ag forlíonadh UA ar fibroblasts craiceann daonna seanaoise ar ghníomhachtú chonair Keapl Nrf ag cur lena gcumas frithocsaídeach. Maolaíonn gníomhachtú chonair Keapl Nrf go héifeachtach leibhéal ROS, trí slonn Nrf2 iartheachtacha ARE-freagra géinte (SOD, NQO1, GCLC, agus HMOX1) a thabhairt suas chun dáta, rud a thugann le fios go bhfuil tuar dóchais inti éifeacht frith-aosaithe [ 35].

KSL04

Tá roinnt staidéar déanta agus é mar aidhm acu moill a chur ar aosú ovarian, agus dá réir sin feabhas a chur ar cháilíocht úicítí agus ar thorthaí torthúlachta. Mar gheall ar an méid a chuireann strus ocsaídiúcháin leis an bpróiseas aosaithe ovarian, chomh maith le mífheidhmiú mitochondrial, tá forlíonadh le frithocsaídeoirí le feiceáil mar theiripe tuar dóchais inti [36,37]. Mar sin féin, ní fios cé acu an bhféadfadh forlíonadh Urolithin A an damáiste a tharlaíonn le linn aosú ovarian a chur ar ais chun fadhbanna neamhthorthúlachta a chosc. Mar sin, ba í aidhm an staidéir seo:(1) a léiriú go bhféadfadh aosú acmhainneacht forbartha coimpléisc cumulus-úicítí(COC) agus léiriú GCanna ar ghéinte tábhachtacha a bhfuil baint acu le cosán comharthaíochta Nrf2 a athrú;(2) chun a chinneadh an féidir le UA tarrthála. torthúlacht baineann a léiríonn éifeacht frith-aosaithe i COCanna agus GCanna d'aois; agus (3) meastóireacht a dhéanamh ar éifeacht UA ar leibhéal slonn na ngéinte a bhaineann le cosán comharthaíochta Nrf2 chomh maith le cáilíocht úicítí.

2. Ábhair agus Modhanna

2.1. Dearadh Turgnamhach

D'fhormheas Coiste um Chúram Ainmhithe an Údaráis Náisiúnta Tréidliachta (Céim N 08965DGAV) an staidéar seo, de réir threoirlínte an Aontais Eorpaigh (uimh.86/609/CEE). Chun imscrúdú a dhéanamh ar an éifeacht a bhaineann le dul in aois ar athrú cáilíochta úicítí agus ar an éifeacht fhrith-aosaithe a d’fhéadfadh a bheith ag UA, múnla a úsáideann COCanna a bailíodh ó bha réamhpubertal agus aosach a cuireadh isteach chuig aosú in Vitro (30 h tar éis aibithe) nó chuig an aibiú fiseolaíoch (22). h) cuireadh próisis i bhfeidhm.

2.1.1.Measúnú Roimhe Seo – Staidéar ar Dháileog-Fhreagartha

Rinneadh measúnacht roimhe seo chun an tiúchan UA ba cheart a úsáid le linn phróiseas aibithe COCanna buaibheach a chinneadh bunaithe ar staidéar ar fhreagra dáileog i gceithre sheisiún. Ós rud é nach ndearnadh tástáil ar UA riamh in úicítí bólachta, baineadh úsáid as dáileoga roimhe seo go rathúil chun roinnt ailsí a chosc agus a mhaolú agus chun éifeacht frith-aosaithe UA a léiriú i línte cille éagsúla [28,39]. Roghnaíodh COCanna a fhaightear ó bhó réamhfhásta agus aibí fásta (n=978) agus ansin roinneadh iad go randamach i gcúig ghrúpa chun dáileoga éagsúla UA a thástáil: rialú, 1,10,25, agus 50 uM le linn aibithe in vitro fiseolaíoch. Tar éis na tréimhse aibithe, rinneadh roinnt úicítí (n=154) a dhaite chun na céimeanna cumraíochta crómasómacha agus aibithe a chinneadh. Cuireadh na húicítí aibithe a bhí fágtha faoi bhráid inseamhnaithe in vitro le seamhan reoite/leáite. Saothraíodh zygotes toimhdeacha, agus socraíodh rátaí scoilteachta agus blastocyst ag lá 2 agus lá 7 den chultúr, faoi seach. Bunaithe ar na torthaí a fuarthas, eadhon easpa éifeachtaí díobhálacha agus cur chun cinn aibithe agus forbairt blastocyst, roghnaíodh an tiúchan de 1 uM de UA.

2.1.2.Turgnamh1

Sa turgnamh seo, a rinneadh i sé sheisiún, COCanna araon ó réamhphubertal (meanaois=9 mí, n=660) agus duine fásta (meanaois =39mí, n=674) Bailíodh ba chun cáilíocht úicítí agus acmhainneacht forbartha na n-úicítí aosta agus aibithe go fiseolaíoch a mheas chomh maith le héifeacht UA chun torthúlacht ban a tharrtháil. Roinneadh COCanna go randamach i 8 ngrúpa: (1) grúpa rialaithe réamhpubertal, COCs ó laonna prepubertal aibithe ar feadh 22h (n=148);(2)ghrúpa réamhpubertal UA, COCs ó laonna prepubertal aibithe i meán fhorlíonadh le 1 uM de UA ar feadh 22 h (n=155);(3)grúpa réamhbhreithe 30 h d'aois a rialú, COCanna ó laonna prepubertacha atá trí 30h d'aibiú in oitro (n=149);(4)UA 30 h d'aois grúpa prepubertal, COCs ó laonna prepubertal in vitro d'aois ar feadh 30h i meán aibithe arna fhorlíonadh le 1 uM de UA(n=144);(5) grúpa rialaithe aosach, COCs ó bha aosach aibí ar feadh 22h (n=155 );(6) Grúpa aosach UA, COCanna ó bha aosacha aibithe go meánach arna bhforlíonadh le 1 uM de UA ar feadh 22 h (n=129);(7) grúpa aosaigh 30 h d’aois a rialú, COCanna ó bha aosach d’aois tríothu. 30 h de aibiú in oitro (n=148); agus (8) Grúpa Aosach 30 h UA d'aois, COCanna ó bha fásta in oitro ar feadh 30 h i meán aibithe arna fhorlíonadh le 1 uM de UA(n{=138).buntáistí cynomoriumTar éis na dtréimhsí aibithe in vitro faoi seach, rinneadh úicítí a inseamhnú le seamhan tairbh leáite. Ina dhiaidh sin, rinneadh measúnú ar fhorbairt suthach, ag meastóireacht ar ráta na suthanna scoilte agus táirgthe araon, chomh maith lena gcáilíocht.

Ina theannta sin, sa turgnamh seo, aisghabhadh COCanna ó gach grúpa chun a gcéim aibithe núicléach a mheas (grúpa prepubertal rialaithe, n=7; grúpa prepubertal UA, n =7; grúpa prepubertal 30 h d'aois a rialú, n{ {3}}; UA aois 30 h grúpa prepubertal, n=6; rialaigh grúpa aosach,n=16; UA grúpa aosach,n=21;rialaigh grúpa aosach 30 h, n{ {9}}; UA grúpa aosach 30 h d'aois,n=18). Rinneadh measúnú freisin ar phoitéinseal membrane miteachondrial (MP) COCanna (grúpa prepubertal rialaithe, n=10; grúpa réamhbhreithe UA, n{ {13}};rialaigh grúpa réamhscoile 30 h d'aois,n=9; UA aois 30 h grúpa réamhbhreithe,n=9;rialaigh grúpa daoine fásta, n=15; grúpa aosach UA, n{ {19}}; rialaigh grúpa daoine fásta 30h d'aois,n=10; UA aois 30 h grúpa aosach,n=14).

2.1.3.Turgnamh2

Toisc go bhfuil ról riachtanach ag na GCanna i bhfás follicular agus forbairt oocyte, rinneadh an dara turgnamh i gcúig sheisiún chun staidéar breise a dhéanamh ar éifeacht aois agus UA ar léiriú NFE2L2, NQO1, agus mt-ND5. Rinneadh measúnú freisin ar líon na gcóipeanna den ghéine mt-ND5. Fuarthas GCanna tar éis lártheifneoiriú a dhéanamh ar an sreabhán follicular asúite ó ubhagán na n-ubhagán (= 10 mí) agus ba fásta (meánaois =62mí). Saothraíodh na cealla seo faoi na coinníollacha seo a leanas:(1)rialú réamhchaithreachais, saothrú GCanna na laonna prepubertal; (2) UA prepubertal, cultúr GCanna na laonna prepubertal arna fhorlíonadh le 1 UM UA; (3) rialú aosach, cultúr GCanna na mbó fásta; agus (4) UA aosach, cultúr GCanna na mbó fásta arna fhorlíonadh le 1 uM UA. Tar éis confluence GCs ar an 5ú lá de chultúr, bhí siad snap reoite i nítrigine leachtach, agus níos déanaí bhaintear an DNA agus RNA, rud a cheadaigh an chainníochtú ina dhiaidh sin NFE2L2, NQO1, agus athscríbhinní mRNA mt-ND5 agus freisin uimhir cóipeanna mt-ND5.

2.2. Bailiúchán Oicítí agus Aibiú In Vitro

Bailíodh ubhagáin ó bha aosacha agus réamhpubertacha (measúnacht roimhe seo, n {{0}} agus exp. 1, n=1334) ag seamlas áitiúil, agus coinníodh iad ag 35-37 céim, i salanda maolánach fosfáite (PBS) arna fhorlíonadh le 0.15 faoin gcéad d’albaimin séiream buaibheach (w/v, BSA) arna fhorlíonadh le 0.05 mg mL-l de kanamycin. Ag an tsaotharlann, asúiteadh 19-snáthaid tomhsaireachta follicles ovarian de 2-8 mm ar trastomhas. Ní raibh ach COCanna a raibh ar a laghad trí shraith de chealla cumal dlúth agus ooplasma aonchineálach nite agus roghnaithe le haghaidh aibithe de réir an dearadh turgnamhach.hyacinth fásaighBaineadh aibiú amach i gorlann ag 38.8 céim ,5 faoin gcéad CO2 in aer taisithe ar feadh 22 nó 30 h i meán aibithe comhdhéanta de mheán saothraithe fíocháin 199 (TCM) le 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais,0.2mM sóidiam pyruvate, 10 ng mL-l fachtóir fáis eipideirm, agus 10 μL mL-l de gentamicin【40】.

2.3.Bailiúchán agus Cultúr na gCeall Granulosa

Fuarthas cealla granulosa ón sreabhán follicular aisghafa tar éis lártheifneoraithe ar feadh 10 nóim ag 200x g[41]. Cuireadh an millín ar fionraí i 1 ml de mheán cultúir (TCM199 móide 10 faoin gcéad serum) chun lártheifneoiriú eile a dhéanamh ar feadh 5 nóiméad. Athchóiríodh an millíní nua i 1 ml de mheán cultúir arna fhorlíonadh le 1 uM de UA nó gan é de réir an dearadh turgnamhach agus homogenized le steallaire ceangailte le snáthaid 19G, ar a laghad 30 uair chun na cealla a dhícheangal. Tar éis measúnú a dhéanamh ar inmharthanacht GC (trypan dath gorm, 0.4 faoin gcéad w/v), síolaíodh cealla ag tiúchan de 2 × 105 cealla inmharthana mL-1 agus saothraíodh iad ar feadh cúig lá ag 38.8 céim ,5 faoin gcéad CO2 i humidified atmaisféar go dtí cumar. Ag gach 48 h, scaipeadh an meán cultúir agus athnuachan le ceann nua. Le haghaidh eastóscadh DNA agus RNA, bailíodh agus nite GCanna trí lártheifneoiriú ag 200x g ar feadh 10 min. Athchóiríodh millíní cille i 1 ml de PBS, léim láithreach reoite i nítrigin leachtach, agus stóráiltear iad ag -80 céim .

2.4. Aibiú Núicléach Oocyte

Rinneadh measúnú ar na céimeanna aibithe núicléach tar éis na tréimhse 22h nó 30 h d’aibiú in Vitro.Modh eastóscadh flavonoid pdfSocraíodh úicítí dílínithe i dtuaslagán d'aigéad aicéiteach/eatánól (1:3, v/v), agus coinníodh iad ag 4 chéim ar feadh 48 u. Ansin dathaíodh úicítí le tuaslagán aceto-lacmoid 1 faoin gcéad, suite i seomra Neubauer, agus breathnaíodh faoi mhicreascóp codarsnachta céime (Olympus BX41). Aicmíodh úicítí mar seo a leanas: Feithicleach Geirmeacha (GV), Crómasóm Comhdhlúthúcháin I (CCI), Crómasóm Comhdhlúthúcháin II(CCII), Diakinesis, Anaphase-I/Telophase-I (AI/TI), agus MII (Meiteaphase-II). . Níor cuireadh san áireamh ach oocytes le staining chromatin infheicthe [42].

2.5. Measúnú ar Phoitéinseal Membrane Mitochondrial

Chun an poitéinseal membrane mitochondrial (MP), táscaire de ghníomhaíocht mitochondrial, bhí dhaite mitochondria le 5, 6, 6'-tetrachloro-1, 1', 3, 3'tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iaidíd (JC-1). , Invitrogen, Waltham, MA, USA). Goradh úicítí dílínithe le 5 ug mL-l de JC-1 [37] i meán aibithe ar feadh 30 nóim ag 38.8 céim agus 5 faoin gcéad CO2 in aer bogtha sa dorchadas. Nitear úicítí faoi dhó i PBS agus aistríodh iad láithreach chuig gloine sleamhnáin réamhthéite agus breathnaíodh iad faoi mhicreascóp fluaraiseachta (Olympus BX51) ag baint úsáide as an scagaire fluaraiseachta gorm (BP 470-490 cuspóir UPlanFI 20×/0.50). Ríomhadh poitéinseal membrane mitochondrial ansin mar an cóimheas idir an fhluaraiseacht dearg/glas tomhaiste ag baint úsáide as na bogearraí Image] (Institiúid Náisiúnta Sláinte, Bethesda, MD, SAM). 2.6.Toirchiú In Vitro agus Cultúr Suthanna

Rinneadh toirchiú in vitro le speirm reoite-leáite de thairbh Holstein-Freascáine, a cuireadh isteach go toilleas roimhe seo trí úsáid a bhaint as modh grádán Percoll (45 agus 90), ag tiúchan de 2 x 10 céim spermatozoa mL-4.COCs agus comh-ghlais sperm ar feadh 20 h ag 38.8 céim agus 5 faoin gcéad CO2 in aer tais. Aistríodh zygotes toimhdeacha ansin chuig braoiníní de mheán sreabhán oviductal sintéiseach (SOF) arna fhorlíonadh le aimínaigéid BME agus MEM, glutamine, glutathione, agus BSA [40]. Tar éis 48 h den inseamhnú, ritheadh an ráta scoilteachta (suthanna scoilte in aghaidh na n-úicítí inseamhnaithe iomlán), agus coinníodh suthanna scoilte i SOF arna fhorlíonadh le BSA agus 10 faoin gcéad de shéiream bó féatais (FBS). Saothraíodh suthanna ar feadh 12 lá [41,43] chun measúnú a dhéanamh ar an ráta forbartha blastocyst (ag laethanta 7,9, agus 12; suthanna D7 in aghaidh na suthanna cleaved) agus ráta suthanna hatched (suthanna hatched in aghaidh an D7 suthanna) agus a gcáilíocht [43]. Rangaíodh suthanna Lá 7 mar ghrád 1 (dea-chaighdeán), 2 (cáilíocht chothrom), agus grád 3 (droch-chaighdeán)[4].

2.7.DNA agus Eastóscadh agus Cainníochtú DNA agus RNA

Rinneadh DNA iomlán agus RNA a leithlisiú ó GCanna ag baint úsáide as Kit Ullmhúcháin Teimpléad PCR High Pure (Roche, Basel, an Eilvéis) agus PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, SAM), faoi seach, de réir threoracha an mhonaróra. Áiríodh leis na prótacail sin úsáid na gcolún casadh a úsáidtear chun DNA iomlán ardcháilíochta agus RNA agus DNase a leithlisiú mar chóireáil chun DNA géanómach a bhaint de RNA[40]. Tar éis an eastósctha, stóráladh na samplaí ag -80 céim . Cinneadh tiúchan agus cáilíocht DNA agus RNA trí úsáid a bhaint as Speictreafótaiméadar NanoDropTM One/OneC (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA).

2.7.1. Sintéis DNA Comhlántach

Rinneadh sintéis de DNA comhlántach (cDNA) ó aonróga RNA ag baint úsáide as trealamh Mastermix Sintéise Xpert cDNA (GRiSP, Porto, an Phortaingéil, de réir threoracha an déantóra. Trascríobhadh RNA droim ar ais ag baint úsáide as 500 ng de RNA a bhaintear as gach sampla chun sintéis cDNA a dhéanamh, a rinneadh trí úsáid a bhaint as teirmeabúscaire (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules,CA, USA).Stóráladh na cDNAanna dá bharr ag -20 céim go dtí go n-úsáidfí iad le haghaidh tuilleadh measúnaithe.

Don staidéar seo, dearadh priméirí don spriocdhírithe (NFE2L2 agus NQO1) agus géine rialaithe inginiúil (6-actin) ag baint úsáide as bogearraí Primer-BLAST an Ionaid Náisiúnta um Fhaisnéis Biteicneolaíochta (NCBI) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, rochtain air an 6 Márta 2020). Léirítear seicheamháin primers do na géinte tagartha agus na géinte sprice i dTábla 1. Ina theannta sin, baineadh úsáid as an géine mt-ND5 san obair seo, agus fuarthas sonraí faoi primers mt-ND5 ó staidéar roimhe seo [45].

2.7.3.Imoibriú Slabhra Polymerase Droim ar ais-Trascríobh Cainníochtúil

Rinneadh anailísí PCR fíor-ama ag baint úsáide as an Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X le ROX i teirmeabúscaire QuantStudio 3 (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, SAM), ag baint úsáide as cDNA ag tiúchan 25 ng uL-l. Rinne qPCR an measúnú ar uimhir chóipeanna DNA mitochondrial (mt-DNA) den ghéin ND5 tríd an DNA a bhaintear roimhe seo, ag baint úsáide as an trealamh céanna agus a úsáidtear chun géinte a chainníochtú. Rinneadh gach imoibriú optamaithe, comhdhéanta de Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X le ROX, primer (Ar Aghaidh agus Droim ar ais) de gach géine sprice, sampla (cDNA/DNA), agus uisce saor ó RNase arb ionann é agus toirt iomlán de 10 μL. Rinneadh anailís ar na samplaí i ndúblach agus áiríodh imoibrithe ina raibh uisce in ionad an teimpléid mar rialuithe diúltacha. Cuireadh na samplaí faoi réir prótacail aimpliúcháin a chuimsigh timthriall tosaigh ag 95 céim ar feadh 2 nóiméad den chéim dínádúraithe, agus 40 timthriall dínádúraithe ina dhiaidh sin ag 95 céim ar feadh55s, 40 timthriall anáil ar feadh 30 s ag 60 céim (ag brath ar theocht leá na seichimh primer), agus céim shínte ag 72 céim ar feadh 30 s agus, ar deireadh, tréimhse síneadh deiridh ag 72 céim ar feadh 10 nóiméad.

Le haghaidh cainníochtú slonn géine, baineadh úsáid as an modh cainníochtaithe coibhneasta. Rinneadh an modh seo de chainníochtú coibhneasta ar léiriú géine le leibhéil slonn na spriocghéin faoi staidéar, a normalaíodh leis na géinte coimeádta, ag an modh comparáideach CT. De réir mar a rinneadh an t-aimpliú le RT-qPCR i ndúblach, socraíodh na meánluachanna CT do gach géine agus ríomhadh na leibhéil slonn ag baint úsáide as an bhfoirmle seo a leanas:

áit a bhfuil △Ct{0}}Ct géine sprice -Ct géine rialaithe inghin.

Chun líon na gcóipeanna mt-DNA a chainníochtú, baineadh úsáid as an gcainníochtú coibhneasta normalaithe i gcoinne mhodh na maise aonaid. Rinneadh an modh seo le luachanna CT na GCanna a ndearnadh cóireáil orthu le UA (ainmnithe mar thástáil), a normalaíodh le samplaí rialaithe (atá ainmnithe mar chalabróir faoi láthair). Toisc go ndearna qPCR measúnú ar chóipuimhir mt-ND5 agus rinneadh í i ndúblach, socraíodh na meánluachanna CT do na samplaí tástálacha agus calabraithe agus ríomhadh na cóimheasa ag baint úsáide as an bhfoirmle seo a leanas: